CN102952903A

CN102952903A - 可用于检测南方水稻黑条矮缩病毒的引物、试剂盒及其定量检测方法

Info

Publication number: CN102952903A
Application number: CN201210544601XA
Authority: CN
Inventors: 张松柏; 刘勇; 张德咏; 罗香文; 程菊娥; 彭静; 谭新球; 成飞雪; 朱春晖; 杨春晓
Original assignee: HUNAN PLANT PROT INST; HUNAN PLANT PROTECTION INSTITUTE
Current assignee: HUNAN PLANT PROT INST; HUNAN PLANT PROTECTION INSTITUTE
Priority date: 2012-12-14
Filing date: 2012-12-14
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2032-12-14
Also published as: CN102952903B

Abstract

本发明公开了一种可用于检测SRBSDV的引物以及试剂盒，还公开了一种利用该试剂盒定量检测SRBSDV的方法，首先合成前述的引物；然后利用RNA提取试剂盒从样品中提取其RNA；以RNA为模板并利用cDNA合成反应体系合成cDNA，再制备阳性标准样品，该阳性标准样品经实时荧光定量PCR反应程序绘制得到荧光信号达到阈值的循环数-起始浓度对数值的标准曲线；最后以合成的cDNA为模板配制实时荧光定量RT-PCR反应体系，通过实时荧光定量RT-PCR反应程序进行扩增反应，根据采集的荧光信号和标准曲线测得样品中SRBSDV的起始浓度值。本发明的方法具有精确度高、稳定性好、重复性好、特异性强、灵敏度高等优点。

Description

可用于检测南方水稻黑条矮缩病毒的引物、试剂盒及其定量检测方法

技术领域

本发明属于植物病毒分子生物学检测和鉴定技术领域，尤其涉及一种植物病毒检测用引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）是今年来严重危害水稻的一种新病毒。2009年以来，在我国南方主要水稻种植区爆发成灾，仅2010年，南方水稻黑条矮缩病毒病发生面积就达到1400多万亩，严重威胁到我国水稻的安全生产。

南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarfvirus，SRBSDV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus），病毒粒体球状，基因组由10条双链RNA(dsRNA)组成，由白背飞虱（Sogatella furcifera Horvath）以持久性方式传播。侵染水稻症状表现为植株矮缩、叶色深绿、高位分蘖、茎秆出现乳白色或浅褐色点条状突起，茎节上出现气生须根。SRBSDV主要浸染禾本科作物和杂草，如水稻、高粱和玉米以及看麦娘等，病害发生严重时能导致作物绝收。

由于SRBSDV是近年来水稻上分离并命名的一种新病毒病，目前，检测的方法主要是病害症状鉴别、血清学技术和常规RT-PCR技术。病害症状鉴别主要根据SRBSDV浸染水稻的典型症状来鉴别，但在SRBSDV浸染水稻早期，水稻不会表现典型症状，因此，如果单凭病害症状鉴定该病害，则SRBSDV造成的损失可能已无法避免。血清学技术主要依据SRBSDV编码的蛋白作为抗原，与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。而常规RT-PCR技术则通过将目的DNA片段扩增至数十万倍乃至百万倍，直至肉眼能够直接判断。然而，现有的技术均不能定量地检测SRBSDV病毒含量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种可用于检测南方水稻黑条矮缩病毒的引物和试剂盒，还提供一种精确度高、稳定性好、重复性好、特异性强、灵敏度高的定量检测南方水稻黑条矮缩病毒的方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种可用于检测南方水稻黑条矮缩病毒的引物，所述引物由上游引物和下游引物组成，所述上游引物和下游引物的序列如下所示：

上游引物：CTTTGACCGAGATGAGC；

下游引物：ACCTTCGTGAATGATGTT。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种可用于检测南方水稻黑条矮缩病毒的试剂盒，包括以下组成试剂：

包含上述引物的引物溶液；

阳性标准样品；

RNA提取试剂盒；

cDNA合成反应体系；和

实时荧光定量RT-PCR反应体系。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种定量检测南方水稻黑条矮缩病毒的方法，包括以下步骤：

