CN102947330B - 二硫键稳定的功能性可溶mhc ii类异二聚体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及二硫键稳定的重组MHC II类分子。特别地，本发明提供了一种重组MHC II类分子，该重组MHC II类分子包括：(i)MHC II类分子α链细胞外部分的全部或部分；(ii)MHC II类分子β链细胞外部分的全部或部分；其中，(i)和(ii)提供了功能性肽结合结构域，且其中(i)和(ii)通过位于所述α链α2结构域和所述β链的β2结构域中的半胱氨酸残基间的二硫键连接，其中，所述半胱氨酸残基不存在于天然MHC II类的α2和β2结构域中。在原核系统中制备这些分子的方法以及这些分子的各种用途构成了另外的方面。
Description
技术领域
本发明涉及二硫键稳定的重组MHC II类分子。
背景技术
主要组织相容性复合体(MHC)分子为脊椎动物免疫系统的主要组成部分，存在于所有有核细胞表面。MHC有两种主要的形式，即MHC I类和MHCII类。重要的是，两种类型都与蛋白质水解加工的肽形成称为T细胞表位的功能性复合体，这发生于表达特定MHC的完全相同的细胞中。产生的肽/MHC(pMHC)复合体随后作为跨膜复合体存在于细胞表面上——该现象称之为抗原递呈。然后细胞表面-结合的pMHC可以与其同源部分(cognate partner)——T细胞受体(TCR)相互作用，所述T细胞受体存在于T淋巴细胞的表面。
鉴于其在适应性免疫中的重要作用，基础和应用科学对在细胞和分子水平上理解pMHC-TCR的相互作用很感兴趣，从而获得两种分子的重组类型。也日益认识到，能否获得这种重组分子对能研究和理解系统生物，以及对开发新的治疗和诊断是非常关键的。
许多重大的医学疾病需要进行治疗干预(therapeutic interventions)，以调节病人免疫系统的活动。在如自身免疫性疾病和过敏症中，需要抑制过于活跃的免疫系统和慢性炎症。相反，免疫刺激是与感染和癌症有关的途径，以将免疫细胞激活并靶向于癌细胞。此外，移植接受者通常需要免疫抑制。同时，这也导致了大量免疫调节剂的产生，目前是一个数十亿美元的产业。
理解这些疾病中的免疫成分和筛选新的治疗方法的关键是抗原递呈细胞和T细胞间的相互作用，或者更具体地是MHC I型和II型分子与TCR间的相互作用。II型MHC特异性的与外源衍生肽结合，并将它们递呈给CD4+T辅助细胞(TH细胞)。然后所述TH细胞被活化并成为分泌各种细胞因子的效应细胞。这些细胞因子大量地活化参与处理威胁的其它免疫细胞。该系统的故障会导致诸如自身免疫性疾病或者使癌细胞生存和分裂。因此，自身免疫性疾病的特征是与MHC密切相关和靶器官T细胞浸润(infiltration)。
用于免疫调节剂筛选的平台需要稳定的、完全功能性的可溶性MHCII类分子。重要的是，目前可溶MHC II类分子的制备由于严重的问题而受阻，即缺乏分子稳定性。
在过去的几年里，制备四聚体的可溶MHC I类分子的能力(四聚体技术)已经使基础和应用免疫学发生了变革(Constantin et al.，2002，Biological Research for Nursing，4：115-127)。原因是，无论是就抗原而言还是就T细胞反应而言，四聚体技术已大幅提高了以特定方式追踪免疫反应过程的能力，这主要通过流式细胞术来评估。这种能力也带来了对免疫系统更深入的了解且确实可能带来了新的诊断工具。
到目前为止，四聚体试剂在很大程度上限于MHC I类分子，因为关于重组MHC I类制备的大多数技术问题似乎已经得到解决。事实上，就MHC II类分子而言，已经证明了这个任务更具显著的挑战性。因此，目前MHC II类四聚体制备的常规方法没有可用的，虽然在文献和商用试剂中都出现了独立的例子(Vollers，S.and Stern，L.，2008，Immunology 123：305-313)。在MHC II类四聚体可获得的少量实例中，它们被广泛地使用，并已对了解疾病的发展产生了巨大的影响。因此，鉴于成功制备重组MHC I类产物已经显示的影响，可以看出无论在学术上还是商业上都存在强烈而清晰的动力，以在新的MHC II类生产道路中投入更多的努力。然而，鉴于迄今为止遇到的问题，成功是不确定的。
由于部分不明的原因，已经证明了MHC II类分子制备成可溶形式的稳定重组分子尤其困难。天然分子是非共价的跨膜异质二聚体，包括α-和β-链，α-链和β-链都具有跨膜区且属于免疫球蛋白(Ig)超家族。各链的细胞外部分包括由两个结构域组成，每个结构域由大约90个氨基酸残基组成，其中两个膜远端结构域，α1和β1结构域形成对T细胞表位的肽结合性能所必需的格状的α/β结构(inter-latticed α/βstructure)。两个膜近端结构域，α2和β2结构域，均形成离散的Ig结构域。在α链和β链中，均有约20个氨基酸残基的一段跨越细胞膜且在膜的细胞质侧存在相当短的肽段。
α链和β链的二聚作用被认为是由以下原因产生(i)跨膜片段，(ii)肽结合以及(iii)在膜中发现的推定的附属成分。因此，一旦脱离其天然环境并作为可溶性分子制备，MHC II类分子经常受到内在低稳定性和非常低的生产水平的制约。此外，必须进行广泛的和资源高要求情况依赖性的优化。
此外，鉴于二聚作用的上述要求，在任何非天然环境下的MHC II类分子制备的通用方法还不明朗，即在除与天然表达MHC II类分子的细胞的细胞膜相关制备以外的任何环境下，如其它生物实体、细胞或微粒(particles)表面上显示的非水溶性分子制备，如通过融合成病毒衣壳蛋白的方式在噬菌体表面表达的非水溶性分子。
因此，目前还不存在可制备稳定MHC II类异二聚体的通用方法。然而，已进行了大量的研究，所有的研究都代表了特定案例成功的例子，这相当反映了任务的复杂性。这些例子是：(i)真核细胞表面上的膜结合MHC II类异二聚体通过利用脂质系链(lipid tether)(GPI锚定)的异位表达，参见Wettstein et al.，1991，J.of Exp.Medicine，174：219-228；(ii)昆虫细胞中MHC II类胞外结构域(ectodomains)的表达，参见Wallny etal.，1995，Eur.J.Immunology，25：1262-1266；(iii)异源二聚作用基序的引入，如亮氨酸拉链、MHC II类分子C端的引入，结合昆虫细胞生产，参见Quarsten et al.，2001，J.Immunol.，167：4861-4868和Crawford et al.，2006，Immunological Reviews，210：156-170；(iv)抗体/MHC II类嵌合体结合昆虫细胞生产的制备，参见Casares et al.，1997，Protein Engineering，10：1295-1301；(v)利用细菌表达系统使得功能性pMHC三聚体通过包涵体重折叠的方法而形成，参见Arimilli et al.，1995，J.Biol.Chem.，270：971-977；或者(vi)使用截断型细菌(truncated bacteral)产生的仅由α1和β1结构域构成的单链MHC II类形式，使得功能性MHC分子通过包涵体重折叠的方法而形成，参见Burrows et al.，1999，ProteinEngineering，12：771-778。此外，Landais et al.，2009，J.Immunol.，183：7949-7957描述了利用内部人工二硫桥与外源性亮氨酸拉链结合以制备稳定的小鼠I-Ad OVA MHC II类四聚体的昆虫细胞表达系统。重要的是，尽管由于修饰，表达水平增加，显然这些稳定增加的分子没有表现出特异性T细胞染色。
发明内容
本文所描述的方法与现有技术体系相比具有显著的优势，因为它们不仅提供可以应用于所有MHC II类分子的通用方法，还可以用于原核表达系统且不需要使用异源性/外源性二聚作用基序，如亮氨酸拉链。此外，本文描述的方法转化为特异性T细胞染色功能的增强，且直接归因于引入的修饰。
然而令人惊讶的是，本发明的发明人已经确定了通用的方法，该方法可以克服或在很大程度上缓解与重组MHC II类分子相关的不稳定性问题。该方法包括重组MHC II类分子的制备，所述重组MHC II类分子中具有α和β链的细胞外部分且α和β链异二聚体通过改造的/人工的二硫桥被稳定，所述二硫桥利用α2-β2结构域交叉区域(interface)连接该两条链。二硫键将分子锁定在稳定的完整的功能性构象中。重要的和有利的是，该用于稳定MHC II类异二聚体的方法是通用的且不限于单一的重组形式，这样，避免了需要进行以上讨论的广泛的和资源高要求情况依赖性的优化。此外，与许多现有的方法不同的是，考虑到原核宿主缺乏真核细胞的复杂机制，通常需要正确的二硫桥形成并因此形成功能性分子的事实，该方法可以应用于原核表达系统/宿主，这本身是令人惊讶的。本发明不仅解决了当前阻碍探索和开发免疫调节剂领域的争议，而且也将是开发和修饰T细胞并用于治疗的一个重要工具。
因此，一方面，本发明提供了一种重组MHC II类分子，包括：
(i)MHC II类分子α链细胞外部分的全部或部分；
(ii)MHC II类分子β链细胞外部分的全部或部分；
其中，(i)和(ii)提供了功能性肽结合结构域，且其中(i)和(ii)通过位于所述α链α2结构域和所述β链的β2结构域当中的半胱氨酸残基间的二硫键连接，其中，所述半胱氨酸残基不存在于天然MHC II类的α2和β2结构域中。
如上所述，蛋白质如MHC II类分子，由一个以上的多肽组成并具有跨膜结构域(transmembrane domain)，该蛋白质很难在其天然膜的外部环境下制备，特别是以可溶的形式，因为在许多情况下，除其它原因外，蛋白质通过它的跨膜区域和可能的膜附属成分被稳定。这是MHC II类分子的实例且在文献中已被揭示，文献中MHC II类分子被报导是不稳定的，不能以良好的产量制备或不能识别和结合肽。因此，目前发明的分子代表了优于现有技术的重要进步，因为它们是稳定的并可以识别并结合肽，也接受T细胞的染色。
如上所述，天然MHC II类分子包括α链和β链，它们都具有跨膜区域并属于免疫球蛋白(Ig)超家族。各个链的细胞外部分包括两个结构域，每一个结构域由大约90个氨基酸残基组成，其中两个膜远端结构域，α1和β1结构域形成T细胞表位的肽结合性能所必需的格状α/β结构。两个膜近端结构域，α2和β2结构域，均形成离散的Ig结构域。α和β链中，均有约20个氨基酸残基伸出跨越细胞膜且在膜的细胞质侧存在相当短的肽段。
本发明的分子包括MHC II类α链细胞外部分的全部或部分以及MHC II类β链细胞外部分的全部或部分。MHC II类α链细胞外部分包括信号序列、膜远端α1结构域和膜近端α2结构域(形成离散的Ig结构域)。在跨膜结构域和α2结构域之间还有间隔区域。同样，MHC II类β链细胞外部分包括信号序列、膜远端β1结构域、膜近端β2结构域(形成离散的Ig结构域)和间隔区域。
本文所用的术语“MHC II类α链细胞外部分”不包括α链的跨膜结构域或胞浆结构域(cytoplasmic domain)。事实上，在本发明的优选实施方式中，重组MHC II类分子不包括所述跨膜结构域的任何氨基酸残基(即由专用的跨膜外显子编码的氨基酸)或所述胞浆结构域的任何氨基酸残基。
同样，本文所用的术语“MHC II类β链细胞外部分”不包括β链的跨膜结构域或胞浆结构域。事实上，在本发明的优选实施方式中，重组MHC II类分子不包括所述跨膜结构域的任何氨基酸残基(即由专用的跨膜外显子编码的氨基酸)或所述胞浆结构域的任何氨基酸残基。
本发明的重组分子中可以存在α和/或β链的全部所述细胞外部分(即信号肽、α1/β1结构域、α2/β2结构域和间隔区域)。然而，另外，仅α链和β链的部分细胞外部分需要存在于本发明的分子中，只要就其连接到适当肽的能力而言重组分子仍然是有功能的(如T细胞感受器肽)，并只要所述分子包含人工的(非天然的)半胱氨酸残基且该残基以能被用于形成二硫键来发挥稳定重组MHC II型分子的形式或构象存在。
