CN102944525A - 镍-双缩脲试剂盒的制备方法、产品及应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种镍-双缩脲试剂盒的制备方法、产品及应用方法。本发明产品的制备方法包括如下步骤：1）将1.0~1.4mol/L氢氧化钠用0.14~0.2mol/L氯化钠溶液溶解得A组试剂；2）将0.05~0.07mol/L三乙醇胺、0.17~0.23mol/L柠檬酸三钠、0.015~0.025mol/L六水合硫酸镍分别用0.14~0.2mol/L氯化钠溶液进行溶解，然后将溶解后的三乙醇胺、柠檬酸三钠、六水合硫酸镍以3:（4~5）:(2~3)的体积比先将溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的柠檬酸三钠混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸镍混合得B组试剂。3）使用时将A组试剂与B组试剂以4：1~6：1的比例混合，得镍-双缩脲试剂。本发明的优点是：对各种蛋白显色的一致性好且灵敏度较高，线性范围大。
Description
技术领域
本发明涉及一种镍-双缩脲试剂盒的制备方法、产品及应用方法。
背景技术
测定尿或脑脊液总蛋白的方法有许多，但就对各种蛋白显色的一致性来讲，双缩脲显色法的均一性还是最好的。如目前最常用的邻苯三酚红钼法（PyrogaUol Red．fnolybdate）和氯化苄甲乙氧铵(Benzethonium Chloride)尿总蛋白质测定,前者为染料结合法后者为浊度法。由于两者都与白蛋白和球蛋白反应灵敏性存在差异，故不能准确表达蛋白含量，而双缩脲法是利用了蛋白质的多肽键，所以显色和蛋白质种类没关系。临床大多采用铜双缩脲法,但是其显色不太敏感，通常只能用于检测血清总蛋白等含量较高的体液，而对尿、脑脊液蛋白却需要沉淀离心浓缩步骤而不能直接检测。而已报道的镍-双缩脲试剂稳定性、检测灵敏度也都不能同时达不到对尿、脑脊液蛋白直接检测要求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种不需沉淀离心浓缩即可直接测定尿液或脑脊液总蛋白的镍-双缩脲试剂盒的制备方法、产品及应用方法。
本发明是这样实现的：一种镍-双缩脲试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）制备A组试剂：将1.0~1.4 mol/L氢氧化钠用0.14~0.2mol/L氯化钠溶液溶解得A组试剂；
2）制备B组试剂：将0.05~0.07mol/L三乙醇胺、0.17~0.23mol/L柠檬酸三钠、0.015~0.025 mol/L六水合硫酸镍分别用0.14~0.2mol/L 氯化钠溶液进行溶解，然后将溶解后的三乙醇胺、柠檬酸三钠、六水合硫酸镍以3:（4~5）：（2~3）的体积比先将溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的柠檬酸三钠混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸镍混合得B组试剂；
3）将A组试剂、B组试剂分别保存，使用时将A组试剂与B组试剂以4:1~6:1体积比的比例混合，得镍-双缩脲试剂。
步骤2中所述三乙醇胺优选为0.06mol/L。
所述步骤1、步骤2中所述氯化钠溶液分别优选为0.154 mol/L。
一种如上所述的镍-双缩脲试剂的制备方法所制得的产品。
一种如上所述的镍-双缩脲试剂盒的制备方法所制得产品的应用方法，包括如下步骤：
a）在浓度为0~8000mg/L的范围内，用3~7个不同浓度定标液测定总蛋白，得出定标曲线；
b）测定被测样本总蛋白含量：在以下两种方式中选择一种：方式一：手工比色法：取所述A组试剂1.8~2.8ml与B组试剂0.3~0.7ml混合，然后加入0.25~0.35ml被测样本混合后，放置30℃~40℃水浴2~4小时或避光室温16~48小时；用分光光度仪测定吸光值，并用空白镍-双缩脲试剂校零，最终测得的结果与步骤a中所述定标液的定标曲线进行对照，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量；方式二：生化自动仪测试法：取A组试剂0.18~0.28ml加入被测样本0.025~0.035ml，混合后放入生化自动仪中，在30℃~40℃水浴4~7分钟后测定吸光值，然后加入B组试剂0.03~0.07ml混合后继续水浴10~25分钟，测定吸光值，最终测得结果与所述定标液的定标曲线进行对照，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量。
