CN102952076B - 吡唑啉类化合物的制备及其在抗癌治疗药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
一类吡唑啉衍生物，其特征是它有如下通式：
Description
技术领域
本发明涉及吡唑啉类化合物及其制备方法与抗肿瘤药物。
背景技术
癌症具有较高的发病率和致死率。严重威胁着人类的健康和生命。目前，化疗仍然是肿瘤治疗的主要手段之一，因此新药的开发研究也依然是攻克肿瘤的重要途径之一。目前，抗癌新药的开发对象主要包括天然物质、化学合成物质及生物技术合成物质等，而且开发一种新型的抗癌药物也是解决临床上多药耐药(multidrugresistanceMDR)的途径之一.
烟酸及其衍生物作为一种重要的天然药物成分，大量存在于活细胞中，有着广泛的生物学活性。先前大量的报道证明某些特定的取代基嘧啶及其大环衍生物有抗抑郁、抗菌、抗癌、止痛、抗痉挛等活性。吡唑啉类化合物作为其中一组化合物拥有广泛的药理特性：解热镇痛，抗风湿等。这类衍生物也被报道拥有较好的抗炎活性，被作为一个有效的抗糖尿病靶向基团进行研究。此外，大量报道中具有药理抗癌活性的化合物中都含有吡唑啉基团。最近，这些杂环氮衍生物已被证实具有二价阳离子载体潜能，并作用于硫氰酸盐选择性细胞膜传感器。
前期工作中，我们已经合成了一批各种取代基的吡唑啉，并测试了其生物活性，此文中，这些吡唑啉和几种取代基烟酸、异氰酸苯酯及异硫氰酸苯酯通过酰胺键加成，形成了一系列的未经报道的新化合物。这些新化合物，可能体现出吡唑啉和酰胺、脲及硫脲在抗肿瘤中的协同性。我们测试了这批化合物的活性，并发现其对MCF-7细胞具有良好的抑制作用，引起细胞凋亡。
发明内容
本发明的目的在于提供一类新型吡唑啉衍生物化合物以及它们的制备方法与用途。
本发明的技术方案如下：
1.一类吡唑啉衍生物，其特征是它有如下通式：
结构式中R1为：吡啶-3-基、6-氯吡啶-3-基、6-甲基吡啶-3-基、2-氯-6甲基吡啶-3-基、5-溴吡啶-3-基、2-氯吡啶-3-基；
R2为：甲氧基、氯；
R3为：甲氧基、氯、溴、氟、苄氧基。
2.一种制备上述的吡唑啉衍生物的方法，它由下列步骤组成：
步骤1.制备查尔酮原料：将取代基苯甲醛5.1mmol，取代基苯乙酮5.0mmol分别溶于乙醇，缓慢滴入40％NaOH溶液10ml，磁搅拌，常温反应5h，TLC检测反应进行程度，产物以固体析出，反应结束后抽滤，并以大量的蒸馏水冲洗固体物，最后用乙醇洗涤3次，干燥得取代基查尔酮，将产物重结晶；
步骤2.于50ml烧瓶中加入2mmol取代基查尔酮，0.4ml水合肼，并溶解于20mml正丙醇中，90℃搅拌反应10h，TLC检测，反应结束后，冷却到5℃以下，反应产物自动析出，抽滤并用乙醇洗涤2次，重结晶得到第二步产物；
(1)步骤3.反应生成酰胺系列：将步骤2产物与取代基烟酸、EDC·HCl以1∶1.2∶1.2的摩尔比分别加入50ml烧瓶中，用20mlCH2Cl2溶解，45℃搅拌反应12h，TLC检测，反应结束，用真空将溶剂抽干，将烧瓶中残余固体溶于30ml乙酸乙酯中，用50ml8％稀盐酸洗涤萃取3次，真空抽干萃取液，得到残余固体用乙醇重结晶，得到最终产物。
本发明的吡唑啉衍生物具有抑制MCF-7细胞增殖的作用。因此本发明的吡唑啉衍生物可做潜在的抗肿瘤药物。
具体实施方式
实施例一：(3，5-双(4-甲氧苯基)-4，5-二氢-1氢-吡唑基-1)(5-溴代吡啶基-3)甲酮(化合物1)的制备
于50ml单口烧瓶内将N-对甲氧基苯甲醛(5.0mmol)，N-对甲氧基苯乙酮(5.0mmol)分别溶于20ml乙醇，缓慢滴入40％NaOH溶液10ml，磁搅拌，常温反应5小时(TLC检测反应进行程度)，产物以固体析出。反应结束后抽滤，并以大量的蒸馏水冲洗固体物，最后用乙醇洗涤3次，干燥得取代基查尔酮。将产物纯化，干燥后，称取2mmol加入到另一个50ml单口烧瓶内，0.4ml水合肼，并溶解于20mml正丙醇中，90℃搅拌反应10小时(TLC检测)。反应结束后，冷却到5℃以下，反应产物自动析出，抽滤并用乙醇洗涤2次，重结晶纯化得到第二步产物。将步骤2产物与5-溴-烟酸、EDC·HCl以1∶1.2∶1.2的摩尔比分别加入50ml烧瓶中，用20mlCH2Cl2溶解，45℃搅拌反应12小时(TLC检测)。反应结束，用真空将溶剂抽干，将烧瓶中残余固体溶于30ml乙酸乙酯中，用50ml8％稀盐酸洗涤萃取3次。真空抽干萃取液，得到残余固体用乙醇重结晶，纯化得到最终产物。得到白色固体，产率：65％.熔点：144-146℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.23(dd，J1＝4.77Hz，J2＝17.73Hz，1H)；3.77(t，4H)；3.86(s，3H)；5.73(dd，J1＝4.74Hz，J2＝11.52Hz，1H)；6.88(d，2H)；6.94(d，2H)；7.46(d，2H)；7.67(d，2H)；8.46(s，1H)，8.75(d，2H)；9.20(s，1H).MS(ESI)：466.1([M+H]+).Anal.CalcdforC23H20BrN3O3：C，59.24；H，4.32；N，9.01.Found：C，59.44；H，4.12；N，9.21.