可以从本发明重组MHC分子的α和/或β链中移除信号肽，特别是如果MHC II类分子在原核细胞中表达。本领域技术人员可以很容易地设计并制备适量N-端氨基酸残基被移除的这种构建体(constructs)。还可以很容易地测试这种移除是否会对功能，如结合肽或使T细胞活化或染色的能力产生影响，或对分子的稳定性产生影响。
间隔区域也可以被完全移除或截去，例如，如实验实施例中所示，不包括α链间隔区和β链间隔区的9个氨基酸。再者，本领域技术人员可以很容易地设计和制备适量间隔区氨基酸残基被移除的这种构建体。还可以测试这种移除是否会对功能，如结合肽或使T细胞活化或染色的能力产生影响，或对分子的稳定性产生影响。
本发明优选的分子包括α1结构域的至少一部分和β1结构域的至少一部分，只要这种结构域结合肽的功能或者本文描述的其它功能(例如为了递呈这种肽到T细胞受体(TCRs))不受影响。
此外，作为整体的重组MHC II类分子无论是在连接肽的能力还是在本文叙述的其它功能上仍必须是有功能的。例如为了递呈这种肽至T细胞受体(TCRs))。优选具有完整或全部长度的α1和/或β1结构域，或者具有基本上完整或基本上全部长度的α1和/或β1结构域，其中，所述基本上完整或基本上全部长度的结构域包括天然序列的各种突变，例如氨基酸插入、缺失或置换，这种突变不影响这种结构域结合肽或本文叙述的其它功能，例如为了递呈这种肽至T细胞受体(TCRs)。本领域技术人员能够确定哪个氨基酸残基可以被突变、修饰或缺失而不影响这种功能。MHC II类分子其它保留的更好的功能是能够使T细胞活化且能更好地使T细胞染色。
因此，本发明这些优选的分子包括α1和β1结构域足够的残基，使得能够结合肽，例如为了递呈这种肽至T细胞受体(TCRs)，以使T细胞活化或让T细胞染色。
本发明其它优选的分子包括α2结构域的至少一部分和β2结构域的至少一部分，只要存在用于形成二硫键的非天然半胱氨酸残基。这种半胱氨酸残基相互之间需要以适当的方向和距离存在，以使半胱氨酸残基之间能够形成二硫桥并能够起作用以稳定重组MHC II型分子。此外，作为整体的重组MHC II型分子无论是就连接肽的能力而言还是就本文所述的其它功能(例如为了将这种肽递呈至T细胞受体(TCRs))而言，仍必须是有功能的。优选具有完整或全部长度的α2和/或β2结构域，或者具有基本上完整或基本上全部长度的α2和/或β2结构域，其中，所述基本上完整或基本上全部长度的结构域包括天然序列的变异，例如氨基酸插入、缺失或置换，这种变异不会影响α2和β2结构域间二硫键的形成和后续重组MHC II类分子的稳定以及不会有害地影响α2或β2结构域的折叠。本领域技术人员能够确定可以突变、修饰或缺失哪个氨基酸残基而不影响这种功能。
α和βMHC II类链的各种结构和功能的结构域和区域的氨基酸位置是众所周知的并在本领域叙述，例如Burrows et al，1999，supra。各种结构域的位置也如图3所示，这些信息可以很容易地被用于设计本文叙述的本发明的重组分子(参见如图7)。
分析本发明重组分子结合肽、使T细胞活化或使T细胞染色的能力的适当功能性测试也是本领域技术人员所公知的，且将包括例如表面等离子体共振(SPR)技术(如Biacore)和流式细胞术技术(如FACS)。特别优选使用流式细胞术，因为流式细胞术可以结合活细胞使用。
本文所用的术语“二硫键”是指任何二硫桥，如改造的或人工的二硫桥，形成于定位在MHC II类异二聚体的α链α2结构域和β链β2结构域的半胱氨酸残基之间(即是与链内(intra-chain)截然相反的链间(inter-chain)二硫键)。所述二硫键在α链和β链之间形成共价键且发挥着稳定MHC II类异二聚体的作用。因此，本发明的重组分子是稳定的，并保留了完整的功能，例如，它们保留了它们对同源T细胞受体的配体的天然特异性，并优选保留了使T细胞活化或使T细胞染色的能力。
可以通过众所周知的方法分析本发明MHC II类分子稳定的或变得稳定的性能，如增强的对热变性的抗性(例如通过ELISA、SPR或圆二色谱法测定)。更优选的测试为评估SDS PAGE凝胶上保留的异二聚体。在非还原条件下，SDS-PAGE凝胶上可以很容易看到完整和稳定二硫键合的异二聚体，可以观察到适当分子量处对应完整异二聚体的带。合理的试验在实施例中显示，参见图5和10。
这种二硫键形成于半胱氨酸残基之间，通常不存在于天然MHC II类α2和β2结构域中。因此，所述半胱氨酸残基被改造或人工地引入，例如通过天然分子中适当的非半胱氨酸残基定点突变为半胱氨酸残基，从而使得在α2和β2结构域中新引入的半胱氨酸残基间形成二硫键。该键也可以被描述为内部二硫键。
用于突变为半胱氨酸的适当残基优选分别具有β-碳原子，所述β-碳原子相距约(0.6nm)、(0.7nm)或以下，例如在(0.4nm)或(0.5nm)至(0.65nm)或(0.7nm)范围内，优选在(0.5nm)至(0.65nm)范围内，最优选在天然MHC II类异二聚体中的距离在(0.4nm)或(0.5nm)至(0.56nm)或(0.6nm)范围内。优选用于突变的位点在物种间和特定物种的亚型(isoforms)和亚类(isotypes)间是保守的。特别地，优选的用于突变的位点在小鼠和人类MHC II类序列间是保守的，或者在人类MHC II类亚类如DP、DQ和DR间或鼠亚类如I-E和I-A间是保守的。
此外，或另外，优选的用于突变的位点通过基于晶体结构的3D叠加(3D superimposition of crystal structures)的结构分析被鉴定。在这种方式中，α2和β2结构域间形成交叉区域的残基能够被检测并可以选择具有相距或者以下(或任何以上所述的其它距离或范围)的β-碳原子的侧链以进一步的分析或突变成半胱氨酸残基。进行这种结构分析的方法是为本领域技术人员所公知的。例如，MHC II类分子的晶体结构随时能够用于进行这样的分析，例如来源于RCSB PDB蛋白数据库。进行这样的晶体结构的3D叠加分析的适当软件或其它方法也在本领域可以得到，例如使用免费的软件如PyMOL、MOLMOL、DeepView或专门的网站如iSuperpose。
特别优选半胱氨酸被引入以形成二硫键的位点对为以下中的一对或多对，即一对或多对Pro 96α2-Ser 119β2(第1排)、Ser 95α2-Ser 121β2(第2排)、Arg 94α2-Asn 151β2(第3排)、Phe 148α2-Gly 152β2(第4排)、Pro 96α2-Thr 101β2(第5排)、Pro 96α2-Ser 121β2(第6排)、Ile 106α2-Asn 151β2(第7排)和Ser 95α2-Asp 122β2(第8排)。根据β碳原子的临近将各位点对排列，且虽然可以使用任意一对，但优选的是1-4或1-3排的位点对。
氨基酸位置和位于α2和β2结构域中以及如上所述的残基对位置上的天然氨基酸的性质适于鼠I-E亚类的MHC II类分子。氨基酸编号与成熟肽的氨基酸(即排除了信号肽的编号)相关。能够被用来鉴定修饰的半胱氨酸残基位置的典型参考序列为IMGT数据库中给出的I-E序列，如图3所示(α链记为H-2EA*02(SEQ ID NO：1)且β链记为H-2EB*01(SEQ ID NO：2))。事实上，在图3中，第1排、第2排和第3排位置的残基用黑色阴影标记，且可以很容易地从图3中确定其它排残基的位置。
因此，除非另有说明，本文所述的MHC II类氨基酸残基的编号和性质遵循Lefranc，M-P.，et al.，2009(Nuc.Acids Res.，37：D1006-D1012，database issue(数据库问题))中描述的IMGT系统以及从以下参考网站获得的IMGT数据库：http://imgt.cines.fr；http://www.imgt.org。实施例中还提供了相关的GenBank(基因库)收录号。例如，H-2E(小鼠I-E)相关的收录号为K00971(α-链)和AF050157(β-链)。
在本发明优选的实施例中，二硫键位于半胱氨酸残基之间，该半胱氨酸残基定位于小鼠I-E亚类的成熟多肽的Pro 96α2-Ser 119β2(第1排)、Ser 95α2-Ser 121β2(第2排)或Arg 94α2-Asn 151β2(第3排)对应的残基上或另外的MHC II类亚类中的相应位置。本文提供了测定这种半胱氨酸残基位置的参考序列。
上述讨论的优选位点对也显示于表2中，表2使用1FNG编号和IMGT编号，即Pro 96α2-Ser 118β2(第1排)、Ser 95α2-Ser 120β2(第2排)、Arg 94α2-Asn 150β2(第3排)、Phe 148α2-Gly 151β2(第4排)、Pro 96α2-Thr100β2(第5排)、Pro 96α2-Ser 120β2(第6排)、Ile 106α2-Asn 150β2(第7排)和Ser 95α2-Asp 121β2(第8排)中的一对或多对。对于1FNG编号，表2的氨基酸编号对应于生物大分子的三维结构信息的蛋白质数据库(PDB)数据库中的编号，检录号(entry number)PDB ID：1FNG，且可以看出，这个数据库记录的β链中适当残基的位置比IMGT数据库序列中的相应残基少一个氨基酸。因此，该命名是略有不同的。
那些如表2和图3所示的相应残基可以很容易地在其它小鼠亚类(如I-A亚类)或人亚类中鉴定到，例如通过使用适当的软件如Clustal软件进行比对。事实上，与小鼠I-A亚类的比对如图3所示。此外，与人类MHC II类同种异型HLA-DP、-DQ和-DR的代表性比对如图7所示。表2和图3中所示的那些第1、2和3排的对应残基的位置用黑色阴影在图7A中标记为α-链和在图7B中标记为β-链，且从图7可以很容易地确定其它排残基的位置。可以看出，表2和图3所示的α2和β2位置在整个人类HLA族群(repertoire)中是完全保守的。
因此，可以很容易地使用图7所示的序列比对和上述信息定位在任何人类MHC II类等位基因的α2和β2结构域中的适当残基突变为半胱氨酸，以形成所需的二硫键排列。类似的比对方法可以用来鉴定任意其它物种或亚类中的对应残基。
本文所讨论的二硫键稳定的连接与稳定MHC II类分子的其它方法和手段如现有技术中的方法和手段是兼容的。例如，二硫键可与各种二聚作用基序如亮氨酸拉链基序(如Quarsten et al.，2001 and Crawford et al.，2006，supra中所述)结合使用，或者与Ig融合(与免疫球蛋白Fc片段融合，如Casares et al.，1997，supra中所述)结合使用，且可以适当地设计本发明的分子以及编码它们的载体。
本文其它地方所述的在原核生物如细菌中表达或制备本发明的分子，宿主是优选的，且在这样的实施方式中，特别是在从包涵体中分离分子的实施方式中，优选不使用亮氨酸拉链基序或其它二聚作用基序。
因此，本发明优选的方面提供了一种能够在细菌宿主中表达的重组MHC II类分子，该重组MHC II类分子包括：
(i)MHC II类分子α链细胞外部分的全部或部分；
(ii)MHC II类分子β链细胞外部分的全部或部分；
其中，(i)和(ii)提供了功能性肽结合结构域，且其中(i)和(ii)通过位于所述α链α2结构域和所述β链的β2结构域中的半胱氨酸残基间的二硫键连接，其中，所述半胱氨酸残基不存在于天然MHC II类的α2和β2结构域中。
另一优选方面提供了一种重组MHC II类分子，该重组MHC II类分子包括：
(i)MHC II类分子α链细胞外部分的全部或部分；
(ii)MHC II类分子β链细胞外部分的全部或部分；
其中，(i)和(ii)提供了功能性肽结合结构域，且其中(i)和(ii)通过位于所述α链α2结构域和所述β链的β2结构域中的半胱氨酸残基间的二硫键连接，其中，所述半胱氨酸残基不存在于天然MHC II类的α2和β2结构域中，且进一步地，所述重组分子不包括亮氨酸拉链基序。在其它实施方式中，不包括二聚作用基序。在这些实施方式中，优选重组MHC II类分子能够在原核生物如细菌宿主中表达。
