CN102933606B - 新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了从革兰氏阴性细菌细胞提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括下列步骤：在包含水、醇和其它有机溶剂的组合物(LPS提取组合物)中从细胞培养物提取LPS。

Description

新方法
发明领域
本发明涉及脂多糖(LPS)的生物合成制备领域。具体地，本发明涉及用于从细菌细胞，诸如通过细菌细胞培养获得的细胞提取LPS的改进的方法和组合物。本发明的这些方法和组合物用于制备LPS、LPS衍生物，并且特别是用于制备3-O-脱酰单磷酰脂质A (3D-MPL)。
背景
脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌外膜的外部小叶(external leaflet)的主要的表面分子，并且只存在于所述外部小叶中。LPS阻止了血清补体和吞噬细胞产生的细菌的破坏，并且与用于集落(colonisation)的粘附有关。LPS是大小约为10,000道尔顿的一组结构相关的复杂分子，并且由三个共价连接区域组成(如图5所示)：
(i) 在外部区域的O-特异性多糖链(O-抗原)
(ii) 核心寡糖中心区域
(iii) 脂质A - 充当疏水性固定物(anchor)的最里面的区域，其包括运载长链脂肪酸的氨基葡萄糖二糖单元。
发明概述
本发明的一个目的是提供用于提取LPS的组合物和方法，其导致改进的LPS的细菌产率。可以从产生的细菌细胞的量(生物量)计算LPS产率。改进的LPS产率能够使在给定的设备中制备更大量的LPS，或者使用较小设备制备等量的LPS。本发明的另一目的是提供用于提取LPS的方法，其显示出从细菌细胞提取的LPS产率的更大可靠性和/或再现性。本发明的另一目的是提供用于提取LPS的更快的方法。
因此，提供了从革兰氏阴性菌细胞提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括下列步骤：使用包含水、醇和其它有机溶剂的组合物(LPS提取组合物)从细菌的细胞膜提取LPS。
附图简述
图 1在50℃从细胞肉汤培养基101B提取的动力学
图 2 来自肉汤培养基101B的再现性数据
图 3A：具有0%水的80个实验的提取产率的分布
图 3B：具有1%的水的55个实验的提取产率的分布
图 4 pH的影响
图 5显示了LPS分子的三个共价连接区域：(i) 在外部区域的O-特异性多糖链(O-抗原)；(ii) 核心寡糖中心区域；和(iii) 脂质A
图 6显示了突变体明尼苏达沙门氏菌(S. Minnesota)R595产生的截短的LPS，并且指出了相对于全长LPS的截断位置。
具体实施方式
LPS提取的已知技术包括Galanos方法，其涉及用苯酚、氯仿和石油醚的混合物(PCP)提取LPS，然后蒸发氯仿和石油醚，添加丙酮和水以沉淀LPS，并且通过离心或过滤回收LPS(Galanos et al., Eur. J. Biochem. 9: 245 (1969))。Chen方法涉及用氯仿和甲醇的混合物(CM)提取LPS，然后进行一系列的甲醇沉淀步骤。Galanos不适合商业制备LPS，因为其不适于大规模生产，并且使用引起健康和安全担忧的溶剂混合物(例如，苯酚：氯仿：石油醚)。Chen方法产生富含LPS和磷脂的CM相，其通常需要多个沉淀步骤以获得具有足够纯度以用于免疫刺激应用(例如用作疫苗佐剂)的LPS。WO02/078637公开了使用革兰氏阴性菌(特别是明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota))的深度粗糙的(deep rough)突变体菌株制备LPS和3D-MPL的方法。WO02/078637的方法显示了从2%变至12%的产率上的显著可变性。需要改进的LPS提取方法。
