CN102946863A - 非糖基化重组人g-csf的长期贮藏 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于非糖基化重组人G-CSF的稳定长期贮藏的方法，其中将包含非糖基化重组人G-CSF和山梨糖醇的水性乙酸盐或谷氨酸盐缓冲的G-CSF组合物冷却至-15℃或更低的温度以获得冷冻G-CSF组合物，然后将该冷冻组合物贮藏于冷冻状态下，然后经历一段时间升温至在2℃至8℃范围的温度，所述时间被调整以使组合物融化并获得液体组合物，所述液体组合物的G-CSF含量为起始组合物G-CSF含量的至少95％。

Description

非糖基化重组人G-CSF的长期贮藏
本发明涉及用于非糖基化重组人G-CSF的长期贮藏的方法。
G-CSF(粒细胞-集落刺激因子)是属于细胞因子家族的天然存在的生长因子。G-CSF在造血过程中起关键作用，并增强嗜中性粒细胞和嗜中性子代细胞的成熟、增殖、分化和存活。G-CSF在临床上主要用于控制肿瘤，尤其用于化疗后嗜中性白细胞减少症的治疗，并且其还用于骨髓移植和传染性疾病的治疗。
天然存在形式的人G-CSF为具有5个半胱氨酸残基的约20kDa的糖蛋白。这些残基中的四个形成对该蛋白活性至关重要的两个分子间二硫键。由于从天然来源仅能获得少量的G-CSF，在药物中主要使用重组形式的G-CSF，尤其是通过在原核宿主中表达蛋白而产生的那些。在原核宿主例如大肠杆菌(E.Coli)中表达的蛋白与天然G-CSF的区别在于它们是非糖基化的。在大肠杆菌中表达的蛋白具有在该宿主生物体中表达所必须的额外的N-末端蛋氨酸残基。
由于该蛋白的高疏水性，非糖基化重组G-CSF较不稳定。该分子易于吸附于贮藏容器、小瓶或注射器等的内表面，并形成二聚体和更高级的聚集体。常规的液体G-CSF制剂还对机械应力、例如运输中振摇而导致的应力敏感，并且对意外的冻融敏感，这也可能会导致更高水平聚集体以及生物活性的损失。而且，G-CSF还会经受化学修饰例如脱酰胺化、氧化、二硫键断裂或蛋白水解。比其它降解途径更迅速发生的脱酰胺化是一个特殊问题，因为G-CSF的谷氨酰胺含量高。总之，这可能导致生物学上可获得的活性G-CSF单体的含量减少，尤其在长期贮藏所述蛋白的情况下。这不仅成本高而且从治疗上是不期望，例如在较长时间内以恒定剂量施用G-CSF的情况。而且，由多聚化或脱酰胺化形成的产物可导致不利的免疫应答。
G-CSF制剂的稳定化是各种专利和非专利文献的主题。
DE-A-3723781描述了磷酸盐缓冲的含水G-CSF制剂，其包含药学上可接受的表面活性剂如聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯，用于与人血清白蛋白和甘露醇联合以稳定活性成分。这些制剂在4℃长期保持稳定。然而，由于其抗原性，源自人类和动物的蛋白和肽可能引起不利的免疫反应。
EP-A-0373679公开了具有2.75-4.0的pH值和低导电性的G-CSF制剂，其可以长期贮藏而不会形成聚集物。如果使用，则在这些制剂中使用少于2mM的少量缓冲剂以避免G-CSF的聚集。
EP-A-1197221公开了pH为5-7的长期稳定的G-CSF制剂，其包含赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸和天冬酰胺中的一种或多种氨基酸以及一种或多种疏水性氨基酸。加入蛋氨酸以防止G-CSF分子中蛋氨酸残基的氧化。
WO-A-2007/034509公开了包含重组人G-CSF和氨基酸的稳定的水性制剂，所述氨基酸是蛋白中蛋氨酸残基的氧化抑制剂。
WO-A-2005/042024公开了包含G-CSF和酸如乙酸或谷氨酸的药物组合物，其不含表面活性剂。
WO-A-2005/039620公开了在宽pH范围内稳定的琥珀酸盐和酒石酸盐缓冲的组合物。