虽然本发明的二硫键连接可以与稳定MHC II类分子的其它方法和手段结合使用，所述二硫键可以提供稳定MHC II类分子的独有手段。事实上，这是优选的实施方式。本文使用的术语“稳定MHC II类分子的独有手段”是指为稳定分子提供独有或唯一手段的二硫键不是特定MHC II类分子中任何天然存在或固有的稳定性，如本发明的二硫键提供了稳定MHC II类分子的独有的或唯一的人工的或改造的或非天然的手段。因此，这种实施方式排除了本领域所述的其它稳定手段的使用，如亮氨酸拉链或其它二聚作用基序。
令人惊奇的发现，这种二硫键足以稳定MHC II类分子而不需要任何额外的非天然手段的稳定如二聚作用基序，这已在本文提供的数据中得到了很好的证明，其中该分子以稳定和有功能的形式存在于丝状噬菌体表面。该发现特别令人惊奇的是这样的事实，以Ig折叠拓扑结构(Ig foldtopology)构建的改造分子在天然生物宿主中表达。在自然界只出现在生命的真核生物域的Ig折叠需要在天然半胱氨酸间形成保守的域内S-S桥(Halaby，D.M.，et al.，1999，Protein Eng.，12(7)：563)，以完成其功能的拓扑结构。因此，被普遍接受的是，当该分子在原核生物宿主中表达时，难免缺乏正确形成S-S桥所需的复杂真核细胞伴侣机制，明显异常S-S桥的形成，会导致功能性表达的缺失。包括增加半胱氨酸数量的改造方法，不是说在这些系统中确定的形成人工S-S桥，因此，一般被认为是无法生存的。在此，我们明确地提供了这不是事实的证据，因为功能性分子通过表现出特异性结合到同源配体(图6和图9)的共价二聚体的形成显示于所示噬菌体上(图5和图10)。
在一个实施方式中，本发明MHC II类分子的α和β链还包括链内二硫键，如天然存在的存在于天然存在的半胱氨酸残基之间的链内二硫键。例如，这种天然存在的链内二硫键可能存在于α2和β2结构域中，以形成这些结构域的Ig折叠拓扑结构。此外，大多数MHC II类分子在连接β-折叠层与α-螺旋部分的β1结构域中具有域内二硫桥。更重要的是，许多MHC II类分子在β1结构域的β-折叠层中包含额外的游离半胱氨酸，它不参与任何二硫键的形成，但可以与新引入的非天然半胱氨酸残基形成错误的二硫键。因此，在本发明优选的实施方式中，特别是在使用原核生物表达的实施方式中，剔除了该残基，例如通过突变成保留完整结构的其它残基，如丝氨酸或丙氨酸。技术人员能够很容易地在任何MHCII类等位基因中确定该半胱氨酸残基的位置。例如，图3B(如SEQ ID NO：2)所示的全长IMGT参考序列H-2EB*01中的β链残基38对应的半胱氨酸，或者成熟IMGT参考序列(即无信号肽的序列)中的残基12。
其它β1结构域半胱氨酸(形成桥的半胱氨酸)，该半胱氨酸也可以与新引入的非天然半胱氨酸残基促进错误二硫键形成，也可以很容易地被技术人员找到。例如，位于图3B(SEQ ID NO：2)所示的全长IMGT参考序列H-2EB*01中的残基42和106，或分别是成熟IMGT参考序列(即无信号肽)的残基16和80。在本发明替代和优选的实施方式中，不存在一个或多个这些半胱氨酸残基。这可以通过将适当的天然半胱氨酸残基中的一个或多个突变为不参与二硫键形成的另一种氨基酸残基来实现，以防止键的形成。取代半胱氨酸的代表性残基为保留分子完整结构的，例如，保留氢键。上述Ser或Ala为首选的。
上述一个或多个天然半胱氨酸残基的剔除应当有利于防止在天然半胱氨酸残基和本发明新改造的非天然半胱氨酸残基之间形成错误的二硫键。因此，在本发明优选的实施方式中，剔除了β1结构域中的一个或多个天然半胱氨酸残基。在本发明特别优选的实施方式中，对应全长参考序列H-2EB*01(SEQ ID NO：2)位置38、42或106的半胱氨酸残基中的一个或多个(或成熟参考序列中的相应残基)，或者其它MHC II类亚类中相应位置处半胱氨酸残基中的一个或多个被剔除。
本文使用的术语“功能性肽结合结构域”是指本发明重组MHC II类分子中能够与肽(如T细胞效应器肽或抗原肽)结合的结构域。这种肽结合应当处于能够检测的水平且用来检测结合的适当方法为本领域技术人员所公知，如表面等离子体共振(SPR)技术或流式细胞术技术。在一些实施例中，所述肽以这样的方式被结合，从而能够将所述肽递呈至TCR，或者至少测试所述肽是否能够被递呈至TCR。
优选地该肽以这样的方式与MHC II类分子结合或联合，从而能够使TCR与pMHC复合体结合。更优选地，这种与TCR的相互作用使得识别pMHC复合体的T细胞被染色或是可见。优选地，这种肽结合结构域能够结合肽，然后开始通过TCR活化T细胞，如能够诱导T辅助细胞例如分泌细胞因子如IL-2，或者诱导细胞增殖(如通过将BrdU并入为cpm进行测量)。这种肽结合结构域通常由来源于MHC II类分子α1和β1结构域的残基形成。
本发明的MHC II类分子可以以无修饰或空载的形式提供，即没有肽结合到上述的肽结合结构域(即不含肽)。在这种情况下，随后可以在体外用任何适当的肽装载MHC II类分子。这种体外装载优于许多在先的MHC II类分子，为了有助于II类异二聚体的稳定，必须附加肽而制备，如按照借助短接头(linker)将肽制备成具有MHC β链的共价融合蛋白的方式制备。体外装载能够产生真正通用的MHC II类分子，而无需为每个不同的MHC-肽复合体提供不同的表达载体。
在本发明的一些实施方式中，重组MHC II类分子含有与上述肽结合结构域结合或联合的肽。可以使用任何适于与由MHC II类分子的α1和β1结构域的残基形成的肽结合结构域相结合或联合的肽。通常这种肽为12-25mer，且通常由α1和β1结构域形成的凹槽两端伸出。
在天然的MHC II类分子中，该肽源于外源性抗原。在本发明中，可以使用任何这种多肽。例如，本领域已经鉴定的和文献报导的一些由MHC II类分子递呈并引起TCR结合和T细胞活化的特异性T细胞效应器肽，且这些肽中的任何一个可以与本发明结合使用。特别地，已经确定了由MHC II类分子递呈的特定肽与特定疾病存在联系，且在本发明重组MHC II类分子与肽联合的实施方式中，优选疾病特异性肽。本领域已经描述了一些这样的肽，而其它的在将来将被鉴定，这些肽中的任何一个均适于与所述MHC II类分子使用。
与MHC II类分子肽结合结构域联合或结合的代表性肽为已被发现的由HLA-DQ2MHC II类分子递呈且与腹腔疾病相关的人类α-II-醇溶蛋白(N-PQPELPYPOPE-C)；已被发现的由HLA-DR4MHC II型分子递呈且与类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)相关的人类hCkappa aa40-48(N-WKIDGSERQ-C)；已经发现的由HLA-DP1 MHC II类分子递呈且与破伤风相关的人类TTaa947-967(N-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-C)；以及已经发现的由鼠I-Ed II类分子递呈且源自H型流感(H.influenza)(aa110-120：N-SFERFEIFPKE-C)的禽流感膜蛋白(HA)衍生的肽。
另外，可以使用其它肽，例如鉴定这些肽是否可以与肽结合结构域结合以及它们是否能够使T细胞结合以及优选通过TCR使T细胞染色或使T细胞活化。以这种方式，本发明的分子可以用于鉴定充当T细胞表位的新的和先前未知的肽(如抗原肽)。
另外，重组MHC II类分子可以与无关的或非T细胞效应器肽(所谓的“填充”肽)联合，所述无关的或非T细胞效应器肽可以通过打开将其连附至MHC分子的接头而从MHC II类分子中释放出来，然后被参与体外肽交换反应的T细胞效应器肽取代。
可以以任何适当的方式促进所述肽与MHC II类分子的结合或联合。例如，可以改造本发明的构建体，使得这种肽与MHC II类分子结合而制得(如通过在相同的构建体上编码它们，如编码通过适当的接头序列共价连接至βMHC II类链或αMHC II类链的肽，或者在相同宿主细胞中的不同构建体)，从而促进重组MHC II类分子的制备(该重组MHC II类分子可递呈或结合或联合被适当的T辅助细胞识别的所述肽)。制备所述肽联合分子的适当方法如Kozono等1994(Nature，369：151-154)所述。Kozono的方法使用18aa的残基接头，然而在本发明优选的实施方式中，更短的接头如15aa接头(如Gly-Ser接头如(G4S)3)或6、7或8aa残基接头(如Gly-Ser接头如GSGSGS、GGSGSGS、SGSGSGS或SGGSGSGS)，最优选使用6aa的残基接头。
本发明普遍适用于任何类型的MHC II类分子，例如适用于任何物种的MHC II类分子和那个物种中MHC II类分子的任何子型(sub-type)。特别地，本文鉴定的残基(该残基用于突变为非天然半胱氨酸残基以促使一个或多个链间二硫键的形成)为物种间保守的，从而支持了方法的普遍性。因此，本发明能够适用于所有哺乳动物的MHC II类分子，如人类、小鼠、大鼠、猪、山羊和绵羊，特别是人类和小鼠分子。例如，本发明适用于DP、DQ和DR人类MHC II类分子(即三种在人类中鉴定的功能性MHC II类分子类型)和小鼠I-A和I-E分子(例如I-Ed和I-Ek分子，优选I-Ed)。其它I-A和I-E分子的例子如下表所示。
用常规使用的近交系小鼠(inbred mouse strain)表达MHC等位基因：
最优选MHC II型分子是人类的。
由于鉴定的用于突变为半胱氨酸的残基在物种间是保守的，本领域技术人员可以很容易地鉴定任何物种的任何MHC II类分子中用于突变的对应、相应和适当残基，从而制得被一个或多个适当的链间二硫键稳定的重组MHC II类分子。
在本发明的一个实施方式中，重组MHC II类分子在细胞或另一个生物实体或组件(package)表面表达，例如在丝状噬菌体表面。本文引入的这种形式有时为“非水溶性”形式或“非水溶性”分子。在这样的实施方式中，本发明MHC II类分子的α链或β链通常被改造为融合蛋白，所述融合蛋白具有通常在已讨论的实体表面表达或者嵌入已讨论的实体表面或与已讨论的实体表面联合。
优选与噬菌体表面蛋白融合而表达，且在这样的实施方式中，可以设想到本发明MHC II类分子的或者α链或者β链可以与任何适当的噬菌体表面蛋白融合。优选的例子为与gpIII、gpVIII、gpVII或gpIX的融合，更优选与gpIII的融合。本发明MHC II类分子在噬菌体颗粒表面表达的方法为本领域技术人员所熟知，且代表性的技术和方法如实施例中所述。优选的方法如WO09/024591中所述。
在本发明另外的实施方式中，重组MHC分子是水溶性分子，例如本发明的MHC II类分子(该MHC II类分子不联合细胞或其它生物实体表面，或在细胞或其它生物实体表面表达，如与病毒衣壳蛋白或引起与生物实体表面联合或络合的其它蛋白融合)。因此，代表性的可溶性分子包括仅含有本发明分子细胞外部分(i)和(ii)的分子，并且还包括不影响分子溶解性的含有其它短元件的胞外结构域，如短C-端延伸如亲和标记物和/或二聚作用基序。基于制备系统，所述可溶性分子可以由宿主细胞分泌或者可以通过任何其它适当的方法从宿主细胞获得。所述可溶性分子可以以一种基本纯净的形式提供或者作为纯化或分离的制剂。例如，可以将所述可溶性分子制备成基本上不含其它蛋白质的形式。
在本发明优选的实施方式中，所述重组MHC II类分子制备成多聚体的形式(multimeric form)如具有多价性能(multivalent properties)。所述多聚体形式有利于使得MHC II类分子与T细胞受体结合，由于单个的pMHC复合体和T细胞受体间的亲和力通常是相当低的。所述多聚体形式包括多个(多于一个)本发明的重组MHC II类分子。优选地，多个MHC II类分子的每一个是相同的。
