CN102947445B - 成花素激活复合物 - Google Patents

成花素激活复合物 Download PDF

Info

Publication number
CN102947445B
CN102947445B CN201180013932.4A CN201180013932A CN102947445B CN 102947445 B CN102947445 B CN 102947445B CN 201180013932 A CN201180013932 A CN 201180013932A CN 102947445 B CN102947445 B CN 102947445B
Authority
CN
China
Prior art keywords
paddy rice
sequence numbering
mixture
albumen
anomaly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201180013932.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102947445A (zh
Inventor
大木出
田冈健一郎
辻宽之
儿岛长次郎
岛本功
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NAT UNIVERSITY CORP NARA I OF
Nara Institute of Science and Technology NUC
Original Assignee
NAT UNIVERSITY CORP NARA I OF
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by NAT UNIVERSITY CORP NARA I OF filed Critical NAT UNIVERSITY CORP NARA I OF
Publication of CN102947445A publication Critical patent/CN102947445A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102947445B publication Critical patent/CN102947445B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/827—Flower development or morphology, e.g. flowering promoting factor [FPF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C30—CRYSTAL GROWTH
    • C30B—SINGLE-CRYSTAL GROWTH; UNIDIRECTIONAL SOLIDIFICATION OF EUTECTIC MATERIAL OR UNIDIRECTIONAL DEMIXING OF EUTECTOID MATERIAL; REFINING BY ZONE-MELTING OF MATERIAL; PRODUCTION OF A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; SINGLE CRYSTALS OR HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; AFTER-TREATMENT OF SINGLE CRYSTALS OR A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; APPARATUS THEREFOR
    • C30B29/00—Single crystals or homogeneous polycrystalline material with defined structure characterised by the material or by their shape
    • C30B29/54—Organic compounds
    • C30B29/58—Macromolecular compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C30—CRYSTAL GROWTH
    • C30B—SINGLE-CRYSTAL GROWTH; UNIDIRECTIONAL SOLIDIFICATION OF EUTECTIC MATERIAL OR UNIDIRECTIONAL DEMIXING OF EUTECTOID MATERIAL; REFINING BY ZONE-MELTING OF MATERIAL; PRODUCTION OF A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; SINGLE CRYSTALS OR HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; AFTER-TREATMENT OF SINGLE CRYSTALS OR A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; APPARATUS THEREFOR
    • C30B7/00—Single-crystal growth from solutions using solvents which are liquid at normal temperature, e.g. aqueous solutions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Metallurgy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)

Abstract

本发明的课题在于提供由成花素、14-3-3蛋白以及bZIP转录因子结合而成的成花素激活复合物的晶体，进而利用该晶体并对它们的相互作用机制加以控制从而调节植物的成花；本发明的课题通过如下方案来解决，即，着眼于Hd3a通过GF14c与FD1结合而形成成花素激活复合物，并且，通过制备该成花素激活复合物的晶体、和使用成花素激活复合物的晶体得到立体结构信息，并利用该立体结构信息对成花素等的相互作用机制加以控制，由此来调节植物的成花。

Description

成花素激活复合物
技术领域
本发明涉及成花素通过14-3-3蛋白与bZIP转录因子结合而形成的成花素激活复合物的晶体、和由该晶体得到的成花素激活复合物的立体结构信息以及成花素激活复合物的功能的利用。
本申请要求通过参考而援引于此的日本申请特愿2010-061562号的优先权。
背景技术
对于稳定的粮食生产或者有效利用了植物生物量等的循环型经济社会系统的构建的实现来说，认为各种环境下的植物的开花的调节是有效的。为了构建调节植物开花的技术，需要弄清楚植物环境响应的信息传达的分子基础。
作为诱导植物开花的因素，成花素的存在在70年前就被提倡，近年来，已经明确了其实体为高等植物中普遍存在的FT基因的产物。成花素是在达到最适于花芽形成的日长时在叶子中合成，并向茎顶端移动从而使成花开始的分子。在水稻中，Hd3a被认为相当于成花素而促进抽穗，从而提出了将水稻Hd3a基因用于植物的开花调节中(专利文献1、非专利文献1)。
有报告称水稻Hd3a与水稻14-3-3蛋白GF14c相互作用，由此抑制性地控制成花(非专利文献2)。在非专利文献2中，使用酵母双杂交法对与Hd3a相互作用的蛋白质进行了筛选，发现水稻的14-3-3蛋白GF14c与Hd3a相互作用。GF14c主要定位于细胞质中，这暗示Hd3a与GF14c的复合物主要存在于细胞质中。由当过量表达GF14c时成花延迟的情况等可以认为，GF14c是抑制成花的因素。
在鼠耳芥中，认为作为成花素的实体的FT蛋白质在细胞核内与bZIP转录因子FD等相互作用，从而有助于花分生组织确定基因(flower meristem identi ty gene)的表达(非专利文献3、4)。有报告将bZIP转录因子使用于成花控制中(专利文献2)。
虽然关于成花素的研究报告有很多，但是，开花诱导中的成花素的作用机制仍不明确。
【在先技术文献】
【专利文献】
专利文献1：日本公开公报、特开2002-153283号
专利文献2：日本公开公报、特开2003-274972号
【非专利文献】
非专利文献1：Tamaki S et al.Science(2007)vol.316(5827)pp.1033-6
非专利文献2：Purwestri YA et al.Plant and Cell Physiology 2009 50(3)： 429-438 
非专利文献3：Wigge et al.Science(2005)vol.309(5737)pp.1056-9 
非专利文献4：Abe et al.Science(2005)vol.309(5737)pp.1052-6
发明内容
本发明的课题在于，提供成花素通过14-3-3蛋白与bZIP转录因子结合而形成的成花素激活复合物的晶体，并且，利用该晶体而将上述蛋白质间的相互作用机制明确，并对该相互作用进行控制，由此来调节植物的成花。
为了解决上述课题，本发明者们进行了潜心研究，结果在成花素通过14-3-3蛋白与bZIP转录因子结合而形成的成花素激活复合物的晶化上获得成功，并且发现利用由该成花素激活复合物的晶体得到的立体结构信息来控制相互作用机制，能够调节植物的成花，从而完成了本发明。
即，本发明由以下内容构成。
1.一种植物的成花的调节方法，其包括：在由成花素、14-3-3蛋白以及bZI P转录因子的复合物构成的成花素激活复合物中，对成花素与14-3-3蛋白的结合部位和/或14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合部位施加影响，由此来促进和/或抑制成花素激活复合物的形成，
成花素与14-3-3蛋白的结合部位是选自由相当于序列编号1中的D62、M63、R64、T98、F103及R132的成花素的部位和相当于序列编号2中的F200、D201、I204、E212、Y215、R226及D227的14-3-3蛋白的部位构成的群中的1个以上的部位，
14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合部位是选自由相当于序列编号2中的K51、R58、F121、R131、L224及D227的14-3-3蛋白的部位和相当于序列编号3中的R189～F195的bZIP转录因子的部位构成的群中的1个以上的部位。
2.上述1中所述的植物的成花的调节方法，其中，
促进和/或抑制成花素激活复合物的形成是指制备含有以下的(A)～(C)中的任一种以上的蛋白质的转化体，
(A)成花素与14-3-3蛋白的1个以上的结合部位发生了变异的成花素，
(B)成花素与14-3-3蛋白的1个以上的结合部位和/或14-3-3蛋白与bZIP转录因子的1个以上的结合部位发生了变异的14-3-3蛋白，
(C)14-3-3蛋白与bZIP转录因子的1个以上的结合部位发生了变异的bZIP转录因子。
3.一种多核苷酸，其编码以下的(A)～(C)中的任一种以上的蛋白质：
(A)成花素与14-3-3蛋白的1个以上的结合部位发生了变异的成花素，
(B)成花素与14-3-3蛋白的1个以上的结合部位和/或14-3-3蛋白与bZIP转录因子的1个以上的结合部位发生了变异的14-3-3蛋白，
(C)14-3-3蛋白与bZIP转录因子的1个以上的结合部位发生了变异的bZIP转录因子；
在此，成花素与14-3-3蛋白的结合部位是选自由相当于序列编号1中的D62、M63、R64、T98、F103及R132的成花素的部位和相当于序列编号2中的F200、D201、I204、E212、Y215、R226及D227的14-3-3蛋白的部位构成的群中的1个以上的部位，
14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合部位是选自由相当于序列编号2中的K51、R58、F121、R131、L224及D227的14-3-3蛋白的部位和相当于序列编号3中的R189～F195的bZIP转录因子的部位构成的群中的1个以上的部位。
4.一种重组载体，其含有上述3中所述的任一种以上的多核苷酸。
5.一种控制植物的成花的物质的筛选方法，其包括以下的任一工序：
(1)使候选物质与成花素或14-3-3蛋白中的任一种接触，然后使候选物质与14-3-3蛋白或成花素接触的工序；或者
(2)使候选物质与结合有或未结合有成花素的14-3-3蛋白或者bZIP转录因子中的任一种接触，然后使候选物质与bZIP转录因子或者结合有或未结合有成花素的14-3-3蛋白接触的工序。
6.上述5中所述的调节植物的成花的物质的筛选方法，其还包括以下的工序：
选择成花素与14-3-3蛋白的结合部位和/或14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合部位上的结合在候选物质的存在下被促进和/或阻碍的物质的工序，
其中，成花素与14-3-3蛋白的结合部位是选自由相当于序列编号1中的D62、M63、R64、P96、T98、F103及R132的成花素的部位和相当于序列编号2中的F200、D201、I204、E212、Y215、R226及D227的14-3-3蛋白的部位构成的群中的1个以上的部位，
14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合部位是选自由相当于序列编号2中的K51、R58、F121、R131、L224及D227的14-3-3蛋白的部位和相当于序列编号3中的R189～F195的bZIP转录因子的部位构成的群中的1个以上的部位。
7.上述5或6中所述的调节植物的成花的物质的筛选方法，其中，
成花素是至少含有序列编号1中所示的氨基酸序列中的第62～132位的氨基酸序列，并且含有以第1～6位中的1个氨基酸开始且以第165～177位中的1个氨基酸结束的氨基酸序列的成花素多肽片段，
14-3-3蛋白是至少含有序列编号2中所示的氨基酸序列中的第51～227位的氨基酸序列，并且含有以第1～5位中的1个氨基酸开始且以第230～256位中的1个氨基酸结束的氨基酸序列的14-3-3蛋白的多肽片段，
bZIP转录因子是至少含有序列编号3中所示的氨基酸序列中的第189～195位的氨基酸序列，并且含有以第182～188位中的1个氨基酸开始且以第195位氨基酸结束的氨基酸序列的bZIP转录因子多肽片段。
8.一种多肽片段，其是选自以下的多肽片段：
(i)由序列编号1中所示的氨基酸序列中的第6～170位的氨基酸序列构成的新型成花素多肽片段；
(ii)由序列编号2中所示的氨基酸序列中的第1～235位的氨基酸序列构成的 新型14-3-3蛋白多肽片段；
(iii)由序列编号3中所示的氨基酸序列中的第187～195位的氨基酸序列构成的新型bZIP转录因子多肽片段。
9.一种多核苷酸，其编码上述8的(i)～(iii)中所述的多肽片段。
10.一种成花素激活复合物，其是成花素多肽片段通过14-3-3蛋白多肽片段与bZIP转录因子多肽片段结合而形成的成花素激活复合物，
其中，成花素多肽片段、14-3-3蛋白多肽片段以及bZIP转录因子多肽片段分别为上述8的(i)～(iii)中所述的多肽片段。
11.一种成花素激活复合物的晶体，其是成花素通过14-3-3蛋白与bZIP转录因子结合而形成的，且是选自以下(1)～(3)中的晶体：
(1)晶体的空间群为P1，晶格常数为 α＝66°～70°、β＝85°～90°、γ＝75°～79°的晶体；
(2)晶体的空间群为P6522，晶格常数为 α＝90°、β＝90°、γ＝120°的晶体；
(3)晶体的空间群为P4，晶格常数为 α＝90°、β＝90°、γ＝90°的晶体。
12.上述11中所述的成花素激活复合物的晶体，其是选自以下(1)～(5)中的晶体：
(1)晶体的空间群为P1，晶格常数为α＝68.2°、β＝87.9°、γ＝77.9°的晶体；
(2)晶体的空间群为P1，晶格常数为α＝68.1°、β＝87.8°、γ＝77.9°的晶体；
