CN102940704B - 用于防治酒精性脂肪肝的松花粉水提取物口含片 - Google Patents

Abstract

用于防治酒精性脂肪肝的松花粉水提取物口含片，涉及从植物，特别是从松花粉中提取有效物质的工艺技术领域。主要由以松花粉水提取方法取得的分子量小于5000的松花粉水提取物的冻干粉、紫苏叶粉、山楂粉、异麦芽糖醇和硬脂酸镁组成。本发明对于防治酒精性脂肪肝效果显著，且无副作用，而且费用低廉，简单易行。

Description

用于防治酒精性脂肪肝的松花粉水提取物口含片

技术领域

本发明涉及从植物，特别是从松花粉水提取物制备口含片的工艺技术领域。

背景技术

经WHO统计我国长期饮酒者近2亿人，因酒精的毒性作用而致肝脏损害，嗜酒者中约2／3可发展为酒精性肝病（ALD），其包括酒精性肝损伤、脂肪肝（AFL）、肝炎、肝纤维化和肝硬化，是顺序渐进的过程，发病机制较复杂，中药对AFL治疗效果尚可。酒精性肝病是临床上常见的肝病之一，主要是患者长期大量饮酒所致的肝损害。据西方研究，酒精性肝病是导致肝硬化的主要病因，几乎50％的肝硬化患者都有长期饮酒的习惯。

近年来，随着我国人民生活水平提高，生活方式和饮食习惯改变，酒精性肝病发病率明显上升，成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，并且逐渐向女性化、少年化发展。酒精性肝病在临床上已属多发病和常见病，所以，对酒精性肝病的临床研究引起了广泛的关注。酒精性肝病的好发年龄为30-50岁，其发病率逐年增加，且有年轻化和女性化的倾向。通过研究发现酒精性肝病患者年龄越大，饮酒史越长，饮酒量越大，肝功能损害就越重；酒精性肝病除与饮酒时间和饮酒量有关外，还和患者所饮酒类的质量及患者的饮酒习惯密切相关，酒类质量越差，其患病率越高；空腹饮用白酒或混合饮用多种酒类，患病率也会明显增加；其次，虽然男性患者多于女性患者，但如果男女饮相同量的酒，女性较男性更容易患酒精性肝病，且临床症状较男性严重。由于受自身体质量、脂肪以及胃排空时间等因素的影响，女性的酒精性肝损害有高易感性。

酗酒可导致实质器官的微血管改变和脂肪变性，进而发展为器官的萎缩和硬化，最初可出现在肝脏、肺、心脏和脑；肥胖可使体内游离脂肪酸（FFAs）增加，后者除本身引起的脂毒性外，还可抑制葡萄糖的氧化、抑制糖原合成、影响胰岛β细胞功能，加速甘油三酯在肝细胞内蓄积等。酒精和肥胖可使上述所有病理变化加重外，还可诱发脂肪性肝炎，并能促进活性氧和活性乙醛-4-羟基乙醛基产生并增加，使酒精性脂肪肝（ASH）和非酒精性脂肪肝（NASH）都处在高水平的氧化应激状态，促使炎症和纤维化不断升级。糖脂代谢异常和酗酒还可以表现在对胰岛素抵抗（IR）的协同作用，IR是肥胖和超重人群代谢综合征的一个重要标志，同时也是FFAs在肝脏聚集的标志，肝细胞中的FFAs可以作为非TG代谢物的载体，加速组织破坏和炎症浸润及纤维化；酒精可以介导周围型IR并刺激肝脏脂肪酸代谢，还可以在乙醇脱氢酶介导乙醇氧化成乙醛过程中，由于NAD⁺向NADH转化使NAD⁺消耗增加，促进FFAs合成，抑制脂质分解，最终导致TG在肝细胞内蓄积。另外，与传统饮酒者导致明显的营养缺乏和体重降低不同，狂饮者可能会食欲增加，更多的摄入纤维、高脂等食物，使酒精中获得的额外能量不能通过减少食物摄入量来抵消，最终导致体重增加及肥胖。

在慢性酗酒、糖尿病和肥胖条件下，粘膜损伤导致的肠道渗透性增强，使肠道细菌分解产生的巨大分子物质如病原体相关的分子进入肠内循环，并通过门脉系统进人肝脏，激活肝星状细胞表达TLRs。在TLRs配体刺激后，纤维原细胞激活MAP信号途径，激活NF-κB，促使胶原肌纤维原细胞分泌大量前炎症细胞因子及化学因子，使血管周围产生炎症反应和纤维化。尤其是肿瘤坏死因子-α、白介素-6、血清内毒素／脂多糖和血浆胶原激活抑制剂-1等可以作为儿童NAFLD向NASH转化的重要生物标记物。

长期过度饮酒，可使肝细胞发生脂肪变性、坏死和再生，导致酒精性肝病（ALD）；在组织病理学上主要表现为三种形式：酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝硬化，这三种形式可单独也可混合存在。随着生活条件的改善，酗酒有增多趋势。由于我国肝病主要由肝炎病毒引起，肝炎病毒携带者的数量更多，可能掩盖了实际上是酒精作为病因的肝病。因此，正确认识酒精引起的肝损害，及时诊断和防治具有重要的意义。