可以使用任何适当的方法制备MHC II类分子多聚体形式，本领域已经描述了几个方法(例如参见Vollers et al.，2008，supra)。制备本发明MHCII类分子多聚体形式的特别有利的方法是通过在丝状噬菌体表面使用展示(display)。在该方法中，可以利用噬菌体分子的天然结构，以通过选择与MHC II类分子融合和联合的适当噬菌体结构蛋白而产生多聚体。例如可以将与gpIII、gpVII或gpIX的融合，优选与gpIII的融合，用于在各个噬菌体颗粒表面获得3-5个拷贝的MHC II类分子。与gpVIII的融合可被用于获得比这更多的拷贝数(野生型噬菌体中约有2700个拷贝数的gpVIII)。因此，重要的是，与gpIII展示和典型的四聚体技术相比，pVIII展示将MHC化合价增加了至少一个数量级，这大大增强了灵敏度。这将要开辟新的和令人关注的应用。
已知的噬菌体展示和构建体设计技术，例如可以使用噬菌粒构建体和改良类型的辅助噬菌体去改变噬菌体表面的MHC II类分子的拷贝数。由于具有在噬菌体表面产生多聚MHC II类分子的能力，这有利地使得多聚MHC II类分子的制备或生产以单一快速、成本低的进程进行。这与传统的四聚体技术形成了鲜明的对比，如Vollers et al.，2008中所述的技术，其中在试剂适于下游应用前，各个组分是分开制备、混合、合成和纯化的。
因此，优选的多聚体包括两个或三个或四个或五个或更多的彼此相连的重组MHC II类分子。可以使用本领域已知的和已记载的方法进行所述联合，但是一般由另一种连接如接头分子介导。适当的接头分子为众所周知的且已有记载，且特别适合的接头分子具有多个连接所述重组分子的结合位点。例如，可以使用分别具有多个生物素结合位点的多个接头分子如抗生物素蛋白(avidin)和链霉亲和素(streptavidin)(或任何其它以多价方式与生物素结合的分子)。因此，使用本领域已知的方法(如使用AviTag或其它BirA底物以使酶生物素化)将生物素整合到重组MHC分子中将能形成多聚体如MHC分子的四聚体。还可以方便地将标记整合到多聚体形式中，如用荧光链霉亲和素或通过将标记与噬菌体外壳蛋白融合，例如与选用于MHC II类分子展示的那个不同类型的外壳蛋白。这种标记的整合能预先通过各种已知的技术检测四聚体。例如，荧光标记的使用允许细胞计数技术如FACS分析可以被用到，这是非常有利的。
本发明MHC II类分子或其多聚体还可以被涂覆到固体支撑物如平面或颗粒固体支撑物如膜、板或珠上。本领域公知或有文献报导这种技术。
如本文所述，本发明的MHC II类分子以及使用一个或多个MHC II类分子α2和β2结构域间的改造二硫键以稳定所述分子与所有制备MHCII类分子的现有技术方法是兼容的。因此，本发明与在本领域描述的任何在先的MHC II类分子形式是兼容的，并能够提高产品的制备效率和稳定性。特别地，本发明扩大了重组MHC II类的适用性和多功能性，由于现在所述分子可以以二硫键稳定的形式制备，例如(i)细菌周质的功能性、可溶性分子，(ii)在纯化之后可被溶解并重折叠为功能性实体的细菌包涵体的非功能性组成成分，优选比目前的标准方法具有相当更高的产量(目前的标准方法最多为起始原料的30％，如参见Arimilli et al，1995，supra)，(iii)丝状噬菌体系统中噬菌体展示的元件，(iv)真核细胞中的Ig融合；以及(v)真核细胞中的可溶性MHC II类分子。
有利地，方法(ii)-包涵体方法，和(iii)-噬菌体展示方法，将立即使得两个非常重要的应用用于重组MHC II类分子的有效使用，其中方法(iii)是非常新颖的。在这方面，pMHC II类在丝状噬菌体病毒粒子上成功的功能性展示在以前从未实现过，且开辟了新的或改进的应用，如(a)在MHC II类的背景下，噬菌体展示的肽库；(b)任何特定的pMHCII类制品的极快速和简单制备；以及(c)MHC II类分子的多价丝状噬菌体展示，作为传统pMHC II类多聚体的替代物如四聚体，除了病毒粒子可被小成本和快速制备。
本发明的MHC II类分子具有特殊的价值并可用作科研试剂。这是本文所述的多价形式和噬菌体展示形式的特殊情况(可以很容易地被设计为多价，是由于展示MHC II类分子的噬菌体颗粒的固有结构)。因此，对于这种应用，优选的是MHC II类分子的四聚体形式和噬菌体展示形式，特别是多价噬菌体展示形式。可以将本发明MHC II类分子的四聚体形式或多价噬菌体展示形式用作优选的替代性试剂用于使用传统四聚体的任何应用中。本发明分子可被用作传统四聚体的替代的优选的应用为T细胞的MHC染色，所述T细胞的MHC染色通常包括基于利用pMHC低聚物如二聚体和高级低聚物(higher order oligomers)进行T细胞检测的流式细胞术。这里展示的数据显示当前发明的MHC分子可用于流式细胞术分析中以使T细胞染色。这是非常有利和重要的性能，因为许多现有的MHC II类四聚体不能使抗原特异性TH细胞染色，即使该四聚体可以活化T细胞。因此，本发明优选的MHC II类分子具有能够检测染色T细胞的能力，例如使用流式细胞术。特别能用多聚或多价形式的分子观察到该性能，虽然可以利用单体形式观察T细胞的染色。通常，多聚噬菌体展示形式的进一步的优势是可以使用低滴度的噬菌体获得相同的结果，如T细胞染色。
如上所述，当所述MHC II类分子制备成试剂时，它们可以具有或不具有联合的肽。可以将所述试剂制备成蛋白质、或编码所述MHC II类分子的核酸，例如一种或多种表达载体的形式。
所述试剂，特别是用于以上描述的T细胞染色的试剂，能被用于研究T细胞对特定肽的应答，例如研究T细胞反应的族群和动力学以及能够实现抗原特异性CD4+T细胞的直接离体(ex vivo)分析，例如在外周血液(peripheral blood)中。迄今，分析与重组MHC II类分子有关的外周血液已是一个挑战。它们也可能被用于在体内、体外和离体状态下分离和鉴定抗原特异性T细胞。以这种方式鉴定的T细胞可以进行进一步的研究，扩展或活化且在治疗中具有潜在的用途。
还可以将本发明的重组MHC II类分子用作免疫调节剂筛选的平台。涉及免疫系统的疾病的关键步骤是抗原递呈细胞和T-细胞间的相互作用。特别是抗原递呈细胞上的MHC II类复合体是至关重要的，因为它能够结合外源衍生肽(exogenously derived peptides)并将其递呈给T辅助细胞。然后活化所述T辅助细胞并分泌各种能够广泛活化效应器细胞的细胞因子。
对稳定的要求，如本文所述的完全功能性MHC II类分子，特别是这种分子的可溶形式，对提供免疫调节剂(可以调节，如上调或下调)的筛选平台、对T辅助细胞和MHC II类分子间的相互作用以及对随后T辅助细胞和效应器细胞的活化是至关重要的。在本发明之前，所述筛选受阻于很难高产量和低成本地制备稳定的MHC II类分子。因此，本发明的重组MHC II类分子可以被用来作为免疫调节剂的筛选平台。
本文其它地方还描述了在所述方法中优选使用的MHC II类分子。优选地，将所述MHC II类分子与疾病特异性的肽联合。所述肽的例子如本文和现有技术所述且包括与疾病特异性肽(如腹腔疾病)相关联的人类HLA-DQ2分子或I型糖尿病特异性肽、与类风湿性关节炎疾病特异性肽相关联的人类HLA-DR4MHC II类分子以及与特异性破伤风肽相关联的人类HLA-DP1 MHC II类分子。同样可以使用其它与本发明MHC II类分子相联合的肽。
然后，在MHC II类的环境下，能够特异性识别这些疾病相关肽的T细胞被鉴定，例如，使用如上所述本发明的MHC II类分子，或以其它方式获得的(例如，一些这样的细胞系已经被科学家开发出来)，之后对一个或多个化合物调节T细胞和抗原递呈细胞之间的相互作用或其下游事件(例如细胞因子的分泌和效应细胞的功能)的能力进行评估。可以将本发明的重组MHC II类分子，特别是所述分子的噬菌体展示形式用于表位研究(epitope discovery)，如通过T细胞(T细胞表位)识别的抗原肽表位的鉴定和表征。因此，本发明的进一步的实施方式是提供了能够被T细胞识别的抗原肽表位的鉴定方法，其中，所述方法包括将本发明的重组MHC II类分子与T细胞受体接触，以及检测所述重组MHC II类分子与所述T细胞受体结合的步骤。T细胞受体的结合表明存在与MHC II类分子联合的抗原肽表位，之后可以进一步分析和描述所述表位的特征。
例如，可以通过将多样性(diversity)插入在固定的MHC环境下展示的抗原肽中而制得表位库(library of epitopes)。然后筛选该库，例如利用重组、可溶性TCRs或噬菌体展示TCRs、或其它T细胞群如来源于患者的T细胞。现有方法杆状病毒库(bacculovirus libraries)的产量低且具有不能够在活细胞上进行选择的进一步缺点(Crawford et al.，2004，PLosBiology，2：0523-0533)，对比于现有方法，这将是主要的改进。
可以将本发明的重组MHC II类分子用作诊断试剂。例如，如本文其它地方所述，可以将疾病特异性肽与本发明的MHC II类分子合成或联合，且可以将它们用于检测样品(如从可能患有疾病的患者身上取得的血液样品)中疾病特异性T细胞的存在或缺失。疾病特异性T细胞的存在，特别是如与没患病的患者所示的标准相比，存在大量的疾病特异性T细胞则显示为阳性的诊断。
因此，本发明的另一个方面，提供了检测样品中抗原特异性T细胞的方法，其中所述方法包括将本发明的重组MHC II类分子与所述样品接触，并检测所述重组MHC II类分子与所述T细胞结合的步骤。所述重组MHC II类分子与所述T细胞的结合表明抗原特异性T细胞的存在。
可以将这种方法用于检测样品中的疾病特异性T细胞的存在并诊断是否患有疾病。使用这种方法可以诊断的适当疾病为与疾病特异性肽联合的MHC II类分子的疾病。代表性的疾病如本文其它地方所述，且包括腹腔疾病、风湿性关节炎、破伤风和流感。
还可以表征获得性疾病特异性T细胞以及所述T细胞和本发明MHCII类分子间的相互作用，以更加全面地了解特定疾病背后的机制。因此，这是本发明MHC II类分子如何可以被用作研究试剂的另一个例子，如监测和表征特异性T细胞反应。
当本发明的重组MHC II类分子与肽联合时，可以被用作TCR亲和力成熟中的靶标。
本领域技术人员能够理解本发明的重组MHC II类分子可以通过本领域熟知和记载的各种方式中的任何一种制备，但是最优选利用重组的方法制备。
因此，可以利用基因克隆技术制备本发明的MHC II类分子且适当的技术已被公开，例如J.Sambrook et al.，Molecular Cloning，2nd edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989。因此，含有编码本发明MHC II类分子的链(如α和/或β链)的序列的核酸分子、或其互补序列也进一步构成了本发明的另外方面。
可以通过任何适当的方法得到或制备编码本文所述MHC II类分子α链(即链(i))或β链(即链(ii))的核酸分子，如通过克隆或合成。例如，可以通过克隆适当来源(如细胞，如从标准的血沉棕黄层(buffy coat)中分离的白细胞)的适当序列制备所述序列，可以使用PCR技术如标准RT-PCR技术利用适当引物克隆适当的序列，所述引物利用与特定MHC II类等位基因相关的序列(从GenBank中获得，但是更容易从IMGT数据库中获得)设计。还可以进行完整的基因合成，特别是原核生物的表达促使密码子最优化，这对最大限度地提高产量是很重要的。
一旦克隆或合成了初始序列后，可以利用本领域熟知或已记载的方法对所述序列进行任何所需的修饰以获得编码本发明突变的半胱氨酸残基的核酸分子，例如通过定点诱变。
此外，如果期望或需要，可以操纵MHC II类分子α和/或β链的其它部分以制得本发明的分子。因此，例如，可以剔除编码跨膜和胞浆结构域的核苷酸，任何被认为对本发明分子非必需的其它区域是有功能的。
一旦获得编码本发明MHC II类分子的两条链的核酸片段，可以通过标准的重组DNA技术对这些片段进行进一步的操纵，例如为了包括其它所需的元件、调控序列等，或者为了合并非天然半胱氨酸残基或为了剔除本文其它地方所述的天然半胱氨酸残基。通常情况下，或者作为其它操纵步骤的部分，可以将编码本发明MHC II类分子的核酸片段整合到一个或多个适当的表达载体中，且将所述载体整合到宿主细胞中，以促进本发明MHC II类分子的制备。所述表达载体和含有所述表达载体的宿主细胞还构成了本发明的另外方面。