(3)晶体的空间群为P1，晶格常数为α＝68.2°、β＝88.6°、γ＝77.8°的晶体；
(4)晶体的空间群为P6522，晶格常数为α＝90°、β＝90°、γ＝120°的晶体；
(5)晶体的空间群为P4，晶格常数为α＝90°、β＝90°、γ＝90°的晶体。
13.一种上述11或12中所述的成花素激活复合物的晶体的制备方法，其包括：
将GST融合后的上述8的(i)中的成花素与GST融合后的上述8的(ii)中的14-3-3蛋白以摩尔比1∶1.5进行混合而制备复合物，使用含有pH为7.5的0.1M的HEPES、0.2M的硫酸铵、以及容量百分比为25的PEG 3500的沉淀剂溶液，并通过坐滴法在4℃下将含有所述复合物且蛋白质浓度为10mg/mL的蛋白质溶液晶化的工序；
回收得到的晶体的工序；以及
使用沉淀剂溶液对得到的晶体进行培养，从而得到成花素激活复合物的晶体的工序，其中，上述沉淀剂溶液含有容量百分比为25的乙二醇和2mM的上述 8的(iii)中的bZIP转录因子。
14.一种调节植物的成花的物质的筛选方法，其是使用计算机而设计和/或选择具有调节成花素激活复合物的活性的功能的候选物质，由此来筛选调节植物的成花的物质的方法，
其中，上述筛选方法包括：
(a)将从上述11或12中所述的成花素激活复合物的晶体中得到的立体结构信息存储在存储手段中的工序，
(b)根据立体结构信息并利用导出手段而导出三维立体结构模型的工序，
(c)在导出的三维立体结构模型中，利用计算手段计算出原子间距离的工序，
(d)根据计算出的原子间距离并利用计算手段而计算出候选物质的立体结构信息，从而设计和/或选择候选物质的工序，其中，上述候选物质能够增强和/或阻碍成花素与14-3-3蛋白的结合和/或14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合。
15.上述11或12中所述的成花素激活复合物的晶体，其中，
成花素是至少含有序列编号1中所示的氨基酸序列中的第62～132位的氨基酸序列，并且含有以第1～6位中的1个氨基酸开始且以第165～177位中的1个氨基酸结束的氨基酸序列的多肽片段，
14-3-3蛋白是至少含有序列编号2中所示的氨基酸序列中的第51～227位的氨基酸序列，并且含有以第1～5位中的1个氨基酸开始且以第230～256位中的1个氨基酸结束的氨基酸序列的多肽片段，
bZIP转录因子是至少含有序列编号3中所示的氨基酸序列中的第189～195位的氨基酸序列，并且含有以第182～188位中的1个氨基酸开始且以第195位的氨基酸结束的氨基酸序列的多肽片段。
16.上述11、12以及15任一项所述的成花素激活复合物的晶体，其中，
成花素是含有序列编号1中所示的氨基酸序列中的第6～170位的氨基酸序列的多肽，14-3-3蛋白是含有序列编号2中所示的氨基酸序列中的第1～235位的氨基酸序列的多肽，bZIP转录因子是含有序列编号3中所示的氨基酸序列中的第187～195位的氨基酸序列的多肽。
17.上述13中所述的成花素激活复合物的晶体的制备方法，其中，含有成花素与14-3-3蛋白的复合物的溶液的浓度为5mg/mL～40mg/mL，将成花素与14-3-3蛋白的复合物晶化的工序中的沉淀剂溶液含有0.05M～0.1M HEPES(pH为6.5～8.5)、0.01M～0.4M硫酸铵、以及分子量为2000～4000且容量百分比为15～30的聚乙二醇，得到成花素激活复合物的晶体的工序中的沉淀剂溶液含有容量百分比为15～30的乙二醇、1mM～5mM bZIP转录因子、0.05M～0.1M HEPES(pH为6.5～8.5)、0.2M～1M硫酸铵、以及分子量为2000～4000且容量百分比为15～30的聚乙二醇。
18.上述14中所述的调节植物的成花的物质的筛选方法，其中，上述立体结构信息为表1或表2中记载的信息。
19.上述14或18中所述的调节植物的成花的物质的筛选方法，其中，
成花素与14-3-3蛋白的结合部位是选自由序列编号1中的D62、M63、R64、T98、F103及R132和序列编号2中的F200、D201、I204、E212、Y215、R226及D227构成的群中的1个以上的部位，
14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合部位是选自由序列编号2中的K51、R58、F121、R131、L224及D227和序列编号3中的R189～F195构成的群中的1个以上的部位。
20.上述14、18、19任一项所述的调节植物的成花的物质的筛选方法，其中，还包括获得上述被设计或选择的候选物质的工序、和为了研究上述候选物质的成花素激活复合物活性调节功能而使上述候选物质与成花素、14-3-3蛋白和/或bZ IP转录因子接触的工序。
21.上述14、18～20任一项所述的调节植物的成花的物质的筛选方法，其中，还包括：利用上述13或17中所述的成花素激活复合物的晶体的制备方法来制备成花素激活复合物的晶体的工序、和通过对该结晶进行X射线晶体结构分析而得到成花素激活复合物的立体结构信息的工序。
(发明効果)
本发明的晶体能够带来对于弄清楚植物的成花调节机制很重要的成花素激活复合物的立体结构信息，并且，该晶体能够作为用于对成花调节机制进一步研究的材料而使用。另外，根据从本发明的晶体得到的立体结构信息，能够人为地调节植物的成花。在本发明中，明确了成花素激活复合物中的各蛋白质的结合部位，并且，能够将结合部位的信息作为成花调节的新型标的而使用，从而能够有效地进行成花调节。根据本发明中得到的立体结构信息，能够得到可广泛利用于农业生产物的收量增加或育种的効率化等的转基因植物。
附图说明
图1是表示Hd3a、GF14c以及OsFD1这三者的成花索激活复合物的立体结构的图。
图2是表示关于Hd3a与OsFD1、Hd3a与GF14c、GF14c与OsFD1这三个组合的体外GST pull-down实验的结果的图。(实施例1(1))
图3是表示使用了NMR的、Hd3a与GF14c的相互作用分析的结果的图。(实施例1(2))
图4是表示Hd3a与GF14c的相互作用的详细情况的图。图4b表示Hd3a R64周边的放大图。(实施例3)
图5是表示使用了变异型Hd3a的、与GF14c的体外GST pull-down实验的结果(图5a)和使用了变异型GF14c的、与Hd3a的体外GST pull-down实验的结果(图5b)的图。(实施例6)
图6是表示Hd3a、GF14c以及OsFD1的成花素激活复合物与C-box DNA的凝胶迁移实验的结果的图。(实施例7)
图7是表示使用酵母双杂交法确认OsGF14的各同种型与Hd3a的相互作用的结果的图。(实施例8)
图8是表示使用酵母双杂交法确认Hd3a、OsGF14b以及OsFD1各组的相互作用的结果的图。(实施例9)
图9是表示使用免疫沉淀法确认Hd3a、OsGF14b以及OsFD1的各组在水稻茎顶端的相互作用的结果的图。(实施例10)
图10是表示Hd3a、OsGF14b以及OsFD1的细胞内定位的确认结果的图。(实施例11)
图11是表示Hd3a、OsGF14b以及OsFD1的细胞内定位的确认结果的图。(实施例11)
图12是表示Hd3a、OsGF14b以及OsFD1的细胞内定位的确认结果的图。(实施例11)
图13是表示Hd3a、OsGF14b以及OsFD1的瞬时表达对OsMADS15基因的转录的影响的确认结果的图。(实施例12)
图14是表示Hd3a变异对植物的成花的影响的确认结果的图。(实施例13-1)
图15是表示通过本发明得到的成花素激活复合物的作用机制的图。
图16是表示Hd3a变异对植物的成花的影响的确认结果的图。(实施例13-2)
具体实施方式
植物一般具有营养生长期和生殖生长期，并且在生长相从营养生长向生殖生长转换时形成花芽。将该从营养生长向生殖生长的转换现象称为“成花”。例如单子叶植物的水稻或麦类中的成花为抽穗，所谓的抽穗是指穗下方的节距(穗颈)急速伸长从而从旗叶的叶鞘露出的现象。在水稻中将芒露出时称为抽穗，而在麦类中穗出到根部为止时称为抽穗。
在本发明中，植物是指具有成花素的高等植物，优选为在1天的日照时间为一定时间以下的情况下形成花芽的短日照植物，更优选为单子叶短日照植物，进而更优选为禾本科植物，最优选为水稻。
(成花素激活复合物)
本发明是由成花素、14-3-3蛋白以及bZIP转录因子的复合物构成的成花素激活复合物，并且涉及由成花素通过14-3-3蛋白与bZIP转录因子结合而形成的成花素激活复合物。
在本发明中，成花素没有特别限定，可以例举出水稻的Hd3a、RFT1(Genbank Accession No.AB062676)、拟南芥的FT(Genbank Accession No.AB027504)、TSF(Ge nbank Accession No.AB027506)、西红柿的SFT(Genbank Accession No.AY186735)、小麦的VRN3(Genbank Accession No.LOC100037541)等，优选为水稻Hd3a。水稻Hd3a中含有序列编号1所示的氨基酸序列(Os06g0157700)(Genbank Accession No.BA B61028：源自Oryza sativa Japonica group cultivar Nipponbare)所表示的蛋白质、或者由在序列编号1的氨基酸序列中缺失、取代、附加和/或插入了1个～数个氨基酸残基后的氨基酸序列构成且作为成花素发挥功能的蛋白质。本发明中的水稻Hd3a优选为至少含有序列编号1中的第62～132位氨基酸序列，并且以第1～6位中的1个氨基酸开始且以第165～177位中的1个氨基酸结束的成花素多肽片段，更优选为由序列编号1中的第6～170位氨基酸序列构成的多肽片段。另外，特别优选该多肽片段具有序列编号1中的C43L/C109S/C166S的变异。
在本发明中，14-3-3蛋白没有特别限定，优选为水稻GF14。水稻GF14中具有 OsGF14a(Os08g0480800)、OsGF14b(Os04g0462500)、OsGF14c(Os08g0430500)、Os GF14d(Os11g0546900)、OsGF14e(Os02g0580300)、OsGF14f(Os03g0710800)、OsGF14g(Os01g0209200)、OsGF14h(Os11g0609600)这八个同种型(isoform)，在本发明中，优选为GF14b、GF14c、GF14e、GF14f，更优选GF14c或GF14b。需要说明的是，在本说明书中，以Os开始的编号只要没有特别说明，便是水稻注释计划数据库(Ri ce annotation proiect database、RAP-DB)中被特定的基因座的编号。可以根据这些编号来特定各GF14等的蛋白质的氨基酸序列和碱基序列。
水稻GF14c中含有序列编号2所示的氨基酸序列(Os08g0430500)(Genbank Acce ssion No.AAB07457.1：源自Oryza sativa Japonica group cultivar Nipponbare)所表示的蛋白质、或者由在序列编号2的氨基酸序列中缺失、取代、附加和/或插入了1个～数个氨基酸残基后的氨基酸序列构成，并且具有作为14-3-3蛋白与成花素结合的功能的蛋白质。本发明中的14-3-3蛋白优选为至少含有序列编号2中的第51～227位的氨基酸序列，并且以第1～5位中的1个氨基酸开始且以第230～256位中的1个氨基酸结束的多肽片段，更优选为由序列编号2中的第1～235位的氨基酸序列构成的多肽片段。
另外，水稻GF14b含有序列编号4所示的氨基酸序列(Os04g0462500)(Genbank Accession No.AK071822：源自Oryza sativa Japonica group cultivar Nipponbare)所表示的蛋白质、或者由在序列编号4的氨基酸序列中缺失、取代、附加和/或插入了1个～数个的氨基酸残基后的氨基酸序列构成，并具有作为14-3-3蛋白与成花素结合的功能的蛋白质。水稻GF14b的氨基酸序列与GF14c的氨基酸序列相比较有六个残基发生偏离。序列编号2中的第51～227位的氨基酸序列相当于序列编号4中的第57～233位的氨基酸序列，序列编号2中的以第1～5位中的1个氨基酸开始并以第230～256位中的1个氨基酸结束的氨基酸序列，相当于序列编号4中的以第7～11位中的1个氨基酸开始并以第236～262位中的1个氨基酸结束的氨基酸序列。
在本发明中，bZIP转录因子没有特别限定，可以例举出水稻OsFD1或者拟南芥的FD(Genbank Accession No.AB105823)，优选水稻OsFD1。水稻OsFD1含有序列编号3所示的氨基酸序列(Os09g0540800：源自Oryza Sativa Japonica group cultiva r Nipponbare)(TIGR水稻基因组注释数据库中被特定的Rice genome annotation loc us No.LOC_Os09g36910.1)所表示的蛋白质、或者由在序列编号3的氨基酸序列中缺失、取代、附加和/或插入了1个～数个氨基酸残基后的氨基酸序列构成且作为bZIP转录因子发挥功能的蛋白质。本发明中的bZIP转录因子优选为至少含有序列编号3中的第189～195位的氨基酸序列，且以第182～188位中的1个氨基酸开始并以第195位的氨基酸结束的多肽片段，更优选为由序列编号3中的第187～195位的氨基酸序列构成的多肽片段。另外，优选在该多肽片段中第192位的丝氨酸被磷酸化。该丝氨酸的磷酸化被认为是14-3-3蛋白与bZIP转录因子相结合所必需的。
上述成花素、14-3-3蛋白以及bZIP转录因子结合而形成成花素激活复合物。对于成花素和14-3-3蛋白的结合而言，认为序列编号1中的第62～132位的氨基酸序列的区域或者具有序列编号1以外的氨基酸序列的成花素的与上述区域相当的区域， 和/或序列编号2中的第200～227位的氨基酸序列的区域或者具有序列编号2以外的氨基酸序列的14-3-3蛋白的与上述区域相当的区域很重要。另外，对于14-3-3蛋白和bZIP转录因子的结合而言，序列编号2中的第51～227位的氨基酸序列的区域或者具有序列编号2以外的氨基酸序列的14-3-3蛋白的与上述区域相当的区域，和/或序列编号3中的第189～195位的氨基酸序列的区域或者具有序列编号3以外的氨基酸序列的bZIP转录因子的与上述区域相当的区域很重要，这在本发明中是显而易见的。
进而，在这些区域中，对于成花素和14-3-3蛋白的结合而言，认为序列编号1中的D62、M63、R64、P96、T98、F103、R132的氨基酸或者具有序列编号1以外的氨基酸序列的成花素的与上述氨基酸相当的氨基酸，和/或序列编号2中的F200、D201、I204、E212、Y215、R226、D227的氨基酸或者具有序列编号2以外的氨基酸序列的14-3-3蛋白的与上述氨基酸相当的氨基酸很重要。另外，对于14-3-3蛋白和bZIP转录因子的结合而言，序列编号2中的K51、R58、F121、R131、L224、D227的氨基酸或者具有序列编号2以外的氨基酸序列的14-3-3蛋白的与上述氨基酸相当的氨基酸很重要，这在本发明中是显而易见的。
在本发明中，所谓的“相当于序列编号X中的特定的氨基酸(例如D62等)的蛋白质的部位”，是以除了序列编号X中的特定的氨基酸(例如D62)的部位以外，还包括在具有序列编号X以外的氨基酸序列且具有与序列编号X的蛋白质等价的功能的蛋白质中的、相当于上述特定的氨基酸(例如D62)的部位的含义进行使用。例如，所谓的“相当于序列编号2中的F200、D201、I204、E212、Y215及R226的14-3-3蛋白的部位”，是指除了序列编号2中的F200、D201、I204、E212、Y215及R226的部位以外，还包括具有序列编号2以外的氨基酸序列的14-3-3蛋白的与上述氨基酸相当的氨基酸、例如水稻GF14b的F206、D207、I210、E218、Y221及R232(相当于水稻GF14c的F200、D201、I204、E212、Y215及R226)。