据研究，酒精性肝病的病因是乙醇的过量摄入，摄入的乙醇主要在十二指肠和上段回肠通过单纯扩散吸收，胃也能缓慢吸收少量的乙醇，进入血液循环中的乙醇随着血流迅速扩散，在肝、肺及脑等血管分布较多的器官很快达到平衡。乙醇不能储存，必须被代谢，肝脏是体内乙醇代谢的最主要器官，其中90～95%在肝脏通过乙醇脱氢酶（ADH）和微粒体乙醇氧化酶系统（MEOs）进行氧化代谢，长期大量饮酒在加重肝脏负担的同时，很大程度上对肝脏造成损伤。乙醇代谢后的主要产物是乙醛，同时还产生氧应激产物，乙醛随后又被乙醛脱氢酶（ALDH）氧化代谢最终的产物是二氧化碳和水。戒酒是ALD治疗关键的措施之一，戒酒可明显提高ALD患者的生存质量。戒酒后可使ALD的肝功能异常迅速好转，明显提高生存率；对于轻微ALD，戒酒后可不继续发展；肝硬化已充分形成，且有门脉高压和食管静脉曲张者，戒酒也难以逆转，但可改善活动进程，减少并发症的发生。酒精性肝病患者通常合并热量／蛋白质缺乏性营养不良，而营养不良又可加剧酒精性肝损伤。因此，酒精性肝病患者宜给予富含优质蛋白和维生素B类、高热量的低脂软食，必要时适当补充支链氨基酸为主的复方氨基酸制剂。严重的酒精性肝病应执行卧床休息，疾病的稳定阶段应做肌肉锻炼，如非剧烈运动、体操、游泳，家庭中简单易行的身体锻炼同样有效。

目前，有关酒精性脂肪肝的确切发生机制尚未完全明了；一般认为长期饮酒可使体内乙醛生成量增加，NADH/NAD的平衡改变而导致脂肪代谢和转运紊乱，酒精性脂肪肝是由于乙醇削弱了正常肝细胞的代谢及肝细胞膜的稳定性。①乙醇中间产物乙醛及乙酸，可使还原性辅酶I与辅酶V的比值升高，从而抑制线粒体三羧酸循环，使肝内脂肪酸代谢发生障碍。②酒精有特异性地增加胆碱需要量的作用，磷脂的不足影响了脂蛋白的合成，从而使运出发生障碍。③大量饮酒致胃肠功能紊乱，影响微量元素的吸收，使体内氧化磷酸化和脂肪酸β氧化受损，血中游离脂肪酸增多，促进脂肪肝形成，大量乙醇刺激肾上腺及垂体-肾上腺轴，增加脂肪组织分解率，使甘油三脂合成增加并堆积。④长期饮酒可诱导肝微粒体中细胞色素P450的活性，其活性增加更加重乙醇及代谢产物对肝脏的毒性作用。酒精中毒引起的肝损伤的机理比较复杂，除了乙醇的直接毒性作用外，乙醇代谢过程中，产生大量的氧自由基，引起肝脏脂质过氧化，是形成肝脏损伤的一个原因。

从防治效果看，戒酒对酒精性肝病的治疗预后非常重要，戒酒为终生治疗，仅此一项即可改变肝病进程。加强社会宣传教育、改变生活方式、减少烈性酒精耗量、早期诊治酒精肝及提高戒酒成功率等，可逐步减少酒精性肝病的发病率。

研究表明双环醇有良好的保肝降酶作用，从ALT、AST、ALP和GGT的恢复速度和程度明显优于多烯磷脂酰胆碱组，其机理可能是诱导体内抗氧化物谷胱甘肽-s-转移酶（GST）和还原型谷胱甘肽（GSH），提高肝细胞抗氧化能力，提高肝细胞线粒体内GSH水平，双环醇还能保护肝线粒体结构，对抗各类肝损伤负效应；双环醇不是抑制剂，而是通过清除氧自由基，保护肝细胞膜，使肝细胞核DNA免受损伤及减少细胞凋亡的发生而起到保肝作用；双环醇可减轻酒精引起的脂质过氧化招致的肝损伤，从而改善炎症坏死，表明双环醇为一种治疗酒精性脂肪肝的较好药物选择。

由于脂肪肝并非为独立性病种，通过引发肝功能的损伤，引起血液生化指标和酶值的变化。在反应肝细胞损伤的检测项目中，以血清酶值最常见，如谷丙转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）等。当肝脏发生脂肪变时，由于肝细胞受到损害，细胞变性、坏死，细胞膜破碎或细胞膜的通透性增加，肝细胞中所含的ALT就会被释放到血液中，使血中ALT活性增加。由于ALT主要存在于肝细胞中，当其明显升高时常提示有肝损伤；肝脏发生脂肪变时，多以ALT升高为主。谷丙转氨酶（ALT）是诊断肝细胞实质损害的主要项目，其高低往往与病情轻重相平行。

有人把脂肪肝和冠心病比喻成高脂血症一根绳上的两个蚂蚱，因为肥胖、高脂血症、糖尿病和酗酒是脂肪肝的常见病因，而这些因素也同样与动脉粥样硬化和冠心病关系密切。有明显心肌损伤和血流动力学紊乱，T细胞免疫功能下降，肝活检研究显示，这些病例中91.4%有肝细胞脂肪变性。一般而言，酒精脂肪肝属可逆性疾病，早期诊断并及时治疗常可恢复正常。长期食用高脂食物或大量饮酒，酒精会直接毒害肝细胞，影响其结构及功能；许多人就是因为饮酒过度才患上酒精性肝炎、脂肪肝致使肝脏受损。而肝损伤可导致甘油三酯（TG）下降，甘油三酯是长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，是人体内含量最多的脂类，大部分组织均可以利用甘油三酯分解产物供给能量，是体内能量的主要来源。脂肪肝会导致食入的大量脂肪吸收减少，胆汁分泌不足，不能分解吃进去的脂肪，脂肪在肝脏形成脂肪滴从而加重病情。