因此，另一方面还提供了一种包括一个或多个本发明核酸分子的表达构建体或表达载体。优选所述表达构建体或载体为重组体。优选所述构建体或载体也包括必要的调控序列，所述调控序列用于由本发明核酸分子编码的蛋白序列的转录和翻译。
另一方面提供了一种含有一个或多个本发明表达构建体或表达载体的宿主细胞。还提供了一种含有一个或多个本发明核酸分子的宿主细胞。表达本发明MHC II类分子的宿主细胞构成了另一方面。
本发明的另一方面提供了一种制备本发明MHC II类分子的方法，如包括培养本发明宿主细胞的步骤。优选的方法包括以下步骤(i)在适于编码的MHC II类分子α和β链表达的条件下，培养含有本发明的一个或多个重组表达载体或一个或多个核酸序列的宿主细胞；以及可选地(ii)从宿主细胞或培养介质/上层清液中分离或获得蛋白质。所述制备的方法还可以包括纯化蛋白质产品的步骤。优选地，所述制备的方法在原核生物如细菌、本文其它地方所述的宿主细胞中进行。
因此，本发明的另一方面提供了一种制备重组MHC II类分子的方法，该方法包括：
(i)MHC II类分子α链细胞外部分的全部或部分；
(ii)MHC II类分子β链细胞外部分的全部或部分；
其中，(i)和(ii)提供了功能性肽结合结构域，且其中(i)和(ii)通过位于所述α链α2结构域和所述β链的β2结构域中的半胱氨酸残基间的二硫键连接，其中，所述半胱氨酸残基不存在于天然MHC II类的α2和β2结构域中。
所述方法包括在原核生物，优选细菌、宿主中表达所述重组分子。
如上所述，可以将原核宿主细胞用于制备并入二硫键的本发明功能性的MHC II类分子，这一事实是令人惊奇的和有利的。
由于本发明MHC II类分子由多个多肽链组成(即异二聚体)，在一些实施方式中，例如，对于涉及噬菌体展示、细菌周质表达和真核生物表达的实施方式中，优选所有的多肽在同一宿主细胞中表达，来自于相同的或不同的表达载体，使得在宿主细胞中可以组装完整的二聚蛋白，并从中分离和纯化。对于其它实施方式如通过蓄意包涵体制备的方式在细菌中批量生产，必须在不同的宿主细胞中表达各个链(特别是宿主细胞的相同类型/菌株)。
可以使用任何适当的制备系统(如原核和真核系统都可以使用)并相应地选择和设计表达载体以确保与使用的宿主细胞的兼容性。因此，表达载体“适于宿主细胞的转化”，指的是表达载体包括一个或多个本发明的核酸分子和根据用于表达的宿主细胞而选择的调控序列，所述调控序列与核酸分子有效地连接(operatively linked)。有效地连接是指核酸与调控序列以能够使核酸表达的方式连接。
在本发明的实施方式中，所述MHC II类分子为不可溶形式，如在另一个生物颗粒或膜表面展示，本发明MHC分子的展示可以通过本领域记载的方法实现。例如，在本发明优选的实施方式中，所述MHC II类分子在丝状噬菌体表面上展示，可以使用任何适当领域内记载的方法。例如，可以参考标准文本如Sachdev S.Sidhu，1995的“Phage Display inBiotechnology and Drug Discovery”或者Barbas et al.，1994的“PhageDisplay：A Laboratory Manual”。代表性的方法和系统如WO09/024591中所述或者如实验性的实施例中所示。
在一般情况下，优选将噬菌粒载体用于本发明噬菌体展示方面且这需要使用本领域技术人员能够很容易选择的适当辅助菌株。可以商购获得许多适当的辅助噬菌体菌株如VCSM13辅助噬菌体(Stratagene)和HyperPhageTM(Progen Biotechnik股份有限公司(GmbH))，且可以方便地使用其中的任何一种。可以方便地将MHC II类异二聚体的一条链，即α链或β链之一整合到载体而融合到选定的外壳蛋白中，如gpIII或本文其它地方所述的其它外壳蛋白中的一种，同时将另一条链制成可溶性分子，即不与外壳蛋白融合。通常在所述外壳蛋白的N-端进行与外壳蛋白的融合。在随附的实施例中，将β链制成与外壳蛋白融合而将α链制成可溶形式。
在构建体/噬菌粒载体中还可以存在其它适当的元件，其中许多在这种载体中是标准性的。例如，通常整合用于指导蛋白质进入周质空间的信号序列，如pelB，连同整合例如适当的启动子/操纵序列、核糖体结合位点、复制起始点、转录终止子等。代表性的噬菌粒载体和元件如图2所示，且可以将一个或多个这些元件整合到本发明的表达载体中。
在本发明的实施方式中，提供了结合到重组MHC II类分子肽结合结构域的肽，然后也可以将它们方便地整合到构建体/表达载体中的适当位置。通常可以将它们制成与α或β链的共价融合，例如，通过接头肽与β链的N-端融合，例子如本文其它地方所述。。
在本发明的实施方式中，MHC II类分子为可溶形式的，所述分子可以通过在细菌宿主细胞如大肠杆菌(E.coli.)中作为包涵体表达，并随后在体外折叠而获得。所述体外折叠发生在利用标准方法及对其进行适当修饰的适当的折叠条件下(如Qoronfleh et al.，2007，Protein Expression andPurification 55：209-224中所述)。
另外，可以通过在细菌宿主细胞如大肠杆菌中表达而获得本发明的可溶性MHC II类分子，其中所述分子在所述宿主的周质中制得。可以通过利用适当的表达载体实现在周质中的制备，例如整合指导蛋白质进入周质空间的信号肽如pelB。
在原核宿主，特别是在细菌宿主中制备本发明的MHC II类分子是本发明的优选实施方式。所述制备方法与噬菌体展示和本文所述的MHC II类分子的可溶形式是兼容的，且可以用于提供大量高纯度的蛋白质。特别优选从包涵体中制备可溶性分子，以获得大量高纯度的蛋白质。本发明的重组MHC II类分子包含改造的二硫键而具有增强的稳定性，特别适于高产量包涵体的制备，且优选能够从包涵体中获得更高产量的功能性MHC II类分子，超过当前能得到的(现有产量低于起始原料的10％是很正常的)。
可以将任何适当的原核或细菌宿主用于所述制备。优选的宿主细胞为革兰氏阴性宿主细胞，更优选为大肠杆菌。用于噬菌体展示形式的适当大肠杆菌宿主为本领域技术人员熟知且包括例如XL1-blue。优选的用于制备可溶形式，特别涉及从包涵体中纯化的可溶形式的大肠杆菌为大肠杆菌K12衍生物，最优选为其BL21表型及其衍生物(Terpe，K.，ApplMicrobiol Biotechnol.2006 Sep；72(2)：211-22)。
用于可溶性周质表达的适当细菌宿主为本领域技术人员所熟知(例如参见综述Terpe，K.，Appl Microbiol Biotechnol.2006 Sep；72(2)：211-22)。
另外，可以通过在真核细胞系统(如酵母菌(包括毕赤酵母属)、哺乳动物或昆虫细胞)表达而获得本发明的可溶性MHC II类分子。用于所述制备工艺的适当的宿主细胞为本领域技术人员所熟知。本发明使用真核宿主细胞的优选实施方式是将本发明的重组MHC II类分子制成与免疫球蛋白(Ig)Fc部分的融合，即Ig融合，如Casares et al，.1997，supra中所述。在这样的实施方式中，可以将免疫球蛋白分子的Fc部分，如IgG2a分子的Fc部分，与α或βMHC II类链(通常与β链的C-端)融合，并用于实现本发明重组MHC II类分子(即包括本发明人工二硫键的分子)的α和β链的二聚作用。所述分子可以在昆虫细胞系统(或其它适当的系统)中表达，如通过用杆状病毒感染昆虫细胞，从而可以制得分泌性二硫键稳定的MHC II类分子。
本发明表达载体中使用的适当调控序列可以有各种来源，包括细菌的、真菌的、病毒的、哺乳动物的或昆虫基因(例如参见Goeddel，1990，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA，1990中所述的调控序列)。适当调控序列的选择取决于宿主细胞的选择，且一个本领域普通的技术人员就能够很容易地完成。这种调控序列的例子包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列、包含翻译起始信号的核糖体结合序列。此外，根据宿主细胞的选择和使用的载体，可以将其它序列如复制起始点、额外的DNA酶切位点、增强子以及能够诱导转录的序列整合到表达载体中。
本发明的表达载体还可以包括可选的标记基因，所述标记基因有利于利用本发明的重组分子转化或转染了的宿主细胞的选择。可选的标记基因的例子为编码蛋白质的基因，所述蛋白质如赋予特定药物抗性的新霉素和潮霉素、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤火虫荧光素酶或免疫球蛋白或其部分如免疫球蛋白的Fc部分，优选IgG。可以理解的是，可以将可选标记引入从感兴趣的核酸中分离的载体上。
重组表达载体还可以包括编码融合部分的基因，所述融合部分能够提供表达增加的重组蛋白；溶解度增加的重组蛋白；并通过在亲和纯化中作为配体发挥作用而有助于靶重组蛋白的纯化(例如适当的“标记”，使可能存在的纯化和/或鉴定能够进行，如His标记、HA标记、FLAG标记或myc标记)。例如，可以将蛋白水解位点添加至靶重组蛋白中以在融合蛋白的纯化之后从融合部分分离重组蛋白。代表性的融合表达载体包括分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A与重组蛋白融合的pGEX(Amrad公司，墨尔本，澳大利亚)、pMal(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)。
表达载体其它可选的元件包括生物素化序列(特别是涉及多聚体形式的实施方式)如AviTag或其它BirA底物、用于检测的标记，如能够进行流式细胞术的荧光标记。
可以将表达载体引入宿主细胞中以制得转化的宿主细胞。术语“用…转化”、“用…转染”、“转化”和“转染”是指通过本领域已知的各种可能技术将核酸(如载体)引入细胞中。本文使用的术语“转化的宿主细胞”还指的是包括用本发明的重组表达载体转化的能够糖基化的细胞。可以通过例如电穿孔或氯钙介导的转化，用核酸转化原核细胞。例如，可以通过传统的技术如磷酸三钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染、电穿孔或显微注射将核酸引入哺乳动物细胞中。Sambrook et al.，1989和其它实验教科书中记载了转化和转染宿主细胞的适当方法。对于本发明涉及噬菌体展示的方面，通用的噬菌体展示教科书可以用于相关技术的参考，如Sachdev S.Sidhu，1995的“Phage Displayin Biotechnology and Drug Discovery”或者Barbas et al.，1994的“PhageDisplay：A Laboratory Manual”。
可以通过重组技术融合制备包括与其它分子结合的本发明蛋白质的N-端或C-端融合蛋白。产生的融合蛋白含有与其它选定蛋白(如本文所述的标识蛋白或标记蛋白)融合的本发明的蛋白质。还可以通过其它已知的方法将本发明的蛋白质与其它蛋白质共轭结合。例如，该蛋白质可以利用如WO 90/10457中所述的含有异双功能的硫醇的接头(heterobifunctional thiol-containing linkers)、N-琥珀酰亚胺-3-(2-硫代吡啶-丙酸酯)(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio-proprionate))或N-琥珀酰亚胺-5硫代醋酸酯(N-succinimidyl-5thioacetate)进行耦合。可以用来制备融合蛋白或轭合物的蛋白质的例子包括细胞结合蛋白如免疫球蛋白、激素、生长因子、凝集素、胰岛素、低密度脂蛋白、胰高血糖素，内啡呔，转铁蛋白、铃蟾肽(bombesin)、去唾液酸糖蛋白谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、血凝素(HA)和截断的myc(truncated myc)。