对成花素激活复合物在成花中的作用机制进行说明(参照图15)。14-3-3蛋白作为从叶子输送到茎顶端的成花素的衔接物(adaptor)而发挥作用。一般认为当成花素进入茎顶端的细胞内时，成花素首先在细胞质内与14-3-3蛋白结合。在此阶段，OsFD1在茎顶端细胞中被表达，该成花素和14-3-3蛋白的复合物从细胞质进入核内，并与bZIP转录因子结合从而形成成花素激活复合物，并且，该成花素激活复合物停留在核内。当这一系列的工序开始时，成花素激活复合物在核内积累。之后，成花素激活复合物将引起成花诱导的成花相关基因(例如OsMADS15基因)的转录激活。在上述作用机制中，成花素在茎顶端细胞的细胞质内被14-3-3蛋白捕获，并且，通过bZIP转录因子而使成花素和14-3-3蛋白的复合物被高效地输送至核内，以便将成花诱导所需的基因的转录激活。另外，本发明中的基于成花素激活复合物的成花相关基因的转录激活，被认为是通过成花素激活复合物向C-box DNA的结合而进行的。所谓的“C-box DNA”由GACGTC(序列编号10)的碱基序列所表示，并且存在于成花相关基因的启动子区中。推测成花素激活复合物是在成花相关基因的C-box上形成稳定的复合物，从而将成花相关基因的转录激活。
在本发明中，成花素、14-3-3蛋白、bZIP转录因子、它们的变异型蛋白质、成花素与14-3-3蛋白的复合物、14-3-3蛋白与bZIP转录因子的复合物、以及作为这三者的复合物的成花素激活复合物，既可以是从细胞、组织等分离提纯后的状态，也可以是将编码蛋白质的基因导入酵母或大肠杆菌等的宿主细胞而将该蛋白质在细胞内表达的状态。另外，本发明还涉及编码这些蛋白质的多核苷酸。也可以根据宿主细胞的表达系统而对这些蛋白质附加不影响蛋白质的功能程度的肽片段。例如在使用大肠杆菌的表达系统的情况下，源自大肠杆菌表达质粒的肽片段(GPGHM)被附加在蛋白质的N末端。
成花素和14-3-3蛋白的复合物或者14-3-3蛋白和bZIP转录因子的复合物可以通过使两种蛋白质以分离提纯后的状态接触、或者在生物体内接触来制备。同样地，作为三者的复合物的成花素激活复合物，也可以通过使三种蛋白质或者上述两者的复合物中的任一种与剩余的蛋白质以分离提纯后的状态接触、或者在细胞等的生物体内接触来制备。
(成花素激活复合物或者成花素的晶体的制备方法)
首先，制备蛋白质溶液。使蛋白质存在于由缓冲液、盐、还原剂等制成的溶液中。缓冲液、盐、还原剂只要是对蛋白质的立体结构没有影响的物质，便可以是任何物质，例如，缓冲液可以例举出1mM～500mM的Na-HEPES、磷酸钠、磷酸钾、T ris-HCl等，盐可以例举出1mM～1M的氯化钠、氯化锂、氯化镁等，还原剂可以例举出0.1mM～10mM的β-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)等。另外，蛋白质溶液中还可以含有二甲亚砜(DMSO)或者乙二醇。含蛋白质的溶液的pH为4～11，优选pH为6～9。该蛋白质溶液或成花素溶液既可以直接使用于晶化中，也可以根据需要进一步添加防腐剂或者稳定剂、表面活性剂等之后使用于晶化中。
作为将蛋白质(多肽)晶化的方法，可以使用蒸汽扩散法、分批法(batch method)、透析法等通常的蛋白质晶化方法。另外，在蛋白质的晶化中，蛋白质的浓度、盐浓度、pH、沉淀剂的种类、温度等的物理和化学因素的确定很重要。
所谓的“蒸汽扩散法”，是将含有沉淀剂的蛋白质溶液的液滴放置于装有含更高浓度的沉淀剂的缓冲液(外液)的容器中并密封后静置的方法。根据液滴的放置方式，有悬滴法(hanging drop method)和坐滴法(sitting drop method)，本发明中可以采用任一种方法。悬滴法是将蛋白质溶液的小液滴配置于盖玻片上，并且，使盖玻片在储液器内倒置并将储液器密封的方法。另一方面，坐滴法是在储液器内部设置适宜的液滴座，将蛋白质溶液的小液滴配置在液滴座上，并利用盖玻片等将储液器密封的方法。在任一方法中，均在储液器中的溶液(储液器溶液)中含有沉淀剂。也可以在蛋白质的小液滴中适当地含有少量的沉淀剂。
蒸汽扩散法中使用的储液器溶液(也称为“沉淀剂溶液”)是由缓冲液、沉淀剂、盐等制成的溶液。缓冲液、沉淀剂、盐只要是能够有効地制备晶体的物质，便可以是任何物质，例如，缓冲液可以从pH4～10、5mM～200mM的Na-HEPES、磷酸钠、磷酸钾、Tris-HCl、乙酸钠、柠檬酸、卡可基酸(cacodylic acid)等中进行选择，沉淀剂可以从分子量为550～20000且容量百分比为5～35的聚乙二醇(PEG)、0.2M～2M 的硫酸铵、容量百分比为5～35的MPD(甲基戊二醇)、0.2M～2M的酒石酸铵或容量百分比为5～35的异丙醇、或者这些物质的组合中进行选择，盐可以从0.2M～4M的氯化钠、氯化锂、氯化镁等中进行选择。储液器溶液的成分并不限于上述情况。
本发明的成花素激活复合物的晶体可以如下那样进行制备。将成花素和14-3-3蛋白加以混合，并透析至含有10mM～50mM NaCl的1mM～50mM Tris-HCl缓冲液(p H为6.5～8.5)中，由此来调制复合物试样。将蛋白质溶液(蛋白质浓度为5mg/mL～40mg/mL)和沉淀剂溶液(0.05M～0.1M HEPES(pH为6.5～8.5)、0.01M～0.4M硫酸铵、容量百分比为15～30的PEG(分子量为2000～4000))进行混合，并使用坐滴法在4℃～20℃的条件下进行成花素和14-3-3蛋白的复合物的晶化。在约1～3周后得到成花素和14-3-3蛋白的复合物的单晶体。将得到的单晶体进行回收，并在含有容量百分比为15～30的乙二醇、1mM～5mM的bZIP转录因子的沉淀剂溶液(0.05M～0.1M HEPES(pH为6.5～8.5)、0.01M～0.4M(优选为0.15M～0.25M)硫酸铵、容量百分比为15～30(优选为23～27)的PEG(分子量为2000～4000))中培养10～20分钟，由此能够得到适于X射线晶体结构分析的成花素激活复合物的晶体。
本发明的成花素激活复合物的晶体优选可以如下那样进行制备。将成花素和14-3-3蛋白以摩尔比1：1～2(更优选为1：1.5)进行混合，并透析至含有20mM NaCl的10mM Tris-HCl缓冲液(pH为7.5)中，由此来调制复合物试样。将1μl蛋白质溶液(蛋白质浓度为10mg/mL)和1μl沉淀剂溶液(0.1M HEPES(pH为7.5)、0.2M硫酸铵、容量百分比为25的PEG3350)进行混合，并使用坐滴法在4℃的条件下进行成花素和14-3-3蛋白的复合物的晶化。在约1～3周后得到成花素和14-3-3蛋白的复合物的单晶体。将得到的单晶体进行回收，并在含有25％乙二醇、2mM bZIP转录因子的沉淀剂溶液((0.1M HEPES(pH为7.5)、0.2M硫酸铵、容量百分比为25的PEG3350)中培养10～20分钟(更优选为15分钟)，由此能够得到成花素激活复合物的晶体。
本发明中的成花素的晶体可以如下那样进行制备。将提纯后的成花素透析至含有10mM～50mM NaCl的1mM～50mM Tris缓冲液(pH为5.5～7.5)中，并浓缩至浓度成为5mg/mL～40mg/mL。将得到的蛋白质溶液和沉淀剂溶液(0.01M～0.5M(优选为0.05M～0.15M)卡可基酸(pH为5.5～7.5)、0.01M～0.5M(优选为0.15M～0.25M)酒石酸铵、容量百分比为10～50(优选为25～35)的PEG(分子量为5000～12000))进行混合，并使用坐滴法在4℃～20℃的条件下进行，由此能够在约0.5天～3天(优选为约1天)后得到适于X射线晶体结构分析的成花素激活复合物的晶体。
本发明中的成花素的晶体优选可以如下那样进行制备。将提纯后的成花素透析至含有20mM NaCl的10mM Tris缓冲液(pH为7.5)中，并浓缩至浓度成为5mg/ml。将得到的1μl蛋白质溶液和1μl沉淀剂溶液(0.1M卡可基酸(pH为6.5)、0.2M酒石酸铵、容量百分比为30的PEG8000)进行混合，并使用坐滴法在4℃的条件下进行，由此能够在约0.5天～3天(优选为约1天)后得到适于X射线晶体结构分析的成花素激活复合物的晶体。
在本发明中，优选得到具有如下那样的品质的晶体，即，在供于X射线晶体结构分析时仅赋予至少以下的分辨率、优选为以下的分辨率、更优选为 以下的分辨率、进而更优选为以下的分辨率、尤其优选为以下的分辨率的品质(《Introduction to Protein Structure蛋白质的结构入门》Carl Brandon＆Joh nTooze，胜部幸辉等翻译，教育社，1992年，276-277页)。
(成花素激活复合物或成花素的晶体)
本发明的成花素激活复合物或成花素的晶体实质上不含杂质，并且即使再次溶解时也具有活性。作为杂质，可以举出GST、成花素或成花素激活复合物的分解产物、大肠杆菌固有的蛋白质等。
本发明的成花素激活复合物的晶体的空间群为P1、P6522或者P4，晶格常数为 α＝66°～90°、β＝85°～90°、γ＝75°～120°。根据本发明得到的晶体的分辨率为约～约是足以实施X射线晶体结构分析的品质和大小。
本发明的成花素激活复合物的晶体优选为从以下选择的晶体：
(1)晶体的空间群为P1，晶格常数为 α＝66°～70°、β＝85°～90°、γ＝75°～79°的晶体； 
(2)晶体的空间群为P6522，晶格常数为 α＝90°、β＝90°、γ＝120°的晶体； 
(3)晶体的空间群为P4，晶格常数为 α＝90°、β＝90°、γ＝90°的晶体。
本发明的成花素激活复合物的晶体更优选为从以下选择的晶体：
〔成花素激活复合物1〕晶体的空间群为P1，晶格常数为 α＝68.2°、β＝87.9°、γ＝77.9°且分辨率为的晶体；
〔成花素激活复合物2〕晶体的空间群为P1，晶格常数为 α＝68.1°、β＝87.8°、γ＝77.9°且分辨率为的晶体；
〔成花素激活复合物3〕晶体的空间群为P1，晶格常数为 α＝68.2°、β＝88.6°、γ＝77.8°且分辨率为的晶体；
〔成花素激活复合物4〕晶体的空间群为P6522，晶格常数为 α＝90°、β＝90°、γ＝120°且分辨率为的晶体；
〔成花素激活复合物5〕晶体的空间群为P4，晶格常数为 α＝90°、β＝90°、γ＝90°且分辨率为的晶体。
本发明的成花素的晶体的空间群为P63，晶格常数为 α＝90°、β＝90°、γ＝120°。根据本发明得到的晶体的分辨率为约 ～约(优选为)，是足以实施X射线晶体结构分析的品质和大小。
本发明的成花素的晶体优选为从以下选择的晶体：
〔成花素1〕晶体的空间群为P63，晶格常数为α＝90°、β＝90°、γ＝120°且分辨率为的晶体；
〔成花素2〕晶体的空间群为P6522，晶格常数为 α＝90°、β＝90°、γ＝120°且分辨率为的晶体；
上述成花素的晶体的分辨率优良，并且，对上述晶体进行X射线结构分析而得 到的立体结构信息适合使用于基于计算机的对接仿真(docking simulation)等。
(X射线晶体结构分析)
作为明确蛋白质(多肽)的立体结构的方法而最普遍进行的是X射线晶体结构分析。其是将蛋白质晶化，对其晶体照射单色化后的X射线，从而根据得到的X射线的衍射像来明确蛋白质中的立体结构信息。立体结构信息中包括电子密度图和原子坐标，原子坐标可以通过该技术领域公知的方法进行分析而得到(D.E.McRee，Practi cal Protein Crystallography，Academic Press，San Diego(1993))。
X射线晶体结构分析包括：对晶体照射X射线而得到衍射数据的工序、通过得到的衍射数据的分析而得到蛋白质(多肽)的电子密度的工序、以及通过得到的电子密度的分析而得到蛋白质(多肽)的原子坐标的工序。
X射线晶体结构分析是使用实验室的X射线衍射仪或大型放射光设施(ESRF，A PS，SPring-8，PF，ALS，CHESS，SRS，LLNL，SSRL，Brookhaven等)，通过振动照相法等并利用成像板或CCD照相机等的二维检测器而进行衍射数据的收集，并根据该数据得到电子密度，由此能够弄清楚原子坐标。
由于蛋白质的晶体因X射线照射而受到损伤从而衍射能力变差的情况较多，因此，优选利用低温测定来进行高分辨率的X射线衍射。所谓的“低温测定”，是将晶体急剧冷却冻结至-173℃左右并在该状态下收集衍射数据的方法。一般而言，在蛋白质晶体的冻结中，出于防止因为冻结而导致晶体损坏的目的，想出了利用含有甘油等保护剂(防冻剂)的溶液进行处理等的方法。冻结晶体可以通过将浸泡在例如添加了保护剂的保存液中的晶体直接浸渍于液态氮中而使之瞬间冻结来制备。
通过利用数据处理软件对根据X射线衍射实验收集的衍射图像进行处理，能够算出由各个衍射斑点的指数和积分得到的衍射强度。通过使用这些衍射斑点的衍射强度和相位信息进行傅里叶逆变换而导出三维空间的电子密度。在衍射实验中，由于在原理上是无法测量电子密度的计算所需的各衍射斑点的相位信息，因此，为了得到电子密度，而利用分子置换法、重原子同晶置换法、多波长反常散射法(MAD法)或它们的改进方法来推定作为失去的信息的相位。
由这样得到的电子密度绘出电子密度图，根据该电子密度图并使用在图形工作站上运行的软件来构建三维模型。在构建了该模型之后，利用最小二乘法等进行结构的精密化，由此得到最终的蛋白质的原子坐标(立体结构坐标)。
(成花素激活复合物或成花素的立体结构信息)
原子坐标是指将上述蛋白质的原子的位置以三维坐标的形式进行表示的数学坐标。原子坐标实质上是指根据构成化学结构的分子(原子)间的各距离而确定的空间配置。在将空间配置在计算机上作为信息进行处理时，将相对的配置作为某一坐标系中的特定坐标而数字信息化(称为“坐标化”)。这是在进行计算机处理时为了方便所必需的处理，原子坐标的本质如之前所示为根据各分子(原子)间相互的距离而确定的配置，应当理解为并非计算机处理时暂时被特定的坐标值。另外，在本说明书中，所谓的“原子坐标”是指关于构成物质(蛋白质、氨基酸等)的各个原子的坐标。
在本说明书中，将成花素激活复合物1的原子坐标表示于表1中，将成花素1 的原子坐标表示于表2中。表1和2的数据依据蛋白质数据银行(PDB)的格式(http：//www.wwpdb.org/documentation/format23/v2.3.html)进行记载。另外，在本发明中，对于与本发明的多肽具有40％以上的同源性的蛋白质，也可以使用由上述电子密度或原子坐标所表示的立体结构信息，而以衍生物的形式得到在计算机上通过同源建模(homology modeling)等得到的原子坐标。
(调节植物的成花的物质的筛选方法)
通过选择在由成花素、14-3-3蛋白以及bZIP转录因子构成的成花素激活复合物中能够对各蛋白质的结合产生影响的物质(包括化合物)、具有能够竞争性地与结合部位结合的结构的物质(包括化合物)，能够从大量物质中得到能够调节成花的物质。
作为本发明的筛选方法的一个形态，可以举出使用计算机设计和/或选择具有调节成花素激活复合物的活性的功能的候选物质，由此筛选出调节植物的成花的物质的方法(以下，也简称为“使用计算机的筛选方法”)。该筛选方法包括以下的工序：
(a)将从本发明的成花素激活复合物或成花素的晶体中得到的立体结构信息存储在存储手段中的工序，
(b)根据立体结构信息并利用导出手段而将三维立体结构模型导出的工序，
(c)在导出的三维立体结构模型中，利用计算手段计算出原子间距离的工序，
(d)根据计算出的原子间距离，并利用计算手段而计算出能够增强和/或阻碍成花索与14-3-3蛋白的结合、和/或14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合的候选物质的立体结构信息，由此设计和/或选择候选物质的工序。
作为上述成花素激活复合物等的立体结构信息，可以使用各蛋白质的结合部位的原子坐标，可以利用各蛋白质的原子坐标的整体、包含结合部位在内的其派生物、以及它们的一部分。另外，在本发明中，也可以利用将结合部位的原子坐标在计算机上适宜地进行了改变后的信息，以便适于筛选。
在工序(a)和工序(b)中，通过将成花素激活复合物或成花素的立体结构信息中的原子坐标输入到表达分子的原子坐标的计算机程序运行的计算机或该计算机的存储介质中，能够详细地表达出各种蛋白质的三维化学相互作用的方式。表达分子的原子坐标的计算机程序在市场上大量有售，这些程序一般具备：分子的原子坐标的输入手段；根据立体结构信息并通过导出手段而将三维立体结构模型导出，并且将该坐标视觉性地表达在计算机图像中的手段；测量或计算被表达在计算机图像中的分子内的各原子间的距离或结合角等的手段；进行该坐标的追加修正的手段等。进而，还可以使用具备根据分子的坐标来计算分子的结构能的手段、考虑到水分子等的溶剂分子后计算自由能的手段的程序。由Accelrys公司市售的计算机程序InsightII或QUANTA适合用于本发明的筛选方法，但是，能够使用于本发明中的程序并不限于上述程序。