Herman，A.C.等(“Characterisation，Formulation，and Stability of(Filgrastim)，a Recombinant Human Granulocyte-ColonyStimulating Factor.”(一种重组人粒细胞集落刺激因子-
Figure BDA00002636292400022
(Filgrastim)的表征、制剂和稳定性)，见：Formulation Characterisation andStability of Protein Drugs，第303-328页，R.Pearlman和Y.J.Wang，编著，Plenum Press，New York，1996)中描述了非糖基化重组G-CSF的稳定组合物，其包含10mM乙酸钠，pH4.0、5％甘露醇和0.004％的聚山梨醇酯80。这类组合物在2-8℃保持稳定24小时以上。据发现，在非格司亭(filgrastim)制剂中用山梨糖醇代替甘露醇可以消除意外冻融期间蛋白对聚集的敏感性。然而，根据生产商的说明，应当避免将其贮藏于冰箱中。
WO-A-2007/099145公开了液体乙酸盐缓冲G-CSF制剂，其包含聚山梨醇酯20和/或聚山梨醇酯80作为表面活性剂且pH值在4.1和4.4之间。
WO-A-2008/122415公开了液体水性谷氨酸盐缓冲G-CSF制剂，具有的pH为3.5-4.8，其在例如冻融时碰到的机械应力的条件下是稳定的。
Piedmonte等(Pharmaceutical Research，第24卷，No.1，2007年1月，136-146页)描述了山梨糖醇对冷冻蛋白制剂中蛋白聚集的影响。
本发明的目的是提供用于生物学活性非糖基化重组人G-CSF的稳定长期贮藏的方法，其中贮藏期间由于吸附于容器壁的现象而导致的G-CSF损失、降解、尤其是脱酰胺作用被减少。
此目的是通过本发明用于非糖基化重组人G-CSF的稳定长期贮藏的方法实现的，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含非糖基化重组人G-CSF和山梨糖醇的水性乙酸盐或谷氨酸盐缓冲的G-CSF组合物；
(b)将步骤(a)中提供的G-CSF组合物冷却至-15℃或更低的温度以获得冷冻G-CSF组合物；
(c)将步骤(b)中获得的G-CSF组合物贮藏于冷冻状态下；以及
(d)将步骤(c)的冷冻G-CSF组合物的温度经历一段时间升至2℃至8℃范围的温度，所述时间被调整以使组合物融化并获得液体组合物，所述液体组合物的G-CSF含量为步骤(a)中提供的组合物的G-CSF含量的至少95％。
本发明还涉及提供非糖基化重组人G-CSF的药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用乙酸盐或谷氨酸盐缓冲液和山梨糖醇配制非糖基化重组人G-CSF以获得水性缓冲G-CSF组合物；
(b)将步骤(a)的G-CSF组合物冷却至-15℃或更低的温度以获得冷冻G-CSF组合物；
(c)将步骤(b)中获得的G-CSF组合物贮藏于冷冻状态下；
(d)将步骤(c)的冷冻G-CSF组合物的温度经历一段时间升至2℃至8℃范围的温度，所述时间被调整以使组合物融化并获得液体组合物，所述液体组合物的G-CSF含量为步骤(a)中提供的组合物的G-CSF含量的至少95％；以及
(e)将步骤(d)中获得的液体组合物灌装至用于胃肠外用途的初级包装(primary packaging)中。
在本发明的过程中已经发现，通过本发明的方法，可以显著减少或者甚至可以避免脱酰胺作用和非糖基化重组人G-CSF的损失，即使以高浓度和大体积提供G-CSF并且不使用表面活性剂。这样，即使贮藏较长时间也能保持活性。而且，由于G-CSF组合物可以贮藏于冷冻状态下，它们对例如运输中可能经历的机械应力不敏感。