实施例二：(3，5-双(4-甲氧苯基)-4，5-二氢-1氢-吡唑基-1)(6-氯代吡啶基-3)甲酮(化合物2)的制备
制备方法同实施例一。以6-氯-烟酸代替例十一中的取代基烟酸。得到黄色粉末状目标化合物。产率：68％.熔点：129-131℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.19-3.27(m，1H)；3.76(d，4H)；3.86(s，3H)；5.73(dd，J1＝4.53Hz，J2＝11.52Hz，1H)；6.86-6.95(m，5H)；7.26(d，1H)；7.41(d，1H)；7.67(d，2H)；8.28(d，1H)；9.14(s，1H).MS(ESI)：422.1([M+H]+).Anal.CalcdforC23H20ClN3O3：C，65.48；H，4.78；N，9.96.Found：C，65.28；H，4.98；N，9.56.
实施例三：(3，5-双(4-甲氧苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(2-氯代-6-甲基吡啶基-3)甲酮(化合物3)的制备
制备方法同实施例一。以2-氯，6-甲基-烟酸代替例十一中的取代基烟酸。得到黄色粉末状目标化合物。产率：61％.熔点：161-165℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：2.59(s，3H)；3.18-3.25(m，1H)；3.77(d，4H)；3.83(d，3H)；5.68(dd，J1＝4.65Hz，J2＝11.52Hz，1H)；6.86-6.90(m，4H)；7.14(d，1H)；7.30(d，2H)；7.56(d，2H)；7.66(d，1H).MS(ESI)：436.1([M+H]+).Anal.CalcdforC24H22ClN3O3：C，66.13；H，5.09；N，9.64.Found：C，66.45；H，5.24；N，9.28.
实施例四：(3，5-双(4-甲氧苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(2-氯代吡啶基-3)甲酮(化合物4)的制备
制备方法同实施例一。以2-氯-烟酸代替例十一中的取代基烟酸。得到棕色粉末状目标化合物。产率：71％.熔点：133-135℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.19-3.27(m，1H)；3.80(s，3H)；3.84(d，4H)；5.67-5.72(m，1H)；6.86-6.91(m，4H)；7.23-7.32(m，3H)；7.55(d，2H)；7.75-7.78(m，1H)；8.44-8.46(m，1H).MS(ESI)：421.1([M+H]+).Anal.CalcdforC23H20ClN3O3：C，65.48；H，4.78；N，9.96.Found：C，65.64；H，4.56；N，9.75.
实施例五：(3，5-双(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(6-甲基吡啶基-3)甲酮(化合物5)的制备
制备方法同实施例一。以6-甲基-烟酸代替例十一中的取代基烟酸。得到白色粉末状目标化合物。产率：68％.熔点：144-151℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：2.56-2.67(m，3H)；3.19-3.27(m，1H)；3.76(t，3H)；3.84(d，4H)；5.70-5.76(m，1H)；6.87(d，2H)；6.95(t，2H)；7.24(s，1H)；7.26(d，1H)；7.67(d，2H)；8.45(s，1H)；8.75(d，1H)；9.20(s，1H).MS(ESI)：402.2([M+H]+).Anal.CalcdforC24H23N3O3：C，71.80；H，5.77；N，10.47.Found：C，71.42；H，5.54；N，10.73.
实施例六：(3，5-双(4-甲基苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(3-吡啶基)甲酮(化合物6)的制备
制备方法同实施例一。以异烟酸代替例十一中的取代基烟酸。得到白色粉末状目标化合物。产率：65％.熔点：183-185℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.20-3.28(m，1H)；3.74-3.84(m，4H)；3.85-3.89(m，3H)；5.78(dd，J1＝4.77Hz，J2＝11.70Hz，1H)；6.97(d，2H)；7.25(s，2H)；7.33-7.44(m，4H)；7.81(d，2H)；8.76(d，2H).MS(ESI)：388.2([M+H]+).Anal.CalcdforC23H21N3O3：C，71.30；H，5.46；N，10.85.Found：C，71.61；H，5.33；N，10.57.
实施例七：(3，5-双(4-甲基苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(4-吡啶基)甲酮(化合物7)的制备
制备方法同实施例一。以烟酸代替例十一中的取代基烟酸。得到白色粉末状目标化合物。产率：64％.熔点：139-145℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.15-3.25(m，1H)；3.78(d，4H)；3.86-3.89(m，3H)；5.76(dd，J1＝4.54Hz，J2＝11.54Hz，1H)；6.76-6.90(m，4H)；7.29(d，2H)；7.46(d，3H)；7.67-7.79(d，2H)；8.78(d，1H).MS(ESI)：488.2([M+H]+).Anal.CalcdforC23H21N3O3：C，71.30；H，5.46；N，10.85.Found：C，71.45；H，5.57；N，10.56.
实施例八：(5-(4-溴代苯基)-3-(4-甲氧苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(6-氯代吡啶基-3)甲酮(化合物8)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，以6-氯烟酸代替例十一中的取代基烟酸。得到灰色晶体状目标化合物。产率：65％.熔点：174-176℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.15-3.23(m，1H)；3.72-3.89(m，4H)；5.73-5.85(m，1H)；6.87-6.97(m，1H)；7.24-7.35(m，3H)；7.37-7.49(m，3H)；7.56-7.77(m，3H)；8.46(d，1H).MS(ESI)：426.1([M+H]+).Anal.CalcdforC22H17Cl2N3O2：C，61.98；H，4.02；N，9.86.Found：C，61.57；H，4.15；N，9.58.
实施例九：(5-溴代吡啶基-3)(5-(4-氯代苯基)-3-(4-甲氧苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)甲酮(化合物9)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，以6-氯烟酸代替例十一中的取代基烟酸。得到黄色晶体状目标化合物。产率：79％.熔点：159-162℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.16-3.24(m，1H)；3.79(t，1H)；3.86(s，3H)；5.71-5.76(m，1H)；6.94(d，2H)；7.26(t，2H)；7.33(d，2H)；7.66(d，2H)；8.46(s，1H)；8.76(d，1H)；9.21(d，1H).MS(ESI)：470.0([M+H]+).Anal.CalcdforC22H17BrClN3O2：C，56.13；H，3.64；N，8.93.Found：C，56.45；H，3.44；N，8.86.