发明人已经揭示除了醇和其它有机溶剂外，通过在LPS提取步骤中使用水，与其中在LPS提取步骤中不使用水的等效步骤相比，能够得到较高的LPS产率。本发明人已经证明了可以通过使用包含水的提取组合物从革兰氏阴性菌提取脂多糖，其产生更多的LPS，具有更大的可靠性并且经历较短的时间(与缺水的等效组合物相比)，并且没有与其它提取方法相关的某些缺点。除了增加的LPS产率以外，本发明人还揭示了通过在LPS提取组合物(水、醇和有机溶剂)中使用水，能够以比没有水时更大的可靠性并且在较少时间内实现这种较大产率。
如本文所用的术语“LPS产率”是指以干燥细菌细胞重量(DCW)的百分数的形式获得的LPS的量。
因此，提供了从细菌细胞培养物提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括下列步骤：使用包含水、醇和其它有机溶剂的LPS提取组合物从所述细胞提取LPS。“LPS提取”或“从细菌细胞提取LPS”是指LPS被直接从细菌外膜除去。
在本发明的另一方面中，提供了LPS提取组合物。“LPS提取组合物”是指其中从细菌的膜直接提取脂多糖的LPS提取步骤中使用的组合物/混合物。本发明的LPS提取组合物包含水、醇和其它有机溶剂，并且用于本发明的LPS提取方法。本发明的LPS提取组合物是单相提取组合物。“单相”是指液体形成单一均匀溶液而非其中液体是不能混溶的混合物。
术语“水”(H2O)是本领域技术人员熟知的。该术语包括纯的和基本纯的水(H2O) (包括通过蒸馏、去离子、离子交换处理或反渗透获得的水)，以及包含少量杂质的水(本领域技术人员清楚水通常包含某些杂质)。水杂质是本领域技术人员熟知的并且包括无机离子、有机分子、微粒、胶体、溶解的气体、微生物及其副产物。在特定的实施方案中，水是无菌的，因为其基本上没有任何活的微生物。在进一步的实施方案中，水是过滤过的。
本发明可以进一步使用水溶液，例如进一步包含碱的水。在一个实施方案中，本发明的组合物不包含其中溶解了酸的水。因此，在一个实施方案中，水的pH是中性的，即约pH 7。在本发明的一个实施方案中，提供了LPS提取组合物，其包含水、醇和有机溶剂，其中水的pH在7以上。在本发明的特定实施方案中，提供了LPS提取组合物，其中LPS提取组合物的pH不低于7。在特定的实施方案中，可以通过加入选自的氢氧化钠(NaOH)、三乙胺(TEA)和碳酸氢钾(KHCO3)的一种或多种的碱提高水的pH。
术语“水”还包括去离子水。去离子水是本领域技术人员熟知的术语，但是简言之，去离子水是其中基本除去了所用矿物离子的水。可以通过电导率测量去离子的水平，并且在特定的实施方案中，去离子水的最大电导率为1 µ西门子(siemens)/cm。本发明的水不必须与LPS提取组合物的其它组分分别添加。例如，LPS提取组合物中的水可以源自包含醇和水二者的醇溶液，并且因此，技术人员仅需要混合醇和有机溶剂来提供包含醇、有机溶剂和水的LPS组合物。
正如已经指出的，本发明人已经揭示了向包含醇和其它有机溶剂的提取组合物中添加水导致更大的LPS产率和/或更大的LPS产率的一致性。因此，提供了包含水、醇和其它有机溶剂的LPS提取组合物，其中LPS提取组合物中水的量为约0.1-约1.5% (v/v)。本发明的LPS提取组合物可以包含约0.4%-1.5%的水(v/v)，例如0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5% (v/v)。特别地，本发明的LPS提取组合物中水的量为约1% (v/v)，即0.8-1.2% (v/v)。
本发明的LPS提取组合物包含除了醇以外的有机溶剂。术语“有机溶剂”是本领域熟知的。有机溶剂为能够将固体、液体或气体溶质溶于溶液中的含碳化学制品。
本发明的LPS提取组合物包含有机溶剂，其可以选自下组：氯仿、链烷(alkane)、甲苯和石油醚。氯仿是本领域技术人员熟知的，并且由化学式CHCl3表示。链烷也是本领域熟知的。链烷是没有任何环状结构的饱和烃。本发明的LPS提取组合物可以包含选自下组的链烷：异辛烷、乙烷、庚烷和己烷。