图1示出用经历本发明方法的非格司亭样品(泳道1和2)以及贮藏于25℃温度的非格司亭样品(泳道3和4)观察到的脱酰胺产物的对比，由等电点聚焦(IEF)测定。
本发明组合物中使用的非糖基化重组人G-CSF蛋白(在下文亦称为G-CSF)可以是包含人G-CSF的非糖基化氨基酸序列并具有其生物活性的任何蛋白。非糖基化重组人G-CSF通常通过在原核宿主如大肠杆菌中表达人G-CSF基因来获得。在大肠杆菌中表达的非糖基化重组人G-CSF通常具有N-末端Met残基。在本发明的优选实施方案中，人G-CSF包含或具有人G-CSF的一级结构加上N-末端蛋氨酸(r-met HU G-CSF)，如欧洲药典6.3专论(01/2009：2206；“Filgrastim Concentrated Solution”，第4142页)或Herman，A.C等(上述)中所示，即非格司亭的氨基酸序列，或是其基本具有非格司亭生物活性的变体，例如具有N-末端或C-末端延伸(例如融合蛋白)的变体、其中在N-末端的蛋氨酸残基已经被一些其它氨基酸如甘氨酸替代的变体，或者氨基酸序列中具有中性突变的变体。可用于本发明制剂的G-CSF变体公开于例如EP-A-0456200中。
本发明的G-CSF组合物中使用的缓冲体系为乙酸/醋酸盐缓冲液或谷氨酸/谷氨酸盐缓冲液。本发明中使用的组合物优选不含其它缓冲剂。根据本发明所用的缓冲液可以例如如下制备：以乙酸或谷氨酸和/或其盐开始，并使用相应的酸或碱或其它合适的无机酸或有机酸或无机碱如盐酸或碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物将pH调整为期望值。优选生理学上可接受的乙酸盐或谷氨酸盐，例如碱金属盐、碱土金属盐或铵盐。优选碱金属盐或铵盐，尤其是单钠盐。优选地，以乙酸或谷氨酸开始、利用合适的无机碱如氢氧化钠调整pH值来制备所述缓冲液。
本发明方法的步骤(a)提供的组合物的pH值通常在3.5至5.0的范围，优选在3.7至4.8的范围。更优选地，pH在3.7至4.6的范围，例如4.0至4.6。
可以方便地调整乙酸盐或谷氨酸盐缓冲液的浓度，从而在期望的pH值获得pH-稳定效应并且获得足够的缓冲容量。通常，乙酸盐或谷氨酸盐缓冲液的浓度至少为0.5mM，优选为1至100mM，更优选为2至80mM。在2至40mM的范围、尤其是2至25mM、例如5至15mM和优选约10mM的缓冲剂浓度将提供充分的稳定性，并且低到足以避免组合物注射时不利的组织反应。
本发明方法的步骤(a)中提供的组合物中的G-CSF浓度将取决于预期用途。浓度上限由G-CSF在缓冲液的溶解度决定。通常，G-CSF浓度在0.1至8mg/ml的范围，优选为0.25至6.5mg/ml。在分析样品中或在无需进一步稀释的待施用药物组合物中，G-CSF的含量通常在0.1至2.0mg/ml的范围，优选不超过2.5mg/ml。在可以进一步处理以获得适合施用于患者的药物产品更浓的组合物、例如包含G-CSF作为方法中间体的组合物中，其G-CSF浓度通常在2.5mg/ml至8.0mg/ml的范围，优选为2.5至6.5mg/ml，更优选不超过5.5mg/ml。
本发明方法的步骤(a)提供的组合物包含山梨糖醇作为张力调节剂。优选地，除缓冲体系以外，山梨糖醇是组合物中使用的唯一张力调节剂。山梨糖醇的含量通常不超过200mg/ml，优选为10至100mg/ml，更优选为25至75mg/ml，例如约50mg/ml。