候选物质可以是公知或新型物质中的任一种，其结构、来源、物理性能等也没有特别限制，可以为天然化合物、合成化合物、高分子化合物、低分子化合物、肽、核酸类似物的任意一种。候选物质的立体结构的坐标化只要使用公知的程序即可，例如，作为将低分子化合物的立体结构坐标化的程序，可利用CORINA(http∶//www2. chemie.uni-erlangen.de/sottware/corina/index.html)、Concord(http∶//www.tripos.com/sc iTech/inSilicoDisc/chemInfo/concord.html)、或者Converter等。
在工序(c)和(d)中，包括以下阶段：使候选物质的原子坐标与具有成花素、14-3-3蛋白、bZIP转录因子(或者，它们之中二者的复合物或成花素激活复合物)的结合部位的原子坐标在同一坐标系上重合，从而对两者的一致状态进行评价的阶段、或者根据成花素激活复合物等的原子坐标计算出原子间距离，并根据原子间距离来设计候选物质的阶段。这些阶段能够使用上述那样的市售软件包和能够运行该软件的计算机系统进行实施。
该计算机系统适宜地包括例如：保存化合物等物质的结构式的存储手段、将化合物等物质的立体结构坐标化的手段、保存化合物等物质的原子坐标的存储手段；保存工序(a)中所使用的各蛋白质的原子坐标的存储手段、保存评价结果的存储手段；显示各存储手段中的内容的手段；键盘等的输入手段、显示器等的显示手段、以及中央处理器等的运作目标软件所需的各种手段。
作为分析用软件，只要是能够在计算机上进行使候选物质与蛋白质对接(docki ng)的操作的软件，便可以使用任何软件，例如也可以使用DOCK、FlexX(Tripos公司)、LigandFit(Accelrys公司)、Ludi(Accelrys公司)等。此外，还可使用InsightII等的分子显示软件以对话的方式进行。此时，作为使用这些程序评价一致状态时的指标，可以任意选择使用复合物整体的自由能计算值、经验打分函数、形状的互补性的评价等。通过该指标，能够客观地评价结合的良好与否。
使用了成花素和成花素激活复合物等各种蛋白质的原子坐标的成花调节物质的设计或选择，能够在计算机上迅速地进行筛选。另外，对于通过利用计算机的筛选而选择的候选物质群而言，优选进行实验性评价。
在上述使用计算机筛选调节植物的成花的物质的方法中，为了实验性评价上述候选物质的调节成花素激活复合物的作用的功能，候选物质优选合成或获得。候选物质只要使用公知的方法合成、或通过提纯等从生物体获得即可。
进而，通过将得到的候选物质供给于使用成花素等各种蛋白质的生物化学方法或生物学方法等而进行实验性评价，从而能够选择具有更有效地调节成花素激活复合物的作用的功能的物质，进一步能够选择调节成花的物质。
作为本发明的筛选方法的其他形态，可以举出通过生物化学方法或生物学方法来选择具有调节成花素激活复合物的作用的功能的物质(即，具有能够调节成花的功能的物质)的方法本身(以下，也仅称为“基于生物化学方法等的筛选方法”)。候选物质是否显示成花素激活复合物作用的调节功能，只要调查在向能够确认成花素激活复合物作用的调节功能的系统中添加和未添加该候选物质时，成花素激活复合物的作用是否具有差别、例如形成的成花素激活复合物的量是否有差别即可。所谓的“能够确认调节成花素激活复合物的作用的功能的系统”，例如是基于使成花素、14-3-3蛋白和/或bZIP转录因子接触的工序的系统，进一步可具体举出以下的工序：
(1)使候选物质与成花素或14-3-3蛋白中的任一种接触，之后使候选物质与14-3-3蛋白或成花素接触的工序；或者
(2)使候选物质与结合有或未结合有成花素的14-3-3蛋白或者bZIP转录因子中的任一种接触，之后使候选物质与bZIP转录因子或者结合有或未结合有成花素的14-3-3蛋白接触的工序。
所谓的“调节成花素激活复合物的作用的功能”，优选为增大和/或抑制成花素激活复合物的形成的功能。一般认为通过增大和/或抑制成花素激活复合物的形成，能够调节植物的成花，即能够加快和/或延迟成花。
上述使成花素、14-3-3蛋白和/或bZIP转录因子接触的工序能够通过在候选物质的存在下或不存在下进行酵母双杂交法、双分子荧光互补法等确认相互作用而进行，从而能够评价成花素激活复合物作用的调节功能。或者，成花素激活复合物作用的调节功能的评价能够通过下述那样而进行，即，将成花素或bZIP转录因子固定在平板上，并添加经荧光标记后的14-3-3蛋白和候选物质，从而测量平板的荧光强度。此外，在成花素激活复合物作用的调节功能的评价中，还可使用等温滴定量热仪(ITC)、表面等离子共振(SPR)等。
在具有成花素激活复合物作用的调节功能的物质(进而为调节成花的物质)的选择方法中，优选以成花素与14-3-3蛋白的结合部位、和/或14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合部位上的结合作为指标。所谓的“将这些结合部位上的结合作为指标”，是指对成花素激活复合物中的结合部位的结合状态进行确认。与候选物质的不存在下的情况相比，在候选物质的存在下的情况中，当结合被阻碍时能够将该候选物质作为具有抑制成花素激活复合物的形成的功能的物质来选择，当结合被促进时能够将该候选物质作为具有增大成花素激活复合物的形成的功能的物质来选择。
复合物中的结合部位上的结合状态的确认，能够通过NMR(核磁共振)法、荧光标记法等进行。
在NMR法中，例如在候选物质的存在下使稳定同位素标记后的成花素与未标记的14-3-3蛋白和bZIP转录因子结合的情况下，与候选物质不存在下的情况相比较，当成花素的NMR波谱在结合部位发生特异性变化时，能够确认候选物质对结合部位上的结合产生了影响。在成花素的NMR信号的全部残基的归属(例如成花素为Hd3a时，鉴别各NMR峰值源自Hd3a的哪个氨基酸)被确认的情况下，能够特定出结合了候选物质的氨基酸。
在荧光标记法中，只要使用例如使结合部位附近的氨基酸变异为半胱氨酸残基，并使其与半胱氨酸特异性作用的荧光试剂反应从而导入了荧光标记的物质即可。由于一般认为当结合状态发生变化时导入的荧光的强度也会发生变化，因此，能够根据候选物质的有无来确认该结合部位的结合状态。
NMR法可以通过将成花素、14-3-3蛋白以及bZIP转录因子溶解在溶液中并测量NMR波谱而进行。作为溶解成花素等的溶液，只要是能够测量NMR波谱的溶液，便可以是任何溶液，可使用含有DTT(二硫苏糖醇)、KCl(氯化钾)、NaCl(氯化钠)、重水的缓冲液等。作为NMR测量法，优选使用同核多维NMR测量或者异核多维NMR测量等。例如，可以利用被称为1H-15NHSQC的NMR测量法进行。该测量是本领域普通技术人员已知的技术。1H-15NHSQC是蛋白质的肽键中的氢原子和氮原子 的相关波谱，即1H-15N相关波谱，能够从源于主链的1H-15N信号得到各个残基的信息。通过该NMR测量方法，能够分析蛋白质等的目标高分子物质的立体结构，从而能够分析蛋白质的相互作用。
在本发明的筛选方法中，也可以将使用计算机的筛选方法和基于生物化学方法等的筛选方法加以组合进行使用。
进而，候选物质的调节植物的成花的功能、即加快和/或延迟成花的功能的评价，能够通过将候选物质施与植物体(例如从根部吸收候选物质、导入编码候选物质的基因等而制备转化体)来进行调查。
(调节植物的成花的方法)
本发明还涉及调节植物的成花的方法。所谓的“调节成花”，是指加快和/或延迟成花。更详细而言，本发明涉及通过对下述1)和/或2)所示的任一个或多个结合部位施加影响、即调节该结合部位上的结合，而促进(增大)和/或抑制成花素激活复合物的形成，由此调节植物的成花的方法。
1)成花素与14-3-3蛋白的结合部位是相当于序列编号1中的D62、M63、R64、P96、T98、F103及R132的成花素的部位和相当于序列编号2中的F200、D201、1204、E212、Y215、R226及D227的14-3-3蛋白的部位。
2)14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合部位是相当于序列编号2中的K51、R58、F121、R131、L224及D227的14-3-3蛋白的部位和相当于序列编号3中的R189～F195的bZIP转录因子的部位。
促进(增大)和/或抑制成花素激活复合物的形成的情况，例如可以例举出使成花素与14-3-3蛋白的结合部位和/或14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合部位发生变异的情况、或者将能够促进和/或抑制成花素与14-3-3蛋白的结合和/或14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合的物质施与植物体的情况等。
作为能够促进成花素与14-3-3蛋白的结合和/或14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合的物质，可以举出编码成花素、14-3-3蛋白或bZIP转录因子的基因本身。作为编码成花素、14-3-3蛋白或bZIP转录因子的基因，例如可以例举出编码水稻Hd3a(序列编号11)、水稻GF14b(序列编号14)、水稻GF14c(序列编号12)、水稻FD1(序列编号13)的基因。编码成花素、14-3-3蛋白或bZIP转录因子的基因也可以是对相当于序列编号1中的D62等的部位、相当于序列编号2中的F200等的部位、相当于序列编号R189～F195的部位中的1个以上的结合部位发生了变异的蛋白质(变异型蛋白质)进行编码的基因。编码变异型蛋白质的基因可以通过使用本领域普通技术人员周知的定点突变法等的基因工程方法导入变异而制备。例如，可以通过组合PCR反应(聚合酶链式反应)、限制酶反应、连接反应等来制备编码变异型蛋白质的基因，具体而言，可以使用QuikChangeTM定点突变试剂盒(site-directed mutagenesis kit)(STRATAGENE公司)等的试剂盒。通过使上述基因在植物体内、优选为所期望的植物组织的细胞内、更优选为细胞器内(过量地)表达，能够促进成花素与14-3-3蛋白的结合和/或14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合，从而能够促进(加快)成花。
使基因(过量地)表达的方法没有特别限定，但是，一般采用通过基因工程方法将 分离后的基因以能够表达的状态导入到植物细胞内等的公知方法。公知方法可以例举出将含有所希望的基因的重组载体(recombinant vector)导入到宿主中的方法。具体而言，可以举出原生质体共培养法或者叶盘法等利用土壤杆菌属细菌的感染的方法，聚乙二醇法，电穿孔法，显微注射法，基因枪法，脂质体法，使用适宜的载体系统的导入法等，只要根据宿主细胞的种类而选择最适的方法即可。另外，作为上述载体，可以举出质粒、噬菌体、粘粒等，但是，上述载体并没有特别限定，只要根据宿主细胞的种类适宜地选择即可。另外，作为宿主细胞，可以使用广泛种类的植物，也可以是原生质体、细胞、愈伤组织、器官叶、种子、胚芽、花粉、卵细胞、接合子等能够增殖的植物材料，花、果实、叶、根、插枝等植物体的一部分等。
“促进成花”是指缩短营养生长时间而加快花的形成，一般认为通过促进成花能够使农作物和园艺作物的收获时期改变(一般是提前)，从而能够谋求育种的効率化或农作物和园艺作物的收量增加。另外，由于可以推测花或种子的形成能力正常，因此，能够迅速地生产植物的种子。
另外，作为能够抑制成花素与14-3-3蛋白的结合和/或14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合的物质，可以举出例如具有结合能的成花素、14-3-3蛋白、bZIP转录因子的多肽片段、或者成花素等的工程蛋白质(engineered protein)且阻碍正常蛋白质的功能的工程蛋白质。通过将表达上述蛋白质的基因导入到植物体中，能够阻碍成花索激活复合物的形成，从而能够调节成花。此处所谓的“工程”，是指使上述蛋白质所具有的特征性氨基酸序列区域的任意区域完全缺失的情况、和相对于上述序列区域的特定部位而缺失、取代和/或插入1个～数个氨基酸残基的情况。工程蛋白质中包括变异型蛋白质。
改变编码各蛋白质的基因的方法只要通过现有公知的方法进行即可，并没有特别限定。即，只要通过如上所述那样利用PCR法向碱基序列导入变异、或者使用公知的定点突变法(Kunkel et al.：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.82.p488-(1985))、市售的试剂盒(例如Quikchange定点突变试剂盒：STRATAGENE公司)等进行即可。
工程蛋白质(包括多肽)相对于从野生型基因中得到的蛋白质起显性作用，抑制目标基因的转录从而阻碍目标基因的表达。因此，当使用改造型基因时，能够阻碍野生型基因所具有的本来的功能而使其功能缺损，从而能够生产将成花抑制了的转化体。因此，能够减少生产将成花抑制了的转化体所需的工夫。
工程蛋白质的导入方法能够通过表达上述基因的方法而进行。
另外，使植物体的内在性蛋白的结合部位变异或者将蛋白质剔除(knockout)，可以通过利用公知的反义法、基因打靶法、基因破坏型标记法等的方法等进行(Kem pin et al.Nature389：802-803.1997)。
反义法是下述那样的方法，即，构建含有适当的启动子和配置于其下游的反向的目标基因(反义DNA)的载体，并将该载体导入到植物中，由此来抑制目标基因的表达的方法。基因打靶法是通过同源重组而在目标基因的一部分中插入其他的DNA从而将目标基因剔除的方法。基于基因破坏型标记法的本发明的方法，是将T-DNA或转座子(transposon)任意地插入基因组中，并利用PCR筛选目标基因破坏株的方 法。
“抑制成花”是指延长营养生长期从而延迟花的形成，一般认为通过这样，与野生型的植物体相比植物体变大(Development135，767-774(2008)doi：10.1242/dev.008631、Fig3E)。即，通过抑制成花，能够提供每个个体的生物量增产了的植物体。所谓的“生物量增产”，是指与野生型相比每个个体的总重量变大，也包括植物体的一部分组织特异性地变大，而其他的组织与野生型同等的情况。植物生物量由于是使用太阳能而将大气中的二氧化碳固定而生成，因此，能够作为所谓的碳中和能量进行掌握。增加植物的生物量具有保护地球环境、防止地球变暖、降低温室效应气体排出的效果。另外，对于除了有关花芽形成的器官(花或种子)以外的其他部分被作为粮食等使用的植物而言，通过抑制成花，能够使植物体变大，从而能够谋求增加每个个体的农作物和园艺作物的收量。
(转化体)
本发明还涉及导入了所希望的基因的转化体、或者所希望的基因被破坏了的转化体。本发明的转化体包括在上述调节植物的成花的方法中得到的物质。所谓的“转化体”不仅包括植物个体还包括细胞、组织、器官、原生质体。另外，成为转化对象的生物也没有特别限定，可以举出各种微生物(包括大肠杆菌等)或植物。另外，在选择启动子或载体时，也可以将动物、昆虫作为转化的对象。另外，此处所说的转化体中还包括导入了本发明所涉及的基因的植物、或者与其具有相同性质的该植物的后代或它们的组织。上述转化体可以使用在上述调节植物的成花的方法的项目中说明的方法进行制备(生产)。
实施例
以下，为了加深对本发明的理解，根据实施例和实验例具体地进行说明，当然，这些实施例和实验例并非对本发明的范围进行限定。另外，在以下的实施例中使用的Hd3a、GF14、FD1全部为源自水稻的蛋白质。在表示各蛋白质时，存在记载为“Os”的情况和不记载为“Os”的情况，但是，在以下的实施例中所使用的蛋白质均源自水稻。
首先，实施例中所使用的质粒的制备方法如下所示。
通过RT-PCR将Hd3a(Os06g0157700)、OsGF14(OsGF14a：Os08g0480800、OsG F14b：Os04g0462500、OsGF14c：Os08g0430500、OsGF14d：Os11g0546900、OsGF14e：Os02g0580300、OsGF14f：Os03g0710800、OsGF14g：Os01g0209200、OsGF14h：Os11g0609600)、OsFD1(Os09g0540800)的全长cDNA进行克隆(cloning)。利用通常方法将编码区域PCR扩增，并导入至pENTR/D-TOPO克隆载体(Invitrogen)，由此得到了入门克隆(entry clone)。