松花粉是裸子植物松科松属马尾松和油松等松树的花粉，我国是世界上利用和食用松花粉最早的国家。全世界的松花粉的资源大部分分布在我国，但作为我国独有的生物资源，马尾松和油松的花粉还没有被充分的开发利用。全国松花粉产量非常丰富，仅马尾松的花粉，每年可再生产量就在近千万吨，此外我国还有2000多万公顷的油松花粉可供采集，由于松花粉是风媒传粉系，如此之多的松花粉的资源如果不能及时采集和加工就会被白白浪费掉。松花粉的医疗保健作用近几年已经越来越被人们所认知，但是松花粉中存在一类防治酒精性脂肪肝的物质就不为人所知，经过我们多年研究发现这类物质在松花粉中呈水溶性状态，因而分离提取特别困难，最近我们成功分离出来，并做了相关防治酒精性脂肪肝分子机理的研究工作，找到其发挥作用的关键基因，其防治效果非常理想，为此，提出该发明专利申请。

研究表明紫苏叶可以显著降低脂肪肝模型家兔血清的总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白含量，提高高密度脂蛋白水平，降低肝脏指数，病理切片也显示能够减轻脂肪变性程度，说明紫苏叶具有抵抗脂肪肝形成的作用。研究表明山楂能明显降低实验大鼠血清中总胆固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）的含量，提高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的水平；此外, 山楂还能够改善肝脏的病理损害程度，说明山楂可降低脂肪肝模型大鼠的血脂水平，保护肝功能，具有一定的防治脂肪肝的作用。但是，无论是紫苏叶，还是山楂在目前的研究中都没有提出来过它们具有治疗酒精性脂肪肝的研究记录。

目前我国松花粉的研究已经处于国际领先水平，国外的研究还处于营养成分的分析等初级研究阶段，而我国已经很好地解决了松花粉保鲜、破壁以及生产等一系列难题，实现了规模化生产，并大大提高了食用松花粉后的营养吸收率，为松花粉行业在世界上的领先地位提供了有力保障。尽管如此国外的花粉产品却比我国在应用上更广泛，瑞典将花粉食品应用于美容，日本将花粉食品用做营养品，法国将花粉作为助长儿童发育的机能食品。与之相比，我国松花粉的开发研究虽然已经进行了十几年，出现了大量的松花粉产品，但综合加工利用水平还不高，市场上已有的松花粉的产品种类单一，质量参差不齐，精深加工的程度也不高，出口产品更是稀少，宝贵的松花粉的资源没有被很好的利用。

松花粉中蕴含着非常丰富的营养成分，王开发等研究总结，松花粉含有氧化还原酶、磷酸酶、超氧化物歧化酶（SOD）等104种酶；除常量元素外，还含有碘、钴、硒等多种微量元素；黄酮类、胡萝卜素、核酸、生长素等；丰富的磷脂，具有调整脂肪、蛋白质和碳水化合物新陈代谢的作用，可以有效预防动脉粥样硬化、肥胖等疾病，保护肝脏并促进肝细胞生成，其中的卵磷脂还能促进大脑发育，增强记忆力；还含有A、B、C、D、E等多种维生素，能满足不同层次人群的营养需要，是上好的天然保健品，但利用松花粉解酒方面研究仍然是空白。松花粉是中国医学宝库中的药食兼用花粉品种，作为中国传统药材，其药食兼用的历史已逾数千年，从2400年前的《神农本草经》、《本草纲目》到今天的《中华人民共和国药典》中均有记载，在民间更是以其神奇的功效被奉为“仙药”。

口含片，是一类不经过胃消化，直接通过口腔粘膜吸收进入血液，采用在口腔中可溶解的物质为主要包衣材料进行包衣而制成的片剂。可防止酸性及酶对某些药物的破坏或防止药物对胃的强烈刺激性；经过研究我们发现蜂王浆中有许多生物活性物质在胃中易被胃酸破坏，而通过舌下粘膜可以直接吸收，所以制作口含片可以更好地保护生物活性物质免遭破坏，提高产品的使用效果。经过研究我们发现人大量饮酒的同时也摄取了大量的食物，特别是高油高脂性食物使人胃呈高饱腹状态，其胃容物的排空一般需要2小时左右，如果同时服用解酒药物，由于服用量与胃容物相比相差太悬殊，很难发挥作用而失效，但如果采用大剂量的解酒药物，又会受到胃容量的限制而无法实施，所以饭后使用的解酒药物最好采用不经过胃的方式，这就是我们为什么要开发口含片的主要原因。

经过我们最新的研究发现松花粉中还存在一类具有促进酒精代谢的物质，对促进机体解酒、防治脂肪肝方面具有显著作用。如专利申请号为201010607364.8的中国专利就公开了通过水提取方法，将松花粉经破壁、浸泡、水提、超滤，取得松花粉水溶性物质，并证明松花粉水溶性物质具有治疗脂肪肝的作用。

目前各种各样的应酬越来越多，由于饮酒诱发的多种疾病的发病率逐年提高，酗酒诱发的身体健康问题已经成为影响现代人生活质量的重要方面。

发明内容

本发明目的在于发明一种能高效防治酒精性脂肪肝的松花粉水提取物口含片。

本发明主要由以松花粉水提取方法取得的分子量小于5000D的松花粉水提取物的冻干粉、紫苏叶粉、山楂粉、异麦芽糖醇和硬脂酸镁组成。

所述冻干粉、紫苏叶粉、山楂粉、异麦芽糖醇和硬脂酸镁分别占口含片总质量的5～25%、5～15%、5～15%、50～80%、0.2～0.4%。

经试验，本发明利用松花粉水提物治疗酒精性脂肪肝效果显著，且无副作用，而且费用低廉，简单易行。松花粉是裸子植物松科松属马尾松和油松等松树的花粉，松花粉内含各种丰富的营养物质，具有多种的生物学活性。松花粉水提物能够在基因水平上发挥防治酒精性脂肪肝的药理作用，我们的研究已经基本解决了其防治解酒性脂肪肝的分子机理，为此，提出申请本发明专利。