实施例十：(5-(4-氯代苯基)-3-(4-甲氧苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(6-甲基吡啶基-3)甲酮(化合物10)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，以6-甲基烟酸代替例十一中的取代基烟酸。得到黄色晶体状目标化合物。产率：75％.熔点：160-163℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：2.63(s，3H)；3.13-3.20(m，1H)；3.73-3.85(m，4H)；5.72-5.78(m，1H)；6.81(d，1H)；6.93(d，2H)；7.30(t，3H)；7.61-7.69(m，2H)；8.21(d，1H)；9.25(s，2H).MS(ESI)：406.1([M+H]+).Anal.CalcdforC23H20ClN3O2：C，68.06；H，4.97；N，10.35.Found：C，68.35；H，4.76；N，10.49.
实施例十一：(2-氯代-6-甲基吡啶基-3)(5-(4-氯代苯基)-3(4-甲氧苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)甲酮(化合物11)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，以2-氯，6-甲基烟酸代替例十一中的取代基烟酸。得到黄色晶体状目标化合物。产率：81％.熔点：149-154℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：2.62(s，3H)；3.17-3.25(m，1H)；3.79-3.89(m，4H)；5.63-5.72(m，1H)；6.70(d，2H)；7.14(d，1H)；7.31-7.40(m，4H)；7.57(d，2H)；7.68(d，1H).MS(ESI)：440.1([M+H]+).Anal.CalcdforC23H19Cl2N3O2：C，62.74；H，4.35；N，9.54.Found：C，62.56；H，4.58；N，9.33.
实施例十二：(5-(4-氯代苯基)-3-(4-甲氧苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(2-氯代吡啶基-3)甲酮(化合物12)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，以2-氯，6-甲基烟酸代替例十一中的取代基烟酸。得到红色晶体状目标化合物。产率：73％.熔点：127-130℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.17-3.25(m，1H)；3.79-3.89(m，4H)；5.70(dd，J1＝4.74Hz，J2＝11.52Hz，1H)；6.88(d，2H)；7.33(t，5H)；7.54(d，2H)；7.77(d，1H)；8.47(d，1H).MS(ESI)：426.1([M+H]+).Anal.CalcdforC22H17Cl2N3O2：C，61.98；H，4.02；N，9.86.Found：C，61.75；H，4.26；N，9.58.
实施例十三：(5-(4-氯代苯基)-3-(4-甲氧苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(3-吡啶基)甲酮(化合物13)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，以烟酸代替例十一中的烟酸。得到白色晶体状目标化合物。产率：65％.熔点：146-148℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.11-3.25(m，1H)；3.73-3.89(m，4H)；5.63-5.76(m，1H)；7.08-7.14(m，2H)；7.31(d，2H)；7.46(d，1H)；7.61-7.66(m，2H)；7.73-7.85(m，2H)；7.93(d，2H)；8.47(d，1H).MS(ESI)：392.1([M+H]+).Anal.CalcdforC22H18ClN3O2：C，67.43；H，4.63；N，10.72.Found：C，67.85；H，4.57；N，10.34.
实施例十四：(5-(4-溴代苯基)-3-(4-甲氧苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(5-溴代吡啶基-3)甲酮(化合物14)的制备
制备方法同实施例一。以对溴苯甲醛取代例十一中的苯甲醛。得到黄色晶体状目标化合物。产率：61％.熔点：170-172℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.17-3.24(m，1H)；3.80(t，1H)；3.87(s，3H)；5.70-5.76(m，1H)；6.95(d，2H)；7.21(d，2H)；7.49(d，2H)；7.67(d，2H)；8.47(s，1H)；8.77(s，1H)；9.22(s，1H).MS(ESI)：514.0([M+H]+).Anal.CalcdforC22H17Br2N3O2：C，51.29；H，3.33；N，8.16.Found：C，51.44；H，3.16；N，8.27.
实施例十五：(5-(4-溴代苯基)-3-(4-甲氧苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(2-氯代吡啶基-3)甲酮(化合物15)的制备
制备方法同实施例一。以对溴苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，以2-氯烟酸取代例十一中的烟酸。得到黄色晶体状目标化合物。产率：75％.熔点：138-142℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.17-3.24(m，1H)；3.79-3.88(m，4H)；5.69(dd，J1＝4.77Hz，J2＝11.52Hz，1H)；6.87(d，2H)；7.25(d，1H)；7.28(s，1H)；7.30-7.34(m，1H)；7.49-7.55(m，4H)；7.77(dd，J1＝2.01Hz，J2＝7.50Hz，1H)；8.46-8.48(m，1H).MS(ESI)：470.0([M+H]+).Anal.CalcdforC22H17BrClN3O2：C，56.13；H，3.64；N，8.93.Found：C，56.45；H，3.46；N，8.87.
实施例十六：(5-(4-溴代苯基)-3-(4-甲氧苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(2-氯代-6-甲基吡啶基-3)甲酮(化合物16)的制备
制备方法同实施例一。以对溴苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，以2-氯，6-甲基烟酸取代例十一中的烟酸。得到黄色晶体状目标化合物。产率：78％.熔点：159-162℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：2.60(s，3H)；3.15-3.23(m，1H)；3.77-3.87(m，4H)；5.65-5.70(m，1H)；6.88(d，2H)；7.16(d，1H)；7.24(s，1H)；7.26(d，1H)；7.50(d，2H)；7.55(d，2H)；7.66(d，1H).MS(ESI)：484.0([M+H]+).Anal.CalcdforC23H19BrClN3O2：C，56.98；H，3.95；N，8.67.Found：C，56.64；H，3.77；N，8.79.
实施例十七：(5-(4-溴代苯基)-3-(4-甲氧苯)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(6-氯代吡啶基-3)甲酮(化合物17)的制备
制备方法同实施例一。以对溴苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，以6-氯烟酸取代例十一中的烟酸。得到黄色晶体状目标化合物。产率：64％.熔点：190-192℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.16-3.23(m，1H)；3.80(t，1H)；3.87(s，3H)；5.70-5.75(m，1H)；6.94(d，2H)；7.21(d，2H)；7.41-7.50(m，3H)；7.66(d，2H)；8.28(s，1H)；9.15(s，1H).MS(ESI)：470.0([M+H]+).Anal.CalcdforC22H17BrClN3O2：C，56.13；H，3.64；N，8.93.Found：C，56.35；H，3.46；N，8.87.