本发明方法中使用的组合物可以含有或不含表面活性剂。如果表面活性剂存在，所述表面活性剂通常为非离子表面活性剂。优选地，所述非离子表面活性剂选自乙氧化脂肪醇、烷基聚糖苷、聚氧化烯(polyoxyalkylenes)、聚山梨醇酯或上述两种或多种的混合物。优选聚氧化烯，如聚氧化稀嵌段共聚物，例如Poloxamer 188(可按商品名Pluronie F68获得)，以及聚山梨醇酯，即脂肪族脂肪酸的聚氧乙烯脱水山梨醇酯。最优选聚山梨醇酯，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯(可按商品名Tween 20获得)、聚氧乙烯脱水山梨醇单棕榈酸酯(可按商品名Tween 40获得)、聚氧乙烯脱水山梨醇单硬脂酸酯(可按商品名Tween 60获得)、聚氧乙烯脱水山梨醇三硬脂酸酯(可按商品名Tween 65获得)、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(Tween 80)和聚氧乙烯脱水山梨醇三油酸酯(Tween 85)。最优选聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯和聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。
如果使用表面活性剂，所述表面活性剂优选以5mg/ml或更低的量存在，优选1mg/ml或更低。优选表面活性剂、尤其是聚山梨醇酯的使用量为0.001至1.0mg/ml，更优选为0.01至0.5mg/ml。
尽管本发明方法的步骤(a)中提供的组合物可能包含其它试剂如氨基酸、还原剂、抗氧化剂和血清蛋白，但是组合物通常由G-CSF、水性乙酸盐或谷氨酸盐缓冲液、山梨糖醇和任选的表面活性剂组成，因此不含其它试剂。
本发明方法的步骤(a)中提供的组合物可以以其本身已知的方式制备。例如，将缓冲物质即乙酸或谷氨酸或其盐、山梨糖醇和任选的其它添加剂如表面活性剂溶解在适量的水性溶剂、通常为水中。如果需要，利用上述的合适的酸或碱调节pH值。在灭菌、例如过滤通过无菌滤器后，以所需的浓度加入G-CSF。可选并优选地，步骤(a)中使用的G-CSF组合物作为来自进行或不进行再次缓冲(re-buffering)的生产工艺的一个批次而获得。
本发明方法的步骤(a)中提供的水性G-CSF组合物可以以任何期望体积提供，但优选体积为0.1ml至8l的范围，优选为5ml至4l，更优选为10ml至2.0l，最优选为100ml至1.5l。在合适的容器如聚乙烯(PE)袋、玻璃瓶、或由不含或含有乙二醇(PETG)的聚对苯二甲酸乙二酯(PET)制成的瓶中提供该组合物。
通常在无菌条件下将组合物灌装至容器中，并且优选使用惰性气体如氮气。通常，容器仅用组合物部分灌装，并且优选不超过90％体积，优选用惰性气体充入容器中的顶部空间。
将以期望体积提供的本发明的液体水性G-CSF组合物冷却至-15℃或更低的温度直至冷冻。通常，将组合物冷却至-15至-25℃的温度，例如约-20℃，或将它们冷却至-60℃至-80℃的温度。例如可以在冰箱或冷藏室中或通过将含G-CSF组合物的容器浸入液氮中来实现冷却。
将步骤(b)中获得的冷冻G-CSF组合物在期望的-15℃或更低温度贮藏于冷冻状态。通常，将组合物贮藏于该组合物已经冷却到的温度，即如上所述，优选在-15至-25℃或-60至-80℃的温度，该温度为所定义的标准冷藏室或低温冰箱的温度。通常，将冷冻G-CSF组合物贮藏至少两天的时间，优选至少一个月，例如至少三个月或至少六个月。已经发现，在G-CSF组合物贮藏于冷冻状态下的时间内脱酰胺作用显著减少(参见实施例4和图1)。
在步骤(c)中冷冻G-CSF组合物的贮藏之后，将冷冻组合物的温度经历一段时间升至2℃至8℃范围的温度，所述时间被调整以使组合物融化并获得液体组合物，所述液体组合物的G-CSF含量为步骤(a)中提供的组合物的G-CSF含量的至少95％。
术语“升高温度至2℃至8℃范围的温度”意指组合物未暴露于8℃以上的温度。具体而言，根据本发明的一个实施方案，可通过逐渐或线性地升高温度经较长时间将冷冻组合物升温至2℃至8℃的温度。融化冷冻组合物并获得G-CSF含量为起始提供的组合物的G-CSF含量的至少95％的液体组合物必需的延长的时间通常为至少6小时。例如，在-20℃的温度将组合物保持在冷冻状态的情况下，可通过逐渐或线性每小时升温4℃经6小时将组合物从-20℃升温至+4℃。例如，可以使用Integrated BiosystemsCryoPilotTM系统运行线性温度梯度。