向OsGF14、OsFD1、Hd3a的氨基酸的取代或缺失的导入，利用KOD FX DNA polymerase(TOYOBO)并通过PCR而进行。将PCR扩增片段导入pENTR/D-TOPO克隆载体，从而得到了入门克隆。
将源白玉米的泛素启动子(ubiquitin promoter)、NOS终止区(Miki and Shima  moto，Plant Cell Physiol.45，490(2004).)、以及T7标签区或HA标签区与attR重组区(Nakagawa et al.2007)一起插入至pGreen II载体(Hellens et al.Plant Mol.Biol.42，819(2000).)中，由此制备了pGII pUbq GW-T7和pGII pUbq HA-GW。
根据文献记载制备了pUbq：Hd3a-mCherry表达载体(非专利文献2)、pHd3a：H d3a-GFP以及prolC：Hd3a-GFP双元载体(Tamaki et al.，Science316，1033(2007))。按照Tamaki et al.，Science316，1033(2007)2007且使用变异型Hd3a cDNA而制备了prolC：Hd3a(R64G)-GFP双元载体和prolC：Hd3a(R64G/R132A)-GFP双元载体。为了制备其他的载体，通过基于Gateway BP clonase II(Invitrogen)的Gateway重组法，将pENTR D-TOPO载体中的变异型Hd3a基因、变异型OsGF14基因、变异型OsFD1基因转化成各种载体。
这些载体在酵母双杂交实验(yeast two-hybrid assay)(实施例8、9)中有时被包含在pBTM116-GW和pVP16-GW中，另外，在瞬时表达实验(transient expression assay)(实施例11、12)中有时被包含在pGII pUbq GW-T7、pGII pUbq HA-GW、p35S-GFP-GW、p35S-mCerulean-GW、p35S-Vn-GW、p35S-Vc-GW、p35S-GW-Vn、p35S-GW-Vc以及pUbq-GW中，在转基因植物(实施例10、13-1、13-2)的制备中有时被包含在p2K-GW双元载体和pANDA RNAi载体(Miki and Shimamoto2004)中。通过PCR而使SV40NLS与GF14b以及GF14e融合。
(实施例1)三种蛋白质的相互作用的确认
(1)通过体外GST pull-down实验对三种蛋白质的相互作用进行了确认。
对插入了编码序列编号1所示的全长Hd3a(1～179残基)的cDNA、编码序列编号2所示的全长GF14c(1～256残基)的cDNA的质粒进行限制酶处理，使限制酶处理后的片段与编码GST的多核苷酸融合并导入到载体中。将该载体导入到大肠杆菌中，在大肠杆菌内表达了GST融合GF14c蛋白质或者GST融合Hd3a蛋白质。在对大肠杆菌进行了培养之后，对大肠杆菌进行离心并回收，从溶解溶液中将GST融合GF14c蛋白质或者GST融合Hd3a蛋白质分离提纯。
将分离提纯后的GST融合GF14c蛋白质或者GST融合Hd3a蛋白质各10nmol与10μl的谷胱甘肽-琼脂糖凝胶(Glutathione Sepharose)4B树脂(GE Healthcare)进行培养，从而使各多肽与树脂结合。之后，用含有50mM KCl、1mM DTT的磷酸缓冲液(pH为6.8)对树脂进行清洗，将未与树脂结合的游离的GST融合蛋白质除去。作为阴性对照(negative control)而使用了使分离提纯后的GST蛋白质与树脂结合后的物质。向结合了GST-GF14c蛋白质、GST-Hd3a蛋白质或者GST蛋白质的3种树脂中加入1nmol的分离提纯后的各蛋白质(OsFD1为序列编号3的第147～195位的区域且被导入了S192E的变异的蛋白质，Hd3a为全长且未融合任何GST)，并在室温下培养了15分钟。之后，用含有50mM KCl、1mM DTT的磷酸缓冲液(pH为6.8)对树脂进行清洗，将未与树脂结合的游离的GST-GF14c多肽除去。利用含有50m M谷胱甘肽、50mM KCl、1mM DTT的磷酸缓冲液(pH为6.8)对结合后的各蛋白质进行洗脱，并通过SDS聚丙烯酰胺电泳进行了确认。
结果如图2所示。由于在Hd3a与OsFD1(FD1)之间未发现相互作用，而在Hd3a 与GF14c之间和GF14c与OsFD1之间发现了相互作用，因此，认为Hd3a与OsFD1通过GF14c结合。
(2)关于Hd3a与GF14c的相互作用，使用NMR进行了确认。利用含有100mM KCl、1mM DTT、7％重水的50mM磷酸缓冲液(pH为6.8)将15N稳定同位素标记后的Hd3a蛋白质调制成最终浓度为0.2mM。之后，对于仅调制好的Hd3a蛋白质溶液、和在Hd3a蛋白质溶液中以摩尔比1：0.5加入了未进行稳定同位素标记的GF14c蛋白质的混合溶液的各溶液，对15N-HSQC NMR波谱进行了测量，并对波谱进行了比较。NMR测量在温度30℃下进行，并且使用Bruker公司制AV500NMR装置进行。
结果如图3所示。由于因GF14c的结合而Hd3a的NMR波谱发生变化，因此，可以确认Hd3a与GF14c发生结合。另外，由于局部地观察到NMR信号的移动(图3中的放大图，Hd3a R64、M63等)，因此，确认到部位特异性的结合。
(实施例2)成花素激活复合物的晶体的制备
对插入了编码序列编号1所示全长Hd3a(1～179残基)中的6～170残基的cDNA、编码序列编号2所示全长GF14c(1～256残基)中的1～235残基的cDNA的质粒进行限制酶处理，使限制酶处理后的片段与编码GST的多核苷酸融合并导入到载体中，并且将该载体导入到大肠杆菌中。在大肠杆菌中表达GST融合后的Hd3a蛋白质、GS T融合后的GF14c蛋白质。在对大肠杆菌进行了培养之后，对大肠杆菌进行离心并回收，并从溶解溶液中提纯蛋白质。之后，利用SDS-聚丙烯酰胺电泳法(SDS-PAGE)进行了分析，结果得知蛋白质的纯度为95％以上。对于编码序列编号3中所示的全长OsFD1(1～195残基)中的187～195残基的多肽，通过进行化学合成而进行了调制。
将得到的Hd3a、GF14c以摩尔比1：1.5进行混合，并将其透析至含有20mM NaCl的10mM Tris-HCl缓冲液(pH为7.5)中，由此制备了复合物试样。复合物的晶化是将1μl蛋白质溶液(蛋白质浓度为10mg/mL)和1μl沉淀剂溶液(0.1M HEPES(pH为7.5)、0.2M硫酸铵、25％PEG3350)加以混合，并使用坐滴法在4℃下进行。在约2周后得到0.1mm×0.1mm的单晶体。将得到的Hd3a-GF14c复合物晶体进行回收，并利用含有25％乙二醇、2mM OsFD1多肽的上述沉淀剂溶液培养15分钟，由此制备了Hd3a、GF14c以及OsFD1的成花素激活复合物的晶体。
得到的晶体为以下5种。
〔成花素激活复合物1〕晶体的空间群为P1，晶格常数为 α＝68.2°、β＝87.9°、γ＝77.9°，分辨率为的晶体；
〔成花素激活复合物2〕晶体的空间群为P1，晶格常数为 α＝68.1°、β3＝87.8°、γ＝77.9°，分辨率为的晶体；
〔成花素激活复合物3〕晶体的空间群为P1，晶格常数为 α＝68.2°、β＝88.6°、γ＝77.8°，分辨率为的晶体；
〔成花素激活复合物4〕晶体的空间群为P6522，晶格常数为 α＝90°、β＝90°、γ＝120°，分辨率为的晶体；
〔成花素激活复合物5〕晶体的空间群为P4，晶格常数为 α＝90°、β＝90°、γ＝90°，分辨率为的晶体。
(实施例3)关于成花素激活复合物的晶体的X射线结构分析 
对于得到的晶体，在放射光科学研究设施Photon Factor的BL5A光束线中使用CCD检测器对其X射线衍射像进行了测量。根据得到的衍射像而得到了成花素激活复合物的原子坐标。
收集X射线衍射数据，并进行了各个衍射斑点的指数标定(indexing)和衍射强度的计算。利用分子置换法从得到的衍射强度和搜索模型(search model)确定了相位角。使用这些衍射斑点的衍射强度和相位角，并通过傅里叶逆变换而导出了电子密度图。根据得到的电子密度图而构建了原子坐标。
具体而言，使用HKL2000对得到数据进行处理，并通过SCALEPACK进行了缩放。作为搜索模型，利用分子置换法而确定了成花素的晶体结构。使用CNS和REF MAC以对得到的模型进行了精密化。在各精密化之后，使用COOT并根据作为电子密度图的2Fo-Fc map对得到的模型进行了补正。
将由上述成花素激活复合物1的晶体得到的原子坐标表示在表1中。另外，将根据原子坐标构建的立体结构模型示于图1和图4中。可知GF14c特异性地识别OsFD1的被磷酸化后的S192(pS192)。
(表1)成花素激活复合物的原子坐标
(实施例4)成花素的晶体的制备
(1)表达载体的制备
对插入了编码序列编号1所示全长Hd3a(1～179残基)中的6～170残基的cDNA的质粒进行限制酶处理，使限制酶处理后的片段与编码GST的多核苷酸融合并导入到载体中，并且将该载体导入到大肠杆菌中。在大肠杆菌中表达GST融合Hd3a蛋白质。在对大肠杆菌进行了培养之后，对大肠杆菌进行离心并回收，从而从溶解溶液中提纯Hd3a蛋白质。之后，利用SDS-聚丙烯酰胺电泳法(SDS-PAGE)进行了分析，结果得知Hd3a蛋白质的纯度为95％以上。
利用含有20mM NaCl的10mM Tris缓冲液(pH为7.5)对提纯后的Hd3a蛋白质进行透析，并浓缩至浓度成为5mg/ml。晶化是1μl将蛋白质溶液和1μl沉淀剂溶液(0.1M卡可基酸(pH为6.5)、0.2M酒石酸铵、30％PEG8000)加以混合，并使用坐滴法在4 ℃下进行。在约1天后得到了0.1mm×0.1mm的单晶体。
得到的晶体为以下2种。
〔成花素1〕晶体的空间群为P63，晶格常数为α＝90°、β＝90°、γ＝120°，分辨率为的晶体。
〔成花素2〕晶体的空间群为P6522，晶格常数为 α＝90°、β＝90°、γ＝120°，分辨率为的晶体。
(实施例5)关于成花素晶体的X射线结构分析 
对于得到的结晶，在放射光科学研究设施Photon Factor的BL5A光束线中使用CCD检测器对其X射线衍射像进行了测量。根据得到的衍射像而得到了成花素的原子坐标。
收集X射线衍射数据，并进行了各个衍射斑点的指数标定和衍射强度的计算。利用分子置换法从得到的衍射强度和搜索模型确定了相位角。使用这些衍射斑点的衍射强度和相位角，并通过傅里叶逆变换而导出了电子密度图。根据得到的电子密度图构建了原子坐标。
具体而言，使用HKL2000对得到的数据进行处理，并利用SCALEPACK进行了缩放。作为搜索模型，利用分子置换法确定了成花素的晶体结构。使用CNS和REFMAC以和对得到的模型进行了精密化。在各精密化之后，使用COOT并根据作为电子密度图的2Fo-Fc map对得到的模型进行了补正。
将从上述成花素1的晶体得到的原子坐标表示于后述的表2中。
(表2)成花素的原子坐标
(实施例6)各种变异型蛋白质的结合能的确认
除了使用了变异型Hd3a和变异型GF14c以外，通过实施例1所记载的方法对相互作用进行了确认。变异型Hd3a(R55A、M63A、R64A、P96L、F103A、R132A、R168A)和变异型GF14c(F200A、1204A、E212A、Y215A、R226A)是使用Quickchange定点突变试剂盒(Stratagene公司)并根据试剂盒的说明书进行制备。需要说明的是，所谓的“R55A”是指在Hd3a中将第55位的精氨酸(R)取代为丙氨酸(A)后的变异型Hd3a蛋白质。
结果如图5所示。在变异型Hd3a中，M63A、R64A、P96L、F103A、R132A的与GF14c的结合能降低。特别是F103A的结合能显著降低(图5a)。在变异型GF14c 中，F200A、1204A、E212A、Y215A的与Hd3a的结合能降低，特别是F200A、1204A的结合能显著降低(图5b)。
(实施例7)成花素激活复合物与C-boxDNA的凝胶迁移实验
C-boxDNA使用了源自鼠耳芥AP1启动子的序列(22碱基对：5′-CTTCACGAGACGTCGATAATCA-3′(序列编号5))。实验中所使用的C-box DNA通过化学合成进行制备。成花素激活复合物的调制中使用了含有0.2mM EDTA(乙二胺四乙酸)、1.5mM MgCl2、5％甘油的100mM Tris-borate缓冲液。成花素激活复合物(FD1-GF14-Hd3a)(有时也称为“FAC”)与C-box DNA的结合体，是通过将30pmol C-box DNA、40pmol OsFD1、40pmol GF14c以及80pmol Hd3a混合，在4℃下培养30分钟并使其反应而生成的。对于生成的结合体，通过使用10％丙烯酰胺凝胶进行电泳并进行溴化乙锭染色而进行了检测。
结果如图6所示。可知成花素激活复合物与C-boxDNA结合且在DNA上形成了稳定的复合物(泳道4)。可以认为Hd3a是在启动子上形成成花素激活复合物，并进行成花所需的基因的转录激活的物质。
(实施例8)成花素与14-3-3蛋白同种型的相互作用的确认
使用酵母双杂交实验对各蛋白质的相互作用进行了确认。
首先，如下那样进行了质粒的构建。对于OsGF14a(Os08g0480800)、0sGF14b(Os04g0462500)、OsGF14c(Os08g0430500)、OsGF14d(Os11g0546900)、OsGF14e(Os02g0580300)、OsGF14f(Os03g0710800)、OsGF14g(0s01g0209200)、OsGF14h(Os11g0609600)、OsFD1(Os09g0540800)，通过RT-PCR对全长的cDNA进行了克隆。根据水稻DNA数据库中的基因信息设计了正向引物和反向引物。将编码区域全长进行PCR扩增，并导入到pENTR/D-TOPO克隆载体(Invitrogen)中，由此得到了入门克隆。
利用非专利文献2中记载的方法进行了Hd3a的相互作用因子的筛选。通过使用从野生型的叶片中提取的总RNA制备了酵母双杂交文库。在利用cDNA合成试剂盒(Stratagene)合成了cDNA之后，将cDNA插入到pVP16载体(Hollenberg et al.，1995)中，并导入到酵母L40株中。作为诱饵(bait)，将Hd3a ORF的全长克隆至pBTM116载体(Bartel et al.，1993)中。利用不含组氨酸而含有2.5mM3-氨基三唑(3-AT)的SC培养基进行了筛选。
为了相互作用实验，使用Gateway载体转化系统(Gateway vector conversion system)(Invitrogen)并按照制造商的操作指南而将pBTM116和pVP16转换成pBTM116-GW和pVP16-GW。使用在SC培养基(不含尿嘧啶、色氨酸、亮氨酸、组氨酸)中添加了组氨酸或1mM～10mM3-氨基三唑的培养基(+His或+3-AT)使酵母在30℃下生长了5天。3-AT的浓度根据诱饵与猎物(bait-prey)的组合而决定。
结果如图7所示。可知显示GF14b、c、e、f(OsGF14b、c、e、f)与Hd3a相互作用。以下的实施例中使用了GF14b。
(实施例9)有助于三种蛋白质的相互作用的部位的确认
通过如下那样构建质粒而制备了各种变异型蛋白质。向OsGF14、OsFD1、Hd3a 的氨基酸的取代或缺失的导入通过PCR并利用KOD FX DNA聚合酶(TOYOBO)来进行。将PCR扩增片段克隆到pENTR/D-TOPO克隆载体(Invitrogen)中，由此得到了入门克隆。在得到的入门克隆中表达的变异型蛋白质，对于OsFD1而言为S192A、S192E，对于OsGF14b而言为R64A/R68A、1277A/L230A、F206A、1210A、E212A、E218A、Y221A、R232A、D233A，对于Hd3a而言为R64G、R64A、R64K、T68I、P96L、F103A、R132A、R132K、R64G/R132A、R64K/R132K。与实施例8同样，使用这些入门克隆对相互作用进行了确认。
需要说明的是，变异型蛋白质中使用“/”表示的变异型蛋白质为多重变异型，例如，Hd3a的“R64G/R132A”是指第64位的精氨酸(R)向甘氨酸(G)的取代和第132位的精氨酸(R)向丙氨酸(A)的取代的双重变异型Hd3a蛋白质。
结果如图8a～d所示。