步骤b的手工比色法中所述分光光度仪在波长为420nm~ 470nm处进行吸光值测定。
步骤b中所述被测样本的总蛋白含量在50mg/L~8000mg/L范围内呈线性。
所述步骤b的生化自动仪测试法中测定吸光值时所在的主波长为420nm~470nm ，副波长为650nm~700nm。
所述被测样本在尿液样本、脑脊液样本中任选一种。
所述步骤b的手工比色法中，所述空白镍-双缩脲试剂是指取所述A组试剂1.8~2.8ml与B组试剂0.3~0.7ml混合，然后用等量的生理盐水或蒸馏水代替被测样本加入到A组试剂与B组试剂的混合液中，所述空白镍-双缩脲试剂用于对被测样本所测得的颜色进行校准。
本发明发明原理及效果如下：
1、本发明所述的空白镍-双缩试剂为浅黄色，6个内月稳定，镍-双缩脲试剂与被测样本混合后最终产物为深黄。根据本发明用镍-双缩脲试剂盒测定尿液或脑脊液总蛋白的应用方法(简称镍双缩法)，消光系数可达到0.459，而铜Doumas法双缩法复合物消光系数为0.298，比铜双缩法高出54%，恰好达到了能够测定尿液总蛋白的最低要求。其光谱吸收曲线用SHIMABEU-2550型分光光度仪进行扫描，吸收峰为440nm。
但是若通过手工比色法，要完成整个反应在37℃需3小时，为了适合自动化分析仪的应用，对生化自动仪的测定过程进行改进，缩短了反应时间，增加了定标点，最后标准曲线呈现抛物线。定标液的蛋白最高定标浓度是2000mg/L，但经过测定，本发明在定标曲线的2000~8000mg/L的延伸范围依然呈现良好的总蛋白测定结果。
2. 镍双缩法的核心问题是络合剂。络合剂的作用就是防止镍液析出沉淀，增加镍液稳定性并延长使用寿命。如果镍液中没有络合剂存在，由于镍的氢氧化物溶解度较小，便可析出浅绿色絮状含水氢氧化镍沉淀。硫酸镍溶于水后形成六水合镍离子，如果六水合镍离子中有部分络合剂存在则可以明显提高其抗水解能力，甚至有可能在碱性环境中以镍离子形式存在。不过，pH值增加，六水合镍离子中的水分子会被OH根取代，促使水解加剧，要完全抑制水解反应，镍离子必须全部螯合以得到抑制水解的最大稳定性。
但是加入络合剂使试剂中游离镍离子浓度大幅度下降，从质量作用定律看降低反应物浓度反而提高了反应速度是不可能的，因此合适的络合剂则要求它们具有较大的溶解度，存在一定的反应活性。经过研究和反复实验，发现三乙醇胺络合能力虽较差在碱性条件下较稳定，pH11-13时能隐蔽Fe、Al、Mn 等，可用于乙二胺四乙酸（EDTA）对镍滴定的隐蔽剂。符合使游离的镍离子既不能太多使产生沉淀，也不能太少而影响双缩脲显色法的速度的要求。
3.黄疸尿光谱分析其色素变化规律为：
1）尿液分析呈单一胆红素峰。
2）尿液中出现两种吸收峰，一种吸收峰为420nm的胆红素、另一种吸收峰为492nm的尿胆素，其中胆红素为主。
3）各种原因引起红细胞大量破坏，肝脏超负荷代谢，至使尿胆原、尿胆素显著增高。同时大量血红蛋白（Hb）超过结合球蛋白等结合能力，从滤膜滤出。因此除尿胆素吸收峰外，尚可见吸收峰在415nm、540nm、575nm的血红蛋白（Hb）特异吸收峰，其中以吸收峰在415nm为主。而胆红素的吸收峰在420nm与自动化分析仪的450nm相近，具有干扰作用。考虑到胆红素在碱性条件下的分解情况，本发明的生化自动仪测试法中特意把含有氢氧化钠液的A试剂放在1号试剂位，与2号位的B试剂三乙醇胺分开存放，使三乙醇胺避开强碱性而更稳定，并把第1次测定点设在样品加入A试剂后4~7分钟以用于胆红素分解，胆红素浓度< 0.07262mol/L时，对结果无影响。
本发明产品在制备时三乙醇胺的最佳浓度在0.05~0.07mol/L之间浓度，三乙醇胺浓度和试剂空白具有一定关系，当三乙醇胺的浓度提高时，试剂空白也会随之相应提高，而０．０６mol/L就是在确保反应速度的前提下尽可能减少空白值是最佳点。当三乙醇胺的浓度再提高时反应速度没提高而只是提高了试剂空白。使最低检测灵敏度下降。