根据本发明的优选实施方案，冷冻组合物将立即被转移至期望的2℃至8℃的温度，然后将在该温度保持较长的时间以使冷冻组合物融化并获得具有所需要的G-CSF含量的液体组合物。通常，将冷冻组合物转移至调整为该温度范围的冷藏室或水浴。在这种情况下，组合物在该温度保持的时间取决于例如冷冻G-CSF组合物的体积和组合物中G-CSF的浓度。通常，具有大体积、例如100ml或更多和高G-CSF浓度的组合物所需的时间比具有小体积、例如低于100ml和低G-CSF浓度的组合物更长。同样的，在冷藏室中所需时间比在水浴中更长。通常，为获得期望的高G-CSF含量所需的时间为至少12小时，且通常时间在12-72小时范围内。例如，具有低于100ml的小体积的组合物所需的时间通常在12-24小时范围，尽管具有100ml或更多的大体积、例如100ml至8l、例如0.8l和/或高浓度G-CSF、例如2.5至8mg/ml的组合物所需的时间通常为18小时或更多，例如在水浴中为24至48小时，以及在冷藏室中36小时或更多，例如36至72小时。更大体积可能需要成比例的更长时间。
在获得的液体组合物中，G-CSF含量为步骤(a)中提供的组合物的G-CSF含量的至少95％，优选至少97％，最优选至少99％。术语“G-CSF-含量”意在包括G-CSF单体及其多聚体以及由其衍生的相关蛋白如脱酰胺和氧化的变体。例如，可以通过如欧洲药典6.3专论(01/2009：2206；“Filgrastim Concentrated Solution”，第4143-4144页，尤其是第4143页：“Impurities with molecular masses higher than that of filgrastim.Size-exclusion chromatography(2.2.30)”和“Related proteins.Liquidchromatography(2.2.29)”)中所描述的尺寸排阻色谱(SEC)或反相-HPLC(RP-HPLC)来测定G-CSF-含量。尽管两种方法给出相同的结果，但通常使用RP-HPLC。
使用本发明的方法，步骤(d)中获得的重组G-CSF的生物效价基本被保持。具体而言，相对于步骤(a)中提供的G-CSF的生物效价，该生物效价为至少90％，优选至少95％，更优选至少97％、98％或99％。如欧洲药典6.3专论(01/2009：2206；“Filgrastim Concentrated Solution”；第4142-4144页，尤其是第4144页：ASSAY一“potency”)中对非格司亭所述来测定生物活性。简言之，通过与步骤(a)中提供的组合物(以国际单位标定作为参比)相比，通过测量其刺激NFS-60细胞增殖的能力来测定步骤(d)中获得组合物的生物效价。为测定活细胞数目，可以使用荧光素酶化学发光系统来定量细胞内ATP。测量的发光信号与ATP的量成比例，ATP的量与存在的细胞数目成正例。相对效价可以使用合适的统计学方法、例如根据欧洲药典5.3专论的平行线测定来计算，并以步骤(d)中获得组合物与步骤(a)组合物相比的百分比来表达。
在步骤(d)之后，尤其是在提供非糖基化重组人G-CSF的药物组合物的方法中，可将所获得的液体组合物灌装至用于胃肠外用途的初级包装如小瓶或注射器中。有利地，在灌装前，可将液体组合物分成适合施用、例如通过注射或输注于患者的等分试样。G-CSF的浓溶液可在灌装前稀释，并且任选地，稀释缓冲液也可能包含表面活性剂和其它添加剂。