（1）合成上述的引物；

（2）利用RNA提取试剂盒从待测农作物样品中提取其RNA；所述农作物包括水稻、高粱、玉米、看麦娘等；

（3）以步骤（2）中提取的RNA为模板，利用cDNA合成反应体系合成cDNA；

（4）制备阳性标准样品，该阳性标准样品经实时荧光定量PCR反应程序绘制得到荧光信号达到阈值的循环数-起始浓度对数值的标准曲线；

（5）以步骤（3）中合成的cDNA为模板，添加荧光染料和步骤（1）中合成的引物配制实时荧光定量RT-PCR反应体系，通过实时荧光定量RT-PCR反应程序进行扩增反应，在每个反应循环的延伸温度步骤采集荧光信号（采集的信号值，通过信号值可以确定对应的循环数），最后根据步骤（4）中建立的荧光信号达到阈值的循环数-起始浓度对数值的标准曲线，测得待测农作物样品中南方水稻黑条矮缩病毒的起始浓度值。

上述方法的步骤（3）中，合成cDNA的具体方法优选包括以下步骤：将RNA free水、随机引物六聚体和所述提取的RNA混匀，置于变性温度65℃，4min～6min；取出置于冰上，然后加入M-MLV反转录酶、M-MLV Buffer、dNTP Mixture和RNA抑制剂，进行RT反应合成cDNA。

上述方法的步骤（4）中，阳性标准样品的制备方法优选具体包括以下步骤：从水稻阳性样品中提取南方水稻黑条矮缩病毒的RNA，然后以该RNA为模板，采用cDNA合成反应体系进行RT反应，得到其cDNA；以该cDNA为模板进行PCR扩增反应，对扩增反应产物进行回收纯化，再进行连接和转化E.coli感受态DH5α，得到阳性克隆菌液；将阳性克隆菌液接种于培养基中培养，再从中提取病毒质粒，采用紫外分光光度法测定出病毒质粒含量，最后将病毒质粒用超纯水梯度稀释，得到一组阳性标准样品。

上述的检测方法中，所述RT反应的程序优选包括：30℃，1h；70℃，15min；-4℃保存。

上述的检测方法中，所述PCR扩增反应的程序优选包括：95℃预变性5min；35个循环：95℃变性50s，58℃退火50s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min，-4℃保存。

上述的检测方法中，所述荧光信号达到阈值的循环数-起始浓度对数值的标准曲线的拟合方程优选为Y＝-3.901X+6.068，其中，Y表示荧光信号达到阈值的循环次数，X表示起始浓度值（单位为拷贝/μL），检测下限150拷贝/μL，线性检测范围为150～25703957.83拷贝/μL。

上述的检测方法中，所述实时荧光定量RT-PCR反应程序优选包括：UDG孵育50℃，2min；变性温度95℃，10min；35个反应循环：变性温度95℃，15s；退火温度58℃，30s；延伸温度72℃，30s。

上述本发明的技术方案主要基于以下原理：本发明的实时荧光定量RT-PCR反应技术是在实时荧光定量RT-PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过已经建立的标准曲线对待测样品中的南方水稻黑条矮缩病毒进行定量分析。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1.本发明的方法稳定性好、灵敏度高、精度高、特异性强；

2.本发明方法的检测时间短，从样品总RNA的抽提到得到检测结果，仅需要3.5h；

3.本发明的方法既可以定量检测、又能定性检测南方水稻黑条矮缩病毒，对减轻南方水稻黑条矮缩病毒对农作物危害，减少农作物损失具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例中引物特异性考察的电泳图，其中谱带1、2表示RBSDV阳性样品RT-PCR扩增检测结果；谱带3、4表示SRBSDV阳性样品RT-PCR扩增检测结果；CK为灭菌超纯水对照；M为DL2000Marker。

图2为本发明实施例1中得到的荧光信号值与采集信号循环数的标准扩增曲线。

图3为本发明实施例1中得到的荧光信号达到阈值的循环数-起始浓度对数值的标准曲线。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例1：

一种本发明的可用于检测南方水稻黑条矮缩病毒的引物，该引物由上游引物和下游引物组成，上游引物和下游引物的序列如下表1所示，上游引物的序列如表1中的SEQ ID 1，下游引物的序列如表1中的SEQ ID 2。

表1：本实施例的引物序列表

一种本发明的可用于检测南方水稻黑条矮缩病毒的试剂盒，包括以下组成试剂（本实施例中用到的各种试剂如无特别说明，均为市售产品）：

包含上述本实施例引物的引物溶液；

阳性标准样品；

RNA提取试剂盒；

cDNA合成反应体系；和

实时荧光定量RT-PCR反应体系。

利用本实施例的上述引物对及试剂盒定量检测南方水稻黑条矮缩病毒的方法，具体包括以下步骤：

1.合成检测引物

合成上述表1中所述序列的上游引物和下游引物；上述的引物主要根据GenBank报道的SRBSDV基因组组分S9的序列（登录号为：EU784843），采用GenBank中分析工具Blast进行序列比对并选择特异性区域，利用引物设计软件Primer 5.0在特异性区域设计得到；该引物由北京华大基因公司合成。