经过反复实验发现氯化钠的存在可以加快镍双缩法的反应速度，而在氯化钠达到0.154mol/L后，则加快作用不再增加。
本发明的有益效果是：本发明根据双缩脲在碱性条件下除能与铜形成络合物外, 还能与钻、镍、锌等结合 ,且与镍-螯合物配制双缩脲显色较为灵敏的特点，通过研究和各种改进建立了蛋白检测范围50mg/L-8000mg/L且能用于自动化分析的方法，使双缩脲显色法的应用领域得到了扩展。本发明的产品在用于测定尿液总蛋白时，不需沉淀离心浓缩、可以直接准确的测定尿液/脑脊液总蛋白。以生化自动仪测试法测定20例尿液蛋白并与钨酸沉淀离心铜双缩脲法、邻苯三酚红钼法、氯化苄甲乙氧铵法同时检测，蛋白浓度在68-3684mg/L之间，结果配对t检验分析显示镍双缩脲法与钨酸沉淀离心铜双缩脲法间p>0.05无显著差异。而邻苯三酚红钼法偏高，氯化苄甲乙氧铵法偏低，说明镍双缩脲法具有铜双缩脲沉淀离心法的准确性，却同时有着直接测定的便利性，值得推广。
具体实施方式
本发明镍-双缩脲试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1）制备A组试剂：将1.0~1.4mol/L 氢氧化钠用0.14~0.2mol/L 氯化钠溶液溶解得A组试剂；
2）制备B组试剂：将0.05~0.07mol/L三乙醇胺、0.17~0.23mol/L柠檬酸三钠、0.015~0.025mol/L六水合硫酸镍分别用0.14~0.2mol/L氯化钠溶液进行溶解，然后将溶解后的三乙醇胺、柠檬酸三钠、六水合硫酸镍以3:（4~5）:(2~3) 体积比先将溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的柠檬酸三钠混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸镍混合得B组试剂。
3）将A组试剂、B组试剂分别保存，使用时将A组试剂与B组试剂以4:1~6:1体积比的比例混合，得镍-双缩脲试剂。
本发明镍-双缩脲试剂盒的制备方法所制得产品的应用方法，包括如下步骤：
a）定标曲线可通过常规手工比色法和常规生化自动仪测试法两种方法进行定标得到，定标曲线在用常规手工比色法定标时，在浓度为0~8000mg/L的范围内用2~7个不同浓度定标液测定总蛋白，得出定标曲线呈直线；在用常规生化自动仪测试法定标时在浓度为0~2000mg/L的范围内用5~7个不同浓度定标液测定总蛋白，得出定标曲线呈抛物线。所述的用定标液得出定标曲线的方法为常规的现有技术，本发明不作详述。
b）测定被测样本总蛋白含量：在以下两种方式中选择一种：
方式一：手工比色法：取所述A组试剂1.8~2.8 ml（优选2.3~2.7ml）与B组试剂0.3~0.7ml混合，然后加入0.25~0.35ml被测样本混合后，放置30℃~40℃水浴2~4小时或避光室温16~48小时；用分光光度仪测定在波长为420nm~470nm处的吸光值，并用空白镍-双缩脲试剂校零，最终测得的结果与步骤a中所述的定标曲线进行对照，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量；所述被测样本的总蛋白含量在50mg/L~8000mg/L范围内呈线性。
所述空白镍-双缩脲试剂是指用等量的生理盐水或蒸馏水代替被测样本，即在取所述A组试剂1.8~2.8 ml与B组试剂0.3~0.7ml混合后，加入0.25~0.35ml的生理盐水或蒸馏水混合。所述空白镍-双缩脲试剂用于对被测样本所测得的颜色进行校准。
方式二：生化自动仪测试法：取A组试剂0.18~0.28ml（优选0.23ml~0.27ml）加入被测样本0.025ml~0.035ml，混合后放入生化自动仪中，在30℃~ 40℃水浴4~7分钟后在主波长为420~470nm，副波长为650~700nm处测定吸光值，然后加入B组试剂0.03~0.07ml混合后继续水浴10~25分钟，在主波长为420~470nm，副波长为650~700nm处测定吸光值，最终测得结果与所述定标曲线进行对照，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量。