在本发明方法的步骤(c)和(d)中贮藏和融化后获得的G-CSF制剂不显示或仅显示少量的由蛋白吸附、脱酰胺作用或聚集而引起的G-CSF蛋白损失。如上所述，根据本发明方法最终获得的G-CSF组合物的总G-CSF含量为G-CSF起始含量的至少95％。这些组合物，任选稀释后，可以用作各种应用形式的药物，例如用于注射或输注的制剂，尤其是用于静脉内、肌肉内或皮下施用的制剂。所获得的药物可以用于任何可以使用G-CSF的适应症，例如用于嗜中性白细胞减少症、用于骨髓移植的治疗，以及用于传染病和肿瘤疾病的治疗中。
下文将参考实施例和图1对本发明作更详细的说明，但其并不意图限制本发明。
实施例
方法
1.尺寸排阻色谱(SEC)
根据欧洲药典6.3专论(01/2009：2206；“Filgrastim ConcentratedSolution”第4143页：“Impurities with molecular masses higher than that offilgrastim.Size-exclusion chromatography(2.2.30)”)中描述的方法，通过SEC进行聚集分析，不同的是使用荧光检测。简言之，在30℃温度使用亲水硅胶作为固定相。使用磷酸盐缓冲的碳酸氢铵溶液作为流动相、以0.5ml/min的流速进行洗脱。在345nm检测荧光并在280nm激发。对色谱图进行定量，区分G-CSF单体和作为杂质的更高级的聚集体。实验结果用峰面积百分比(％)表示。
2.反相(RP)HPLC
根据欧洲药典6.3专论(01/2009：2206；“Filgrastim ConcentratedSolution”，第4143页：“Related proteins.Liquid chromatography(2.2.29)”)中描述的方法，使用RP-HPLC测定长期贮藏后样品中的G-CSF含量和杂质(脱酰胺和氧化的变体)，不同的是使用荧光检测进行纯度测定，如上所述。相对于G-CSF参比标准，通过UV检测在215nm测定蛋白含量。实验结果用峰面积百分比(％)表示。
3.等电点聚焦(IEF)
根据欧洲药典6.3专论(01/2009：2206；“Filgrastim ConcentratedSolution”，第4143页：“Impurities with charges differing from that offilgrastim.Isoelectric focusing(2.2.54)”)中描述的方法，通过IEF进行对冻融后样品的与非格司亭电荷不同的杂质的分析，不同的是使用较低浓度的参比溶液以及银染法以得到更高的灵敏度。
实施例1
制备作为非糖基化重组人G-CSF的非格司亭的以下水性乙酸盐或谷氨酸盐缓冲的组合物，如下表1所示，并用于以下实验：
表1
组合物 G-CSF(mg/ml) 缓冲剂(10mM) 山梨糖醇 pH
1 2.26 乙酸盐 50mM 4.1
2 1.90 谷氨酸盐 50mM 4.4
3 3.10 乙酸盐 50mM 4.5
4 3.30 乙酸盐 50mM 4.5
5 1.98 谷氨酸盐 50mM 4.4
6 1.86 谷氨酸盐 50mM 4.4
7 1.70 谷氨酸盐 50mM 4.4
8 1.79 谷氨酸盐 50mM 4.4
在所有以下实验中，将各组合物的G-CSF含量(mg/ml)定义为100％数值。
实施例2
使用Integrated Biosystems CryoPilotTM系统，将组合物1和2(在聚乙烯(PE)袋中30ml)在各种条件下进行冻融。如欧洲药典6.3专论(01/2009：2206；“Filgrastim Concentrated Solution”，第4143页：“Impurities withmolecular masses higher than that of filgrastim.Size-exclusionchromatography(2.2.30)”)中所述，使用SEC测定G-CSF的聚集体、低聚体、二聚体和单体的百分比以及总G-CSF含量。在冷冻前(T0)和按照条件A、B和C冻融后测定所有数值。下表2中指示了结果和冷冻/融化(F/T)条件。