与编码本发明第一个MHC II类分子的核酸分子的制备方式无关，可以很容易通过标准的分子生物学技术制备其它适合的变异核酸分子。为了确认编码本发明MHC II类分子的任何变体、突变或第二代核酸分子都适用于本发明，将对核酸分子进行测试以确定其在本文其它地方所述的功能性。优选，将对变体、突变或第二代核酸片段进行测试以确定在标准条件下杂交，更优选在标准的严格杂交条件下杂交。代表性适当的杂交条件包括在约7％的十二烷基硫酸钠(SDS)、约0.5mM的NaPO4、约1mM的EDTA中于约50℃进行杂交，并用约1％的SDS于42℃洗涤。
附图说明
下面将结合附图和非限制性的实施例进一步描述本发明，其中：
图1显示了连接小鼠MHC II类分子I-Ek(PDB：1FNG)α2-β2结构域的推定二硫桥的硅片模型。表2中显示了最上面3排aa对的wt(上图)和对应的突变体残基(下图)：包括相关原子间距的第1排(A)、第2排(B)和第3排(C)。
图2显示了基于PIII展示噬菌粒pSEX81(GenBank收录号：Y14584)的pFABDFN噬菌粒的载体骨架。噬菌粒可以分别通过NcoI/SpeI和MluI/SfiI部分的表达盒变化容纳框架中外源序列的片段(称为E1和E2)。分别将I-Ed α-链(aa 26-204)和β-链(aa 27-216)插入E1和E2。缩略语：lacPO，lac启动子；sd，Shine-Dalgarno序列；pelB，细菌果胶酸酯裂解酶的信号序列；t，T7转录终止子；xPO，fkpA的天然启动子；FkpA，fkpA的开放阅读框；f1 IG，噬菌体f1的间隔区；AmpR，β-内酰胺酶编码区域；ColE1，复制起始点。
图3显示了小鼠MHC II类分子I-E和I-A的IMGT参考序列α-(A)和β-链(B)序列与克隆的I-Ed(标记的_EL)和I-Ek(标记的1FNG)的IMGT参考序列α-(A)和β-链(B)序列进行比较的ClustalW2.02多个序列比对结果。选择的半胱氨酸取代位置用黑色阴影高亮显示(根据表2/成熟IMGT I-E seq编号)：第1排(α96-β118/α96-β119)、第2排(α95-β120/α95-β121)和第3排(α94-β150/α94-β151)。显示了α链的全长IMGT序列(H-2EA*02)且在本文有时指SEQ ID NO：1。显示了β链的全长IMGT序列(H-2EB1*01)且在本文有时指SEQ ID NO：2。α链的成熟IMGT序列即不含信号肽的全长序列有时指SEQ ID NO：3(不含信号肽的H-2EA*02)。β链的成熟IMGT序列即不含信号肽的全长序列有时指SEQID NO：4(不含信号肽的H-2EA*01)。上述各个序列的注释参考PDB ID：1FNG和Burrows et al.，1999，Protein Engineering，12：771-778。
图4显示了通过噬菌体ELISA的I-Ed-pIII完整性分析。将所用的抗体固定并使用标准量的病毒粒子参加反应。用抗-M13HRP轭合物检测捕获的病毒颗粒且用TMB显色ELISA并在A450nm下读数。phOx-BSA特异性Fab展示的抗体作为对照。
图5显示了通过用抗-PIII处理的SDS PAGE/蛋白免疫印迹分析多价I-Ed-pIII展示水平。根据PDB ID：1FNG进行残基编号(见表2)。
图6a显示了噬菌体展示的P96Cα2-S119Cβ2(第1排，表2)稳定的I-Ed特异性LD1 T-杂交瘤细胞。用I-Ed-pIII展示噬菌粒在冰上封闭并染色LD1细胞2h，然后用生物素化的兔抗-fd生物素轭合物和链霉亲和素PE温育。实线代表HAaa110-120/I-Ed-pIII展示且虚线代表I-Ed-pIII展示。值得注意的是，即使在很少的滴定量下也获得了特异性染色(5x 109噬菌体/ml)，而最大的可实现的滴定量为～1013噬菌体/ml。
图6b显示了R94Cα2-N151Cβ2(第3排，表2)、S95Cα2-S121Cβ2(第2排，表2)或P96Cα2-S119Cβ2(第1排，表2)稳定的I-Ed特定染色LD1T细胞杂交瘤细胞的噬菌体展示。用I-Ed-pIII展示噬菌粒在室温(RT)下将LD1细胞染色30min，然后用生物素化的兔抗-fd生物素轭合物和链霉亲和素APC温育。各个噬菌体制剂的平均荧光强度(MFI)用条形图表示。值得注意的是，即使在很少的滴定量下也获得了特异性染色(2x 109噬菌体/ml)，而最大的可实现的滴定量为～1013噬菌体/ml。
图7显示了IMGT代表的小鼠和人类MHC II类异型I-E、I-A、HLA-DP、-DQ和-DR序列的ClustalW2.02多个序列比对结果。α-链的比对结果如A所示且β-链的比对结果如B所示。鉴定的半胱氨酸取代位置如表2、图1和图3所示，并用黑色阴影高亮显示。鉴定的位置均位于保守的α2/β2结构域中。
图8显示了叠加8种不同人类HLA-II类结构表现出了分子的四级结构是高度保守的，尽管广泛的遗传多样性；因此在结构水平上验证了图7中的比对结果(图8A)。特别是如A全局叠加结构中的R94α2-N150β2残基对(第3排，表2)，揭示了中全局RMSD变化的高度保守的定位(图8B)。因此在拓扑结构水平上，这些结构实质上可以看作是相同的，因为仅仅在单个分子的独立结构预期的实验变化中观察到了差异。
图9显示了噬菌体展示S95Cα2-S121Cβ2(第2排，表2)稳定的HLA-DR或HLA-DQ2.5特异性染色人类T细胞克隆。在室温下用HLA-II类-PIII展示噬菌粒封闭并染色T18、TCC 820.26、和TCC 820.88细胞1h，然后在冰上用生物素化的兔抗-fd生物素轭合物和链霉亲和素PE进行温育。各个噬菌体制剂的几何平均密度(GMI)用条形图表示。
图10显示了通过非还原性或还原性SDS PAGE然后用抗-PIII蛋白免疫印迹检测分析单价(M13K07)和多价(HyperPhage)I-Ed-pIII展示水平的结果。根据IMGT将残基编号(见表2)。
具体实施方式
实施例1
材料与方法
结构评价、分子模型和序列分析
将分辨率晶体结构(PDB ID：1FNG)的小鼠MHC II类分子I-Ek与血红蛋白(Hb)-衍生肽(Hbaa65-76)1用于初始二硫键的预形成。检测形成α2-β2恒定结构域间的交叉区域的残基并选择β-碳原子的距离小于的侧链作进一步的分析。首先，通过硅片诱变(in silico mutagenesis)将所选的侧链变为半胱氨酸，而通过旋转异构体库扫描(rotamer libraryscan)选择最佳的旋转异构体。
所选残基对的硫醇-基团在二硫键形成的次佳位置的情况下，将侧链的χ1二面角手动旋转至有利的状态。然后通过约束能量最小化(constrained energy minimization)利用Gromos96力场优化局部的几何形状(Local geometries)。
为H-2E(GenBank收录号：K00971和AF050157)和H-2A(GenBank收录号：V00832和M13538)翻译的小鼠IMGT参考序列、我们克隆的H-2Ed(见下文)和PDB：1FNG H-2E序列用ClustalW2.02(http://www.ebi.ac.uk/)进行比对并手动注释。从IMGT(http://imgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoireMHC/LocusGenes/Represen tativeMHCgc.html)下载代表性的小鼠H-2A和E、以及人类HLA-DP、DQ和DR并用ClustalW2.02(http://www.ebi.ac.uk/)翻译和比对。使用的IMGT参考序列为(GenBank收录码(α-链/β-链))：I-A(V00832/M13538)、I-E(K00971/AF050157)、HLA-DP(X03100/M23907)、HLA-DQ(M23907/U92032)和HLA-DR(J00204/AJ297583)。根据H-2E和PDBID：1FNG的结构分析将比对手动地加上阴影。该序列比对结果通过结构比对和代表性的PDB条目的同步结构叠加进行验证：1FNG(I-Ek)、1S9V(HLA-DQ2)、1JK8(HLA-DQ8)、1DLH(HLA-DR1)、1BX2(HLA-DR2)、1HQR(HLA-DR2a)、1A6A(HLA-DR3)、1D6E(HLA-DR4)和2Q6W(HLA-DR52a)。使用spdb查看器3.7SP5 software2进行所有分子的可视化和处理操作。
细菌菌株、辅助噬菌体和质粒
大肠杆菌菌株XL1-Blue和VCSM13辅助噬菌体购于Stratagene(LaJolla，CA，美国)。HyperPhageTM辅助噬菌体购于Progen Biotechnik股份有限公司(海德堡，德国)。包括具有特异性针对phOx-BSA的单链Fv(scFv)的PIII展示噬菌粒pSEX813由Affitech AS(奥斯陆，挪威)友情提供且也能够从PROGEN Biotechnik股份有限公司(海德堡，德国)获得。pSEX81-基pFAB-展示和具有phOx-BSA特异性的pFABDFN噬菌粒如前所述4。
细胞株
当在小鼠MHC II类分子I-Ed上递呈时，T-细胞杂交瘤细胞LD15对流感血凝素衍生肽(氨基酸110-120；N-SFERFEIFPKE-C)是特异性的。人类CD4+ T细胞克隆T18对小鼠Ig C kappa(氨基酸40-48；N-WKIDGSERQ-C)是特异性的且受到HLA-DR4(DRA1，B1*0401)(PMID：12456590)的限制。人类T细胞克隆、TCC 820.26和TCC 820.88分别识别DQ2-αI-表位(氨基酸57-68；N-QLQPFPQPELPY-C)和DQ2-αII-表位(氨基酸62-72；N-PQPELPYPQPE-C)。细胞由S.-W.Qiao博士(免疫学研究所，奥斯陆大学，奥斯陆，挪威)友情提供。所有的细胞均保存在添加有10％的FCS、0.1mM的非必需氨基酸、1mM的丙酮酸钠、50μM的硫代甘油(Monothioglycerol)和12μg/ml的硫酸庆大霉素的RPMI1640中。
Abs和其它试剂
基本上所有的培养基和缓冲液都是按照Sambrook等6中所述的方法配制的。小鼠抗-PIII、兔抗-fd生物素轭合物、羊抗-M13-HRP、羊抗-小鼠-HRP抗体分别购于MoBiTec(哥廷根，德国)、Sigma-Aldrich(奥斯陆，挪威)和Amersham Biosciences(乌普萨拉，瑞典)。抗-I-E/I-A抗体2G9和链霉亲和素-PE和链霉亲和素-APC轭合物购自BD Pharmingen(圣何塞，CA，美国)。鼠抗-小鼠CD32抗体2.4G2(ATCC号HB-197TM)在组织内部(in-house)制得。与牛血清白蛋白(BSA)共轭的半抗原2-苯基恶唑-5-酮(phOx)基本上通过参考文献7中所述的方式制得。限制性内切酶(RE)购自New England Biolabs(伊普斯维奇，马萨诸塞州，美国)，DpnI不同，从Stratagene(LaJolla，MA，美国)获得。DNA寡核苷酸购自MWG Biotech AG(Ebersberg，德国)、DNA Technology(奥胡斯，丹麦)或Sigma-Aldrich。BSA和Tween 20购自Sigma-Aldrich(奥斯陆，挪威)。Pfu Turbo DNA聚合酶购自Stratagene(LaJolla，CA，美国)。胰蛋白酶/EDTA购自BioWhittaker(Lonza Group Ltd.，菲斯普，瑞士)。
I-Ed-PIII展示噬菌粒的构建
通过RT-PCR重获A20 BALB/c B淋巴瘤细胞的H-2E基因，并将其分别克隆至真核pLNOH2载体中，创建I-Ed-Ig融合，基本上如Casares等8中所述。利用以下引物对从这些载体上扩增编码I-Edα和I-Edβ的基因：用于I-Edα的pFAB I-Eda fw