本发明的LPS提取组合物中不为醇的有机溶剂的百分数可以为约60%-约95% (v/v)，并且在本发明的特定实施方案中，LPS提取组合物包含约75% (v/v)-约90% (v/v)的除了醇以外的溶剂。本发明的LPS提取组合物特别包含约70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90 % (v/v)的除了醇以外的溶剂。
本发明的LPS提取组合物包含醇。如本文所用的术语“醇”被定义为任何非环状的有机化合物，其中羟基(-OH)与烃基(alkyl)或取代的烃基基团的碳原子连接。为了阐明，本发明不包括芳香族不饱和醇，例如苯酚(环状醇)，并且因此提供了包含水、醇和其它有机溶剂的LPS提取组合物，其中所述醇不为芳香族不饱和醇，例如苯酚。
本发明的LPS提取组合物中醇的百分数可以为约5%-约40%，并且在本发明的特定实施方案中，LPS提取组合物包含约10% (v/v)-约30% (v/v)的醇。本发明的LPS提取组合物特别包含 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30% (v/v) 的醇。
本发明的LPS提取组合物中的醇可以选自下列：异丙醇、甲醇、乙醇和丁醇。醇的选择可以取决于许多因素，所述因素包括特定LPS提取组合物中的特定有机溶剂，因为某些醇不溶于某些有机溶剂。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了包含水、氯仿和甲醇的LPS提取组合物。在本发明的可替换的实施方案中，提供了包含水、链烷和乙醇的LPS提取组合物。
如本文所定义的本发明的LPS提取组合物用于本文所述的本发明的LPS提取方法。因此，提供了从细菌细胞提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括下列步骤：在本文所定义的LPS提取组合物中从所述细胞提取LPS，所述LPS提取组合物包含水、醇和其它有机溶剂。LPS提取方法是技术人员熟知的。
可以改变本发明方法的各种参数而同时保持在本发明的范围内，所述参数包括温度、时间和pH。可以在约35℃至约65℃的温度进行包括在包含水、醇和其它有机溶剂的LPS提取组合物中从细胞提取LPS的步骤(LPS提取步骤)的本发明的方法。在本发明的特定实施方案中，在约45℃至约55℃，特别是45、46、47、48、49、50、52、52、53、54或55℃的温度进行LPS提取步骤。在本发明的特定方法中，在约50℃进行提取步骤。
可以进行包括在包含水、醇和其它有机溶剂的LPS提取组合物中从细胞提取LPS的步骤的本发明的方法，其中在约7至约9，例如约7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8或8.9的pH进行提取步骤。在本发明的特定实施方案中，在约7.8至约9的pH进行LPS提取步骤，并且在本发明的甚至更特定的方法中，在约pH 8.6进行提取步骤。
包括在包含水、醇和其它有机溶剂的LPS提取组合物中从细胞提取LPS的步骤的本发明的方法可以进行约0.5至约30小时。在本发明的特定实施方案中，LPS提取步骤进行1至20小时，特别是0.5至1.5、1至2、1.5至2.5或2至2.5小时，例如0.75、1、1.25、1.5、1.75、2或2.25小时。在本发明的特定方法中，提取步骤进行约一小时。
本发明的方法可以进一步包括下列步骤：(i) 用乙醇溶液洗涤细胞；以及任选地(ii) 用乙醇第二次地洗涤。在提取步骤之前用乙醇洗涤可以降低在LPS提取步骤中与LPS共同提取的磷脂的量，并因此洗涤能够降低LPS提取中杂质的量。因此，提供了从细菌细胞提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括下列步骤：
(i) 用乙醇溶液洗涤细胞；
(ii) 用乙醇第二次地洗涤细胞；以及
(iii) 在包含水、醇和其它有机溶剂的LPS提取组合物中从细胞提取LPS。