实例十八：(5-(4-溴代苯基)-3-(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(6-甲基吡啶基-3)甲酮(化合物18)的制备
制备方法同实施例一。以对溴苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，以6-甲基烟酸取代例十一中的烟酸。得到灰色晶体状目标化合物。yield：71％.Mp：137-143℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：2.51-2.64(m，3H)；3.89(t，5H)；6.75(s，1H)；7.50-7.57(m，3H)；7.62(d，2H)；7.73(d，1H)；7.84(d，2H)；7.97(d，2H)；8.03(d，1H).MS(ESI)：450.1([M+H]+).Anal.CalcdforC23H20BrN3O2：C，61.34；H，4.48；N，9.33.Found：C，61.65；H，4.56；N，9.59.
实例十九：(5-(4-溴代苯基)-3-(4-甲氧苯基)-4，5-二氢-1氢-吡唑基-1)(吡啶基-3)甲酮(化合物19)的制备
制备方法同实施例一。以对溴苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，以烟酸取代例十一中的烟酸。得到红色晶体状目标化合物。产率：68％.熔点：170-179℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.28-3.36(m，1H)；3.87(t，4H)；5.72-5.77(m，1H)；6.88-7.00(m，5H)；7.70(d，2H)；7.98(s，1H)；8.82(d，1H)；8.98(d，1H)；9.67(s，1H).MS(ESI)：436.1([M+H]+).Anal.CalcdforC22H18BrN3O2：C，60.56；H，4.16；N，9.63.Found：C，60.35；H，4.38；N，9.42.
实例二十：(5-(4-溴代苯基)-3-(4-甲氧苯基)-4，5-二氢-1氢-吡唑基-1)(4-吡啶基)甲酮(化合物20)的制备
制备方法同实施例一。以对溴苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，以异烟酸取代例十一中的烟酸。得到灰色晶体状目标化合物。产率：65％.熔点：209-216℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.15-3.22(m，1H)；3.79(t，1H)；3.86(s，3H)；5.74(dd，J1＝4.53Hz，J2＝11.31Hz，1H)；6.94(d，2H)；7.21(d，2H)；(d，2H)；7.49(d，2H)；7.64(d，2H)；8.66(d，2H).MS(ESI)：436.1([M+H]+).Anal.CalcdforC22H18BrN3O2：C，60.56；H，4.16；N，9.63.Found：C，60.18；H，4.35；N，9.47.
实例二十一：(5-(4-苄氧苯基)-3-(4-甲氧苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(5-溴代吡啶基-3)甲酮(化合物21)的制备
制备方法同实施例一。以对苄氧苯甲醛取代例十一中的苯甲醛。得到黄色晶体状目标化合物。产率：63％.熔点：106-109℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.20-3.27(m，1H)；3.78(dd，J1＝11.52Hz，J2＝17.76Hz，1H)；3.86(s，3H)；5.04(s，2H)；5.71-5.76(m，1H)；6.94(t，5H)；7.26(d，1H)；7.31-7.40(m，5H)；7.67(d，2H)；8.47(s，1H)；8.76(s，1H)；9.21(s，1H).MS(ESI)：542.1([M+H]+).Anal.CalcdforC29H24BrN3O3：C，64.21；H，4.46；N，7.7.Found：C，64.44；H，4.65；N，7.48.
实例二十二：(5-(4-苄氧苯基)-3-(4-甲氧苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(2-氯代-6-甲基吡啶基-3)甲酮(化合物22)的制备
制备方法同实施例一。以对苄氧苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，2-氯，6-甲基烟酸取代例十一中的烟酸。得到黄色晶体状目标化合物。产率：79％.熔点：205-210℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：2.60(s，3H)；3.20-3.25(m，1H)；3.74-3.82(m，4H)；5.04(s，2H)；5.66-5.71(m，1H)；6.87(d，2H)；6.96(d，2H)；7.15(d，1H)；7.30(d，3H)；7.33-7.43(m，4H)；7.56(d，2H)；7.66(d，1H).MS(ESI)：512.1([M+H]+).Anal.CalcdforC30H26ClN3O3：C，70.38；H，5.12；N，8.21.Found：C，70.56；H，5.34；N，8.45.
实例二十三：(5-(4-苄氧苯基)-3-(4-甲氧苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(2-氯代吡啶基-3)甲酮(化合物23)的制备
制备方法同实施例一。以对苄氧苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，2-氯烟酸取代例十一中的烟酸。得到棕色晶体状目标化合物。产率：64％.熔点：146-147℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.23(dd，J1＝4.56Hz，J2＝17.55Hz，1H)；3.75-3.85(m，4H)；5.05(s，2H)；5.70(dd，J1＝4.38Hz，J2＝11.52Hz，1H)；6.87(d，2H)；6.97(d，2H)；7.29-7.34(m，4H)；7.35-7.43(m，4H)；7.56(d，2H)；7.77(dd，J1＝1.83Hz，J2＝7.5Hz，1H)；8.46(dd，J1＝1.83Hz，J2＝4.74Hz，1H).MS(ESI)：598.2([M+H]+).Anal.CalcdforC29H24ClN3O3：C，69.95；H，4.86；N，8.44.Found：C，69.56；H，4.68；N，8.69.
实例二十四：(5-(4-苄氧苯基)-3-(4-甲氧苯基)-4，5二氢-1氢-吡唑基-1)(6-氯代吡啶基-3)甲酮(化合物24)的制备
制备方法同实施例一。以对苄氧苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，6-氯烟酸取代例十一中的烟酸。得到黄色晶体状目标化合物。产率：75％.熔点：151-157℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.23(dd，J1＝4.53Hz，J2＝17.73Hz，1H)；3.72-3.82(m，1H)；3.86(s，3H)；5.04(s，2H)；5.73(dd，J1＝4.53Hz，J2＝11.34Hz，1H)；6.93-6.96(m，4H)；7.26(d，1H)；7.35-7.42(m，7H)；7.67(d，2H)；8.28(d，1H)；9.14(s，1H).MS(ESI)：498.1([M+H]+).Anal.CalcdforC29H24ClN3O3：C，69.95；H，4.86；N，8.44.Found：C，69.57；H，4.64；N，8.29.