(5’-TATACCATGGCCATCAAAGAGGAACACACCATCATCCAGG-3’)和pFAB I-Eda rv
(5’-TATAACTAGTCATTACTCCCAGTGCTTCCGCAGAG-3’)、以及用于I-Edβ的pFAB I-Edb fw
(5’-TATAACGCGTCAGAGACACCAGACCACGGTTTTTG-3’)和pFABI-Edb
rv(5’-TATAGGCCGCAGCGGCCCCTTTCCACTCGACCGTGACAGGGT-3’)。将I-Ed基因克隆到pFABDFN噬菌粒中，以使I-Ed基因与M13 PIII表面蛋白融合而I-Edα链被制成可溶性实体(图2)。如参考文献9中所述的利用重叠延伸的基因剪接将编码流感血凝素衍生肽(aa 110-120)和15aa接头(linker)(G4S)3的DNA的N-端插入I-Edβ链，且引物如下：pMHCHA SOEing fw
(5’-AAAGGAAGGAGGTGGTGGCTCCGGTGGAGGGGGAAGTGGAGGTGGAGGGTCTGTCAGAGACACCAGACCACGGTT-3’)和pMHCHASOEing rv
(5’-GGAGCCACCACCTCCTTCCTTTGGGAAGATCTCGAACCTTTCGAATGATACGCGTGCCATCGCCG-3’)。为了克隆的目的，根据厂家的说明书(Stratagene，LaJolla，CA，美国)通过QuikChangeTM定点诱变除去I-Edβ基因中的PstI限制性位点，使用的引物为：QCIEdbPstI fw(5’-TGGACACGTACTGTAGACACAACTATGAGAT-3’)和QCIEdbPstI rv(5’-ATCTCATAGTTGTGTCTACAGTACGTGTCCA-3’)。根据厂家的说明书(Stratagene，LaJolla，CA，美国)通过QuikChangeTM定点诱变引入二硫键。使用的引物为：用于I-Edα中R94C突变的Mut R94C I-Ed alfa fw(5’-GACTGTACTCTCCTGTAGCCCTGTGAACC-3’)和Mut R94C I-Ed
alfa rv(5’-GGTTCACAGGGCTACAGGAGAGTACAGTC-3’)、用于I-Edβ中N150C突变的MutN151C I-Ed beta fw
(5’-CCTGGTCCGATGTGGAGACTGGACCTTC-3’)和Mut N 151C I-Edbeta rv(5’-GAAGGTCCAGTCTCCACATCGGACCAGG-3’)、用于I-Edα中S95C突变的QCIEdaS95C fw(5’-ACTCTCCAGATGCCCTGTGAAC-3’)和QCIEdaS95C rv(5’-GTTCACAGGGCATCTGGAGAGT-3’)、用于I-Edβ中S120C突变的QCIEdbS120C fw
(5’-GTCTGCTCTGTGTGTGACTTCTAC-3’)和QCIEdbS 120C rv
(5’-GTAGAAGTCACACACAGAGCAGAC-3’)、用于I-Edα中P96C突变的QCIEdaP96C fw(5’-CAGAAGCTGTGTGAACCTGGGA-3’)和
QCIEdaP96C rv(5’-TCCCAGGTTCACACAGCTTCTG-3’)、以及用于I-Edβ中S118C突变的QCIEdbS118C fw
(5’-CCTGGTCTGCTGTGTGAGTGAC-3’)和QCIEdbS 118C rv
(5’-GTCACTCACACAGCAGACCAGG-3’)。
MHC II-展示噬菌体的制备
通过参考文件10所述的点滴定方法(spot titration)监测利用VCSM13或HyperPhageTM辅助噬菌体和组装病毒粒子的大肠杆菌XL1-Blue的噬菌粒营救(Phagemid rescue)。
噬菌体捕获ELISAs
将捕获的Abs和phOx-BSA吸附至MaxiSorpTM微量滴定板孔中(NUNC，罗斯基勒，丹麦)，在PBS中的浓度为2.5-5μg/ml，pH值为7.4，4℃过夜。在室温下用PBSTM(补加有0.05％v/vTween 20和4％w/v脱脂牛奶的PBS)将孔封闭1h。然后添加标准量的病毒粒子制剂(VCSM13-营救的样品：1x 1010cfuampR/孔；HyperPhage-营救的样品：1x108cfuampR/孔)，并于用抗-M13-HRP(1∶5,000)于室温下检测捕获的病毒粒子1h前在室温下反应1-2h。用TMB可溶性底物(Merck KGaA，达姆施塔特，德国)处理孔，30min后用1M的HCl终止并读取A450nm下的吸光度。
SDS-PAGE和蛋白免疫印迹
用非还原性和还原性的4-12％的Bis/Tris XT Criterion precastSDS-PAGE(Bio-Rad，Hercules，CA，美国)分离病毒粒子(108cfuampR/泳道)，并利用半干燥印迹仪(Bio-Rad，Hercules，CA，美国)在Tris/甘氨酸缓冲液(25mM的Tris、192mM的甘氨酸和20％的甲醇，pH值8.3)中于25V下30min使其吸附于聚偏二氟乙烯膜(Millipore，麦迪逊，美国)上。在用小鼠抗-pIII MAb(1∶4000)和随后的羊抗-小鼠-HRP(1∶10000)检测PIII-融合前在PBSTM中封闭膜。用SuperSignalTM West Femto底物(皮尔斯，罗克福德，IL，美国)洗涤和处理膜并暴露于BioMaxTM MR薄膜(柯达，Fernwald，德国)。
含有人工S-S桥的HLA-DP、-DR和DQ的构建
由IMGT(http://imgt.cines.fr/)所定义的编码代表性的HLA-DR(DRA*0101/DRB1*1402)和-DQ(DQA1*0501/DQB1*0301)的基因是化学合成的(Genscript，Piscataway，NJ)。通过修正大肠杆菌密码子偏性优化DNA序列，并整合引入第2排α2-β2半胱氨酸对(表2)的点突变。将DNA片段克隆到如上所述的pFABDFN噬菌粒中。
另外，通过RT-PCR扩增从人类PBMC新鲜分离的由IMGT(http://imgt.cines.fr/)所定义的编码代表性的DP(DPA1*0103/DPB1*0401)、-DR (DRA*0101/DRB1*1402)和DQ(DQA1*0501/DQB1*0301)的基因并将其克隆至如上所述的pFABDFN噬菌粒中。根据厂家的说明书(Stratagene，LaJolla，CA，美国)通过QuikChangeTM定点诱变整合引入第2排(表2)α2-β2半胱氨酸对的点突变。使用的引物(表1所列)为：用于HLA-DPA α2-结构域中S95C突变的DPA_S95C_正义链和DPA_S95C_反义链，用于HLA-DPB β2-结构域中S121C突变的DPB_S121C_正义链和DPB_S121C_反义链，用于HLA-DRAα2-结构域中S95C突变的DRA_S95C_正义链和DRA_S95C_反义链，用于HLA-DRBβ2-结构域中S121C突变的DRB_S121C_正义链和DRB_S121C_反义链，用于HLA-DQA α2-结构域中S95C突变的DQA_S95C_正义链和DQA_S95C_反义链，用于HLA-DQB β2-结构域中S121C突变的DQB_S121C_正义链和DQB_S121C_反义链，
流式细胞术
将LD1细胞的单细胞悬液在冰上用60％的热灭活的大鼠血清和含200μg/ml抗-CD32mAb(HB197)的1x PBS封闭15min(图6a)，或者不封闭(图6b)。于染色缓冲液(0.5％BSA的1x PBS)中在冰上进行超级噬菌体(HyperPhage)-封装的I-Ed-pIII展示染色2h(图6a)，或者于1％BSA的1x PBS中在室温下30min(图6b)。图6a中输入使用的噬菌体为用于HAaa110-120-I-Ed展示的5x 109cfuampR和用于I-Ed展示的1.6x 1010cfuampR。图6b中输入的噬菌体为用于所有除VCSM13辅助噬菌体(阴性对照，1x1011cfukanR/ml)外的制剂的2x109cfuampR。然后将样品用10μg/ml的生物素化兔抗-fd在冰上温育1h(图6a)或30min(图6b)，接着用2μg/ml的链霉亲和素PE在冰上温育15min。
在染色缓冲液(0.5％BSA的1x PBS)中分别制备三个T细胞克隆T18、TCC 820.26或TCC 820.88的单细胞悬液。在室温下用单价(multivalently)(超级噬菌体(HyperPhage)-封装)或多价(monovalently)(VCSM13-封装)展示HLAII类-pIII融合的噬菌体将细胞染色1h(图9)。使用的输入噬菌体分别为～1x 109cfuampR(图9a)、～2x 109cfuampR(图9b)和～2x 1012cfuampR(图9c和d)。然后将样品用10μg/ml的生物素化兔抗-fd在冰上温育1h，接着用2μg/ml的链霉亲和素PE在冰上温育30min。在FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)上获得结果并利用CellQuestPRO软件(BD Biosciences)分析。
结果
分子模拟
表2(1FNG编号)显示了用于选择I-Ed/I-Ek结构(PDB ID：1FNG)α2/β2恒定结构域交叉区域中残基对的β-碳原子侧链距离。事实上，第1-3排残基的硅片诱变和侧链优化成半胱氨酸形成的二硫键的距离在2.03和之间，不会干扰蛋白质的三级结构(图1)。这一结果强烈表明，这些氨基酸的取代能够且可能在突变多肽中形成二硫桥，因此被选做用于进一步的分析。值得注意的是，aa的编号在偏离β-链的IMGT序列编号的PDB ID 1FNG中放置(见图3B)。
*根据PDB ID：1FNG的aa编号。
**根据成熟的IMGT参考的aa编号
序列H-2EA*02和H-2EB1*01。
表2
MHC-PIII融合的设计
将I-Ed基因片段插入pFABDFN噬菌粒中，使得α-和β-链被翻译成两个独立的多肽，且其中β-链直接与病毒衣壳蛋白pIII的N-端框内(in-frame)融合(图2)。两条链都包括用于周质靶向的N-端信号序列(pelB)。插入的α-链部分(图3A，H-2EA EL)对应于图3A所示的IMGTH-2EA*02参考序列的氨基酸26-204(GenBank收录码：K00971，SEQ IDNO：1)。同样，使用的β-链部分对应于图3B所示的IMGT H-2EB1*01参考序列(GenBank收录码：AF050157，SEQ ID NO：2)的氨基酸27-216(图3B，H-2EB EL)。因此，基于I-E IMGT参考序列，表2第1-3排的半胱氨酸取代的位置分别对应于成熟肽(即无信号肽的肽)的α-链位置94-96(图3A)和β-链位置119、121和151(图3B)。值得注意的是，该β-链残基编号偏离了1FNG模板文件中的编号。
噬菌粒-衍生的MHC II-PIII展示的分析
为了比较pMHC部分展示的习性和完整性，通过捕获I-E特异性单克隆抗体(MAb)，2G9上标准量的病毒粒子进行了噬菌体ELISA。结果表明，所有以高价和低价展示的样品都被MAb 2G9识别(图4)，表明了整体保留的结构完整性。MAb 2G9与直接融合到PIII的I-E β-链结合。为了评估噬菌体中是否存在任何的共价的共价的α-链异二聚作用，通过非还原性和还原性的SDS PAGE随后通过抗-PIII的蛋白免疫印迹检测分析了标准量的病毒粒子(图5)。结果表明，所有样品中都存在显著比例的共价异二聚体，有两个例外，wt(图5，泳道5)和携带HA肽的α95/β120突变体(图5，泳道3)。然而，后者意外地表现出阻碍了适当分辨率的很低的样品装载。基于样品的减少，破坏了所有共价复合物的形成(图5，泳道11-20)。此外，对于抗体Fab对照(图5，泳道10和20)，改进的pMHC部分只有一个预期的共价异二聚体种类，显然，这并不是事实，因为在所有相关样品中都观察到了多个这样的种类。这种现象最可能的解释是在天然半胱氨酸残基间以及引入的突变间形成了异常的二硫桥。因此，实际上只发现了小部分展示的蛋白，由于α2-β2结构域中的链除了人工引入的桥还具有天然二硫桥。