可以使用约75%至约95% (v/v)的乙醇溶液进行本发明的方法中的洗涤步骤(用水进行洗液的调节(balance))。在本发明的某些实施方案中，用约85% (v/v)的乙醇溶液进行第一次洗涤(i)。在本发明方法的进一步的实施方案中，用约90% (v/v)的乙醇溶液进行第二次洗涤(ii)。
本发明方法的其它实施方案可以进一步包括用甲醇溶液洗涤细胞的步骤。因此，提供了从细菌细胞提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括下列步骤：
(i) 用乙醇溶液洗涤细胞；
(ii) 用乙醇第二次地洗涤细胞；
(iii) 用甲醇洗涤细胞；以及
(iv) 在包含水、醇和其它有机溶剂的LPS提取组合物中从细胞提取LPS。
本发明的方法用于从细菌细胞(包括从细菌细胞培养物获得的那些)提取LPS，以便可以使用和/或进一步加工LPS。因此，本发明方法的其它实施方案进一步包括从LPS溶液蒸发水、醇和其它有机溶剂的步骤，由此在提取步骤后产生干燥的LPS残留物。适当地，提供了从细菌细胞提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括下列步骤：
(i) 用乙醇溶液洗涤细胞；
(ii) 用乙醇第二次地洗涤细胞；
(iii) 用甲醇洗涤细胞；
(iv) 在包含水、醇和其它有机溶剂的LPS提取组合物中从细胞提取LPS；以及
(v) 从LPS溶液蒸发水、醇和其它有机溶剂，由此产生干燥LPS残留物。
在本发明的另一方面中，提供了由本发明方法制备的LPS组合物。已经显示了LPS的生物活性(诸如致死毒性、热原质性和佐剂性)与脂质A部分有关。相反，免疫原性与O-特异性多糖组分(O-抗原)有关。长期已知LPS和脂质A二者的强佐剂作用，但是这些分子的高毒性妨碍了其在疫苗制剂中的应用。因此，已经对降低LPS或脂质A毒性同时保持其佐剂性做出了重要努力。
在1966年从母体(smooth)菌株的培养物分离了明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)突变体R595 (Luderitz et al. 1966 Ann. N. Y. Acad. Sci. 133:349-374)。通过噬菌体板(panel of phage)筛选所选菌落对溶菌作用(lysis)的易感性，并且仅选择表现出小范围敏感性(仅易受一种或两种噬菌体影响)的那些菌落用于下一步研究。该努力导致分离出在LPS生物合成中有缺陷的，并且称为明尼苏达沙门氏菌(S. minnesota)R595的深度粗糙的突变体菌株。
与其它LPS相比，由明尼苏达沙门氏菌(S. minnesota)R595制备的那些是截短的并且具有较简单的结构(参见图6)，因为它们：
(i) 不含有O-特异性区域-对从野生型光滑表型到突变体粗糙表型的转变负责并且导致毒力损失的特征
(ii) 核心区域极短-该特征增加了菌株对多种化学制剂的易感性，以及
(iii) 脂质A部分被多至7个的脂肪酸高度酰化。
因此，本发明的方法中使用的细菌细胞可以为沙门氏菌属(Salmonella)或埃希杆菌属(Escherichia)的深度粗糙的突变体细菌菌株的细菌细胞。术语“深度粗糙的突变体细菌菌株”是指具有深度粗糙表型的革兰氏阴性菌的菌株。深度粗糙表型是其中与脂质A相连接的多糖部分仅由2-酮-3-脱氧-D-甘露辛酮糖酸(2-keto-3-deoxy-D-mannooctulonic acid) (KDO)的约2-3个残基组成的一种表型。特别地，深度粗糙突变体细菌菌株选自沙门氏菌属(Salmonella)。如果深度粗糙突变体细菌菌株选自沙门氏菌属(Salmonella)，则其可以为明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)种，特别是明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)R595菌株。