附图说明

图1为自然健康对照组肝脏组织切片图。

图2为自然健康对照组肾脏组织切片图。

图3为酒精性脂肪肝模型组肝脏组织切片图。

图4为酒精性脂肪肝模型组肾脏组织切片图。

图5为灌胃口含片组肝脏组织切片图。

图6为灌胃口含片组肾脏组织切片图。

具体实施方式

一、制备松花粉防治酒精性脂肪肝水提取物冻干粉：

1、松花粉除杂、干燥，使含水量下降到4～8%。

2、采用气流粉碎破壁的方式将松花粉破壁。

3、以常压常温纯净水1:1-10浸泡已经破壁的松花粉，同时以低频超声波处理10～40分钟，控制超声提取液的温度在10～40℃。

4、以8000～15000转冷冻离心法除去固体杂质，取上清液。

5、将所述上清液在1～5℃的环境温度下以5000D分子筛超滤分离，取得分子量为5000D以下的松花粉水溶性物质。

6、将上述松花粉水提物冷冻干燥24～48小时制备含水量低于6%的松花粉水提物的冻干粉。

二、制备松花粉防治酒精性脂肪肝的口含片：

1、制粒工艺：沸腾锅预热到60～80℃以上，预热后，先将松花粉提取物、紫苏叶粉、山楂粉、异麦芽糖醇加入沸腾锅内，按照下表参数设置，打开蠕动泵喷纯化水进行一步制粒。制粒结束后加入硬脂酸镁混合均匀，再制备解酒松花粉水提物的口含片。

典型的几种质量配比表：（单位：kg）

	冻干粉	紫苏叶粉	山楂粉	异麦芽糖醇	硬脂酸镁
						配比1	15	10	15	59.6	0.4
配比2	20	10	12	57.7	0.3
						配比3	25	10	10	54.7	0.3

工艺参数表：

参数	进风温度	出风温度	引风频率	蠕动泵	雾化压力
						喷浆时	70-85℃	40-60℃	40Hz	150rpm	0.2MPa
喷浆后	85-90℃	50-65℃	35Hz	150rpm	0.2MPa

2、压片工艺：采用ZP1100压片机（29冲）进行压片实验，工艺参数：转速30～40转/分；工作压力7～15kN；片重0.4～0.6g。

三、应用：

（一）试验对象：

灌胃22周龄的Wistar清洁级雄性大鼠，体重344.43±38.49；自然对照组大鼠每天按体重1%灌胃纯净水；模型组大鼠每天按体重0.5%灌胃二锅头和体重0.5%灌胃猪油制模型；灌胃口含片实验组大鼠每天按体重0.5%灌胃二锅头和体重0.5%灌胃猪油后8小时灌胃口含片。

（二）实验组采用空腹灌胃本发明含片的方式进行实验：

使用剂量：按每只大鼠每天50-100mg本发明口含片的量灌胃，连接服用30～40天。

（三）对比结果：

1、试验组大鼠肝脏和肾脏组织切片结果比较：

（1）将自然健康组肝脏和肾脏组织切片，见图1、2。

从图1、2可见雄性大白鼠肝脏肝细胞结构清晰呈多边形，肝血窦明显，肝细胞索排列整齐，肝细胞中没有明显的脂肪空泡；肾脏组切片中肾小球结构清楚，肾小球囊间隙明显适中，没有明显损伤。

（2）将灌胃白酒猪油模型组肝脏和肾脏组织切片，见图3、4。

从图3、4可见肝细胞边界不清，变圆内有空泡，肝血窦受压变窄，肝索排列紊乱；肾小球结构不清楚，损伤严重，肾小球囊变形。

（3）灌胃本发明口含片肝脏和肾脏组织切片，见图5、6。

从图5、6可见肝脏肝小叶结构清晰， 肝血窦分布均匀，肝细胞呈多边形,排列整齐；肾脏肾小球结构明显改善，肾小球囊间隙明显，存在明显肾小球修复过的痕迹。

从切片中发现长期酗酒除了对肝脏造成严重损伤外，对肾脏也能够造成严重的损伤，但是本发明口含片对损伤的肝脏和肾脏均存在很好的防治效果。

2、空腹灌胃本发明口含片干预后对试验组大鼠主要血液生化指标比较分析。

血液生化指标的测试方法：采用麻醉腹主动脉采血，取血清后由东芝全自动血液生化检测仪检测主要血液生化指标。

比较分析如下表：

组别	自然组	模型组	灌胃口含片组
				ALT	73.0±16.67	81.8±14.81	39.5±6.65
ALP	102.50±11.90	179.40±32.39	81.67±13.17
				GRE	55.78±2.97	48.02±4.44	52.93±3.76
LDH	962.75±96.05	722.20±271.52	1384.00±290.85
				CHO	1.23±0.08	1.57±0.18	1.09±0.09
TG	1.25±0.18	1.46±0.31	1.03±0.26

经SPSS统计，自然对照组和模型组ALT与灌胃松花粉水提液口含片组差异极显著；转氨酶广泛存在组织细胞内，尤以肝、心肌、脑、肾等组织中活性最强，正常时血浆含量很低，ALT主要存在于肝脏，当肝组织病损时ALT大量释放入血可引起血中转氨酶升高。本实验灌胃口含片组血清转氨酶活力很低，说明口含片对肝脏的修复作用效果很强。

健康人血清ALP主要来自肝脏和骨骼，肝脏中的ALP与物质的转运和排泄有关。而2型糖尿病患者由于胰岛素分泌障碍或胰岛素抵抗，造成糖代谢障碍，同时也导致脂类代谢的障碍及在肝内沉积，甚至形成脂肪肝，而使肝脏受损引起血清ALP水平的升高。经SPSS统计，模型组碱性磷酸酶与其它二实验组差异极显著；说明松花粉口含片能够改善肝细胞损伤，降低碱性磷酸酶水平，碱性磷酸酶（ALP）的上升与肝细胞的损伤密切相关，说明本实验模型组酗酒并高脂饮食对肝细胞伤害很严重，而灌胃口含片后能够改善长期酗酒并高脂饮食引起的不良反应。