实例二十五：(5-(4-苄氧苯基)-3-(4-甲氧苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(6-甲氧吡啶基-3)甲酮(化合物25)的制备
制备方法同实施例一。以对苄氧苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，6-甲基烟酸取代例十一中的烟酸。得到灰色晶体状目标化合物。产率：69％.熔点：107-110℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：2.56(s，3H)；3.13-3.27(m，1H)；3.87(t，4H)；5.12(t，2H)；5.70-5.79(m，1H)；6.96-7.06(m，4H)；7.34-7.45(m，7H)；7.60(d，2H)；7.77(d，1H)；8.03(dd，J1＝2.01Hz，J2＝6.96Hz，2H).MS(ESI)：478.2([M+H]+).Anal.CalcdforC30H27N3O3：C，75.45；H，5.70；N，8.80.Found：C，75.66；H，5.52；N，8.43.
实例二十六：(5-(4-苄氧苯基)-3-(4-甲氧苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(4-吡啶基)甲酮(化合物26)的制备
制备方法同实施例一。以对苄氧苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，异烟酸取代例十一中的烟酸。得到黄色晶体状目标化合物。产率：76％.熔点：159-162℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.18-3.25(m，1H)；3.71-3.81(m，1H)；3.85(s，3H)；5.03(s，2H)；5.74(s，1H)；6.92-6.96(m，4H)；7.26(t，2H)；7.31-7.39(m，5H)；7.64(d，2H)；7.83(d，2H)；8.73(d，2H).MS(ESI)：464.2([M+H]+).Anal.CalcdforC29H25N3O3：C，75.14；H，5.44；N，9.07.Found：C，75.58；H，5.25；N，9.39.
实例二十七：(5-(4-溴代苯基)-3-(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(3吡啶基)甲酮(化合物27)的制备
制备方法同实施例一。以对苄氧苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，无取代烟酸取代例十一中的烟酸。得到黄色晶体状目标化合物。产率：72％.熔点：146-152℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.14-3.20(m，1H)；3.74-3.88(m，4H)；5.24(s，2H)；5.85-5.89(m，1H)；7.905(d，3H)；7.29(t，2H)；7.37-7.49(m，6H)；7.65(d，3H)；8.29(d，1H)；8.78(d，2H).MS(ESI)：464.2([M+H]+).Anal.CalcdforC29H25N3O3：C，75.14；H，5.44；N，9.07.Found：C，75.37；H，5.54；N，9.38.
实例二十八：(5-(4-苄氧苯基)-3-(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(5-溴代吡啶基-3)甲酮(化合物28)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮取代例十一中的苯乙酮。得到白色晶体状目标化合物。产率：73％.熔点：128-133℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.14-3.23(m，1H)；3.78-3.83(m，1H)；5.71-5.83(m，1H)；6.75(s，1H)；6.99(d，3H)；7.49-7.57(m，3H)；7.62(d，2H)；7.73(d，1H)；7.84(d，2H)；7.97(d，2H)；8.03(d，1H)；9.23-9.25(m，1H).MS(ESI)：546.1([M+H]+).Anal.CalcdforC28H21BrClN3O2：C，61.50；H，3.87；N，7.68.Found：C，61.72；H，3.55；N，7.99.
实例二十九：(5-(4-苄氧苯基)-3-(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(2-氯代吡啶基-3)甲酮(化合物29)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮取代例十一中的苯乙酮，2-氯烟酸取代例十一中的烟酸。得到棕色晶体状目标化合物。产率：74％.熔点：162-165℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.24(dd，J1＝4.74Hz，J2＝17.73Hz，1H)；3.75-3.86(m，1H)；5.06(s.2H)；5.69-5.75(m，1H)；6.98(d，2H)；7.28-7.44(m，10H)；7.53(d，2H)；7.75-7.78(m，1H)；8.46-8.48(m，1H).MS(ESI)：502.1([M+H]+).Anal.CalcdforC28H21Cl2N3O2：C，66.94；H，4.21；N，8.36.Found：C，66.78；H，4.43；N，8.09.
实例三十：(5-(4-苄氧苯基)-3-(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(6-氯代吡啶基-3)甲酮(化合物30)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮取代例十一中的苯乙酮，6-氯烟酸取代例十一中的烟酸。得到黄色晶体状目标化合物。产率：71％.熔点：154-156℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.19-3.27(m，1H)；3.73-3.83(m，1H)；5.04(s，2H)；5.73-5.79(m，1H)；6.94(t，2H)；7.24(d，2H)；7.31-7.42(m，8H)；7.63(t，2H)；8.24(d，1H)；9.10(s，1H).MS(ESI)：502.1([M+H]+).Anal.CalcdforC28H21Cl2N3O2：C，66.94；H，4.21；N，8.36.Found：C，66.57；H，4.43；N，8.59.
实例三十一：(5-(4-苄氧苯基)-3-(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(2-氯代-6-甲基吡啶基-3)甲酮(化合物31)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮取代例十一中的苯乙酮，2-氯，6甲基-烟酸取代例十一中的烟酸。得到黄色晶体状目标化合物。产率：78％.熔点：158-163℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：2.61(s，3H)；3.23(d，1H)；3.71-3.85(m，1H)；5.04(d，2H)；5.71(d，1H)；6.97(d，2H)；7.16(d，1H)；7.28-7.43(m，9H)；7.52(d，2H)；7.66(d，1H).MS(ESI)：516.1([M+H]+).Anal.CalcdforC29H23Cl2N3O2：C，67.45；H，4.49；N，8.14.Found：C，67.64；H，4.65；N，8.38.