可以使用其它深度粗糙突变体细菌菌株，诸如空肠弯曲菌(Compylobacter jejuni) (Kanipes et al. 2004 Infection and Immunity 72:2452-2455)、大肠杆菌(E. coli) K12菌株CS2429 (Klena et al. 2005 J. Bact. 187:1710-1715)、大肠杆菌(E. coli) D31m4 (Qureshi et al.1988 J. Biol. Chem. 263:11971-11976)、大肠杆菌(E. coli)菌株F515 (Wiese et al. 1997 Biochemistry 36:10311-10319)和奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)菌株R45 (Wiese et al. 1997 Biochemistry 36:10311-10319)。
4’-单磷酰脂质A (4’-monophosporyl lipid A) (MPL)(可以通过对从革兰氏阴性菌的深度粗糙的突变体菌株提取的LPS进行酸水解来获得)保留了LPS的佐剂性质，同时显示出了超过1000倍的毒性的降低(由鸡胚蛋的致死剂量测量)(Johnson et al. 1987 Rev. Infect. Dis. 9 Suppl:S512-S516)。通常将LPS在中等强度无机酸溶液(例如，0.1 M HCl)中回流大约30分钟的时间。该操作导致在1位脱磷酸(dephosphorylation)，以及在6’位脱碳水化合物(decarbohydration)，产生MPL。3-O-脱酰单磷酰脂质A (3D-MPL)(可以通过MPL的温和碱水解获得)具有进一步降低的毒性，同时仍保持佐剂性，参见美国专利第4912094号 (Ribi Immunochemicals)。通常在诸如氯仿/甲醇混合物的有机溶剂中通过用诸如pH 10.5的0.5 M碳酸钠的弱碱水溶液饱和进行碱水解。制备3D-MPL的进一步的信息可以在例如在美国专利第4912094号和PCT公开WO02/078637 (Corixa Corporation)中得到。
因此，本发明的方法可以进一步包括使LPS经历连续的酸水解和碱水解以形成3D-MPL的步骤，并因此在本发明的进一步的实施方案中，提供了从革兰氏阴性菌制备LPS衍生物的方法，所述方法包括下列步骤：
(i) 用乙醇溶液洗涤细胞；
(ii) 用乙醇第二次地洗涤细胞；
(iii) 用甲醇洗涤细胞；
(iv) 在包含水、醇和其它有机溶剂的LPS提取组合物中从细胞提取LPS；
(v) 从LPS溶液蒸发水、醇和其它有机溶剂，由此产生干燥的LPS残留物；以及
(vi) 使LPS经历连续的酸水解和碱水解以形成3D-MPL。
在本发明的另一方面中，提供了由本文所述的本发明方法制备的3D- MPL组合物。
关于该申请的所有文献，包括专利和专利申请都以最大可能并入本文中作为参考。
除非上下文另有需要，在下面的本说明书和权利要求书通篇中，词语“包括(comprise)”以及变体，诸如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将理解为暗示包括所指明的整数、步骤、整数组或步骤组，但是不排除任何其它的整数、步骤、整数组或步骤组。
本发明的方法通过参照下列非限制性实例来进行例示。
实施例
实施例 1 ： LPS 提取方法
1.1标准洗涤方法 ( 下列洗涤方法与实施例 2 类似 )
该洗涤方法应用于在下列LPS提取实施例1、2和3中使用的细胞肉汤培养基90A、101B和128A。
将灭活肉汤培养基的一部分(通常为200L，含3-5 kg DCW，360-600g LPS1)装入具有推进器、测温探头、氮气覆盖的并且在25mbar N2下的300L双层夹套不锈反应容器中。
将肉汤培养基在50℃在搅拌下通过在反应容器的双层夹套中循环热水加热。