2.RNA的提取

利用H.Q&Q.溶液型RNA提取试剂盒（安徽优晶生物工程有限公司）从待测水稻样品（本实施例选用采自湖南省永州市水稻田的水稻阳性样品，RT-PCR检测呈阳性）中提取其RNA，操作步骤按照该RNA提取试剂盒所提供的使用说明书进行。

3.合成cDNA

以步骤2中提取的RNA为模板，利用cDNA合成反应体系合成cDNA；采用20μL cDNA合成反应体系，将RNA free水8μL、随机引物六聚体2μL和待测的样本RNA 3μL混匀，置于变性温度65℃，5min；取出置于冰上，然后加入M-MLV反转录酶0.5μL、5×M-MLVBuffer 4μL、10mM dNTP Mixture 2μL和40U/μL的RNA抑制剂0.5μL，进行RT反应合成cDNA，RT反应程序为：30℃，1h；70℃，15min；-4℃保存；合成的cDNA置于-20℃保存备用。

4.制备阳性标准样品

从水稻阳性样品（采自湖南省永州市水稻田，RT-PCR检测呈阳性）中提取南方水稻黑条矮缩病毒的RNA（具体的提取方法参见上述步骤2），然后以该RNA为模板，采用cDNA合成反应体系进行RT反应，得到其cDNA（具体的合成方法参见上述步骤3）；

以该cDNA为模板进行PCR扩增反应，采用上述步骤1中合成的引物进行PCR扩增，PCR扩增反应体系包括cDNA 2μL、10×PCR Buffer 2.5μL、10mM dNTP Mixture 0.5μL、10μM上游引物1.5μL（参见步骤1）、10μM下游引物1.5μL（参见步骤1），Taq DNApolymerase（5U/l）0.5μL，灭菌超纯水13μL；

PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；35个循环：95℃变性50s，58℃退火50s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min，-4℃保存；

利用PCR产物回收纯化试剂盒（北京全式金生物技术公司）并按照其提供的使用说明书回收纯化上述PCR扩增反应产物，再利用pEASY^TM-T5 Zero Cloning试剂盒（北京全式金生物技术公司）进行连接，然后转化E.coli感受态DH5α，连接和转化过程同实验说明书；

培养基上挑选克隆至10μL灭菌超纯水中，涡旋混合，以步骤1中的引物进行PCR反应验证，验证表明其为目标片段（目标产物片段大小为80bp）；

再选用上述得到的阳性克隆菌液接种于含Amp的LB培养基（含Amp的LB培养基是按照Takala公司常用试剂配制中含Amp的LB培养基配制方法配制而成）中培养，37℃条件下培养12h～16h；再以质粒回收纯化试剂盒EasyPure^TM Plasmid MiniPrep Kit（北京全式金生物技术公司的）提取质粒，操作步骤同其使用说明书；采用紫外分光光度法（根据分光光度计测定OD260nm和OD280nm的吸光度）测定其质粒含量，然后以灭菌超纯水10倍梯度稀释，最后稀释到以10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷倍质粒制成阳性标准样品，每次使用量各位1μL/反应。

5.绘制标准曲线

以步骤4中获得的阳性标准样品，每个相应的浓度设置3个重复，采用实时荧光定量RT-PCR技术（具体操作参见后续的步骤6）制成相应的标准扩增曲线（参见图2）和荧光信号达到阈值的循环数-起始浓度对数值的标准曲线Y＝-3.901X+6.068（参见图3），该标准曲线的相关系数为0.9854，PCR扩增效率为80.4％，该标准曲线的斜率绝对值为3.901，（3.0～4.0）。

6.实时荧光定量RT-PCR反应

以步骤3中合成的cDNA为模板，添加荧光染料和步骤1中合成的引物配制实时荧光定量RT-PCR反应体系，采用25μL的反应体系，其中1μL cDNA（步骤3合成）、上游引物和下游引物（步骤1合成）各0.5μL，12.5μL 2×Transstart Green qPCR SuperMix UDG，10.5μLddH₂O，所有反应试剂都在冰上配制；