经SPSS统计，模型组肌酐（GRE）与自然对照组差异极显著，与灌胃本发明口含片组差异显著，说明本实验条件下酗酒并高脂饮食会使机体对外源性蛋白质的利用下降，而灌胃本发明口含片能够改善机体对外源性蛋白质的利用。

经SPSS统计，模型组乳酸脱氢酶（LDH）与灌胃本发明口含片组差异极显著；乳酸脱氢酶是糖酵解的关键酶，灌胃松花粉水提液口含片后乳酸脱氢酶水平很高，说明与促进糖酵解密切相关，也就是说在本实验条件下本发明口含片具有较强的促糖酵解作用，利于肝脏解酒及糖代谢。

2型糖尿病是以胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能障碍为主要特征的一类疾病，其中胰岛β细胞的丢失和功能障碍在疾病的发生和发展中起决定性作用。近年来的研究表明，胆固醇代谢与胰岛β细胞功能密切相关。正常情况下，胰岛β细胞可以通过其表面表达的一系列受体和转运分子来控制细胞内胆固醇的摄入和流出，使得细胞内胆固醇的含量维持在一个动态平衡。胰岛β细胞内胆固醇代谢出现紊乱后，可以通过多种途径影响β细胞的糖代谢，最终诱导β细胞凋亡。因此，胆固醇代谢紊乱可能是导致2型糖尿病患者β细胞功能障碍的一个新机制。经SPSS统计，模型组胆固醇（CHO）与其它二个实验组差异极显著，说明酗酒并高脂饮食是导致高胆固醇血症的罪魁祸首，而灌胃本发明口含片具有显著改善作用。

近年来高甘油三酯（HTG）所致的脂毒性已引起广泛关注，其可引起并加重胰岛素抵抗（IR），使胰岛素的生物学效应降低。肝脏通过参与糖原合成、糖原分解和糖异生在维持血糖稳定中起着直接而重要的作用，特别是葡萄糖-6-磷酸酶在肝糖生成中起关键作用，肝脏胰岛素抵抗还表现为脂代谢异常，如甘油三酯释放增加和肝脏脂肪变性。经SPSS统计，模型组甘油三酯（TG）与灌胃本发明口含片组差异显著；从实验情况，模型组出现血清高甘油三酯水平，说明长期酗酒并高脂饮食是产生高甘油三酯血症的主要原因，是诱发2型糖尿病的致病因素之一；而服用本发明口含片对由于酗酒并高脂饮食诱发的甘油三酯代谢异常具有很好的调控作用。

以上结果表明：本发明口含片对由于酗酒并高脂饮食引起的大鼠肝脏脂肪变有相当大的治疗作用，从血液生化指标和肝脏组织切片来看，本发明口含片的改善作用是非常明确的。

3、本发明口含片干预后对酒精性脂肪肝试验组大鼠肝脏代谢中主要基因表达变化比较分析，如下表：

通过基因芯片技术研究发现长期酗酒并高脂饮食的模型组大鼠肝脏表达基因中许多影响重要代谢途径（比如与解酒相关基因、脂肪代谢相关基因、肝脏损伤修复基因）关键基因的表达均表现出不利于机体正常代谢的状况，而灌胃口含片干预后这种基因表达的变化得到了很好的修正，从下例表中我们不难发现这种类似于“纠错”表达的能力正体现出灌胃口含片对由于长期酗酒并高脂饮食形成的肝脏代谢障碍、肝脏组织损伤的修复具有很强的改善作用，通过我们的研究从基因水平发现灌胃口含片能够有效地解酒，改善肝脏的代谢机能，防治酒精性脂肪肝的发生。

3.1灌胃口含片后对酒精性脂肪肝内与脂代谢相关的关键基因表达的影响

组别

Adh6

Adipoq

Fasn

LpL

Scd

Scd1

模型组/自然组

↓264

↓1.62

↑4.17

↓3.12

↑6.76

↑6.47

口含片组/模型组

↑498

↑4.81

↓2.96

↑2.85

↓15.87

↓20.14

     注：↓264表示Adh6基因在肝细胞mRNA中模型组与自然对照组的表达比下调264倍，↑498表示Adh6基因灌胃口含片组与模型组的表达比上调498倍。

3.1.1  Adh6：醇脱氢酶6，参与乙醇氧化代谢，在胃和肝中有该基因的转录，是大鼠肝细胞内主要的乙醇代谢酶，参与解酒过程中目前研究最多的酶之一。

本实验条件下模型组与自然对照组比，醇脱氢酶6（Adh6）基因的表达下调了264倍，意味着模型组下调了通过乙醇脱氢酶系统分解乙醇的途径，说明：长期酗酒并高脂饮食会使肝脏通过乙醇脱氢酶系统解酒机能大幅度下降，是造成大鼠肝细胞乙醇代谢障碍的主要原因之一。

本实验条件下实验组以松花粉口含片干预后与酒精性脂肪肝模型组比，醇脱氢酶6（Adh6）的表达上调了498倍，说明：本发明口含片能够通过上调醇脱氢酶6（Adh6）基因表达达到显著解酒的目的，本发明口含片具有显著的解酒效果，具有防治酒精性脂肪肝发生的作用，并且对促进肝细胞乙醇脱氢酶系统发挥作用有积极意义，是本发明口含片重要防治酒精性脂肪肝的分子机理之一。