通过在装有孔径为0.22µm (6 mm内径)且表面积为0.15 m2的7通道圆柱形KERASEP®陶瓷膜(Ref供应商: KERMBB-XM2 (Groupe Novasep France))的正切流动过滤(TFF)单元上过滤(持续时间 ~1.5 h)将混合物浓缩至75L。在分析干重残留物并检查透明性之后，丢弃透过物(permeate)。
在乙醇(158L)和水(18L)中稀释渗余物(retentate)，产生250 L总体积。在50℃加热混合物并在该温度快速搅拌30分钟。然后通过正切流动过滤(持续时间 ~2 h)将混合物浓缩至50L，并收集透过物以进行分析。
通过在50℃加入乙醇(180L)和水(20L)(持续时间 ~2 h)以进一步洗涤渗余物。在快速搅拌30分钟后进行过滤至50L。分析两次洗涤的透过物的干燥残留物并丢弃。然后在透析模式下在50℃在TFF单元上用甲醇替换渗余物中含有的乙醇/水(~90/10)。
以每份20 L将总体积为360L的甲醇加入到剩余物混合物中，同时过滤混合物以产生50L细胞的甲醇悬浮液(通常，残留乙醇含量< 1%)，其基本没有疏水性杂质(磷脂)(持续时间 ~3 h)。分析透过物的干燥残留物并丢弃。
典型地，在乙醇洗涤和用甲醇替换乙醇的步骤期间在透过物中除去了20%的总DCW。此时，可以对渗余物混合物进行取样以确定在实验室规模(137ml)或中试工厂规模(260L)下进一步加工的DCW和材料。
1.2.2 无水提取方法 ( 中试工厂规模 ) ( 为提取肉汤培养基 90B 所进行的 )
在上述洗涤步骤后，(在144L的含有4kg DCW的肉汤培养基90A上)，将50L洗涤过的细胞于甲醇中的悬浮液提取至氯仿/甲醇中。加入190L氯仿和20L甲醇。将混合物在50℃进一步加热16h。在提取和过滤期间抽取定时收集的样品。然后通过蒸发滤液的溶剂检测提取的LPS的量以使产率计算与在肉汤培养基上测量的DCW相比较。
然后在TFF单元上过滤悬浮液并将透过物送入300L双层夹套的、氮气覆盖的并且是在25mbar N2下的不锈钢收集容器中。通过在容器的双层夹套中循环冷水(8℃)来冷却透过物。
当获得残留体积为50L的渗余物时，停止过滤(持续时间 ~3 h)。
1.3. 标准浓缩步骤 ( 仅中试工厂规模 )
在真空连续进料上升管蒸发仪(vacuum continuous-feeding rising tube evaporator) (30℃, 200mbar)上浓缩收集的透过物(滤液)直到体积为17L (该仪器的最小运行体积)。在蒸发期间发生部分沉淀，这是由于氯仿的优先蒸发，以及富含甲醇。典型的蒸发速率为50-150 L/h，这取决于真空/冷凝温度(持续时间 2-4 h)。
清空蒸发仪，然后用新鲜氯仿(17L)洗涤以溶解蒸发期间沉淀的任何物质。
在具有50℃水浴和350mbar的起始压力的20 L Buchi ROTAVAPOR® R-220 (BÜCHI Labortechnik AG)上进一步蒸发合并的洗液和浓缩物(总体积：34L)。典型的蒸发速率为 8-10 L/h (持续时间：3-4h)。
当获得约3L的体积时，加入水(3L)并将混合物再次浓缩至3L。重复该操作2次直到获得40mbar的最终压力，这表明仅剩余水(除去了所用溶剂)。在该甲醇/水替换期间，典型的蒸发速率为2.5 L/h (典型的持续时间 ~3h)。
加入另外的3L水以产生~6L的LPS于水中的悬浮液，将其在4℃储存，储存时间通常为7天。对悬浮液进行取样以分析干燥残留物，从而估计LPS的量(也称为CME，氯仿/甲醇提取物)的量：
对肉汤培养基90A的提取产生了189g的LPS。
在提取期间用0%水进行的N=80的实验的平均产率(参见图3)为6.5%，其显示出极宽的分布，且95%的结果在1-12%产率之间。
实施例 2 –使用水进行提取
细胞的洗涤(222L的来自含有5kg DCW的肉汤培养基131A)按照1.1节所述的方式进行。
2.1 方法：
2.1.1 提取 ( 含 1% 的水的中试工厂规模 ) ( 为提取肉汤培养基 131A 所进行的 )
向洗涤过的R595细胞(50L，于甲醇中)中加入氯仿(195L)和水(2.5L)以得到溶剂比为78/22/1的CHCl3/MeOH/H2O。在50℃加热混合物并在该温度下快速搅拌过夜(16h)。