通过实时荧光定量RT-PCR反应程序进行扩增反应，实时荧光定量RT-PCR反应程序是：UDG孵育50℃，2min；变性温度95℃，10min；35个反应循环：变性温度95℃，15s；退火温度58℃，30s；延伸温度72℃，30s；每个反应循环的延伸温度步骤采集荧光信号，结果如下表2所示，结果显示3个重复阳性样本采集的荧光信号的循环数（Ct）为：28.55、28.53、28.98，根据步骤5中建立的荧光采集信号循环数-起始浓度对数值的标准曲线，可测得三个样本中的病毒含量分别为4.31×10⁴、4.31×10⁴、4.37×10⁴，而阴性对照没有荧光信号。

表2：阳性水稻样品的实时荧光定量RT-PCR检测结果

实施例2：特异性考察

采用与实施例1相同的检测方法（选用的引物、试剂、步骤及参数条件均相同），对SRBSDV阳性样品和RBSDV阳性样品（RT-PCR检测法均为阳性）分别进行检测，检测后的特异性电泳图如图1所示，由图1可见，本发明的引物仅能从南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）阳性样品中扩增得到清晰目的条带，而且无杂带，与南方水稻黑条矮缩病毒亲缘关系最近的RBSDV没有扩增目的片段，这充分说明本发明选用的引物具有很强的特异性。

实施例3：重复性和灵敏度考察

采用与实施例1相同的检测方法（选用的引物、试剂、步骤及参数条件均相同），检测样品的浓度选取10²、10³、10⁴、10⁶倍稀释质粒，每个相应浓度设置三个重复，反应重复3次，以计算本方法的重复性，检测结果如下表3所示；由表3可见，同一样品的三个重复的循环数（Ct）差异仅为2.86±0.40％（均值±标准误），同一样品不同批次检测的循环数（Ct）差异仅为3.51±0.37％（均值±标准误），这说明本方法的稳定性好。

表3：实时荧光定量RT-PCR方法的重复性结果

另外，图3的计算结果表明本发明方法的检测下限为150拷贝/μL，这表明本发明的方法灵敏度高。

Claims

1.一种可用于检测南方水稻黑条矮缩病毒的引物，所述引物由上游引物和下游引物组成，所述上游引物和下游引物的序列如下所示：

上游引物：CTTTGACCGAGATGAGC；

下游引物：ACCTTCGTGAATGATGTT。

2.一种可用于检测南方水稻黑条矮缩病毒的试剂盒，包括以下组成试剂：

包含权利要求1所述引物的引物溶液；

阳性标准样品；

RNA提取试剂盒；

cDNA合成反应体系；和

实时荧光定量RT-PCR反应体系。

3.一种定量检测南方水稻黑条矮缩病毒的方法，包括以下步骤：

（1）合成权利要求1所述的引物；

（2）利用RNA提取试剂盒从待测农作物样品中提取其RNA；

（5）以步骤（3）中合成的cDNA为模板，添加荧光染料和步骤（1）中合成的引物配制实时荧光定量RT-PCR反应体系，通过实时荧光定量RT-PCR反应程序进行扩增反应，在每个反应循环的延伸温度步骤采集荧光信号，最后根据步骤（4）中建立的荧光信号达到阈值的循环数-起始浓度对数值的标准曲线，测得待测农作物样品中南方水稻黑条矮缩病毒的起始浓度值。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，合成cDNA的具体方法包括以下步骤：将RNA free水、随机引物六聚体和所述提取的RNA混匀，置于变性温度65℃，4min～6min；取出置于冰上，然后加入M-MLV反转录酶、M-MLV Buffer、dNTP Mixture和RNA抑制剂，进行RT反应合成cDNA。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，阳性标准样品的制备方法具体包括以下步骤：从水稻阳性样品中提取南方水稻黑条矮缩病毒的RNA，然后以该RNA为模板，采用cDNA合成反应体系进行RT反应，得到其cDNA；以该cDNA为模板进行PCR扩增反应，对扩增反应产物进行回收纯化，再进行连接和转化E.coli感受态DH5α，得到阳性克隆菌液；将阳性克隆菌液接种于培养基中培养，再从中提取病毒质粒，采用紫外分光光度法测定出病毒质粒含量，最后将病毒质粒用超纯水梯度稀释，得到一组阳性标准样品。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述RT反应的程序包括：30℃，1h；70℃，15min；-4℃保存。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的程序包括：95℃预变性5min；35个循环：95℃变性50s，58℃退火50s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min，-4℃保存。

8.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述荧光采集信号循环数-起始浓度对数值的标准曲线的拟合方程为Y＝-3.901X+6.068。

9.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量RT-PCR反应程序包括：UDG孵育50℃，2min；变性温度95℃，10min；35个反应循环：变性温度95℃，15s；退火温度58℃，30s；延伸温度72℃，30s。