所述被测样本在尿液样本、脑脊液样本中任选一种。
本发明所使用的分光光度仪主要包括以下几种中的任意一种：日本岛京公司生产的、型号为：SHIMABEU-2550型的分光光度仪；上海上分公司生产的、型号为721-100 的分光光度仪；美国哈希公司生产的、型号为DR2700-01的分光光度仪；上海尤尼柯公司生产的、型号为7200 的分光光度仪。
本发明所使用的生化自动仪主要包括以下几种中的任意一种：日本日立公司生产的、型号为：HITACH I7170型的全自动生化分析仪；德国罗氏公司公司生产的、型号为MODULAR P-800模块的生化自动仪；美国雅培公司生产的、型号为Aeroset 的生化自动仪；德国西门子公司生产的、型号为ADBIAOR2400的生化自动仪。
以上所述分光光度仪与生化自动仪的型号具有代表性，是为了进一步说明本发明，而非对本发明的限制。
下面通过具体实施例对本发明作进一步阐述。
实施例一：本例镍-双缩脲试剂的制备方法，包括如下步骤：
1）制备A组试剂：将1.2mol/L氢氧化钠用0.154mol/L氯化钠溶液溶解得A组试剂；
2）制备B组试剂：将0.05mol/L三乙醇胺、0.2mol/L柠檬酸三钠、0.02mol/L六水合硫酸镍分别用0.154mol/L氯化钠溶液进行溶解，然后将溶解后的三乙醇胺、柠檬酸三钠、六水合硫酸镍以3:5:2的体积比先将溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的柠檬酸三钠混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸镍混合得B组试剂。
3）将A组试剂、B组试剂分别保存，使用时将A组试剂与B组试剂按5:1体积比的比例混合，得镍-双缩脲试剂。
本例用镍-双缩脲试剂测定尿液总蛋白的应用方法，包括如下步骤：
a）在0~2000mg/L的范围内，通过常规生化自动仪测试法，用6个不同浓度的定标液测定总蛋白，得出定标曲线。
b）以加入已知血清含量的尿液样本作为被测样本，测定尿液样本总蛋白含量：在以下两种方式中选择一种：
方式一：手工比色法：取所述A组试剂2.5ml与B组试剂0.5ml混合，然后加入0.3ml尿液样本混合后，放置37℃水浴3小时；用分光光度仪测定在波长为440nm处的吸光值，并用空白镍-双缩脲试剂校零，最终测得的结果与步骤a中所述的定标曲线进行对照，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量；所述空白镍-双缩脲试剂是指用等量的生理盐水代替被测样本加入A组试剂和B组试剂进行混合，用于对被测样本所测得的颜色进行校准。根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量在50mg/L-8000mg/L范围内符合准确度要求。
方式二：生化自动仪测试法：取A组试剂0.25ml加入尿液样本0.03ml，混合后放入生化自动仪中，在37℃水浴5分钟后测定吸光值，然后加入B组试剂0.05ml混合后继续水浴15分钟，在主波长为450nm，副波长为700nm处测定吸光值，最终测得结果与所述标准液定值进行对照，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量在50mg/L-8000mg/L范围内符合准确度要求。
实施例二：本例镍-双缩脲试剂的制备方法，包括如下步骤：
1）制备A组试剂：将1.2mol/L氢氧化钠用0.154mol/L氯化钠溶液溶解得A组试剂；
2）制备B组试剂：将0.05mol/L三乙醇胺、0.2mol/L柠檬酸三钠、0.02mol/L六水合硫酸镍分别用0.154mol/L氯化钠溶液进行溶解，然后将溶解后的三乙醇胺、柠檬酸三钠、六水合硫酸镍以3:5:2 体积比先将溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的柠檬酸三钠混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸镍混合得B组试剂。
3）将A组试剂、B组试剂分别保存，使用时将A组试剂与B组试剂以5:1体积比的比例混合，得镍-双缩脲试剂。
本例用镍-双缩脲试剂测定脑脊液总蛋白的应用方法，包括如下步骤：
a）在0~2000mg/L的范围内，通过常规生化自动仪测试法，用6个不同浓度的定标液测定总蛋白，得出定标曲线。
b）以加入已知血清含量的脑脊液作为被测样本，测定脑脊液样本总蛋白含量：在以下两种方式中选择一种：
方式一：手工比色法：手工比色法：取所述A组试剂2.5ml与B组试剂0.5ml混合，然后加入0.3ml离心后脑脊液样本混合后，放置避光室温48小时；用分光光度仪测定在波长为440nm处的吸光值，并用空白镍-双缩脲试剂校零，最终测得的结果与步骤a中所述的定标曲线进行对照，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量；所述空白镍-双缩脲试剂是指用等量的生理盐水代替被测样本，用于对被测样本所测得的颜色进行校准，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量在50mg/L-8000mg/L范围内符合准确度要求。
方式二：生化自动仪测试法：取A组试剂0.25ml加入脑脊液样本0.03ml，混合后放入生化自动仪中，在37℃水浴5分钟后测定吸光值，然后加入B组试剂0.05ml混合后继续水浴15分钟，在主波长为450nm，副波长为700nm处测定吸光值，最终测得结果与所述标准液定值进行对照，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量在50mg/L-8000mg/L范围内符合准确度要求。
实施例三：本例镍-双缩脲试剂的制备方法，包括如下步骤：
1）制备A组试剂：将1.0mol/L氢氧化钠用0.18mol/L氯化钠溶液溶解得A组试剂；
2）制备B组试剂：将0.065mol/L三乙醇胺、0.21mol/L柠檬酸三钠、0.015mol/L六水合硫酸镍分别用0.18mol/L氯化钠溶液进行溶解，然后将溶解后的三乙醇胺、柠檬酸三钠、六水合硫酸镍以3:5:3的体积比先将溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的柠檬酸三钠混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸镍混合得B组试剂。
3）将A组试剂、B组试剂分别保存，使用时将A组试剂与B组试剂以5:1的比例混合，得镍-双缩脲试剂。
本例用镍-双缩脲试剂测定尿液总蛋白的应用方法，包括如下步骤：
a）在0~2000mg/L的范围内，用5个不同浓度的定标液测定总蛋白，得出定标曲线。
b）以加入已知血清含量的尿液作为被测样本，测定尿液样本总蛋白含量：在以下两种方式中选择一种：
方式一：手工比色法：取所述A组试剂1.8ml与B组试剂0.36ml混合，然后加入0.28ml尿液样本混合后，放置37℃水浴2.2小时或避光室温30小时；用分光光度仪测定在波长为420nm处的吸光值，并用空白镍-双缩脲试剂校零，最终测得的结果与步骤a中所述定标曲线进行对照，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量；所述空白镍-双缩脲试剂是指用等量的生理盐水代替被测样本，用于对被测样本所测得的颜色进行校准，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量在50mg/L-7500mg/L范围内符合准确度要求。
方式二：生化自动仪测试法：取A组试剂0.18ml加入被测样本0.028ml，混合后放入生化自动仪中，在35℃水浴4.3分钟后测定吸光值，然后加入B组试剂0.036ml混合后继续水浴18分钟，在主波长为450nm，副波长为650nm处测定吸光值，最终测得结果与所述标准液定值进行对照，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量在50mg/L-6000mg/L范围内符合准确度要求。
实施例四：本例镍-双缩脲试剂的制备方法，包括如下步骤：
1）制备A组试剂：将1.25mol/L氢氧化钠用0.154mol/L氯化钠溶液溶解得A组试剂；
2）制备B组试剂：将0.06mol/L三乙醇胺、0.18mol/L柠檬酸三钠、0.017mol/L六水合硫酸镍分别用0.154mol/L氯化钠溶液进行溶解，然后将溶解后的三乙醇胺、柠檬酸三钠、六水合硫酸镍以3:4:3的体积比先将溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的柠檬酸三钠混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸镍混合得B组试剂。
3）将A组试剂、B组试剂分别保存，使用时将A组试剂与B组试剂以4:1的比例混合，得镍-双缩脲试剂。
本例用镍-双缩脲试剂测定尿液总蛋白的应用方法，包括如下步骤：
a）在0~2000mg/L的范围内，用5个不同浓度的定标液测定总蛋白，得出定标曲线。
b）以加入已知血清含量的尿液作为被测样本，测定尿液样本总蛋白含量：在以下两种方式中选择一种：
方式一：手工比色法：取所述A组试剂2.8ml与B组试剂0.7ml混合，然后加入0.35ml尿液样本混合后，放置33℃水浴3.5小时或避光室温40小时；用分光光度仪测定在波长为450nm处的吸光值，并用空白镍-双缩脲试剂校零，最终测得的结果与步骤a中所述定标曲线进行对照，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量；所述空白镍-双缩脲试剂是指用等量的生理盐水代替被测样本，用于对被测样本所测得的颜色进行校准，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量为50mg/L-7500mg/L范围内，符合准确度要求。
方式二：生化自动仪测试法：取A组试剂0.28ml加入被测样本0.035ml，混合后放入生化自动仪中，在33℃水浴4分钟后测定吸光值，然后加入B组试剂0.07ml混合后继续水浴25分钟，在主波长为470nm，副波长为700nm处测定吸光值，最终测得结果与所述标准液的定标曲线进行对照，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量为50mg/L-6000mg/L。
实施例五：本例镍-双缩脲试剂的制备方法，包括如下步骤：
1）制备A组试剂：将1.4mol/L氢氧化钠用0.2mol/L氯化钠溶液溶解得A组试剂；
2）制备B组试剂：将0.07mol/L三乙醇胺、0.23mol/L柠檬酸三钠、0.025mol/L六水合硫酸镍分别用0.2mol/L氯化钠溶液进行溶解，然后将溶解后的三乙醇胺、柠檬酸三钠、六水合硫酸镍以3:4:2的体积比先将溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的柠檬酸三钠混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸镍混合得B组试剂。
3）将A组试剂、B组试剂分别保存，使用时将A组试剂与B组试剂以6:1的比例混合，得镍-双缩脲试剂。
本例用镍-双缩脲试剂测定脑脊液总蛋白的应用方法，包括如下步骤：
a）在0~8000mg/L的范围内，通过常规手工比色法，用7个不同浓度的定标液测定总蛋白，得出定标曲线。
b）以加入已知血清含量的脑脊液作为被测样本，测定脑脊液样本总蛋白含量：在以下两种方式中选择一种：
方式一：手工比色法：取所述A组试剂1.8ml与B组试剂0.3ml混合，然后加入0.25ml脑脊液样本混合后，放置30℃水浴4小时或避光室温16小时；用分光光度仪测定在波长为470nm处的吸光值，并用空白镍-双缩脲试剂校零，最终测得的结果与步骤a中所述定标曲线进行对照，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量；所述空白镍-双缩脲试剂是指用等量的蒸馏水代替被测样本，用于对被测样本所测得的颜色进行校准，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量为50~5800 mg/L范围内，符合准确度要求。
方式二：生化自动仪测试法：取A组试剂0.18ml加入被测样本0.025ml，混合后放入生化自动仪中，在30℃水浴7分钟后测定吸光值，然后加入B组试剂0.03ml混合后继续水浴10分钟，在主波长为420nm，副波长为620nm处测定吸光值，最终测得结果与所述标准液的定标曲线进行对照，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量为50~5500 mg/L。
实施例六：本例镍-双缩脲试剂的制备方法，包括如下步骤：
1）制备A组试剂：将1.3mol/L氢氧化钠用0.14mol/L氯化钠溶液溶解得A组试剂；
2）制备B组试剂：将0.065mol/L三乙醇胺、0.17mol/L柠檬酸三钠、0.016mol/L六水合硫酸镍分别用0.14mol/L氯化钠溶液进行溶解，然后将溶解后的三乙醇胺、柠檬酸三钠、六水合硫酸镍以3:5:3的体积比先将溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的柠檬酸三钠混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸镍混合得B组试剂。
3）将A组试剂、B组试剂分别保存，使用时将A组试剂与B组试剂以4:1的比例混合，得镍-双缩脲试剂。
本例用镍-双缩脲试剂测定脑脊液总蛋白的应用方法，包括如下步骤：
a）定标曲线在用常规手工比色法定标时，在浓度为0~8000mg/L的范围内用3个不同浓度定标液测定总蛋白，得出定标曲线，在用常规生化自动仪测试法定标时在浓度为0~2000mg/L的范围内用5个不同浓度定标液测定总蛋白，得出定标曲线。b）以加入已知血清含量的脑脊液作为被测样本，测定脑脊液样本总蛋白含量：在以下两种方式中选择一种：
方式一：手工比色法：取所述A组试剂2.7ml与B组试剂0.675ml混合，然后加入0.32ml脑脊液样本混合后，放置40℃水浴2小时或避光室温20小时；用分光光度仪测定在波长为430nm处的吸光值，并用空白镍-双缩脲试剂校零，最终测得的结果与步骤a中所述定标曲线进行对照，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量；所述空白镍-双缩脲试剂是指用等量的蒸馏水代替被测样本，用于对被测样本所测得的颜色进行校准，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量为50~5600 mg/L范围内，符合准确度要求。
方式二：生化自动仪测试法：取A组试剂0.27ml加入被测样本0.032ml，混合后放入生化自动仪中，在40℃水浴6分钟后测定吸光值，然后加入B组试剂0.0675ml混合后继续水浴20分钟，在主波长为430nm，副波长为630nm处测定吸光值，最终测得结果与所述标准液的定标曲线进行对照，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量为50~5200 mg/L。
表1全自动生化仪回收试验实施例一、三、四测试结果如下（单位：mg/L）
| 预期值 | 58 | 89 | 197 | 490 | 1000 | 1980 | 3897 | 5988 | 7856 |
| 实施例一 | 56 | 91 | 189 | 495 | 988 | 2003 | 3942 | 6032 | 7921 |
| 实施例三 | 61 | 88 | 201 | 487 | 1023 | 1989 | 3922 | 6011 | 7012 |
| 实施例四 | 59 | 92 | 205 | 502 | 1014 | 2011 | 4012 | 5798 | 6895 |
通过表1，本发明在测定尿液样本总蛋白含量时，实施例一的方案最好，实施例三、实施例四在6000mg/L以上高浓度时，测得的蛋白总量明显低于实施例一，但仍能达到良好的测试结果。
表2 全自动生化仪回收试验实施例二测试结果如下（单位：mg/L）
| 预期值 | 63 | 101 | 204 | 510 | 1020 | 2010 | 4210 | 6012 | 8014 |
| 实施例二 | 62 | 98 | 201 | 503 | 1025 | 1997 | 4122 | 6015 | 7982 |
通过表2，本发明实施例二与实施例一采用同样的产品方案测试不同的被测样本的总蛋白含量，最终结果仍能达到理想效果。
Claims (10)
1.一种镍-双缩脲试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）制备A组试剂：将1.0~1.4 mol/L氢氧化钠用0.14~0.2mol/L氯化钠溶液溶解得A组试剂；
2）制备B组试剂：将0.05~0.07mol/L三乙醇胺、0.17~0.23mol/L柠檬酸三钠、0.015~0.025 mol/L六水合硫酸镍分别用0.14~0.2mol/L 氯化钠溶液进行溶解，然后将溶解后的三乙醇胺、柠檬酸三钠、六水合硫酸镍以3:（4~5）：（2~3）的体积比先将溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的柠檬酸三钠混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸镍混合得B组试剂；
3）将A组试剂、B组试剂分别保存，使用时将A组试剂与B组试剂以4:1~6:1体积比的比例混合，得镍-双缩脲试剂。
2.根据权利要求1所述的镍-双缩脲试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤2中所述三乙醇胺为0.06mol/L。
3.根据权利要求1所述的镍-双缩脲试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤1、步骤2中所述氯化钠溶液分别为0.154 mol/L。
4.一种如权利要求 1 所述的镍-双缩脲试剂的制备方法所制得的产品。
5.一种如权利要求 1 所述的镍-双缩脲试剂盒的制备方法所制得产品的应用方法，其特征在于：包括如下步骤：
a）在浓度为0~8000mg/L的范围内，用3~7个不同浓度定标液测定总蛋白，得出定标曲线；
b）测定被测样本总蛋白含量：在以下两种方式中选择一种：方式一：手工比色法：取所述A组试剂1.8~2.8ml与B组试剂0.3~0.7ml混合，然后加入0.25~0.35ml被测样本混合后，放置30℃~40℃水浴2~4小时或避光室温16~48小时；用分光光度仪测定吸光值，并用空白镍-双缩脲试剂校零，最终测得的结果与步骤a中所述定标液的定标曲线进行对照，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量；方式二：生化自动仪测试法：取A组试剂0.18~0.28ml加入被测样本0.025~0.035ml，混合后放入生化自动仪中，在30℃~40℃水浴4~7分钟后测定吸光值，然后加入B组试剂0.03~0.07ml混合后继续水浴10~25分钟，测定吸光值，最终测得结果与所述定标液的定标曲线进行对照，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量。
6.根据权利要求5所述的镍-双缩脲试剂盒的制备方法所制得产品的应用方法，其特征在于：步骤b的手工比色法中所述分光光度仪在波长为420nm~ 470nm处进行吸光值测定。
7.根据权利要求5所述的镍-双缩脲试剂盒的制备方法所制得产品的应用方法，其特征在于：步骤b中所述被测样本的总蛋白含量在50mg/L~8000mg/L范围内呈线性。
8.根据权利要求5所述的镍-双缩脲试剂盒的制备方法所制得产品的应用方法，其特征在于：所述步骤b的生化自动仪测试法中测定吸光值时所在的主波长为420nm~470nm ，副波长为650nm~700nm。
9.根据权利要求5所述的镍-双缩脲试剂盒的制备方法所制得产品的应用方法，其特征在于：所述被测样本在尿液样本、脑脊液样本中任选一种。
10.根据权利要求5所述的镍-双缩脲试剂盒的制备方法所制得产品的应用方法，其特征在于：所述步骤b的手工比色法中，所述空白镍-双缩脲试剂是指取所述A组试剂1.8~2.8ml与B组试剂0.3~0.7ml混合，然后用等量的生理盐水或蒸馏水代替被测样本加入到A组试剂与B组试剂的混合液中，所述空白镍-双缩脲试剂用于对被测样本所测得的颜色进行校准。
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Non-Patent Citations (1)
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