实例三十二：(5-(4-苄氧苯基)-3-(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(6-甲基吡啶基-3)甲酮(化合物32)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮取代例十一中的苯乙酮，6甲基-烟酸取代例十一中的烟酸。得到白色晶体状目标化合物。产率：69％.熔点：115-118℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：2.84-3.01(m，4H)；3.74-3.81(m，1H)；5.16(s，2H)；6.76(m，1H)；7.02-7.09(m，2H)；7.36-7.50(m，9H)；7.62(d，1H)；7.81(d，1H)；7.91-8.00(m，3H).MS(ESI)：482.1([M+H]+).Anal.CalcdforC29H24ClN3O2：C，72.27；H，5.02；N，8.72.Found：C，72.54；H，5.16；N，8.57.
实例三十三：(5-(4-苄氧苯基)-3-(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(3-吡啶基)甲酮(化合物33)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮取代例十一中的苯乙酮，无取代烟酸取代例十一中的烟酸。得到黄色晶体状目标化合物。产率：78％.熔点：156-158℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.18-3.26(m，1H)；3.78(dd，J1＝11.70Hz，J2＝17.73Hz，1H)；5.04(s，2H)；5.75-5.81(m，1H)；6.95(d，2H)；7.26(t，2H)；7.31-7.40(m，8H)；7.65(d，2H)；8.26(d，1H)；8.70(s，1H)；9.27(s，1H).MS(ESI)：468.1([M+H]+).Anal.CalcdforC28H22ClN3O2：C，71.87；H，4.74；N，8.98.Found：C，71.59；H，4.55；N，8.72.
实例三十四：(5-(4-苄氧苯基)-3-(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(4-吡啶基)甲酮(化合物34)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮取代例十一中的苯乙酮，异烟酸取代例十一中的烟酸。得到棕色晶体状目标化合物。产率：79％.熔点：178-181℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.18-3.26(m，1H)；3.78(dd，J1＝11.52Hz，J2＝17.76Hz，1H)；5.04(s，2H)；5.73-5.79(m，1H)；6.96(d，2H)；7.23(d，2H)；7.31-7.41(m，7H)；7.62(d，2H)；7.80(s，2H)；8.76(s，2H).MS(ESI)：468.1([M+H]+).Anal.CalcdforC28H22ClN3O2：C，71.87；H，4.74；N，8.98.Found：C，71.44；H，4.57；N，8.53.
实例三十五：(3，5-双(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(5-溴代吡啶基-3)甲酮(化合物35)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮取代例十一中的苯乙酮，对氯苯甲醛取代例十一中的苯甲醛。得到白色晶体状目标化合物。产率：78％.熔点：142-146℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.17-3.24(m，1H)；3.77-3.87(m，1H)；5.74-5.79(m，1H)；7.26(t，2H)；7.34(d，2H)；7.41(d，2H)；7.64(d，2H)；8.42(s，1H)；8.78(d，1H)；9.18(s，1H).MS(ESI)：474.0([M+H]+).Anal.CalcdforC21H14BrCl2N3O：C，53.08；H，2.97；N，8.84.Found：C，53.35；H，2.86；N，8.79.
实例三十六：(3，5-双(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(2-氯代吡啶基-3)甲酮(化合物36)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮取代例十一中的苯乙酮，对氯苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，2-氯烟酸取代例十一中的烟酸。得到白色晶体状目标化合物。产率：66％.熔点：174-181℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：2.94(s，1H)；4.01(t，1H)；5.67-5.79(m，1H)；7.16(d，2H)；7.31(t，3H)；7.38(d，3H)；7.68(s，3H).MS(ESI)：430.0([M+H]+).Anal.CalcdforC21H14Cl3N3O：C，58.56；H，3.28；N，9.76.Found：C，58.83；H，3.45；N，9.37.
实例三十七：(3，5-双(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(6-氯代吡啶基-3)甲酮(化合物37)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮取代例十一中的苯乙酮，对氯苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，6-氯烟酸取代例十一中的烟酸。得到白色晶体状目标化合物。产率：79％.熔点：177-181℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.18-3.26(m，1H)；3.78-3.88(m，1H)；5.78(dd，J1＝5.13Hz，J2＝11.70Hz，1H)；7.26(s，1H)；7.28(d，1H)；7.35(d，2H)；7.41-7.46(m，3H)；7.65(dd，J1＝1.83Hz，J2＝6.78Hz，2H)；8.24-8.28(m，1H)；9.13(d，1H).MS(ESI)：430.0([M+H]+).Anal.CalcdforC21H14Cl3N3O：C，58.56；H，3.28；N，9.76.Found：C，58.37；H，3.35；N，9.48.
实例三十八：(3，5-双(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(2-氯代-6-甲基吡啶基-3)甲酮(化合物38)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮取代例十一中的苯乙酮，对氯苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，2-氯，6甲基-烟酸取代例十一中的烟酸。得到白色晶体状目标化合物。产率：63％.熔点：186-190℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：2.95(d，4H)；3.96-4.06(m，1H)；5.72-5.81(m，1H)；7.16(d，2H)；7.29-7.32(m，2H)；7.39(d，3H)；7.78(d，3H).MS(ESI)：444.0([M+H]+).Anal.CalcdforC22H16Cl3N3O：C，59.41；H，3.63；N，9.45.Found：C，59.64；H，3.46；N，9.77.
实例三十九：(3，5-双(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(6-氯代吡啶基-3)甲酮(化合物39)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮取代例十一中的苯乙酮，对氯苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，6甲基-烟酸取代例十一中的烟酸。得到白色晶体状目标化合物。产率：65％.熔点：146-148℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：2.78-2.92(m，4H)；3.18-3.25(m，1H)；5.56-5.69(m，1H)；6.79(s，1H)；7.47(m，5H)；7.94(m，5H).MS(ESI)：410.1([M+H]+).Anal.CalcdforC22H17Cl2N3O：C，64.40；H，4.18；N，10.24.Found：C，64.73；H，4.04；N，10.56.
实例四十：(3，5-双(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(3-吡啶基)甲酮(化合物40)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮取代例十一中的苯乙酮，对氯苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，无取代烟酸取代例十一中的烟酸。得到白色晶体状目标化合物。产率：73％.熔点：167-171℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.14-3.21(m，1H)；3.75-3.86(m，1H)；5.78(dd，J1＝4.53Hz，J2＝11.73Hz，1H)；7.26(s，1H)；7.28-7.35(m，3H)；7.40-7.48(m，3H)；7.64-7.73(m，2H)；8.24-8.28(m，3H).MS(ESI)：396.1([M+H]+).Anal.CalcdforC21H15Cl2N3O：C，63.65；H，3.82；N，10.60.Found：C，63.37；H，3.79；N，10.44.