表2
Figure BDA00002636292400111
F/T条件：
T0：冷冻前的组合物
A：将组合物迅速冷却至-20℃。将组合物在该温度贮藏4h后，立即将冷冻组合物转变为+20℃的温度。将组合物在该温度保持2h，然后转变为+4℃的温度，将它们在该温度再保持12h。在+20℃2h以及在4℃1h后，组合物已经完全融化。
B：将组合物从+4℃迅速冷却至-20℃。在该温度贮藏4h后，使用程序化的CryoPilotTM线性温度梯度经7h时间将温度缓慢升至+4℃的温度。
C：使用程序化的CryoPilotTM线性温度梯度经17h时间将组合物从+4℃冷却至-20℃。此后，使用CryoPilotTM系统的程序升温梯度经7h时间将温度缓慢升至+4℃的温度。
结果显示：在条件A下迅速融化导致显著的G-CSF含量损失，然而在条件B和C下将冷冻组合物的温度从-20℃缓慢升至+4℃可以获得G-CSF含量与起始提供的G-CSF组合物的G-CSF含量相当的液体组合物。冷冻速率对最终G-CSF含量没有影响。
实施例3
将组合物3和4(在5ml PETG瓶中3.5ml)进行5个连续F/T循环。在每个循环中，将样品在冰箱中从+4℃冷却至-20℃，在-20℃贮藏20h后，将其直接转移至调整为+4℃温度的冷藏室。使样品在该温度放置16h融化，并使组合物重新获得它们的起始G-CSF含量。如上所述，在实验开始时和循环1、3和5后、使用SEC(非格司亭的多聚体)和RP-HPLC(G-CSF含量和脱酰胺和氧化的G-CSF变体)，测定G-CSF含量和杂质。结果示于下表3。
表3
由以上结果可见，G-CSF含量以及总杂质在每个循环后基本保持相同，所有数值在实验误差限度内。
实施例4
将组合物5和6(在10ml PETG瓶中7ml)在冰箱中从+4℃冷却至-20℃。将冷冻样品在-20℃贮藏2个月，然后将其直接转移至调整为+4℃温度的冷藏室。使样品在该温度放置24h融化，并使组合物重新获得它们的起始G-CSF含量。在实验时间内，将组合物5和6的样品在25℃保持作为对照。
如上所述，使用等电点聚焦(IEF)分析所有样品中具有与非格司亭电荷不同的杂质。结果示于图1，其中主要条带即最强条带代表非格司亭，而迁移至主要条带下具有较低强度的条带主要代表其脱酰胺变体。由图1可以看出，在-20℃贮藏的样品(泳道1和2)显示与在25℃贮藏的样品(泳道3和4)具有显著较少的非格司亭的脱酰胺变体。
而且如上所述，在冷冻前(T0)以及贮藏2个月并融化后(T1/-20℃)，使用RP-HPLC(G-CSF含量和脱酰胺和氧化的G-CSF变体)和SEC(G-CSF的多聚体)，测定在-20℃贮藏的样品的总G-CSF含量和杂质。其结果连同在25℃(T1/+25℃)贮藏的对照样品的结果示于下表4。
表4
由以上结果可见，在冷冻前后G-CSF含量基本保持相同，所有数值在实验误差限度内。通过RP-HPLC测定的脱酰胺和氧化G-CSF变体的增加与图1显示的使用IEF所得结果一致。
实施例5
将组合物5、7和8(在1000ml PETG瓶中800ml)在-20℃贮藏36个月。贮藏后，将组合物转移至调整为+4℃温度的冷藏室并使其在该温度融化48h。将由此获得的液体组合物进行5个连续F/T循环。在每个循环中，将样品在冰箱中从+4℃冷却至-20℃，在-20℃贮藏至少24h后，将其直接转移至调整为+4℃温度的冷藏室。使样品在该温度放置48h融化，并使组合物重新获得它们的起始G-CSF含量。如上所述，在实验开始时(F/T0)和在完成循环5(F/T 5)后、使用的RP-HPLC(G-CSF含量和脱酰胺和氧化的G-CSF变体)和SEC(G-CSF的多聚体)测定G-CSF含量和杂质。结果示于下表5。