可知在OsFD1与OsGF14b的相互作用中，OsFD1的第192位的丝氨酸的磷酸化很重要(图8a)。
OsGF14b的变异型蛋白质中的将F206、I210、E212、E218、Y221、R232、D233取代后的变异型蛋白质与Hd3a的结合能降低，但是，其与OsFD1的结合能未受影响(图8c)。
Hd3a的变异型蛋白质中的将R64、T68、P96、F103、R132取代后的变异型蛋白质与OsGF14b的结合能显著降低(图8d)。在Hd3a的变异型蛋白质中的P77L、R121H的情况下，其与OsGF14b的结合能未受影响，因此，这暗示这些部位对于与14-3-3蛋白的结合而言不重要。
(实施例10)水稻茎顶端的相互作用的确认
使用体内pull-down实验对水稻植物的茎顶端的相互作用进行了确认。
(1)所使用的植物材料
将水稻(Oryza sativa L subsp.Japonica)variety Norin8作为野生型进行使用。按照Tamaki et al.，Science316，1033(2007)，Okano et al.，Plant J.53，65(2008)的记载而制备了转化水稻(pHd3a∶∶Hd3a∶∶GFP、p35S∶∶GFP、prolC∶∶Hd3a∶∶GFP)。转化水稻是按照Hiei et al.Plant J.6，271(1994).的记载且通过使用土壤杆菌转导至水稻愈伤组织来进行制备，由此从被转化转导的愈伤组织制备了潮霉素抗性植物。从制备的植物中提取基因组DNA，并对潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因进行PCR扩增，由此对转基因的整合进行了确认。
需要说明的是，所谓的“pHd3a∶∶Hd3a∶∶GFP”是指导入了使Hd3a的启动子区、Hd3a的编码区全长以及GFP的编码区连结后的基因的转化水稻，以下有时也简称为“HHG”。所谓的“p35S∶∶GFP”是指导入了使CaMV35S启动子与GFP的编码区连结后的基因的转化水稻，以下有时也简称为“35S GFP”。所谓的“prolC∶∶Hd3a∶∶GFP”是指导入了使rolC的启动子区、Hd3a的编码区全长以及GFP的编码区连结后的基因的转化水稻。
(3)体内pull-down实验
在显微镜下从HHG转化水稻和35S GFP转化水稻将茎顶端部位的试样切除并回 收。在将上述试样磨碎后，将各试样的粉末分别溶解于100μl提取缓冲液(150mM NaCl、50mM Tris、0.1％吐温-20、10％甘油、1mM DTT、1mM Pefabloc SC[Roche]、1x的Complete蛋白酶抑制剂混合物[Roche]、1x的Halt磷酸酶抑制剂混合物[Pierce])中并加以混合。在离心分离后(15min、4℃、15000rcf)，将上清液转移至试管中，并通过考马斯亮蓝染色实验对蛋白质量进行了测量。对于与从HHG转化水稻和35SGFP转化水稻提取的全蛋白质量等量的物质，利用50μl anti-GFP MicroBeads(Miltenyi Biotec)，除追加以下的变更以外，按照制造商的操作指南进行了培养：回收流通(flow-through)并用于进一步的分析中。
利用200μl提取缓冲液(150mM NaCl、50mM Tris、0.1％吐温-20、10％甘油、1mM DTT、1mM PefablocSC[Roche]、1x的Complete蛋白酶抑制剂混合物[Roche]、1x的Halt磷酸酶抑制剂混合物[Pierce])将层析柱刷洗了4次。之后，利用100μl的低离子缓冲液(20mM TrisHCl、pH为7.5)清洗了1次。之后，将层析柱从磁埸(magnetic field)中除去，并利用50μl的裂解缓冲液对剩余的蛋白质进行了提取。利用12.5％的SDS-PAGE对洗脱液进行了分离，并使用一级抗体(多克隆兔抗GFP抗体(Abcam))和抗14-3-3抗体(从Dr.Yohsuke Takahashi(广岛大学，日本)获赠)进行了免疫印迹。在利用TBST清洗之后，利用辣根过氧化物酶结合抗兔IgG(GE Healthcare)将膜培养了1小时。使用增强化学发光法(ECL)蛋白凝胶印迹检测试剂(protein gel blot detection reagents)(GE Healthcare)进行了检测，并使用LAS-4000mini Imager(Fuiifilm)进行了可视化。
结果如图9所示。图9的左侧(上样)表示：从使GFP或者Hd3a-GFP融合蛋白质表达了的转化水稻(35S GFP转化水稻或HHG转化水稻)的茎顶端的细胞中提取蛋白质，并使用抗GFP抗体(α-GFP)和抗14-3-3抗体(α-14-3-3)进行了免疫印迹的结果。图9的右侧(IP-GFP)表示：对于从茎顶端的细胞提取了蛋白质的提取液，在利用抗GFP抗体(α-GFP)进行了免疫沉淀(IP)后，同样地进行了免疫印迹的结果。在使Hd3a-GFP融合蛋白质表达了的情况下(HHG的提取液)，在利用抗GFP抗体进行的共沈淀中观察到了14-3-3蛋白，但是，在仅使GFP表达了的情况下(35S GFP的提取液)，在共沈淀中未观察到14-3-3蛋白。由此可知，Hd3a与14-3-3蛋白在水稻的茎顶端相互作用。
(实施例11)三种蛋白质及它们的复合物的细胞内定位
细胞内定位和双分子荧光互补法(Bimolecular Fluorescence Complementation：BiFC法)如下那样进行。
首先，将Hd3a、GF14b、OsFD1以及β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的编码区克隆至荧光蛋白表达载体或BiFC载体上，并使用Purelink质粒中量提取试剂盒(Invitrogen)进行了提纯。对Hd3a、GF14b、OsFD1以及它们的变异型蛋白质，使用了编码区全长。作为荧光蛋白表达载体而使用了表达GFP、CFP或者mCherry的载体。作为BiFC载体而使用了表达Vn或Vc标记的载体。Vn或Vc在靠近存在时会发出作为Venus(mVenus)的荧光。
(1)利用Kyozuka and Shimamoto1991，Plant J.6，271(1994)、非专利文献1等中 记载的方法进行了水稻Oc原生质体的转化。利用PEG法(PEG-mediated method)将导入了各种蛋白质后的荧光蛋白表达载体导入到原生质体悬浮液(2×107protoplasts/ml)。在30℃下培养了24小时后，得到转化后的原生质体，并用于显微镜下的观察。
在同时表达2种蛋白质的系统中，将1μg的GFP-GF14b表达质粒或Hd3a-mCherry表达质粒、和10μg的NLS-CFP、CFP-OsFDl或CFP-OsFDl S192A表达质粒同时转化成原生质体。所谓的“NLS”是指核定位信号肽。
结果如图10所示。Hd3a-mCherry的荧光在细胞质和细胞核的两者中被检测到，GFP-GF14b在细胞质中被检测到，CFP-OsFD1在细胞核内被检测到。
(2)与(1)的方法同样地，在BiFC法中，对5μg的Vn融合蛋白表达载体和Vc融合蛋白表达载体同时进行了转化。
将mCherry表达质粒作为转化効率的标记而同时导入。
为了将蛋白质-蛋白质相互作用定量化，对于导入了BiFC分析用表达质粒(Vn融合蛋白表达载体、Vc融合蛋白表达载体、mCherry表达质粒)的各种原生质体约20个细胞，在同样的显微镜条件下测量了mCherry和Venus的荧光强度，并算出了Venus/mCherry值。将下述细胞作为BiFC信号可信赖的细胞，即，在本实验条件下，对于Hd3a与GF14b的相互作用而言Venus/mCherry＞0.33，并且对于GF14b与OsFD1的相互作用和Hd3a与OsFD1的相互作用而言Venus/mCherry＞0.4的细胞。因此，在显示比上述值更高的值时对细胞的数量进行了计数。
结果如图11所示。
使Vn或Vc与Hd3a和GF14b的N末端和C末端结合，并在水稻原生质体中进行了表达，结果是BiFC信号在细胞质内发现了Hd3a与GF14b的相互作用，这取决于Hd3a的R64和R132的变异(图11a)。在BiFC法中，GF14b的R58和R62的变异未对Hd3a与GF14b的相互作用产生影响。
接着，对GF14b与OsFD1的相互作用进行了确认，结果未在细胞质内观察到两者的相互作用。GF14b与OsFD1的相互作用主要在细胞核内被检测到，而在细胞质中仅确认到GF14b的定位(图11b)。可知OsFD1的S192的变异阻碍OsFD1与GF14b的相互作用。另外，在BiFC法中，GF14b的R58和R132的变异未对GF14b与OsFD1的相互作用产生影响。
对Hd3a与OsFDl的相互作用进行了确认后得知，Hd3a与OsFDl的复合物存在于细胞核内(图11c)。Hd3a与OsFDl的相互作用被Hd3a的R64和R132的变异或者OsFDl的S192的变异阻碍。
(3)与(1)的方法同样地，在确认Hd3a与GF14b的相互作用的BiFC系统中，制备了同时表达OsFD1的细胞，并对BiFC信号在细胞核内的累积量进行了研究。为了在BiFC法中同时表达NLS-CFP和CFP-OsFDl，使用了10μg的NLS-CFP表达质粒和CFP-OsFD1表达质粒。
对细胞核内的累积量的计算方法进行了确定。首先，对转化细胞的细胞核内的Venus和mCherry的荧光强度进行了测量。之后，算出了(细胞核内Veuns/细胞核内 mCherry)/(细胞整体的Venus/细胞整体的mCherry)的值。这表示Venus和mCherry在细胞核内的累积量的比率。对上述值与从各细胞得到的对应的共聚焦图像进行比较，并且与mCherry的分布进行比较，当为大于1.2的值时定位于细胞核内，当为0.8～1.2的值时定位于细胞核和细胞质的两者中，当小于0.8时定位于细胞质内。
结果如图12所示。
在同时表达了GFP-GF14b和NLS-CFP时，在细胞质内发现了GFP的荧光。在瞬时同时表达GFP-GF14b和CFP-OsFD1时，在细胞核内发现了CFP的荧光，并且在细胞核内也观察到GFP的荧光，这与同时表达了NLS-CFP时显著不同。另一方面，在同时表达了OsFD1的变异型蛋白质S192A与GFP-GF14b时，未观察到GFP的荧光向细胞核内的移动(图12a)。这暗示GF14b的定位由于OsFD1的存在而从细胞核内转移至细胞质内。
在同时表达了Hd3a-mCherry和CFP-OsFD1时，与仅与CFP同时表达时相比较，mCherry在细胞核内的累积量增大。在同时表达了OsFD1的变异型蛋白质S192A和Hd3a-mCherry时，未发现细胞核内的累积量的增大(图12b)。这些结果暗示Hd3a和GF14b从细胞质移动至细胞核中并与OsFD1形成复合物。
为了确认OsFD1对Hd3a与GF14b的复合物的定位的影响而同时表达了BiFC法和CFP-OsFD1。在未表达OsFD1的情况下，得知Hd3a与GF14b的复合物(BiFC信号)存在于细胞质内。进而，当将CFP-OsFD1同时表达时，观察到Hd3a与GF14b的复合物明显集中在细胞核内(图12c)。因为OsFD1同时表达而引起的Hd3a与GF14b的复合物的移动通过向GF14b中导入R58A/R62A的变异而减少。这暗示水稻细胞内的各蛋白质的定位情况如下，即，首先在细胞质内形成Hd3a与GF14b的复合物，通过GF14b与OsFD1的相互作用，而使该Hd3a和GF14b的复合物与OsFD1在细胞核内相互作用。
(实施例12)OsFD1、GF14b以及Hd3a的相互作用对OsMADS15转录控制的影响
使用利用了原生质体的瞬时表达实验，对OsFD1、GF14b以及Hd3a的相互作用对OsMADS15转录控制的影响进行了确认。
通过Kyozuka and Shimamoto1991，Plant J.6，271(1994)、非专利文献1等中记载的方法进行了水稻Oc原生质体的转化。利用PEG法(PEG-mediated method)将8μg Hd3a表达载体和16μg OsFD1表达载体导入到500μl的原生质体悬浮液(2×107protoplasts/ml)中。在30℃下培养了24小时后，对原生质体悬浮液进行离心，并在-80℃下使细胞颗粒冻结以便进行RNA提取。
与源白玉米的泛素启动子、NOS终止区(Miki and Shimamoto，Plant Cell Physiol.45，490(2004))、以及T7标签区或HA标签区一起将attR重组区(Nakagawa et al.，2007)插入到pGreen II载体(Hellens et al.，Plant Mol.Biol.42，819(2000))中，由此制备了pGII pUbq GW-T7和pGII pUbq HA-GW。
利用基于Gateway BP clonase II(Invitrogen)的Gateway重组法，将插入到pENTR D-TOPO载体中的Hd3a基因、OsFD1基因或者它们的变异型基因转化成pGII pUbq GW-T7和pGII pUbq HA-GW(pGIIpUbqHd3a-T7、pGIIpUbqHA-OsFD1、 pGIIpUbqHA-OsFD1、pGIIpUbqHd3a-T7)。将各种Hd3a表达载体、OsFD1表达载体导入到原生质体中而将各种蛋白质加以表达，从而对OsMADS15的RNA表达量进行了确认。需要说明的是，由于OsGF14通常在所有细胞中均恒定表达，因此，认为即使导入了OsGF14也不能发现効果。
(2)如下那样进行了RNA提取和实时PCR分析。
回收了野生型和转基因植物的叶片。使用TRizol试剂(Invitrogen)并按照制造商的说明提取了总RNA。使用寡聚dT引物(21-mer)由1μg的RNA或2μg的RNA合成了cDNA，并利用Superscript II逆转录酶(Invitrogen)进行了逆转录。对于1μl的cDNA，使用基因特异性引物并利用SYBR Green PCR master mix(Applied Biosystems)进行了定量基因表达分析。使用ABI PRISM7000序列检测系统并按照其指南手册得到了数据。泛素(Ubquitin)和OsMADS15用的引物依照于Komiya et al.，Development135，767(2008).。GF14b和GF14e用的引物如下。
GF14b-realF GCGGAAGAGATCAGGGAAG(序列编号4)
GF14b realR CGACAACAATCACAGCCACA(序列编号5)
GF14e realF CAAGGGCGAATCAGGAGA(序列编号6)
GF14e realR TGAAACGATAACCCACAGCA(序列编号7)
结果如图13所示。
通过将Hd3a和OsFD1同时转导，OsMADS15的RNA量经时性地增加。在仅转导Hd3a或OsFD1时，OsMADS15的RNA表达量没有增大。在转化4小时后发现OsMADS15激活开始进行，这暗示出Hd3a和OsFD1的快速响应性(图13a)。
将各种变异型Hd3a与OsFD1同时表达的结果如图13b所示。变异型Hd3a Y87H并未促进OsMADS15转录。变异型Hd3a R64G、R132A稍微减少了OsMADS15的表达。变异型Hd3a R64K、R64K/R132K显著减少了OsMADS15的表达。这些结果暗示出，Hd3a与OsGF14的相互作用是OsMADS15的表达所必需的，并且，疏水性而并非精氨酸的正电荷对Hd3a与OsGF14的相互作用很重要。
将各种变异型OsFD1与Hd3a同时表达的结果如图13c所示。可知当OsFD1中缺失了SAP基序时(图13c的“1-191”是由1-191残基构成的片段，其后的氨基酸缺失)或者SAP基序中的丝氨酸取代为丙氨酸时(S192A)，OsMADS15的RNA累积量显著降低。在SAP基序中的丝氨酸被取代为作为模拟磷酸化突变的谷氨酸时(S192E)，未发现OsMADS15的RNA累积量降低。上述情况暗示由14-3-3蛋白来识别OsFD1的SAP基序的磷酸化丝氨酸对于成花素激活复合物的形成很重要。
(实施例13-1)转化水稻中的成花时期的确认
与实施例10同样地制备了表3中记载的转化水稻，并对成花时期进行了确认。