3.1.2  Adipoq：脂联素，参与产生前体代谢分子和能量，磷酸运输。脂联素是脂肪细胞分泌的一种内源性特异蛋白质，是一种具有保护作用的脂肪细胞因子，在脂质和能量代谢及胰岛素敏感性调节方面具有重要作用。Adipoq通过与特异的脂联素受体结合发挥其生物学效应，其受体包括脂联素受体1和2。研究表明，Adipoq在肌肉组织中通过活化AMP激活的蛋白激酶和丝裂原活化蛋白激酶途径激活脂肪酸β氧化和氧化磷酸化过程中相关基因的表达，加快了肌肉组织中游离脂肪酸的β氧化和葡萄糖的转运，实现增加脂肪酸的β氧化、改善胰岛素抵抗和抗炎等生物学作用。脂联素可以增加脂肪酸β氧化，降低肌肉与肝脏中TG含量，改善脂代谢，发挥抗动脉粥样硬化的作用。由于胰岛素靶器官甘油三酯含量增高以及血清游离脂肪酸增高可以干扰胰岛素的作用，故脂联素降低游离脂肪酸和甘油三酯可以改善胰岛素对骨骼肌的作用。脂联素在降低血清游离脂肪酸的同时，降低促使脂肪酸向肝脏转运的分子的表达，促进肝细胞乙酰CoA羧化酶的磷酸化，增强肉碱脂酰转移酶的活性，促进肝内脂肪酸β氧化，从而减少肝脏内糖异生的原料，同时还减少参与糖异生的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、葡萄糖-6-磷酸酶的表达，从而增强亚生理剂量胰岛素对肝细胞内糖异生和糖输出的抑制作用，从而增加肝脏的胰岛素敏感性，抑制糖异生。在啮齿动物体内，促进肝脏和骨骼肌脂肪酸的β氧化，降低血糖水平，降低肥胖鼠骨骼肌和肝脏中甘油三酯的含量，而不影响血清中胰岛素和胰高血糖素的含量，减弱胰岛素抗性。研究发现高脂联素水平可以降低T2DM的患病风险，说明脂联素可能是T2DM的保护性因子。血清脂联素可能通过增加胰岛素敏感性及β细胞功能，对T2DM的发生起到双重保护，因而低脂联素水平与肥胖、胰岛素抵抗及高血糖和高血脂有关。

本实验条件下模型组与自然对照组比，Adipoq基因的表达下调了1.62倍，说明：模型组大鼠长期酗酒并高脂饮食会导致肝细胞内Adipoq基因的表达下调，降低肝细胞对胰岛素的敏感性，影响肝细胞内的糖异生和糖输出，以及脂肪酸的β氧化，促进模型组大鼠肝细胞的脂肪变进程。

本实验条件下以本发明口含片干预后与干预前酒精性脂肪肝模型组比，Adipoq基因的表达上调了4.81倍，说明：本发明口含片通过提高肝细胞内Adipoq基因的表达水平，改善由于酗酒并高脂饮食诱发的胰岛素抵抗状态，促进肝细胞内脂肪酸的β氧化，减少脂肪酸的沉积，对防治酒精性脂肪肝的发生有重要作用，充分说明口含片能够在基因水平上调控肝脏糖脂代谢，改善由于“酒足饭饱”引起的代谢综合征，是本发明口含片防治酒精性脂肪肝主要的分子机理之一。

3.1.3  Fasn：脂肪酸合成酶，参与脂肪酸生物合成。哺乳动物中，脂肪酸合成酶在脂肪酸合成中起着至关重要的作用，负责乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A从头合成一种长链软脂酸（棕榈酸酯）的所有催化步骤，基因的表达直接影响着脂肪酸合成酶多寡对控制动物体脂沉积具有重要的意义。

本实验条件下模型组长期酗酒并高脂饮食使肝细胞中脂肪酸合成酶基因与自然对照组比表达上调4.17倍，说明：模型组能够使脂肪酸合成酶合成增加是导致肝细胞脂肪过量沉积的罪魁祸首，造成脂肪肝发生首要因素。

本实验条件下灌胃口含片组与模型组下调脂肪酸合成酶的基因表达2.96倍，说明：口含片组可以通过减少脂肪酸合成酶的合成，减少肝组织脂肪酸合成，对缓解肝脏脂肪变意义重大。

3.1.4  LpL：脂蛋白脂肪酶，参与脂肪酸代谢，是脂肪代谢的关键酶之一。LpL在实质细胞的粗面内质网合成，新合成的LpL无活性，经糖基化后，才转化成活性LpL。存在于细胞膜外表面的硫酸肝素糖蛋白使酶保持一种无活力的浓缩状态，由肝素刺激后血浆中得到活化的LpL，分布在含三酰甘油的脂蛋白中，主要是分解乳糜微粒和极低密度脂蛋白的三酰甘油，并结合和附着在这些脂蛋白残粒中，可能作为肝摄取这些颗粒的信号。LpL作用于脂蛋白，主要分解脂蛋白中的三酰甘油，是血浆中清除三酰甘油的限速酶，并促使脂蛋白转移胆固醇、磷脂和载脂蛋白。LpL还具有增加乳糜微粒结合到LP受体上的能力，促进乳糜微粒摄取。

本实验条件下模型组与自然对照组比下调脂蛋白脂肪酶基因表达3.12倍，说明：模型组会使脂蛋白脂肪酶含量下降，导致三酰甘油分解减少，加速模型组大鼠肝脏脂肪变。

本实验条件下灌胃口含片组与模型组比表达上调2.85倍，说明：口含片组能够使实验组大鼠肝细胞中脂蛋白脂肪酶合成增加，有利于肝细胞分解脂肪，减轻肝脏脂肪变。

3.1.5  Scd：固醇辅酶A脱饱和酶，参与脂肪酸生物合成。硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)能在脂肪酸碳链cis-9位置引入双键，是催化乳脂cis-9，trans-11CLA和trans-7，cis-9 CLA合成的关键酶。