实例四十一：(5-(4-溴代苯基)-3-(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(5-溴代吡啶基-3)甲酮(化合物41)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮取代例十一中的苯乙酮，对溴苯甲醛取代例十一中的苯甲醛。得到粉色晶体状目标化合物。产率：63％.熔点：155-158℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.18-3.26(m，1H)；3.79-3.88(m，1H)；5.77(dd，J1＝4.95Hz，J2＝11.70Hz，1H)；7.21(d，2H)；7.43(d，2H)；7.51(d，2H)；7.66(d，2H)；8.44(s，1H)；8.79(s，1H)；9.20(s，1H).MS(ESI)：517.9([M+H]+).Anal.CalcdforC21H14Br2ClN3O：C，48.54；H，2.72；N，8.09.Found：C，48.66；H，2.63；N，8.47.
实例四十二：(5-(4-溴代苯基)-3-(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(2-氯代吡啶基-3)甲酮(化合物42)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮取代例十一中的苯乙酮，对溴苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，2-氯烟酸取代例十一中的烟酸。得到灰色晶体状目标化合物。产率：73％.熔点：156-163℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.19-3.27(m，1H)；3.73-3.79(m，1H)；5.72-5.83(m，1H)；7.29-7.33(m，2H)；7.56(t，2H)；7.75(d，1H)；7.86(t，2H)；7.94(dd，J1＝8.58Hz，J2＝11.52Hz，3H).MS(ESI)：474.0([M+H]+).Anal.CalcdforC21H14BrCl2N3O：C，53.08；H，2.97；N，8.84.Found：C，53.26；H，2.74；N，8.79.
实例四十三：(5-(4-溴代苯基)-3-(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(6-氯代吡啶基-3)甲酮(化合物43)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮取代例十一中的苯乙酮，对溴苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，6-氯烟酸取代例十一中的烟酸。得到白色晶体状目标化合物。产率：68％.熔点p：172-180℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.21(dd，J1＝5.13Hz，J2＝17.91Hz，1H)；3.78-3.88(m，1H)；5.74-5.80(m，1H)；7.21(d，2H)；7.41-7.46(m，3H)；7.49-7.59(m，2H)；7.66(d，2H)；8.24-8.38(m，1H)；9.12(t，1H).MS(ESI)：474.0([M+H]+).Anal.CalcdforC21H14BrCl2N3O：C，53.08；H，2.97；N，8.84.Found：C，53.33；H，2.75；N，8.76.
实例四十四：(5-(4-溴代苯基)-3-(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(2-氯代-6-甲基吡啶基-3)甲酮(化合物44)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮取代例十一中的苯乙酮，对溴苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，2-氯，6-甲基烟酸取代例十一中的烟酸。得到黄色晶体状目标化合物。产率：75％.熔点：152-156℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：2.85-2.97(m，4H)；3.94-4.09(m，1H)；5.73-5.85(m，1H)；7.19(d，2H)；7.39-7.42(m，2H)；7.39-7.45(m，3H)；7.78-7.89(m，3H).MS(ESI)：488.0([M+H]+).Anal.CalcdforC22H16BrCl2N3O：C，54.01；H，3.30；N，8.59.Found：C，54.43；H，3.24；N，8.95.
实例四十五：(5-(4-溴代苯基)-3-(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(6-甲基吡啶基-3)甲酮(化合物45)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮取代例十一中的苯乙酮，对溴苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，6-甲基烟酸取代例十一中的烟酸。得到白色晶体状目标化合物。产率：65％.熔点：152-157℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：2.75-2.93(m，4H)；3.15-3.25(m，1H)；5.58-5.67(m，1H)；6.79-6.83(m，1H)；7.47-7.56(m，4H)；7.67-7.89(m，3H)；7.94(d，2H)；8.12-8.20(m，1H).MS(ESI)：410.1([M+H]+).Anal.CalcdforC22H17BrClN3O：C，58.11；H，3.77；N，9.24.Found：C，58.54；H，3.66；N，9.49.
实例四十六：(5-(4-溴代苯基)-3-(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(3-吡啶基)甲酮(化合物46)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮取代例十一中的苯乙酮，对溴苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，无取代烟酸取代例十一中的烟酸。得到灰色晶体状目标化合物。产率：68％.熔点：150-158℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.21(dd，J1＝5.31Hz，J2＝17.73Hz，1H)；3.78-3.88(m，1H)；3.76-3.82(m，1H)；7.23(d，2H)；7.41(d，3H)；7.51(d，2H)；7.66(d，2H)；8.28(d，1H)；8.73(d，2H)；9.29(s，1H).MS(ESI)：440.0([M+H]+).Anal.CalcdforC21H15BrClN3O：C，57.23；H，3.43；N，9.53.Found：C，57.65；H，3.67；N，9.25.
实例四十七：(5-(4-溴代苯基)-3-(4-氯代苯基)-4，5-二氢-1氢-1-吡唑基)(4-吡啶基)甲酮(化合物47)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮取代例十一中的苯乙酮，对溴苯甲醛取代例十一中的苯甲醛，异烟酸取代例十一中的烟酸。得到棕色晶体状目标化合物。产率：61％.熔点：221-227℃.1HNMR(300MHz，CDCl3，δppm)：3.17-3.24(m，1H)；3.77-3.87(m，1H)；5.77(dd，J1＝4.92Hz，J2＝11.70Hz，1H)；7.22(d，2H)；7.40-7.44(m，2H)；7.51(dd，J1＝1.83Hz，J2＝6.57Hz，2H)；7.63(d，2H)；7.81(d，2H)；8.77(d，2H).MS(ESI)：440.0([M+H]+).Anal.CalcdforC21H15BrClN3O：C，57.23；H，3.43；N，9.53.Found：C，57.24；H，3.37；N，9.19.