使植物在湿度70％下在短日照(SD)条件(30℃、10小时的光照期和25℃、14小时的黑暗期的周期)的室内、或者长日照(LD)条件(14小时的光照期和10小时的黑暗期的周期)的室内生长。在光照期中，使用白色荧光管(400nm～700nm、100tmol·m-2s-1)进行了光照射。按照Kyozuka and Shimamoto，1991的记载对水稻悬浮培养细胞进行了维持。使植物在湿度80％下在短日照(SD)条件的室内生长。将直至开花为止 的时间作为将T0转基因植物转移到SD条件后至抽穗(heading stage)为止的天数而进行了测定。
结果如图14和表3所示。源自导入了prolC∶∶Hd3a∶∶GFP的转化水稻的Hd3a-GFP蛋白质从茎顶端移动，从而在转化水稻中有力地促进了成花。将prolC∶∶Hd3a(R64G)∶∶GFP(rolC的启动子区、R64G变异型Hd3a的编码区以及GFP的编码区连结后的基因)、和prolC∶∶Hd3a(R64G/R132A)∶∶GFP(rolC的启动子区、R64G/R132A双重变异型Hd3a的编码区以及GFP的编码区连结后的基因)导入到水稻中，并对成花时期进行了确认。与导入了prolC∶∶Hd3a∶∶GFP的转化水稻(19.6±12.3days)相比较，导入了prolC∶∶Hd3a(R64G)∶∶GFP的转化水稻(44.2+7.8days)和导入了prolC∶∶Hd3a(R64G/R132A)∶∶GFP的转化水稻(58.8+9.3days)的成花促进显著减少，后者几乎与野生型植物没有区别。上述情况暗示出由于Hd3a和14-3-3的亲和力降低而使成花促进能力丧失。
接着，对导入了OsFD1RNAi的水稻与OsFD1表达转化水稻、导入了变异型OsFD1的转化水稻进行了分析。导入了OsFD1RNAi的水稻与野生型相比成花延迟。OsFD1表达转化水稻(pUbq∶∶OsFD1)和导入了变异型OsFD1S192A的转化水稻(pUbq∶∶OsFD1(S192A))的成花未受影响，导入了变异型OsFD1S192E的转化水稻(pUbq∶∶OsFD1(S192E)(S192模拟磷酸化))与野生型相比促进了成花。
[表3]
基因型 直至开花为止的时间(天) n
野生型 54.9+9.7 8
prolC∶∶Hd3a∶∶GFP 19.6±12.3 13
prolC∶∶Hd3a(R64G)∶∶GFP 44.2+7.8 6
prolC∶∶Hd3a(R64G/R132A)∶∶GFP 58.8+9.3 21
野生型* 69.5+6.0* 4*
OsFD1RNAi* 74.6+4.8* 7*
pUbq∶∶OsFD1 58.0+6.1 3
pUbq∶∶OsFD1(S192A) 61.7+2.9 3
pUbq∶∶OsFD1(S192E) 38.3±4.6 8
GF14b GF14e双重RNAi 60.1±7.1 14
pUbq∶∶GF14b 55.4±10.9 5
pUbq∶∶NLS∶∶GF14b 51.0+8.9 13
pUbq∶∶GF14e 61.2±11.0 6
pUbq∶∶NLS∶∶GF14e 47.7+8.3 7
(实施例13-2)转化水稻的成花时期的确认
与实施例13-1同样地制备了转化水稻，并对成花时期进行了确认。
利用与实施例13-1同样的方法使植物(转化水稻)生长，并将直至开花为止的时间作为将T0转基因植物转移到SD条件后至抽穗(heading stage)为止的天数而进行了 测定。
结果如图16和表4所示。与实施例13-1同样，在prolC∶∶Hd3a∶∶GFP转化水稻中，Hd3a-GFP蛋白质从茎顶端移动，从而在转化水稻中有力地促进了成花。与导入了prolC∶∶Hd3a∶∶GFP的转化水稻相比较，导入了prolC∶∶Hd3a(R64G/R132K)∶∶GFP的转化水稻和导入了prolC∶Hd3a(F103A)∶∶GFP(rolC的启动子区、F103A变异型Hd3a的编码区以及GFP的编码区连结后的基因)的转化水稻的成花未被促进。
[表4]
产业上的利用可能性
本发明的晶体能够带来对于植物的成花控制机制的阐明重要的成花素激活复合物的立体结构信息，并且，能够作为用于进一步研究成花调节机制的材料而使用。另外，根据得到的立体结构信息、特别是成花素激活复合物中的结合部位的信息，能够人为地且有效地调节植物的成花。根据通过本发明得到的立体结构信息，能够得到在农业生产物的收量增加或育种的効率化等中能够广泛利用的转基因植物。另外，利用本发明的立体结构信息能够对调节植物的成花的物质进行筛选，该物质能够在各种环境下调节植物的生长，从而认为在农业上是有益的。

Claims (16)

1.一种促进或延迟水稻的成花的方法，其在由成花素、14-3-3蛋白以及bZIP转录因子的复合物构成的成花素激活复合物中，通过促进或阻碍成花素与14-3-3蛋白的结合部位或14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合部位上的结合，从而促进或抑制成花素激活复合物的形成，由此来促进或延迟水稻的成花，所述促进或延迟水稻的成花的方法是选自以下的任意一种方法：
(1)通过制备含有变异型水稻Hd3a的转化体而抑制成花素激活复合物的形成，从而使水稻的成花延迟的方法，其中，所述变异型水稻Hd3a是将选自由序列编号1中的M63、R64、F103以及R132构成的群中的1个以上的氨基酸取代后的水稻Hd3a；
(2)通过制备含有变异型水稻GF14c的转化体而抑制成花素激活复合物的形成，从而使水稻的成花延迟的方法，其中，所述变异型水稻GF14c是将选自由序列编号2中的F200、I204、E212以及Y215构成的群中的1个以上的氨基酸取代后的水稻GF14c；
(3)通过制备含有变异型水稻GF14b的转化体而抑制成花素激活复合物的形成，从而使水稻的成花延迟的方法，其中，所述变异型水稻GF14b是将选自由序列编号4中的F206、I210、E212、E218、Y221、R232、D233、R64、R68、I227、L230构成的群中的1个以上的氨基酸取代后的水稻GF14b；
(4)通过制备含有变异型水稻OsFD1的转化体而抑制成花素激活复合物的形成，从而使水稻的成花延迟的方法，其中，所述变异型水稻OsFD1导入了序列编号3中的S192A的氨基酸取代；或者，
(5)通过制备含有变异型水稻OsFD1的转化体而促进成花素激活复合物的形成，从而促进水稻的成花的方法，其中，所述变异型水稻OsFD1导入了序列编号3中的S192E的氨基酸取代。
2.如权利要求1所述的促进或延迟水稻的成花的方法，其是选自以下的任意一种方法：
通过制备含有变异型水稻Hd3a的转化体而抑制成花素激活复合物的形成，从而使水稻的成花延迟的方法，其中，所述变异型水稻Hd3a导入了选自由序列编号1中的M63A、R64G、R64A、R64K、F103A、R132A、R132K、R64G/R132A、以及R64K/R132K构成的群中的1个以上的氨基酸取代；
通过制备含有变异型水稻GF14c的转化体而抑制成花素激活复合物的形成，从而使水稻的成花延迟的方法，其中，所述变异型水稻GF14c导入了选自由序列编号2中的F200A、I204A、E212A以及Y215A构成的群中的1个以上的氨基酸取代；
通过制备含有变异型水稻GF14b的转化体而抑制成花素激活复合物的形成，从而使水稻的成花延迟的方法，其中，所述变异型水稻GF14b导入了选自由序列编号4中的F206A、I210A、E212A、E218A、Y221A、R232A、D233A、R64A/R68A、I227A/L230A构成的群中的1个以上的氨基酸取代；
通过制备含有变异型水稻OsFD1的转化体而抑制成花素激活复合物的形成，从而使水稻的成花延迟的方法，其中，所述变异型水稻OsFD1导入了序列编号3中的S192A的氨基酸取代；或者，
通过制备含有变异型水稻OsFD1的转化体而促进成花素激活复合物的形成，从而促进水稻的成花的方法，其中，所述变异型水稻OsFD1导入了序列编号3中的S192E的氨基酸取代。
3.如权利要求1所述的促进或延迟水稻的成花的方法，其是选自以下的任意一种方法：
通过制备含有变异型水稻Hd3a的转化体而抑制成花素激活复合物的形成，从而使水稻的成花延迟的方法，其中，所述变异型水稻Hd3a导入了选自由序列编号1中的R64G、R64G/R132A、R64K/R132K、F103A构成的群中的1个以上的氨基酸取代；
通过制备含有变异型水稻OsFD1的转化体而抑制成花素激活复合物的形成，从而使水稻的成花延迟的方法，其中，所述变异型水稻OsFD1导入了序列编号3中的S192A的氨基酸取代；或者，
通过制备含有变异型水稻OsFD1的转化体而促进成花素激活复合物的形成，从而促进水稻的成花的方法，其中，所述变异型水稻OsFD1导入了序列编号3中的S192E的氨基酸取代。
4.一种多核苷酸，其对导入了变异以促进和/或抑制成花素激活复合物的形成的、以下的(A)～(C)中的任一种以上的蛋白质进行编码：
(A)将选自由序列编号1中的M63、R64、F103以及R132构成的群中的1个以上的氨基酸取代后的变异型水稻Hd3a，
(B)将选自由序列编号2中的F200、I204、E212以及Y215构成的群中的1个以上的氨基酸取代后的变异型水稻GF14c，或者，将选自由序列编号4中的F206、I210、E212、E218、Y221、R232、D233、R64、R68、I227、L230构成的群中的1个以上的氨基酸取代后的变异型水稻GF14b，
(C)将序列编号3中的S192的氨基酸取代后的变异型水稻OsFD1。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其对以下的(A)～(C)中的任一种以上的蛋白质进行编码：
(A)导入了选自由序列编号1中的M63A、R64K、R64G、R64A、F103A、R132K以及R132A、R64G/R132A、R64K/R132K构成的群中的1个以上的氨基酸取代的变异型水稻Hd3a，
(B)导入了选自由序列编号2中的F200A、I204A、E212A以及Y215A构成的群中的1个以上的氨基酸取代的变异型水稻GF14c，或者，导入了选自由序列编号4中的F206A、I210A、E212A、E218A、Y221A、R232A、D233A、R64A/R68A、以及I227A/L230A构成的群中的1个以上的氨基酸取代的变异型水稻GF14b，
(C)导入了序列编号3中的S192A或S192E的氨基酸取代的变异型水稻OsFD1。
6.一种重组载体，其含有权利要求4中所述的任一种以上的多核苷酸。
7.一种控制植物的成花的物质的筛选方法，其包括以下的工序：
使候选物质与结合有或未结合有成花素的14-3-3蛋白或者bZIP转录因子中的任一种接触，然后使候选物质与bZIP转录因子或者结合有或未结合有成花素的14-3-3蛋白接触的工序。
8.一种控制植物的成花的物质的筛选方法，其包括以下的工序(1)或(2)：
(1)使候选物质与成花素或14-3-3蛋白中的任一种接触，然后使候选物质与14-3-3蛋白或成花素接触的工序；或者，
(2)使候选物质与结合有或未结合有成花素的14-3-3蛋白或者bZIP转录因子中的任一种接触，然后使候选物质与bZIP转录因子或者结合有或未结合有成花素的14-3-3蛋白接触的工序，
所述控制植物的成花的物质的筛选方法，进而还包括以下的工序(3)：
(3)选择成花素与14-3-3蛋白的结合部位和/或14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合部位上的结合在候选物质的存在下被促进和/或阻碍的物质的工序，
其中，成花素与14-3-3蛋白的结合部位是选自由以下三部位构成的群中的1个以上的部位，该三部位是：选自由序列编号1中的M63、R64、F103以及R132构成的群中的水稻Hd3a的部位、选自由序列编号2中的F200、I204、E212及Y215构成的群中的水稻GF14c的部位、以及选自由序列编号4中的F206、I210、E212、E218、Y221、R232及D233构成的群中的水稻GF14b的部位；
14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合部位是选自由以下两部位构成的群中的1个以上的部位，该两部位是：选自由序列编号4中的R64、R68、I227以及L230构成的群中的水稻GF14b的部位和序列编号3中的S192的水稻OsFD1的部位。
9.根据权利要求7或8所述的控制植物的成花的物质的筛选方法，其中，
成花素是由序列编号1中所示的氨基酸序列中的第6～170位的氨基酸序列构成的水稻Hd3a多肽片段，或者，是由序列编号1中所示的第1～179位的全长氨基酸序列构成的水稻Hd3a多肽片段，
14-3-3蛋白是由序列编号2中所示的氨基酸序列中的第1～235位的氨基酸序列构成的水稻GF14c多肽片段、由序列编号2中所示的第1～256位的全长氨基酸序列构成的水稻GF14c多肽片段、或者由序列编号4中所示的第1～262位的全长氨基酸序列构成的水稻GF14b多肽片段，
bZIP转录因子是由序列编号3中所示的氨基酸序列中的第187～195位的氨基酸序列构成的水稻OsFD1多肽片段，或者，由序列编号3中所示的第1～195位的全长氨基酸序列构成的水稻OsFD1多肽片段。
10.一种多肽片段，其是选自以下的多肽片段：
(i)由序列编号1中所示的氨基酸序列中的第6～170位的氨基酸序列构成的成花素多肽片段；
(ii)由序列编号2中所示的氨基酸序列中的第1～235位的氨基酸序列构成的14-3-3蛋白多肽片段；
(iii)由序列编号3中所示的氨基酸序列中的第187～195位的氨基酸序列构成的bZIP转录因子多肽片段。
11.一种多核苷酸，其编码权利要求10的(i)～(iii)中所述的多肽片段。
12.一种成花素激活复合物，其是成花素多肽片段通过14-3-3蛋白多肽片段与bZIP转录因子多肽片段结合而形成的成花素激活复合物，
其中，成花素多肽片段、14-3-3蛋白多肽片段以及bZIP转录因子多肽片段分别为权利要求10的(i)～(iii)中所述的多肽片段。
13.一种成花素激活复合物的晶体，其是成花素通过14-3-3蛋白与bZIP转录因子结合而形成的，且是选自以下(1)～(5)中的晶体：
(1)晶体的空间群为P1，晶格常数为α＝68.2°、β＝87.9°、γ＝77.9°的晶体；
(2)晶体的空间群为P1，晶格常数为α＝68.1°、β＝87.8°、γ＝77.9°的晶体；
(3)晶体的空间群为P1，晶格常数为α＝68.2°、β＝88.6°、γ＝77.8°的晶体；
(4)晶体的空间群为P6522，晶格常数为α＝90°、β＝90°、γ＝120°的晶体；
(5)晶体的空间群为P4，晶格常数为α＝90°、β＝90°、γ＝90°的晶体。
14.一种权利要求1σ所述的成花素激活复合物的晶体的制备方法，其包括：
将GST融合后的权利要求10所述的(i)中的成花素与GST融合后的权利要求10所述的(ii)中的14-3-3蛋白以摩尔比1∶1.5进行混合而制备复合物，使用含有pH为7.5的0.1M的HEPES、0.2M的硫酸铵、以及容量百分比为25的PEG3500的沉淀剂溶液，并通过坐滴法在4℃下将含有所述复合物且蛋白质浓度为10mg/mL的蛋白质溶液晶化的工序；
回收得到的晶体的工序；以及
使用沉淀剂溶液对得到的晶体进行培养，从而得到成花素激活复合物的晶体的工序，其中，所述沉淀剂溶液含有容量百分比为25的乙二醇和2mM的权利要求10所述的(iii)中的bZIP转录因子。
15.一种调节植物的成花的物质的筛选方法，其是使用计算机而设计和/或选择具有调节成花素激活复合物的活性的功能的候选物质，由此来筛选调节植物的成花的物质的方法，
其中，所述筛选方法包括：
(a)将从权利要求13所述的成花素激活复合物的晶体中得到的立体结构信息存储在存储手段中的工序，
(b)根据立体结构信息并利用导出手段而导出三维立体结构模型的工序，
(c)在导出的三维立体结构模型中，利用计算手段计算出原子间距离的工序，以及
(d)根据计算出的原子间距离并利用计算手段而计算出候选物质的立体结构信息，从而设计和/或选择候选物质的工序，
其中，所述候选物质能够增强和/或阻碍成花素与14-3-3蛋白的结合和/或14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合，
成花素与14-3-3蛋白的结合部位是选自由以下三部位构成的群中的1个以上的部位，该三部位是：选自由序列编号1中的M63、R64、F103以及R132构成的群中的水稻Hd3a的部位、选自由序列编号2中的F200、I204、E212及Y215构成的群中的水稻GF14c的部位、以及选自由序列编号4中的F206、I210、E212、E218、Y221、R232及D233构成的群中的水稻GF14b的部位；