3.1.6  Scd1：固醇辅酶A脱饱和酶1，参与脂肪酸生物合成。硬脂酰辅酶A去饱和酶1(Scd -1)是单不饱和脂肪酸生物合成的限速酶，在脂肪酸代谢中起中心调节作用，也是瘦素（Leptin）作用的目的基因之一。瘦素与糖尿病、肥胖、脂肪肝有着密切关系，是近年来代谢性疾病的热点领域之一。2型糖尿病患者，常常伴有胰岛素抵抗、高瘦素血症，同时约50%的2型糖尿病患者存在脂肪肝。Scd -1是催化饱和脂肪酸向单不饱和脂肪酸转变的关键酶，与肥胖、脂肪性肝脏病变和胰岛素抵抗等一系列的代谢综合征的发生、发展密切相关，因而研究Scd -1的表达、调控可能为临床脂代谢紊乱相关疾病的诊断和治疗效果的监测提供了一个十分重要的实验室指标，在临床医学中有广阔的应用前景。因Scd -1主要存在于内质网膜，目前对体内Scd -1的检测主要采用测定血脂不饱和指数(不饱和脂肪酸／饱和脂肪酸比值)或通过分子生物学方法对细胞内Scd -1mRNA表达水平进行检测。综上所述，Scd -1在能量代谢中起了重要的作用。通过对Scd -1和能量代谢关系的研究，可以更清楚的了解Scd -1在能量代谢中的机制，从而为临床靶向调节能量代谢和避免脂毒性，预防或治疗肥胖、脂肪性肝脏病变及糖尿病等一系列代谢综合症提供基础。

本实验条件下长期酗酒并高脂饮食的模型组与自然对照组比上调固醇辅酶A脱饱和酶（Scd）基因表达6.76倍、固醇辅酶A脱饱和酶1（SCD-1）上调6.47倍，说明：二基因表达上调是造成酒精性脂肪变的最主要分子机理之一，防治酒精性脂肪肝的发生是解酒过程中最关键的病理指标，处理方式有效性就在于是否能够控制脂肪肝，模型组上调了二基因，而模型组肝脏切片显示模型组大鼠出现了严重的脂肪肝，甚至达到肝纤维化的状态。

本实验条件下灌胃口含片组与模型组比下调固醇辅酶A脱饱和酶（Scd）基因表达15.87倍，下调固醇辅酶A脱饱和酶1（Scd-1）基因表达20.14倍，说明：口含片组对长期酗酒并高脂饮食的不良习惯所形成的酒精性脂肪肝具有显著的改善作用，并且与肝脏切片的结果一致，这一改变是松花粉口含片防治酒精性脂肪肝主要的分子机理之一。

3.2灌胃口含片后对肝脏内与肝损伤、修复及代谢相关的关键基因表达的影响

组别

Il7r

Irs2

Pla2g2a

Socs2

Srd5a1

Tnfrsf10b

模型组/自然组

↓2.76

↑21.38

↓2.47

↓8.12

↑2.6

↑4.14

口含片组/模型组

↑2.72

↓2.51

↑2.97

↑3.52

↓2.69

↓6.4

注：↓2.76表示Il7r基因在肝细胞mRNA中模型组与自然对照组的表达比下调2.76倍，

↑2.72表示Il7r基因灌胃口含片组与模型组的表达比上调2.72倍。

3.2.1  Il7r：白细胞介素7，受体，参与调控DNA重组，免疫应答，细胞表面受体信号连接传导，抗微生物体液应答。

本实验条件下模型组与自然对照组比模型组大鼠下调了白细胞介素7基因2.76倍，说明：模型组大鼠由于长期酗酒并高脂饮食会导致肝细胞免疫应答能力下降，下调白细胞介素7基因的表达就是意味着会加重肝细胞的炎症反应，会促进肝细胞脂肪变和纤维化的进程。

本实验条件下口含片组与模型组比上调白细胞介素7基因2.72倍，说明：口含片干预后，通过上调白细胞介素7基因的表达加强肝细胞的免疫应答能力，缓解肝脏炎症反应，对防治酒精性脂肪肝和纤维化有积极意义。

3.2.2  Irs2：胰岛素受体底物2，Irs2在肝脏和胰腺β细胞表达，参与葡萄糖代谢，信号转导，正调控细胞增殖，Irs2蛋白表达下调使PI3-K活性减低，会加重肝胰岛素抵抗。使用基因敲除技术已证实Irs2基因的缺陷可导致胰岛素抵抗，Kubota等发现，敲除Irs2后，肝脏表现出明显胰岛素抵抗，而对骨骼肌的胰岛素敏感性无作用。

本实验条件下模型组与自然对照组比模型组大鼠下调了胰岛素受体底物2基因21.4倍，说明：模型组大鼠由于长期酗酒并高脂饮食导致胰岛素受体底物2基因下调了21.4倍，必然使胰岛素受体底物合成大受影响，显然会影响到肝细胞对胰岛素反应的敏感性，促使模型组产生胰岛素抵抗，诱发一系列代谢综合征，最终形成酒精性脂肪肝，是长期酗酒并高脂饮食诱发二型糖尿病和酒精性脂肪肝的重要分子机理之一。

本实验条件下以口含片干预后与模型组比，上调了Irs2基因的表达2.51倍，说明：灌胃本发明口含片可通过上调Irs2的表达来改善肝细胞对胰岛素反应的敏感性，本发明口含片可以起到一定的缓解胰岛素抵抗作用。

3.2.3  Pla2g2a：磷脂酶A2，基2A，钙依赖，参与脂分解代谢。

本实验条件下模型组与自然对照组比，Pla2g2a基因的表达下调了2.47倍，说明：长期酗酒并高脂饮食通过下调Pla2g2a基因的表达，减少对肝细胞内脂肪的分解代谢，加重脂肪肝的进程。

本实验条件下以本发明口含片干预后实验组大鼠与干预前酒精性脂肪肝模型组比，Pla2g2a基因的表达上调了2.97倍，说明：本发明含片通过上调了该基因的表达，促进肝细胞内脂肪的分解代谢，对防治酒精性脂肪肝有利。

3.2.4  Socs2：细胞因子信号转导抑制因子2，1997年由Starr R等发现，根据4O个氨基酸的Socs框命名。目前已发现这类负调节分子有6种，多数成员参与JAK／STAT通路的负反馈调节。该家族有8个成员含SH2结构域，即CIS和Socs -1～7，这个结构直接与磷酸酪氨酸相互作用，是Socs家族起抑制作用的关键。Socs 2作用广泛，对脂肪沉积、骨骼肌发育、中枢神经系统作用、免疫应答，癌症发生都有重要作用。另外Socs 2能调节胰岛素、催乳素等激素分泌，并对GH／1GF、胰岛素、白介素等细胞因子信号通路起促进或抑制作用。多种细胞因子通过复杂的信号网络调控细胞和机体内脂肪代谢的平衡，目前多数研究集中生长激素（GH）对脂代谢的影响，而Socs 2是生长激素信号通路的关键负反馈抑制因子。

本实验条件下模型组与自然对照组比，Socs2基因的表达下调了8.12倍，说明：长期酗酒并高脂饮食会造成肝细胞内的代谢“刹车”调控系统失灵，影响肝细胞内正常的脂代谢和胰岛素作用，形成代谢障碍，最终促使肝细胞脂肪变。

本实验条件下以本发明口含片干预后与干预前模型组比，Socs2基因的表达上调了3.52倍，说明：本发明口含片可以通过提高Socs2基因的表达，修复由于酗酒并高脂饮食导致的肝细胞内“刹车”调控系统失灵，对改善肝细胞脂肪代谢和胰岛素作用具有重要意义。

3.2.5  Srd5a1：类固醇5α还原酶，α肽1，分布内质网、微粒体，3-C-5α类固醇4脱氢酶，参与细胞信号转导，性别决定，细胞分化。能催化睾酮转化为另一种雄激素—二氢睾酮，故在性分化及雄激素生理中发挥重要作用，该酶具有Srd5a 1、2两个异构体。主要表达于皮肤和脂肪组织及肝脏，可催化绝大部分第4，5位碳原子上非饱和类固醇的还原反应，使有活性的糖皮质激素（GC）转化为无活性的代谢产物。研究发现，糖皮质激素作用不仅与血循环中GC水平相关，还与组织局部有生理活性的GC浓度密切相关。肝脏中增强的Srd5a1活性导致血清皮质醇（COR）清除率增加，进而代偿性下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（HPA）活性增强，COR分泌增加，进一步导致腹型肥胖及MS（MS指一系列代谢紊乱和心脑血管危险因素在同一个体上的聚集，即为肥胖、高血压、血脂异常及糖耐量异常等多种代谢异常临床体征的征候群）。

本实验条件下模型组与自然对照组比，Srd5a1基因的表达上调了2.6倍，说明：模型组通过提高Srd5a1基因表达增强Srd5a1活性导致血清皮质醇清除率增加，使得模型组出现MS，最终形成脂肪。

本实验条件下以口含片干预后与干预前酒精性脂肪肝模型组比，Srd5a1基因的表达下调了2.69倍，说明：本发明口含片能够通过下调该基因表达，改善由于酗酒并高脂饮食所带来的代谢综合征，这从另一方面解释了松花粉口含片为什么可以防治代谢综合征的原因。

3.2.6  Tnfrsf10b：肿瘤坏死因子受体超族，成员10b，胱冬酶激活因子，TRAIL结合，参与胱冬酶激活，信号转导，激活NF-κB引导激酶，调控细胞凋亡，正调控NF-κB级联。

本实验条件下模型组与自然对照组比，Tnfrsf10b基因的表达上调了4.14倍，说明：模型组通过上调Tnfrsf10b基因的表达激活NF-κB级联，促进肝细胞脂质过氧化和炎症反应，加重肝脏脂肪变和纤维化。

本实验条件下以口含片干预后实验组与干预前酒精性脂肪肝模型组比，Tnfrsf10b基因的表达下调了6.4倍，说明：本发明口含片能够通过下调Tnfrsf10b基因表达，抑制大鼠肝细胞内NF-κB的活化，减轻脂质过氧化和炎症反应，实现保护肝组织的目标，是本发明口含片防治酒精性脂肪肝主要分子机理之一。

总之，通过以上试验表明本发明产品能够有效参与机体解酒过程，并有效防治由于酗酒和高脂饮食诱发的脂肪肝。本发明产品能显著提高肝细胞活性，改善血液多种生化指标，预防由于长期酗酒并高脂饮食引起的脂肪肝，对维护和提高我国民众的酒精性脂肪肝的保健具有重大意义。

Claims (1)

1.用于防治酒精性脂肪肝的松花粉水提取物口含片，其特征在于由以松花粉水提取方法取得的分子量小于5000的松花粉水提取物的冻干粉、紫苏叶粉、山楂粉、异麦芽糖醇和硬脂酸镁组成；所述冻干粉、紫苏叶粉、山楂粉、异麦芽糖醇和硬脂酸镁分别占口含片总质量的5～25%、5～15%、5～15%、50～80%、0.2～0.4%；所述松花粉水提取物的冻干粉的制备方法是：

1）松花粉除杂、干燥，使含水量下降到4～8%；

2）采用气流粉碎破壁的方式将松花粉破壁；

3）以常压常温纯净水1:1～10浸泡已经破壁的松花粉，同时以低频超声波处理10～40分钟，控制超声提取液的温度在10～40℃；

4）以8000～15000转冷冻离心法除去固体杂质，取上清液；

5）将所述上清液在1～5℃的环境温度下以5000D分子筛超滤分离，取得分子量为5000D以下的松花粉水溶性物质；

6）将上述松花粉水提物冷冻干燥24～48小时制备含水量低于6%的松花粉水提物的冻干粉。

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