对I-Ed-pIII构建体的单价和多价展示进行了类似的实验，其中，进行了平行分析。结果如图10所示。在低水平噬菌粒展示(单价)中，约1-10％的病毒粒子携带融合蛋白(Bradbury and Marks，J Immunol Methods.2004，290(1-2)：29.)。在这些样品(M13K07样品)中没有因此看到明显的融合蛋白，尽管在更敏感的ELISA试验中很容易检测到融合(图4)。
pMHC-pIII作为细胞表面染色试剂
为了研究在噬菌体上与PIII融合的肽-MHC II类展示是否可以像传统的pMHC II四聚体一样用作染色试剂，我们用没有融合肽的HAaa110-120/I-Ed-pIII或I-Ed-pIII将LD1细胞染色。从图6a可以看出，不用相关肽制得的噬菌体上，用I-Ed-pIII融合未观察到染色，而HAaa110-120/I-Ed-pIII染色的细胞具有0.8log的光照强度。从图6b可以看出，在全部三个研究的二硫桥中都观察到了肽特异性染色。只在用二硫稳定的I-Ed-pIII变体和具有抗原肽的变体(HAaa110-120)中观察到了阳性染色。未看到三个改造的二硫桥间明显的差异；因此它们可能以类似的功效发挥作用。
为了进一步确定pMHC-pIII、mCκaa40-48/HLA-DR4-pIII、αIaa57-68/HLA-DQ2.5或αIIaa 62-72/HLA-DQ2.5的功能，利用VCSM13或HyperPhageTM通过噬菌粒营救制备了展示病毒粒子。也制备所有的pMHC-pIII融合，不含抗原肽的融合作为对照。然后以所述流式细胞术实验测试这些病毒粒子。从图9a可以看出，观察到了mCκaa40-48/HLA-DR4-pIII染色的细胞的肽特异性染色。在图9b和c中，αIaa57-68/HLA-DQ2.5的多价和单价展示均表现出肽特异性染色。值得注意的是，输入的噬菌体为VCSM13-封装αIaa57-68/HLA-DQ2.5展示的1012cfuampR。图9d显示了αIIaa62-72-HLA-DQ2.5的肽特异性染色。
讨论
有效利用可溶性重组MHC II类分子的主要障碍是由这种改造分子的固有的稳定性问题引起的。虽然已经采用了各种改进的方法来克服该限制，但是目前还没有通用的方法11。此外，目前使用的方法都体现为费用高和劳力密集的过程，有效的破坏任何高通量的方法。本发明的发明人发现了解决该问题的引人注意的方案，即在重组MHC II类生成中引入噬菌体展示技术12。这不仅是非常快速和廉价的技术平台，还具有允许使用高度多样化组合筛选方法的固有性能。由MHC分子递呈的指定巨大抗原蛋白质空间将强烈的受益于这种组合特征如表位研究。然而，这种发现受限于基于杆状病毒的繁琐和低通量技术13。
通过利用噬菌体展示，能够很容易在公开报道和简单形式中获得更大级别的族群大小(repertoire sizes orders)12。虽然已研究了MHC I类分子的这种展示14-16，但是MHC I类噬菌体展示方法还没有证明作为替代的可溶性四聚体是有功能的，虽然还是获得了细胞特异性染色16。与能够有效被制成单个多肽的MHC I类分子相比，MHC II类的制备是复杂的，根据它是同样起作用和单独链的异二聚体的事实11。建立在Ig折叠拓扑结构之上，MHC I类和II类的功能性折叠都需要域内二硫桥的形成19。
MHC II类及其同源配体、T细胞受体间的天然相互作用的一个主要方面是固有的微弱亲和力20。为了克服将重组MHC II类分子用作检测试剂时灵敏度的限制，需要将分子聚合成四聚体或五聚体11。这种聚合物的制备包括实质性处理(substantial handling)的多步骤方法。本文使用的噬菌体展示很容易地通过使用允许在噬菌体上展示多聚体的已知技术促使这种聚合21。
本发明的发明人提出了一种通过PIII噬菌粒展示获得功能性展示的MHC II类分子的方法。为了实现这一目标，在大肠杆菌中将两个α-和β-链表达为两个单独的多肽链，其中一条与PIII衣壳融合并靶向于周质。在周质的氧化中，通过利用迫使α2和β2结构域联合的新的人工二硫桥，两条链形成了稳定的异二聚体。小鼠MHC II类分子I-Ed的保守α2-β2交叉区域中的多个位置可以被靶向进行aa取代，从而改造人工链间二硫桥(图1和3)。通过利用标准噬菌粒-基噬菌体展示在PIII上展示该人工MHC分子，实际上共价异二聚体在病毒粒子上展示(图5和10)。所有分子都保留了整体分子的完整性，wt和突变体都对特异于小鼠MHC II类I-E分子的单克隆抗体(MAB 2G9)产生反应(图4)。基本上如参考文献23所述，I-Ed分子被改造成将良好表征的HAaa110-120抗原肽22展示为连接β-链的共价系链。在流式细胞仪中利用噬菌体展示这些二硫桥稳定的重组分子，可以获得LD1T细胞杂交瘤细胞的特异性染色5，所述LD1 T细胞杂交瘤细胞具有对I-Ed/HAaa110-120复合体特异的T细胞受体(图6a和b)。重要的是，只在具有抗原肽的二硫稳定的I-Ed-pIII融合中看到了特异性染色，这真实地显示了该方法的功能。此外，MHC部分的多价展示对染色是必不可少的，由于在强调需要提高天然相互作用的功能性亲和力的单价展示中未看到所述染色(数据未显示)。到目前为止，这代表第一个例子，该例子中噬菌体展示的MHC分子被用于与传统的MHC四聚体技术互补的特异性T细胞的直接可视化。
成功的关键是引入MHC II类分子的人工二硫桥稳定的α2-β2交叉区域。这似乎是通用的方法，由于MHC II类分子(包括HLA)中鉴定的位置是高度保守的(图7和8)。这种通用的性质也得到这样的事实的强烈支持：测试了三种其它的MHC II类复合体，即mCκaa40-48/HLA-DR4、αIaa57-68/HLA-DQ2.5和αIIaa62-72/HLA-DQ2.5，都作为PIII融合，在流式细胞仪中以抗原肽-特异性的方式显示出特异性的细胞染色(图9)。正如所预期的，多价相互作用的染色性能和依赖性(dependency)在特异性pMHCII复合体和与它们反应的T细胞克隆间是不同的。因此，多价的依赖性并不是全有或全无的事件，这由单价变体中被αIaa57-68/HLA-DQ2.5和αIIaa 62-72/HLA-DQ2.5染色的特定细胞显示。流式细胞仪中特异性染色位置的性能取决于参数如特定T细胞受体对pMHC的固有亲和力、T细胞上受体的密度和膜上受体聚集的能力。值得注意的是，用αIaa57-68/HLA-DQ2.5染色的多价(图9b)和单价(图9c)几乎是相同的，尽管低1000倍的噬菌体与多价变体一起输入。
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Claims (24)
1.一种重组MHC II类分子，其特征在于，该重组MHC II类分子包括：
(i)MHC II类分子α链细胞外部分的全部或部分；
(ii)MHC II类分子β链细胞外部分的全部或部分；
其中，(i)和(ii)提供了有功能性肽结合结构域，且其中(i)和(ii)通过位于所述α链的α2结构域和所述β链的β2结构域中的半胱氨酸残基间的二硫键连接，其中所述半胱氨酸残基不存在于天然MHC II类的α2和β2结构域中，并且，其中所述重组分子不包括亮氨酸拉链基序。
2.根据权利要求1所述的重组MHC II类分子，其中，所述二硫键位于位置在小鼠I-E亚类的Pro 96α2-Ser 119β2、Ser 95α2-Ser 121β2或Arg 94α2-Asn 151β2的半胱氨酸残基或其它MHC II类亚类中的相应位置的半胱氨酸残基之间。
3.根据权利要求2所述的重组MHC II类分子，其中，所述二硫键位于位置在小鼠I-E亚类的Ser 95α2-Ser 121β2的半胱氨酸残基或其它MHCII类亚类中的相应位置的半胱氨酸残基之间。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的重组MHC II类分子，其中，对应参考序列H-2EB*01(SEQ ID NO：2)位置38、42或106的半胱氨酸残基中的一个或多个，或者其它MHC II类亚类中相应位置处的半胱氨酸残基中的一个或多个被剔除。
5.根据权利要求1所述的重组MHC II类分子，其中，所述重组分子在丝状噬菌体的表面表达。
6.根据权利要求5所述的重组MHC II类分子，其中，所述重组分子表达为与噬菌体表面蛋白gpIII、gpVII、gpVIII或gpIX的融合。
7.根据权利要求6所述的重组MHC II类分子，其中，所述噬菌体表面蛋白为gpIX。
8.根据权利要求1所述的重组MHC II类分子，其中，所述分子为可溶性分子。
9.根据权利要求8所述的重组MHC II类分子，其中，所述分子的(i)或(ii)与免疫球蛋白的Fc部分融合。
10.根据权利要求1所述的重组MHC II类分子，其中，所述分子为多聚体。
11.根据权利要求1所述的重组MHC II类分子，其中，所述分子的(i)或(ii)源自小鼠或人类MHC II类分子。
12.根据权利要求11所述的重组MHC II类分子，其中，所述分子的(i)或(ii)源自人类MHC II类分子。
13.根据权利要求1所述的重组MHC II类分子，其中，所述分子由细菌宿主产生。
14.根据权利要求13所述的重组MHC II类分子，其中，所述细菌宿主为大肠杆菌。
15.根据权利要求14所述的重组MHC II类分子，其中，所述细菌宿主为大肠杆菌K12衍生物。
16.根据权利要求15所述的重组MHC II类分子，其中，所述细菌宿主为具有BL21表型的大肠杆菌或其衍生物。
17.根据权利要求1所述的重组MHC II类分子，其中，所述二硫键为MHC II类分子的稳定提供了唯一的方式。
18.根据权利要求1所述的重组MHC II类分子，其中，所述分子能够使T细胞染色。
19.根据权利要求1所述的重组MHC II类分子，其中，所述分子进一步包括与所述肽结合结构域结合的肽。
20.一种能够在原核宿主中表达的重组MHC II类分子，其特征在于，该重组MHC II类分子包括：
(i)MHC II类分子α链细胞外部分的全部或部分；
(ii)MHC II类分子β链细胞外部分的全部或部分；
其中，(i)和(ii)提供了功能性肽结合结构域，且其中(i)和(ii)通过位于所述α链的α2结构域和所述β链的β2结构域中的半胱氨酸残基间的二硫键连接，其中，所述半胱氨酸残基不存在于天然MHC II类的α2和β2结构域中。
21.一种制备重组MHC II类分子的方法，其特征在于，该方法包括：
(i)MHC II类分子α链细胞外部分的全部或部分；
(ii)MHC II类分子β链细胞外部分的全部或部分；
其中，(i)和(ii)提供了功能性肽结合结构域，且其中(i)和(ii)通过位于所述α链的α2结构域和所述β链的β2结构域中的半胱氨酸残基间的二硫键连接，其中，所述半胱氨酸残基不存在于天然MHC II类的α2和β2结构域中，
所述方法包括在原核宿主中表达所述重组分子。
22.一种能够被T细胞识别的抗原肽表位的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将权利要求19所述的重组MHC II类分子与T细胞受体接触，并检测所述重组MHC II类分子与所述T细胞受体的结合。
23.权利要求19所述的重组MHC II类分子在制备用于检测样品中抗原特异性T细胞的产品中的应用，其特征在于，所述重组MHC II类分子与所述样品接触，并检测所述重组MHC II类分子与所述T细胞的结合。
24.根据权利要求23所述的应用，其中，所述重组MHC II类分子被应用于用于检测样品中的疾病特异性T细胞的存在并诊断疾病的存在或消失的产品的制备。
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