然后在TFF单元上过滤悬浮液并将透过物送入300L双层夹套的、氮气覆盖的并且是在25mbar N2下的不锈钢收集容器中。通过在容器的双层夹套中循环冷水(8℃)冷却透过物。
当获得残留体积为50L的渗余物时，停止过滤(持续时间 ~3 h)。向渗余物中加入氯仿(40L)和甲醇(10L)以进行进一步提取，并在50℃再次加热混合物并过滤直到体积为50L。还将另外的50L透过物送入收集容器中。然后丢弃残留的50L渗余物。
如1.3节所述进行浓缩，产生568g的LPS。
在这些条件中的平均产率为9.1%，并且如图3所示，95%的结果包括在6-12%产率之间。
实施例 3 –用和不用水进行实验室提取
使用1.1中描述的方法洗涤130L的灭活肉汤培养基101B (2.99kg DCW)，产生50L的洗涤过的细胞。对洗涤过的细胞进行取样以进行缩小规模的实验室提取。
为了更好地理解提取方法，缩小该步骤的规模并且测试了不同的提取条件，以及建立了至多48h提取的动力学。将来自肉汤培养基101B的洗涤过的细胞用于那些试验。
在为了回流而装备的圆底烧瓶中并且在氮气的惰性气氛下向30ml的洗涤过的R595细胞于甲醇中的悬浮液中加入106 ml氯仿，并且若需要的话，加入1.36 ml水。在50℃搅拌悬浮液。在提取期间(至多48h)抽取定时收集的样品(10ml)并在0.22µm聚四氟乙烯(PTFE)过滤器上过滤。将滤液蒸发至干以确定提取的LPS的量和找出(follow)提取动力学。从总实验体积x LPS含量除以原始肉汤培养基的DCW计算产率。
2.2结果
表1显示了氯仿：甲醇提取缓冲液中1%的水对产率的影响
表 1 ：提取期间水对 LPS 含量的影响 ( 在 50 ℃在 PP 规模下进行 16h)
细胞肉汤培养基批次 N° 灭活肉汤培养基体积 水 % CME 中的 LPS (g) 产率 % (LPS/ 来自肉汤培养基的 DCW)
90A 144L (4KgDCW) 0 189 4.7
131A 222L(5Kg DCW) 1 568 11.4
可以看出与采用0%水提取后的LPS含量(90A)相比，采用1%的水提取后的LPS含量(131A)显著增加。
动力学：除了增加LPS产率，该实施例证明向提取缓冲液中加入水增强了提取动力学(参见图1和2，来自细胞肉汤培养基101B的实验室规模实验)。
显示出了在8小时后，在存在1%的水的情况下进行的提取中达到了稳定状态(plateau)(1.15 g/l)。然而，在没有水的情况下，在8小时后仅溶解了0.17 g/L-在30小时后，该量为0.47g/L (并且仍在增加，以达到假定的高值，但是在很长时间以后)。
这些实验在相同的肉汤培养基(101B)上重复了两次。在提取1h、2h、4h、8h、24h、30h和48h之后抽取样品。
再现性：除了产率和速度(LPS在采用其的情况下可能被提取)以外，1%的水还增加了提取LPS的再现性(参见图3A & 3B和2)。
图3中显示了分布和标准偏差在1%的水的影响下变窄(sharpened)。
表2中显示了再现性在使用1%的水的情况下得以改善；当使用0%的水时，在从第一和第二组试验获得的产率间观察到40%的差异。
表 2 ：在实验室规模的0%和1%的水的50℃提取%产率，在1h和30h后抽取样品(来自细胞肉汤培养基101B)。
编号 水 提取时间 LPS g/L (于137 ml中) 产率(来自LPS/ DCW 肉汤培养基101B)*
#1 1% 1h 0.95 7.3%
30h 1.16 8.9%
#2 1% 1h 1.12 8.4%
30h 1.17 8.9%
#1 0% 1h 0.05 0.4%
30h 0.45 3.4%
#2 0% 1h 0.03 0.2%
30h 0.26 2%
*基于来自肉汤培养基 101B( 对于每次提取实验进行取样 ) 的 1794mg DCW (2.99kg/50L/30ml)x 1000 的等量。
实施例 3 – pH 的影响