表5
Figure BDA00002636292400141
由以上结果可见，在冷冻前和完成循环5后G-CSF含量以及总杂质基本保持相同，所有结果在实验误差的限度内。

Claims (13)

1.用于非糖基化重组人G-CSF的稳定长期贮藏的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含非糖基化重组人G-CSF和山梨糖醇的水性乙酸盐或谷氨酸盐缓冲的G-CSF组合物；
(b)将步骤(a)中提供的G-CSF-制剂冷却至-15℃或更低的温度以获得冷冻G-CSF制剂；
(c)将步骤(b)中获得的所述G-CSF-制剂贮藏于所述冷冻状态下；
(d)将步骤(c)的所述冷冻G-CSF组合物的温度经历一段时间升至2℃-8℃范围的温度，所述时间被调整以使所述组合物融化并获得液体组合物，所述液体组合物的G-CSF含量为步骤(a)中提供的组合物的G-CSF含量的至少95％。
2.权利要求1的方法，其中步骤(a)的缓冲的G-CSF-制剂中G-CSF的量在0.1mg/ml至8.0mg/ml的范围，优选0.25mg/ml至6.5mg/ml的范围。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述缓冲的G-CSF组合物的pH为3.5至5，优选3.7至4.8。
4.权利要求1至3任一项的方法，其中所述缓冲的G-CSF组合物的乙酸盐或谷氨酸盐浓度在0.5mM至100mM的范围，优选2mM至80mM的范围。
5.权利要求1至4任一项的方法，其中所述G-CSF组合物中山梨糖醇的量在10至100mg/ml的范围，优选25至75mg/ml的范围。
6.权利要求1至5任一项的方法，其中步骤(a)中提供的水性乙酸盐或谷氨酸盐缓冲的G-CSF组合物的体积为0.1ml至8L，优选为5ml至4L，更优选为100ml至1.5L。
7.权利要求1至6任一项的方法，其中将步骤(b)中的G-CSF组合物冷却至-15℃至-25℃的温度或-60℃至-80℃的温度。
8.权利要求1至7任一项的方法，其中将步骤(c)中的冷冻的G-CSF组合物贮藏至少两天的时间，优选至少一个月的时间，更优选至少三个月的时间。
9.权利要求1至8任一项的方法，其中所述冷冻G-CSF组合物的温度升至步骤(d)中2℃至8℃范围的温度是通过经过至少6小时时间逐渐或线性地升高温度实现的。
10.权利要求1至8任一项的方法，其中所述冷冻G-CSF组合物的温度升至步骤(d)中的温度是通过将冷冻组合物转移至2℃-8℃范围的温度并将组合物在所述温度保持至少12小时、优选至少24小时、更优选至少36小时的时间实现的。
11.权利要求1至10任一项的方法，其中所述G-CSF组合物不含表面活性剂。
12.权利要求1至10任一项的方法，其中所述G-CSF组合物包含表面活性剂。
13.提供非糖基化重组人G-CSF的药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用乙酸盐或谷氨酸盐缓冲液和山梨糖醇配制非糖基化重组人G-CSF以获得水性缓冲G-CSF组合物；
(b)将步骤(a)的所述G-CSF组合物冷却至-15℃或更低的温度以获得冷冻G-CSF组合物；
(c)将步骤(b)中获得的所述G-CSF组合物贮藏于所述冷冻状态下；
(d)将步骤(c)的所述冷冻G-CSF组合物的温度经历一段时间升至2℃至8℃范围的温度，所述时间被调整以使所述组合物融化并获得液体组合物，所述液体组合物的G-CSF含量为步骤(a)中提供的组合物的G-CSF含量的至少95％；以及
(e)将步骤(d)中获得的液体组合物灌装至用于胃肠外用途的初级包装中。
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