实施例四十八：吡唑啉衍生物对肿瘤抑制活性研究
采用MTT[3-(4，5)-双甲基-2-噻唑-(2，5)-苯基溴化四氮唑蓝]法来测定吡唑啉类化合物对MCF7半抑制浓度，即IC50。
(1)培养液(每升)的配制：①悬浮细胞：RPMI-1640培养粉一袋(10.4g)，新生牛血清100ml，青霉素溶液(20万U/ml)0.5ml，链霉素溶液(20万U/ml)0.5ml，加三蒸水溶解后，用5.6％的NaHCO3溶液调PH值至7.2-7.4，最后定容至1000ml。过滤灭菌。②贴壁细胞：同上，再加入NaHCO32.00g，HEPES2.38g。
(2)D-Hanks缓冲液(每升)的配制：NaCl8.00g，KCl0.40g，Na2HPO4·12H2O0.06g，KH2PO40.06g，NaHCO30.35g。高压灭菌。
(3)胰蛋白酶液的配制：利用D-Hanks缓冲液配成浓度为0.5％胰蛋白酶液。过滤除菌。
(4)实验药液的配制：将测试样品用少量的三蒸水溶解配成储备液，一般按实验最高浓度的10倍配制储备液。根据化合物溶解性不同，可用三蒸水直接溶解，或用少量DMSO助溶，再加三蒸水溶解。DMSO在培养液中的浓度不宜过大，加药后的每孔细胞悬液中DMSO的终浓度一般不超过0.05％-0.1％。储备液保存于-20℃冰箱中备用。
(5)MCF-7的培养：为贴壁生长细胞，常规培养于RPMI-1640培养液内(含10％小牛血清、100U/ml链霉素)，置37℃、5％CO2培养箱中培养，每隔3-4天传代一次。传代时先弃去原培养液，再用D-Hanks缓冲液洗涤；然后用0.5％胰蛋白酶消化30秒左右，加入少量新鲜培养液终止消化；吹打，使贴壁细胞从培养瓶壁上脱落下来；移取适量至新鲜培养瓶中，再补充新鲜培养液至原体积(培养液体积约为培养瓶容量的1/10)。
(6)细胞孵育：取对数生长期的上述肿瘤细胞，调细胞悬液浓度为2×104个/ml。在96孔培养板中每孔加细胞悬液100μl，置37℃，5％CO2培养箱中培养24h。培养24h后，分别按设计加入药液。
(7)加药：将测试药液按照最终浓度的浓度梯度分别加入到各个孔中，每个浓度设6个平行孔。实验分为药物试验组(分别加入不同浓度的测试药)、对照组(只加培养液和细胞，不加测试药)和空白组(只加培养液，不加细胞和测试药)。将加药后的96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养48h。
(8)存活细胞的测定：在培养了48h后的96孔板中，每孔加MTT40μl(用40μlPBS配成2.5mg/ml的MTT)。在37℃放置4h后，移去上清液。每孔加100μl提取液(10％SDS-5％异丁醇-0.01MHCl)。37℃孵育过夜，最后，利用自动酶标仪在570nm波长处检测各孔的光密度(OD值)。
抑制率的计算：细胞生长的抑制率按照下列公式计算：
生长抑制率＝(1-存活率)×100％＝[1-(OD实验-OD空白)/(OD对照-OD空白)]×100％(OD实验表示测试药物组的平均光密度，OD对照表示对照组的平均光密度，OD空白表示对照组的平均光密度)。
半数抑制浓度(IC50)定义为当50％的肿瘤细胞存活时的药物浓度。根据测定的光密度(OD值)，制作细胞生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其对应的药物浓度。
表1.化合物1-47对MCF-7细胞增值的抑制作用
化合物1-47的通式
Claims (3)
1.一类吡唑啉衍生物，其特征是它有如下通式：
结构式中R1为：吡啶-3-基、6-氯吡啶-3-基、6-甲基吡啶-3-基、2-氯-6甲基吡啶-3-基、5-溴吡啶-3-基、2-氯吡啶-3-基；
R2为：甲氧基、氯；
R3为：甲氧基、氯、溴、氟、苄氧基。
2.一种制备权利要求1中所述的的吡唑啉衍生物的方法，它由下列步骤组成：
步骤1.制备查尔酮原料：将取代基苯甲醛5.1mmol，取代基苯乙酮5.0mmol分别溶于乙醇，缓慢滴入40％NaOH溶液10ml，磁搅拌，常温反应5h，TLC检测反应进行程度，产物以固体析出，反应结束后抽滤，并以大量的蒸馏水冲洗固体物，最后用乙醇洗涤3次，干燥得取代基查尔酮，将产物重结晶；
步骤2.于50ml烧瓶中加入2mmol取代基查尔酮，0.4ml水合肼，并溶解于20ml正丙醇中，90℃搅拌反应10h，TLC检测，反应结束后，冷却到5℃以下，反应产物自动析出，抽滤并用乙醇洗涤2次，重结晶得到第二步产物；
步骤3.反应生成酰胺系列：将步骤2产物与取代基烟酸、EDC·HCl以1∶1.2∶1.2的摩尔比分别加入50ml烧瓶中，用20mlCH2Cl2溶解，45℃搅拌反应12h，TLC检测，反应结束，用真空将溶剂抽干，将烧瓶中残余固体溶于30ml乙酸乙酯中，用50ml8％稀盐酸洗涤萃取3次，真空抽干萃取液，得到残余固体用乙醇重结晶，得到最终产物。
3.权利要求1所述的吡唑啉衍生物在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
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| Syntheses and Spectroscopic Characterisation of Some New 3,5-Bisaryl-2-pyrazoline Derivatives. II;G. H. Sayed et al.;《Journal für Praktische Chemie》;20041108;第322卷(第5期);第717页 * |
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| Synthesis of some new pyrazolines from 4-nitro- and 4-chloro-4"-methoxy- benzalacetophenones. Part III.;G. H. Sayed;《Indian Jounal of Chemistry, Section B: Organic Chemistry Including Medicinal Chemistry》;19800531;第19B卷(第5期);第365页Scheme 2 * |
| Über 1-Thiocarbamoyl- und 1-Carbamoyl-3,5-diaryl-Δ2-pyrazoline;Fritz Gerd Weber and Karola Brosche;《Zeitschrift fuer Chemie》;20100901;第12卷(第4期);第132页 * |
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