使用1.1所述的方法洗涤130L灭活肉汤培养基101B (2.99kg DCW)，产生50L洗涤过的细胞。对洗涤过的细胞进行取样以进行缩小规模的实验室提取。
在为了回流而装备的圆底烧瓶中并且在氮气的惰性气氛下向25ml洗涤过的细胞于含有期望的碱(例如，15.15mg的TEA、50mg的KHCO3、25µl的NaOH 32%) 的甲醇中的悬浮液中加入120 ml氯仿和1.5 ml水。在50℃搅拌悬浮液16-18h。抽取样品(10ml)并在0.22µm PTFE过滤器上过滤。通过蒸发干燥滤液以确定提取的LPS的量(g/L)。
在pH 8.61 (NaOH)、8.29 (TEA)、7.84 (KHCO3)和pH4 (乙酸)测试pH的影响。
将结果与在pH=7.1用1%的水提取进行比较。
通过将1.6当量的期望的碱 (基于12% LPS含量)溶解于用于达到1%比例的C:M:W的量的水中来实现pH的上升。在加入CHCl3和在50℃加热之前，向甲醇悬浮液中加入水溶液并搅拌1h。在乙酸的情况下，将该酸直接加入至甲醇水混合物中。
图4显示了LPS产率随pH的增加而增加，从在pH 4 (乙酸)的7.8%至在pH 8.6 (NaOH)的11.1%。注：产率计算考虑到由于加入KHCO3和NaOH导致的干含量的增加。如果仍然存在TEA和乙酸，则通过蒸发除去。
4.结论
本发明人已经证明了加入水产生更可靠的提取条件(再现性)并且增加了LPS产率。
此外，本发明人已经揭示了含水提取缓冲液的pH增加增加了LPS的产率。

Claims (11)

1.从革兰氏阴性细菌细胞提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括在LPS提取组合物中从所述细胞提取LPS的步骤，所述LPS提取组合物包含水、醇和其它有机溶剂，其中所述LPS提取组合物是单相的，并且其中所述LPS提取组合物中水的量为0.8-1.2% (v/v)，并且其中所述醇选自下列：甲醇、乙醇、异丙醇或丁醇，所述其它有机溶剂选自下组：氯仿、链烷、甲苯或石油醚，并且所述LPS提取组合物中醇的百分数为5%-40% (v/v)。
2.如权利要求1所述的方法，其中水的量为1% (v/v)。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中LPS提取组合物包含氯仿、甲醇和水。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述LPS提取组合物包含链烷、乙醇和水。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中在35℃-65℃的温度进行LPS的提取。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中在7.8-9的pH进行LPS的提取。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中在0.5-20小时内进行LPS的提取。
8.如权利要求1或2所述的方法，其进一步包括下列步骤：
i. 用乙醇溶液或乙醇洗涤细胞；以及任选地
ii. 用乙醇或甲醇第二次地洗涤细胞。
9.如权利要求1或2所述的方法，其进一步包括下列步骤：从LPS溶液蒸发水、醇和其它有机溶剂，由此产生干燥的LPS残留物。
10.如权利要求1或2所述的方法，其进一步包括下列步骤：使LPS经历连续的酸水解和碱水解以形成3D-MPL。
11.包含水、醇和其它有机溶剂的LPS提取组合物在从革兰氏阴性细菌细胞提取LPS的方法中的用途，其中所述LPS提取组合物是单相的，并且其中所述LPS提取组合物中水的量为0.8-1.2% (v/v)，并且其中所述醇选自下列：甲醇、乙醇、异丙醇或丁醇，所述其它有机溶剂选自下组：氯仿、链烷、甲苯或石油醚，并且所述LPS提取组合物中醇的百分数为5%-40% (v/v)。
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