14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合部位是选自由以下两部位构成的群中的1个以上的部位，该两部位是：选自由序列编号4中的R64、R68、I227以及L230构成的群中的水稻GF14b的部位和序列编号3中的S192的水稻OsFD1的部位。
16.一种促进或阻碍成花素激活复合物的结合部位上的结合的方法，其在由成花素、14-3-3蛋白以及bZIP转录因子的复合物构成的成花素激活复合物中，促进或阻碍成花素与14-3-3蛋白的结合部位或14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合部位上的结合，所述促进或阻碍成花素激活复合物的结合部位上的结合的方法是选自以下的任意一种方法：
在水稻Hd3a中，通过导入选自由序列编号1中的M63、R64、F103以及R132构成的群中的1个以上的氨基酸取代，从而阻碍成花素与14-3-3蛋白的结合部位上的结合；
在水稻GF14c中，通过导入选自由序列编号2中的F200、I204、E212以及Y215构成的群中的1个以上的氨基酸取代，从而阻碍成花素与14-3-3蛋白的结合部位上的结合；
在水稻GF14b中，通过导入选自由序列编号4中的F206、I210、E212、E218、Y221、R232以及D233构成的群中的1个以上的氨基酸取代，从而阻碍成花素与14-3-3蛋白的结合部位上的结合；
在水稻GF14b中，通过导入选自由序列编号4中的R64、R68、I227、L230构成的群中的1个以上的氨基酸取代，从而阻碍14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合部位上的结合；
在水稻OsFD1中，通过导入序列编号3中的S192A的氨基酸取代，从而阻碍14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合部位上的结合；或者，
在水稻OsFD1中，通过导入序列编号3中的S192E的氨基酸取代，从而促进14-3-3蛋白与bZIP转录因子的结合部位上的结合。
CN201180013932.4A 2010-03-17 2011-03-17 成花素激活复合物 Active CN102947445B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010061562 2010-03-17
JP2010-061562 2010-03-17
PCT/JP2011/056426 WO2011115222A1 (ja) 2010-03-17 2011-03-17 フロリゲン活性化複合体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102947445A CN102947445A (zh) 2013-02-27
CN102947445B true CN102947445B (zh) 2015-06-17

Family

ID=44649304

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180013932.4A Active CN102947445B (zh) 2010-03-17 2011-03-17 成花素激活复合物

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20130019345A1 (zh)
EP (1) EP2548959B1 (zh)
JP (1) JP5842287B2 (zh)
CN (1) CN102947445B (zh)
WO (1) WO2011115222A1 (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013118863A1 (ja) * 2012-02-08 2013-08-15 国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 フロリゲンの導入方法
CN107105657B (zh) 2014-12-15 2020-03-03 美国陶氏益农公司 具有杀虫效用的分子、以及与其相关的中间体、组合物、和方法
CN107746846B (zh) * 2017-10-26 2020-03-27 江苏省农业科学院 编码甘薯bZIP转录因子的IbABF4基因及应用
JP7303519B2 (ja) 2019-03-05 2023-07-05 トヨタ自動車株式会社 変異型花成誘導遺伝子、当該変異型花成誘導遺伝子を有する形質転換植物、及び当該変異型花成誘導遺伝子を用いた花成制御方法
JP7299589B2 (ja) 2019-03-05 2023-06-28 トヨタ自動車株式会社 形質転換植物、及び花成誘導遺伝子を用いた花成制御方法
CN109943574A (zh) * 2019-04-09 2019-06-28 贵州大学 一种高粱14-3-3蛋白GF14b基因及其重组载体和表达方法
CN111607577A (zh) * 2020-05-09 2020-09-01 李健 Parp15蛋白与其抑制剂3-氨基苯甲酰胺复合物晶体及其制备方法
CN112126658A (zh) * 2020-09-30 2020-12-25 四川轻化工大学 植物过表达荧光素酶报告基因重组载体及构建方法、应用
CN112321691A (zh) * 2020-11-10 2021-02-05 广东省农业科学院水稻研究所 OsGF14f蛋白在调控水稻耐冷性中的应用
CN113215174B (zh) * 2021-06-21 2022-04-22 南京农业大学 水稻粒长基因OsGF14b的基因工程应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6225530B1 (en) * 1998-04-15 2001-05-01 The Salk Institute For Biological Studies Flowering locus T (FT) and genetically modified plants having modulated flower development
JP2002153283A (ja) 2000-11-24 2002-05-28 National Institute Of Agrobiological Sciences 植物の開花を誘導する遺伝子Ｈｄ３ａおよびその利用
JP2003274972A (ja) 2002-03-26 2003-09-30 Japan Science & Technology Corp 花成制御遺伝子、及びその利用
AU2003265016B2 (en) * 2002-09-05 2009-11-19 Genesis Research And Development Corporation Limited Polypeptides involved in the regulation of flowering in forage grasses
CN101018864A (zh) * 2002-12-26 2007-08-15 先正达合作有限公司 细胞增殖相关多肽及其应用
JP2010061562A (ja) 2008-09-05 2010-03-18 Ricoh Co Ltd 機器動作履歴記録システム

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
14-3-3 proteins act as intracellular receptors for rice Hd3a florigen;Ken-ichiro Taoka et al.;《NATURE》;20110818;第476卷;332-335 *
A single amino acid converts a repressor to an activator of flowering;Yoshie Hanzawa et al.;《PNAS》;20050524;第102卷(第21期);7748-7753 *
Target tanpaku kenkyu program no seika, Structural aspects of florigen to understand the molecular mechanism of flowering;Taoka K et al.;《Protein, nucleic acid and enzyme》;20090910;第54卷(第12期);1702-1707 *
The rice 14-3-3 gene family and its involvement in responses to biotic and abiotic stress;Fang Chen etal.;《DNA Research》;20060430;第13卷(第2期);53-63 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2548959A4 (en) 2014-01-08
WO2011115222A1 (ja) 2011-09-22
CN102947445A (zh) 2013-02-27
EP2548959A1 (en) 2013-01-23
JP5842287B2 (ja) 2016-01-13
JPWO2011115222A1 (ja) 2013-07-04
EP2548959B1 (en) 2018-07-18
US20130019345A1 (en) 2013-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102947445B (zh) 成花素激活复合物
Zhang et al. Genetic variation in ZmTIP1 contributes to root hair elongation and drought tolerance in maize
Suzuki et al. OsHKT1; 4-mediated Na+ transport in stems contributes to Na+ exclusion from leaf blades of rice at the reproductive growth stage upon salt stress
Zhou et al. SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSENSITIVE5
Dey et al. The sucrose non-fermenting 1-related kinase 2 gene SAPK9 improves drought tolerance and grain yield in rice by modulating cellular osmotic potential, stomatal closure and stress-responsive gene expression
Zou et al. Arabidopsis CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE8 and CATALASE3 function in abscisic acid-mediated signaling and H2O2 homeostasis in stomatal guard cells under drought stress
Cong et al. FW2. 2 and cell cycle control in developing tomato fruit: a possible example of gene co-option in the evolution of a novel organ
Nishimura et al. An Arabidopsis ACT2 dominant-negative mutation, which disturbs F-actin polymerization, reveals its distinctive function in root development
Pierre et al. N-myristoylation regulates the SnRK1 pathway in Arabidopsis
CN103717732B (zh) 增加植物产量和胁迫耐性的方法
Huang et al. OsSNDP1, a Sec14-nodulin domain-containing protein, plays a critical role in root hair elongation in rice
Leasure et al. Root UV-B sensitive2 acts with root UV-B sensitive1 in a root ultraviolet B-sensing pathway
Huang et al. Carbonic anhydrases function in anther cell differentiation downstream of the receptor-like kinase EMS1
Patel et al. The Omp85-related chloroplast outer envelope protein OEP80 is essential for viability in Arabidopsis
Long et al. Identification of NHXs in Gossypium species and the positive role of GhNHX1 in salt tolerance
Oyama et al. The IRE gene encodes a protein kinase homologue and modulates root hair growth in Arabidopsis
Mao et al. Genome-wide analysis of the apple CaCA superfamily reveals that MdCAX proteins are involved in the abiotic stress response as calcium transporters
Sato et al. The ER-localized aquaporin SIP2; 1 is involved in pollen germination and pollen tube elongation in Arabidopsis thaliana
US20110119792A1 (en) Genes Controlling Plant Root Growth And Development For Stress Tolerance And Method Of Their Use
CN108250279B (zh) 热激蛋白Hsp17.6CII在调控植物耐盐碱中的应用
Wang et al. The transcription factor MYB110 regulates plant height, lodging resistance, and grain yield in rice
ES2335588T3 (es) Plantas que tienen caracteristicas de crecimiento mejoradas y metodo para la elaboracion de las mismas.
Yu et al. Grape CIPK18 acts as a positive regulator of CBF cold signaling pathway by modulating ROS homeostasis
JP2007515167A (ja) 収穫高の増加した植物およびこの植物を作製するための方法
CN113667658B (zh) 一种蛋白磷酸酶OsPP74在提高水稻磷吸收中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant