CN102933225A - 表面活性剂组合物 - Google Patents

Abstract

本发明描述了一种组合物，所述组合物包含脂质类载体和由多聚-L-赖氨酸或其盐；和或者多聚-L-谷氨酸或者多聚-L-天冬氨酸或其盐形成的肽复合物。所述组合物能够被用于预防或治疗与肺表面活性物质障碍或缺乏相关的疾病，如肺透明膜疾病（HMD）、呼吸窘迫综合征（RDS）、烃类中毒、接近溺死（near-drowning）、HIV/AIDS相关的肺部疾病、成人呼吸窘迫综合征（ARDS）或急性肺损伤（ALI）、哮喘、结核病（TB）或严重急性呼吸综合征（SARS）。作为选择地，所述组合物能够被用于增加药物化合物或组合物穿过受试者的膜的渗透性或被用于充当载体。所述多聚-L-赖氨酸或其盐长于所述多聚-L-谷氨酸或多聚-L-天冬氨酸以便其形成的复合物具有一个电中性的区域和一个带正电的区域。所述肽复合物的电中性的区域与所述脂质类载体发生相互作用，而所述带正电的区域与水性的和/或极性的环境发生相互作用。

Description

表面活性剂组合物

技术领域

本发明涉及表面活性剂组合物及其用于治疗或预防一种或多种与肺表面活性物质障碍或缺乏相关的疾病或病症，或者用于增强在治疗其它疾病或病症中使用的药物化合物的膜渗透性或者用于充当该药物化合物的药物载体的用途。

背景技术

肺表面活性物质见于肺泡表面并且对于呼吸而言是必不可少的。它们由磷脂（85%）、中性脂质（5%）和几种特殊的表面活性蛋白（5%）的复杂混合物组成，所述表面活性蛋白降低肺泡表面的表面张力，允许迅速的气体交换。肺表面活性物质独特的扩散性质降低了表面张力，从而在吸气过程中促进肺扩张（也被称为顺应性），并且在呼气过程中避免肺萎陷。

没有表面活性物质，肺的气囊或肺泡会萎陷并且不能够吸收充足的氧气。这可以表现为肺中气体交换的抑制，引发被称为肺透明膜疾病（HMD），也被称为呼吸窘迫综合症（RDS）的病症。该病症最频繁发生于早产儿当中，但是也经常发生于大龄儿童和成人当中。大龄儿童和成人可以伴有广谱的肺部症状，所述症状包括（但不限于）烃类（例如石蜡）中毒、接近溺死、HIV/AIDS相关的肺部疾病、成人呼吸窘迫综合症（ARDS）或急性肺损伤（ALI）、哮喘、慢性阻塞性肺病（COPD）、结核病（TB）和严重急性呼吸综合征（SARS）。

对于患有RDS的早产儿患有肺泡表面活性材料缺乏的观察引起用外源性表面活性物质替代物治疗病症，并且各种肺表面活性剂目前是商购可获得的，如下表1中所列出的那些。这些包括衍生自哺乳动物的或者天然的包含表面活性蛋白的表面活性剂以及合成的不含蛋白质的脂质混合物：

表1：商购可获得的肺表面活性剂的选集

衍生自哺乳动物的表面活性剂（本文中也被称为原生的或天然的肺表面活性剂）主要由磷脂组成，主要的磷脂是二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）。它还包括磷脂酰甘油（PG）和表面活性蛋白（SP）A、B、C和D。管状髓磷脂（其为原生的肺表面活性物质的活性体内胞外形式）的形成需要DPPC、PG、SP-A、SP-B和钙的存在。SP-B和SP-C被认为帮助天然的表面活性剂来表现优越的体内和体外表面行为（Dizon-Co等人，1994）。在肺表面活性物质的各种蛋白质组分中，SP-B似乎在维持肺泡扩张方面具有必不可少的功能。诚然，已经证明用疏水性SP-B和/或SP-C（无论来自于原生的还是重组来源的）简单地补充人造磷脂会导致改善的体内和体外功能（Dizon-Co等人，1994；Ikegami和Jobe，1998；Davis等人，1998）。已经证明SP-B的缺失不仅会导致足月儿当中SP-C的缺乏，而且会引发致命性呼吸衰竭（Nogee等人1993；Clark等人1995）。

数年来可以获得衍生自哺乳动物的表面活性剂，但是它们昂贵并且其治疗应用已经被专注于用于早产儿当中发生的HMD/RDS。这些表面活性剂制剂通常含有衍生自牛的或猪的来源的蛋白质，因此造成了传播与动物有关的病原体和过敏反应的潜在风险。

当与包含蛋白质的表面活性剂制剂相比时，最初合成的不含蛋白质的脂质表面活性剂（如

）已经在动物实验中和在人类婴儿试验中展示出低劣的性能（Grossman等人，1984；Cummings等人，1992；Halliday 1997；Ainsworth等人，2000）。后来合成的含有西那普肽（sinapultide）KL4的表面活性剂，如芦西纳坦（Lucinactant）（

Discovery Laboratories，费城）已经展示出对于死亡率、慢性肺部疾病和其它发病率的风险的优越的性能，所述发病率与患有HMD/RDS或者处于发展成为该病症的风险当中的婴儿的早产有关的。然而，在两例试验当中，其中将这样的含有蛋白质的合成表面活性剂与衍生自动物的表面活性物质提取物相比，在死亡或慢性疾病方面发现没有统计学差异（Cochrane Syst Review，2007）。此外，芦西纳坦在室温下是凝胶，在使用之前必须首先被加热以便使其以液体形式存在。芦西纳坦尚未经FDA批准用于治疗新生儿HMD/RDS。

在RDS的动物模型中和在涉及具有相同病症的人类婴儿的临床试验中已经对目前商购可获得的制剂的功效进行评估。总体而言，与含有蛋白质的天然制剂相比，可获得的不含蛋白质的合成制剂展示出低劣的体内性能。然而，已经质疑含有外来蛋白质的表面活性剂的安全性。衍生自动物组织的表面活性剂制剂的另外的缺点包括所需的生产和灭菌过程的复杂性。再造的表面活性剂通常包括添加的疏水性蛋白质（或者分离自动物组织或者获得自重组技术）或者这样的蛋白质的合成肽衍生物。因此，所述再造的表面活性剂的性质和活性不但极大地取决于磷脂混合物的组成而且极大地取决于肽/蛋白质组分。

因此，需要有与天然表面活性物质的表面活性性质相当的合成的肺表面活性剂组合物。

发明内容

根据本发明的第一个实施方案，其提供了一种组合物，所述组合物包含：

脂质类（lipidaceous）载体；

多聚-L-赖氨酸或其药学上可接受的盐；和

多聚-L-谷氨酸或多聚-L-天冬氨酸或其药学上可接受的盐。

所述多聚-L-赖氨酸或其药学上可接受的盐与多聚-L-谷氨酸、多聚-L-天冬氨酸或其药学上可接受的盐可以彼此形成肽复合物。

多聚-L-赖氨酸的盐可以是多聚-L-赖氨酸氢溴酸盐，优选具有式（I），其中n是从大约100至大约135，从大约103至大约135，或者从大约103至大约119：

多聚-L-谷氨酸的盐可以是多聚-L-谷氨酸的钠盐，优选具有式（II），其中x至少是50，至少是68或者至少是86：

所述多聚-L-赖氨酸链或其盐可以比所述多聚-L-谷氨酸或多聚-L-天冬氨酸链或其盐长出至少17个残基，长出至少50个残基或者长出至少85个残基。例如，所述多聚-L-赖氨酸链或其盐可以长出大约17至49个残基，大约50至85个残基或者大约35至67个残基。

所述脂质类载体可以包含二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、磷脂酰甘油（1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酸-[1-rac-甘油]）（PG）、十六烷醇、胆固醇、泰洛沙泊或氯化钠中的一种或多种。

例如，所述组合物可以包含下列物质：

二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）；

磷脂酰甘油（PG）；

十六烷醇；

泰洛沙泊；

多聚-L-赖氨酸氢溴酸盐；

多聚-L-谷氨酸钠盐；和

氯化钠。

所述组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。

所述组合物典型地用于预防或治疗与肺表面活性物质障碍或缺乏相关的疾病或病症，如肺透明膜疾病（HMD）、呼吸窘迫综合征（RDS）、烃类中毒、接近溺死、HIV/AIDS相关的肺部疾病、成人呼吸窘迫综合征（ARDS）或急性肺损伤（ALI）、哮喘、慢性阻塞性肺病（COPD）、结核病（TB）或严重急性呼吸综合征（SARS）。

作为选择地，所述组合物可以用于增加药物化合物或者组合物穿过受试者的膜的渗透性或者用于充当药物载体。所述药物化合物、组合物或药物可以是，但不限于，抗癌剂、抗炎剂、免疫抑制剂、抗利尿剂、载体肽、杀微生物的肽、ACTH抑制剂、皮质醇类似物或激素替代疗法剂，并且可以与如上所述的组合物同时施用或者可以包括在所述组合物中。

所述组合物可以适合于通过吸入法、插管法或直接肺部施用来施用。

根据本发明的另一个实施方案，其提供一种用于制备上述组合物的方法，所述方法包含以下步骤：

在有机溶剂中混合二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、十六烷醇和磷脂酰甘油（PG）；

除去有机溶剂并且获得磷脂膜；

在水溶液中混合多聚-L-赖氨酸或其药学上可接受的盐以及多聚-L-谷氨酸或者多聚-L-天冬氨酸或其药学上可接受的盐，并且获得肽复合物；

将肽复合物添加到磷脂膜中；

搅拌混合物，和

添加泰洛沙泊。

根据本发明的另一个实施方案，其提供如上所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在预防或治疗受试者中与肺表面活性物质障碍或缺乏相关的疾病的方法中使用，所述方法包含向受试者施用有效量的所述组合物。

根据本发明的另一个实施方案，其提供一种治疗或预防与患者肺表面活性物质障碍或缺乏相关的疾病的方法，其包含向受试者施用有效量的如上所述的组合物。

根据本发明的另一个实施方案，其提供一种向受试者施用药物化合物或组合物的方法，其包含向受试者施用有效量的药物化合物或组合物和有效量的如上所述的组合物的步骤。

附图说明

图1：是摩尔椭圆率（mdeg）对波长（nm）的图，其显示出如实施例1所述的多聚-L-赖氨酸、多聚-L-谷氨酸复合物的圆二色谱（CD）；

图2：是PaO₂/FiO₂对时间（min）的图，其显示出如实施例2所述的，用实施例1的组合物、generic exosurf（GE）或者GE和Ca²⁺处理的兔子的氧合作用属性，对于数据集A和C而言，p：=6.6x 10^-6；对于数据集C和D而言，p：=0.0002，并且对于数据集A和B而言，p：=0.04；

图3：是柱状图，其显示出如实施例2所述的，用GE、GE和Ca²⁺（GE+Ca）或者本发明的组合物处理的羔羊（n=6）中肺表面活性物质替代物对隔膜厚度（Tsept）（μm）的影响；

图4：是PaO₂x/FiO₂对时间（min）的图，其显示出如实施例3所述的，用本发明的组合物和

处理的羔羊（n=6）的平均系统氧合作用属性，（p=0.936）；

图5：是log_ePaO₂对时间（min）的图，其显示出如实施例3所述的，用本发明的组合物和

处理的羔羊（n=6）所观察到的平均值和平均值的拟合曲线；

图6：是如实施例3所述的，用本发明的组合物和

处理的羔羊（n=6）当中的经时（min）呼吸顺应性（Cdyn/kg）的图，（p=0.242）；

图7：是如实施例3所述的，用本发明的组合物和

处理的羔羊（n=6）当中系统氧合作用（PaO₂，以mmHg计）对动力学呼吸顺应性（Cdyn/kg）的回归点状图；

图8：是PaO₂（mm Hg）对时间（min）的图，其显示出本发明的组合物、修饰的

牛

绵羊肺表面活性剂、（本研究）之间的氧合作用的比较；

图9：是本发明的组合物和

的平均动力学呼吸顺应性数据对时间（min）的图，其显示出如实施例3所述的，用本发明的组合物和处理的羔羊（n=6）所观察到的平均值和平均值的拟合曲线；

图10：是Pa₂/FiO₂对时间（min）的图，其显示出如实施例3所述的，用本发明的组合物、

或生理盐水处理的羔羊的氧合作用属性；

图11：是如实施例3所述的，用本发明的组合物、

或生理盐水处理的羔羊的氧合作用指数（cm H²O/kPa）对时间（min）的图；

图12：是如实施例3所述的，用本发明的组合物、

或生理盐水处理的羔羊的潮气量（tidal volume）（Vte）（ml/kg）对时间（min）的图；

图13：是动脉二氧化碳张力（PaCO₂）对时间的图，其显示出如实施例3所述的，用本发明的组合物、

或生理盐水处理的羔羊的PaCO₂的属性；

图14：是如实施例3所述的，用本发明的组合物、

或生理盐水处理的羔羊中的动力学呼吸顺应性（cdyn/kg）对时间（min）的图；

图15：是显示在穿过猪肺组织的本发明的组合物和

的存在下槟榔碱的平均通量值的图；

图16：是显示在穿过人阴道黏膜组织的本发明的组合物和

的存在下槟榔碱的平均通量值的图；

图17：是显示在穿过猪肺组织的本发明的组合物和

的存在下雌二醇的平均通量值的图；

图18：是显示在穿过猪口腔黏膜组织的本发明的组合物和

的存在下槟榔碱的平均通量值的图；

图19：是显示在穿过猪肺组织的本发明的组合物、

和的存在下槟榔碱的平均通量值的图；

图20：是显示在穿过猪动脉肺组织的本发明的组合物的存在下雌二醇的平均通量值的图；

图21：是显示在穿过猪动脉肺组织的本发明的组合物的存在下血管加压素的平均通量值的图；

图22：是显示在穿过猪肺组织的本发明的组合物的存在下地塞米松的平均通量值的图；

图23：是显示在穿过猪肺组织的本发明的组合物的存在下氢化可的松的平均通量值的图；和

图24：是显示在穿过人阴道黏膜组织的本发明的组合物的存在下FITC-标记的MDY-19的平均通量值的图。

具体实施方式

本文描述一种包含脂质类载体和由两种多肽形成的肽复合物的组合物。第一种多肽是多聚-L-赖氨酸或其药学上可接受的盐；并且第二种多肽或者是多聚-L-谷氨酸或者是多聚-L-天冬氨酸，或其药学上可接受的盐。

所述组合物用于在哺乳动物肺部中临时替代天然的肺表面活性物质，在该哺乳动物肺部中这样的天然的肺表面活性物质是缺乏的、机能障碍的或以低浓度存在的。与其他的表面活性剂组合物不同，本发明的组合物不含有任何衍生自非人类来源的蛋白质。

所述组合物能够用于预防或治疗与肺表面活性物质障碍相关的疾病，如肺透明膜疾病（HMD）、呼吸窘迫综合征（RDS）、烃类中毒、接近溺死、HIV/AIDS相关的肺部疾病、成人呼吸窘迫综合征（ARDS）、哮喘、慢性阻塞性肺病（COPD）、结核病（TB）或严重急性呼吸综合征（SARS）。作为选择地，所述组合物能够用于增加药物化合物或者组合物穿过受试者的膜的的渗透性或用于充当药物载体。所述药物化合物、组合物或药物可以是，但不限于，抗癌剂、抗炎剂、免疫抑制剂、抗利尿剂、载体肽、杀微生物的肽、ACTH抑制剂、皮质醇类似物或激素替代疗法剂，并且能够作为单独的制剂但是与如上所述的组合物同时施用或者甚至可以作为一部分包括在如上所述的组合物中。所述组合物能够被气管插管施用进入哺乳动物的肺部来临时代替天然的肺表面活性物质，并且在肺泡界面的表面上产生一层膜和降低表面张力。从而促进肺泡空间的扩张。作为选择地，所述组合物能够通过吸入法、插管法或直接肺部施用来施用。

所述多聚-L-赖氨酸链或其盐一般比所述多聚-L-谷氨酸或多聚-L-天冬氨酸链或其盐长出至少17个残基、长出至少35个残基、长出至少50个残基或者长出至少85个残基。例如，所述多聚-L-赖氨酸链或其盐可以长出大约17至49个残基、大约50至85个残基或者大约35至67个残基。由于所述多聚-L-赖氨酸主要带正电并且所述多聚-L-谷氨酸主要带负电，因此在这两种多肽之间形成的肽复合物具有一个基本上电中性的区域和一个基本上带正电的区域。所述肽复合物的电中性的区域能够与脂质类载体发生相互作用，然而所述带正电的区域能够与水性的和/或极性的环境发生相互作用。

所述第一种多肽和所述第二种多肽的比例大约是1:0.3（w/w）；并且所述肽复合物和所述脂质类载体的比例大约是3:100（w/w），并且更特别地为3.9:100（w/w）。

典型地，所述多聚-L-赖氨酸是多聚-L-赖氨酸氢溴酸盐的形式，具有式（I），其中n是从大约100至大约135，更优选从大约103至大约135，甚至更优选从大约103至大约119。

典型地，所述多聚-L-谷氨酸（（Glu）_x）是多聚-L-谷氨酸钠盐的形式，具有式（II），其中x至少是50，优选至少是68，或甚至更优选至少是86。

所述脂质类载体可以包含二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、磷脂酰甘油（PG）、十六烷醇、胆固醇、泰洛沙泊或氯化钠的一种或多种。所述DPPC、十六烷醇和PG的比例可以是大约10:1.1:1（w/w）。

所述组合物可以任选地包括胆固醇；以例如从大约3mg/ml至大约4.8mg/ml的浓度，以便于包含所述组合物的大约5至大约8%（w/w）。

本发明的一个适合的实施方案的一个实例是一种组合物，其包含：

二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）60mg/ml；

磷脂酰甘油（PG）6mg/ml；

十六烷醇                    6.7mg/ml；

泰洛沙泊                    1mg/ml；

多聚-L-赖氨酸氢溴酸盐       1.98mg/ml；

多聚-L-谷氨酸钠盐           0.613mg/ml；和

氯化钠                       100mM。

如本文中所使用的，术语“脂质类载体”是指磷脂和任选的其他脂质成分的混合物，例如中性脂质如三酰甘油、游离脂肪酸和/或胆固醇。

如本文中所使用的，术语“主要包含”或“基本”是指大体上包含。例如，主要或基本具有正电的区域是指所述区域的整体的（或净余的）电荷是正性的。

如本文中所使用的，术语二棕榈酰磷脂酰胆碱指的是1,2-二-十六酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。

如本文中所使用的，术语磷脂酰甘油指的是1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酸-[1-rac-甘油]。

如本文中所使用的，用于治疗疾病的有效量是足以缓解，或者在一定程度上减少与所述疾病有关的症状的量。所述量将取决于疾病的种类和严重程度以及受试者的特征（体重、性别、年龄）。

实施例

以下将参考本发明的特殊实施方案来描述本发明，其中所述组合物包含脂质类载体和肽复合物，所述脂质类载体包括由二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、十六烷醇、磷脂酰甘油（PG）以10:1.1:1（w/w）的比例组成的磷脂混合物，所述肽复合物由以多聚-L-赖氨酸氢溴酸盐形式存在的第一多肽（具有大约100-135个氨基酸残基）和以多聚-L-谷氨酸钠盐形式存在的第二多肽（具有大约86个氨基酸残基）形成。申请人已经使用术语“Synsurf”来指代本发明的肺表面活性剂组合物。

用于制备表面活性剂组合物的方法包括在首先通过在有机溶剂（如氯仿）中混合DPPC、十六烷醇和PG来制备脂质类载体，然后于35℃在减压下通过旋转蒸发除去有机溶剂来获得磷脂膜。然后允许多聚-L-赖氨酸和多聚-L-谷氨酸的多肽通过于37℃在含有氯化钠的水溶液中混合来彼此复合，然后将其添加到磷脂膜。然后在大体上温和的条件下，对所述肽复合物和磷脂膜混合物进行超声处理。

在下面陈述的实施例中，制备本发明的肺表面活性剂组合物并且将其用于体内动物试验和使用动物和人类组织样本的体外渗透性研究中。实施例1陈述了如何制备所述肺表面活性剂组合物，以及其生化分析。实施例2陈述了与商购可获得的

相比，当所述肺表面活性剂组合物用作针对早产羔羊当中呼吸窘迫综合症的早期肺表面活性剂治疗所获得的结果。实施例3陈述了与商购可获得的相比，当所述肺表面活性剂组合物用于随机试验来治疗早产羔羊当中呼吸窘迫综合症所获得的结果。实施例4陈述了通过人类和动物组织样本使用所述肺表面活性剂组合物来扩散各种药剂的渗透性研究结果。

实施例1：Synsurf的制备和分析

材料

1,2-二-十六酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC）和1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酸-[1-rac-甘油]（PG）获得自Avanti Polar Lipids（Alabaster，AL），十六烷醇、泰洛沙泊、多聚-L-赖氨酸（氢溴酸盐，Sigma P7890）和多聚-L-谷氨酸（钠盐，Sigma P4636）购买自Sigma Chemical Company（St.Louis，MO）。通过薄层色谱法（TLC）来验证磷脂的纯度。注射用灭菌水用于制备肺表面活性剂。所使用的氯仿是HPLC等级（Merck，Darmstadt）。

方法

肺表面活性剂制剂

通过在5ml氯仿中混合DPPC（450mg）、十六烷醇（49.995mg）和PG（45mg）（以大约10:1.1:1的比例（w/w））制备本发明的组合物（下文中也指“Synsurf”）。然后通过旋转蒸发来除去有机溶剂并且在连续的氮气流下于室温干燥混合物。将多聚-L-赖氨酸（24.8kDa）（47.52mg，119个残基）与多聚-L-谷氨酸盐（10.2kDa）（14.7mg，86个残基）混合并且在100mMNaCl中于37℃孵育30分钟。以这样的方式制备所述复合物以便通过具有多余的多聚-L-赖氨酸残基来带正电。然后用聚合物混合物（3.9%）以磷脂浓度的重量计）水合干燥的磷脂膜，并且在玻璃珠的存在下温和地混合。然后使用配有微探头（microtip）的超声仪在氮气流下在冰上声处理混合物（20瓦特的功率持续7×13秒；60秒间隔）。此后，将7.5mg泰洛沙泊添加到制剂中并且在使用之前将试管在氮气下密封。

同样，以如上所述的类似方式制备generic Exosurf（GE）肺表面活性剂，其由三种组分组成：100mM NaCl中的DPPC/十六烷醇/泰洛沙泊（13.5:1.5:1）。在动物实验中使用的Synsurf和GE的剂量是100mg/kg。

液体表面张力测量

用CAHN 322Dynamic Contact Angle Analyser（动力学接触角分析仪）测量Synsurf和GE的表面张力性质。使用100微米/秒的平台速度伴随1次/秒的数据采集速率。使用玻璃板（22mm x 22mm x 0.15mm）作为力传感器。沉浸在含有12ml样品的25ml玻璃烧杯中进行于25℃记录单循环。进行五组一式三份的分析。

圆二色谱学

用Jasco-810分光偏振计于室温进行多聚-L-赖氨酸-多聚-L-谷氨酸复合物的二级结构分析。用100mM NaCl稀释所述聚合物复合物分别产生6.6μM多聚赖氨酸和3.2μM多聚谷氨酸的最终肽浓度。

结果

液体表面张力测量

DPPC是具有41.6℃的固体至液晶转变温度（solid-to-liquid-crystal transitiontemperature）的不带电分子（Van Golde等人，1988）。因此，它于正常体温下，在气液界面上不会很好地扩散。为了在耗尽肺表面活性剂的兔子模型实验过程中帮助Synsurf中DPPC的扩散，磷脂酰甘油（PG）包括在所述制剂当中。带负电的PG分子稳定了水中的磷脂乳剂并且促进了接触气液界面的脂质体的破坏（Enhorning，1984）。

Synsurf和GE制剂的表面张力的比较分析显示无统计学上的显著差异，并且对于Synsurf和GE制剂分别为37.7mN/m和37.6mN/m的值。尽管表面张力测量取决于所采用的技术，在动力学条件下测量的本发明的数据与在SP-B/C不存在下测量的差的表面张力功能一致（Notter，1983）。

圆二色谱学

多聚-L-赖氨酸能够以各种各样的构象存在，所述构象取决于侧链上氨基的电离作用、温度和盐浓度。当检测所述多聚-L-赖氨酸、多聚-L-谷氨酸复合物的圆二色谱（CD）时，它于218nm处显示出最大值，其表明所述混合物以原生的无规卷曲构象存在（图1）。这与Chittchang和同事们的发现一致，他们发现所述无规卷曲是多聚赖氨酸的原生的二级结构（Chittchang等人，2002）。尽管多聚-L-赖氨酸的疏水性按照下列次序显著增加：无规卷曲＜α-螺旋＜β-折叠构象（Gray等人，1994），但是由于多聚赖氨酸轭合物静电结合至DNA并且构成好的细胞转染剂，因此多聚-L-赖氨酸、多聚-L-谷氨酸的复合物具有一定程度的疏水性（Larson等人，2004）。此外，在与磷脂的相互作用过程中，多聚-L-赖氨酸采取来自于无规卷曲的β-折叠构象（Fukushima等人，1994）。然而，聚合物混合物的无规卷曲（无序状态）倾向于在赖氨酸侧链上暴露基本带电的表面基团，由此肽可以与其他分子灵活地相互作用来在细胞膜中发挥功能性作用。然后，整体效果可以是静电结合至磷脂单层（Carrier等人，1985）。关于SP-B，提出α-螺旋和β-折叠二级结构渗透入肺泡壁中内衬的磷脂膜的脂质酰基链，进而提供稳定性并且预防肺膨胀不全性萎陷（Whitsett等人，2002）。

本发明的制剂中多聚-L-赖氨酸的带电的氨基同样可以与磷脂双层相互作用，模拟SP-B的一种或多种结构的和/或功能的性质。作为选择地，因为对于维持SP-C的结构和功能，正电被认为是重要的（Creuwels等人，1995），所以可以争辩的是Synsurf中多聚-L-赖氨酸残基的整体正电性特征也许模拟了SP-C的结构的和/或功能的性质。

实施例2：在合成的肺表面活性剂替代治疗之后的肺表面活性剂耗尽的模型中的死腔监测、肺力学和血气分析

天然的肺表面活性物质中低浓度的肺表面活性蛋白使其处于有关系统氧合作用、肺力学和患有呼吸窘迫综合征（RDS）的婴儿的结果中改善的边缘，通过合成的不含蛋白质的产品实现在边缘之上。尽管在肺表面活性剂替代治疗（SRT）之后的系统氧合作用的改善归因于萎陷肺泡的补充或者补充的肺隔间的稳定化和过度膨胀、降低的死腔、肺力学的改善或者降低的分流，但是确切的机理仍然是不确定的和有争议的。在实验室动物当中，重复的灌洗提升了肺泡和生理学死腔，其与氧合作用的下降有关。随后的天然SRT改善了氧合作用而并未使肺部恢复至其灌洗前的状态。

以下实施例描述随机试验，其中在成年新西兰白兔模型中相对于其它两种合成的肺表面活性剂评估了本发明的组合物（Synsurf），根据Lachmann等人的过程（1982），通过重复的生理盐水灌洗建立肺表面活性剂缺乏模型。

方法

使用的表面活性剂

·Synsurf，根据实施例1中陈述的过程来制备

·GE–Generic Exosurf（如实施例1中所陈述，通过标准方法来制备）

·GE+Ca²⁺-Generic Exosurf+Ca²⁺

体内肺表面活性剂的活性测定

动物护理和实验过程是在斯泰伦博斯大学健康科学研究委员会的教学人员的批准下进行的。成年新西兰白兔用作肺表面活性剂耗尽的模型。在局部麻醉下进行气管切开术并且将无气囊的导管插入到气管中。在用戊巴比妥的连续静脉麻醉下开始使用标准设定的机械通气。用泮库溴铵实现麻痹。对于每一次清洗，使用20ml/kg温生理盐水（~37℃）通过气管内导管进行重复的灌洗。灌洗终点包括11kPa以下的动脉氧张力（PaO₂）的下降（吸入氧气浓度部分；FiO₂1.0）和40%或更多的动力学呼吸顺应性（Cdyn）的下降。灌洗之后五分钟，将动物随机分为三组。通过气管内导管施用肺表面活性剂制剂（DPPC浓度100mg/kg）。FiO₂，呼气潮气量，呼吸速率和呼气末正压（PEEP）在研究过程中保持恒定。用CO₂SMO Plus呼吸属性检测器（Novametrix MedicalSystems Inc.）测量肺部功能。通过主流红外吸收测量潮气末端二氧化碳张力的部分压力（PETCO₂）。通过使用动脉CO₂张力（PaCO₂）和体积测量来测定解剖死腔、肺泡死腔（Vdalv）、生理学（phys）死腔和死腔/潮气量（Vt）的比例。在灌洗之前和之后，并且在肺表面活性剂替代治疗之后的30、60、90、120、180、240和300分钟时测量血气、体积测量和Cdym。在通过致命性的动脉内注射15%的氯化钾的动物安乐死之前，将该研究持续5小时。

胸部影像

在灌洗之前，在随机分组之前立刻，以及在研究结束时拍摄自前而后的胸部影像。关于灌洗之后（肺膨胀不全）的影像浑浊是否转变（较好）、保持不变（相似）或者恶化（较差），以盲法评价肺部区域的改变。

统计学方法

使用非配对的t检验比较在预定时间点对于各组测量的变量。对于经时测量的连续变量而言，使用最小二乘法分析的经时变量线性回归，通过对于肺表面活性剂的最初应答（y-截距）和经时变化（斜率）的差异比较各组。数据表示为平均值±SD。小于0.05的p值被认为是有显著性的。

结果

在重复的灌洗之后，Vdalv、Vd/Vt比例和PaCO₂-ETCO₂差异（δ）显著增加，然而PaO₂和Cdyn显著降低（表2）。将组作为一个整体，肺表面活性剂滴注法不会将任何测量的变量恢复至灌洗前的状态（表3）。与其它两组相比，Synsurf组中记录了显著较好的氧合作用（PaO₂值）（图2）。在300分钟时，动物的Synsurf组具有显著低于GE组的PaCO₂-ETCO₂差异（数据未显示）。总体而言，负相关存在于a/A比例和Vd/Vt比例之间（r=0.72）并且显著的正相关存在于δPaCO₂-ETCO₂和Vd/Vt比例之间（r=0.8）。尽管显示出较好的氧合作用，但是与其它组相比，Synsurf组中的动物在PaO₂和δPaCO₂-ETCO₂以及PaO₂和Vd/Vt比例之间显示出较弱的相关性。三个研究组中的兔子均存活直至研究阶段结束。与GE+Ca²⁺组中的1/4和GE组中的2/4相比，Synsurf组中3/4的动物中CXR改善（表4）。合成的肺表面活性物质替代物不会将肺部恢复至其灌洗前的状态。

表2：灌洗前对比灌洗后（0时间点）（平均值±SD）

表3：所有动物的灌洗前变量对比300分钟（研究终点）时的变量（平均值±SD）

表4：胸部放射摄影术变化

讨论

所有动物在其Vd/Vt比例（生理学死腔）方面经历恶化。Synsurf处理的动物中经时的系统氧合作用是显著优越的。较低程度的肺内自右向左的分流可以解释该发现，所述分流通过PaCO₂-ETCO₂值的组内差异来反映。此外，尽管人们知道Ca²⁺能够在气液界面上稳定膜和极性磷脂膜，但是我们的实验显示接受GE+Ca²⁺的动物的氧合作用状况劣于用Synsurf处理的动物的状况。因此，用Synsurf处理的动物中系统氧合作用显著改善。该改善显著优于generic“Exosurf”的改善。该改善可能归因于较低程度的肺内分流，所述分流通过该组中PaCO₂-呼气末CO₂差异来反映（表2）。

实施例3：对于早产羔羊呼吸窘迫综合征的早期抢救肺表面活性剂治疗：Synsurf与衍生自牛的

的比较

实施例3是随机试验，其中在出生后30分钟的早产羔羊的滴注法过程中，关于系统氧合作用和肺力学，相对于商购可获得的衍生自牛的肺表面活性剂（ABBOTT Lab），对Synsurf进行评估。

方法

使用的肺表面活性剂

·Synsurf，根据实施例1中陈述的过程制备

体内肺表面活性剂的活性测定

动物护理和实验过程是在斯泰伦博斯大学的对于人类研究的健康科学委员会的教学人员的批准下进行的。将十二只怀孕的杜泊母羊预先麻醉、插管并接受氟烷麻醉和间歇的正压力通气。于126-129天胎龄（正常妊娠期145-150天）时，对标注有时间的怀孕母羊进行剖腹产术。暴露胎儿的头部，进行气管切开术并且放置不带气囊的4或4.5mm的气管内导管。采集10至20ml胎儿肺部流体样品来测定肺部成熟度。切断脐带；然后使动物分娩、干燥并称重，使其镇静并麻痹。开始相同通气类型的通气来实现9-11ml/kg的潮气量。使呼吸机设置在该研究中自始至终保持在1.0的FiO₂，40bpm的速率，Ti0.70秒和4cm H₂O的Peep恒定不变。将羔羊分配到两组当中的一个组（n=6羔羊/组），分娩30分钟。测试两种肺表面活性剂（浓度100mg/kg）：组A接受Synsurf并且组B接受

在35分钟的分娩中，施用肺表面活性剂作为早期抢救治疗。在表面活性剂替代（SR）之后，于30、45、60、90、120、180、240和300分钟时测量生理学变量、血气和体内肺力学的测量值。5小时之后，将所有存活的动物处死。除去所有动物的肺部用于组织学和形态学。

组织学

用空气以25cm H₂O静压将肺膨胀，用10%缓冲福尔马林固定。用苏木素和曙红染色液（H&E）将采集的样品染色并且通过光学显微镜在100X放大率下检测。

结果

表5中给出了两组的预处理参数。组间没有统计学差异。所有羔羊均为严重性肺表面活性物质缺乏，作为平均羊水板层体计数，分娩时总的肺部磷脂的反映是可以忽略的。

表5：Synsurf对比

的预处理参数（平均值SD）

肺表面活性剂滴注法后的15分钟内，Synsurf组和

组中的动物经历了PaO₂/FiO₂比例的增加（p=ns）。此后，然而，在整个研究期间，两组在系统氧合作用方面（PaO₂/FiO₂比例）经历了显著的恶化（图4和5）。在肺表面活性剂滴注法之后的45-90分钟内，系统氧合作用逐渐恶化至低于基线值，除了组A（Synsurf）于300分钟时具有较高的PaO₂值以外（p<0.05），两组之间在任意时间点均没有实际差异（图4和5）。

在5小时研究期间，两组的动脉血气（PaCO₂，pH）、通气指数和血液动力学变量相似。Synsurf组中6只动物中的4只存活至研究结束。在该组中，3只动物分别于45分钟，90-120分钟和180分钟时形成气胸。

组中所有的动物存活直至研究结束并且没有一只形成气胸（存活：Synsurf对p=ns ）。

图6显示了两组动物中呼吸顺应性的经时增加。有趣的是，两组中在氧合作用（图4，减少）和动力学呼吸顺应性（图6，增加）出现不关联。这种负相关性如图7所示。这些结果与文献中所报道的发现的比较如图8所示。动力学呼吸顺应性变化的另外的统计学分析（在下文中更加详细地陈述）表明和Synsurf之间存在差异性的迹象（图9）。在大约90至300分钟的时间间隔内，

的下限处于略高于Synsurf的上限处。

在研究结束时，

处理的动物和Synsurf处理的动物二者的支气管肺泡灌洗（BAL）流体中的磷脂酰胆碱主要由C16:0（棕榈酸）组成。Synsurf处理的动物的BAL流体与

处理的动物在脂肪酸组成方面有差异，该差异在于Synsurf处理的动物含有显著更多的棕榈酸（C16:0）和油酸（C18:1），同时含有显著更少的硬脂酸（C18:0）、肉豆蔻酸（C14:0）和棕榈油酸（C16:1）（图6）。因此，棕榈酸对于降低表面张力是必要的，非但Cdyn和C16:0之间没有相关性，而且Cdyn和BAL流体磷脂酰胆碱之间也没有相关性（μg磷脂/μg蛋白质）（数据未显示）。

表6：研究结束时支气管肺泡流体磷脂酰胆碱的脂肪酸组成。总体脂肪酸的脂肪酸分布百分比（平均值%SD）

用或Synsurf处理的羔羊的代表性肺组织切片没有显著性差异（数据未显示）。对于肺泡尺寸（p=0.3）或者肺泡体积（p=0.29）而言，Synsurf和

组之间不存在形态学差异（表7）。

表7：形态学参数

在肺表面活性剂滴注法之后，Synsurf处理的羔羊的外周总白细胞计数（WCC）与预处理水平相比显著下降（p=0.01）。Synsurf处理组中的后处理WCC水平显著低于

处理的羔羊的后处理WCC水平（p=0.01）。然而，不同的肺表面活性剂处理组之间的肺部（组织学）中的炎症细胞浸润物没有明显差异。

在早产羔羊当中肺表面活性剂缺乏的早期抢救治疗之后，基于气体交换、动力学呼吸顺应性和肺部组织学Synsurf和不能够区别。我们推论血气测量中的劣化可部分被认为是以下的结果：通过血浆蛋白泄漏至气道的肺表面活性剂抑制（之前已被其他人揭示过），通过当作为抢救治疗被滴注时肺表面活性剂的不均匀扩散而被混合，或者氧自由基对肺表面活性剂的抑制作用（用100％的氧气通气5小时）的结果，所有这些都恶化肺内分流。就这一点而言，蛋白质穿过肺泡上皮细胞泄漏可以在第一次呼吸/启动通气之前被SRT降低。

实验结束时的BAL流体脂肪酸组成包含对于充足的肺功能的多于所需最小值的磷脂酰胆碱中的棕榈酸（Shelley等人，1979）。Synsurf制剂中的聚合物可以帮助C16:0脂肪酸的体内吸收和扩散至肺表面活性剂层。

和Synsurf PaO₂数据的统计学分析

对于个体动物的，

和Synsurf数值对于时间的标图显示出，在大多数情况下，随时间的向下渐近趋势。将观察到的PaO₂值转化为log_e（PaO2）产生了观察到的趋势，所述趋势能够通过二次曲线来模拟，除了于时间=0时的观察值始终太低而不适合二次模式。在下文中省略于时间=0时的观察值。二次曲线适合于每一只动物的观察到的log_e（PaO₂）对于时间（分钟）的数据，得到6条

曲线和6条Synsurf曲线。计算观察到的

和Synsurf的平均值并且将它们在图5中作为点来标绘。计算拟合曲线的平均值并且显示为平滑的曲线。于15、30等时间点处，计算平均拟合值的标准误差：它们取决于所述拟合值在动物之间的变化。图5中显示的置信区间是平均值±1.57（标准误差平均值）。选择1.57作为乘数以便所述区间的非重叠表明

和Synsurf之间在大约0.05的水平上的显著性差异。

和Synsurf之间没有显示显著性差异。Synsurf的平均拟合曲线处于Survanta的置信区间当中，反之亦然。

和Synsurf动力学呼吸顺应性数据的统计学分析

用于个体动物的，Survanta和Synsurf数值对于时间的标图显示出随时间的趋势。所述趋势不是线性的，但是能够用二次曲线来充分地表示。

二次曲线适合于每一只动物的数据，得到6条

曲线和6条Synsurf曲线。计算观察到的

和Synsurf的平均值并且将它们在图9中作为点来标绘。计算拟合曲线的平均值并且在图9中显示为平滑的曲线。于0、15、30等时间点处，计算平均拟合值的标准误差：它们取决于所述拟合值在动物之间的变化。图9中显示的置信区间是平均值±1.57（标准误差平均值）。选择1.57作为乘数以便所述区间的非重叠表明

和Synsurf之间在大约0.05的水平上的显著性差异。

在大约90至300分钟的时间间隔内，

的下限处于高于Synsurf的上限处。

实施例4：对于呼吸窘迫综合征的肺表面活性剂治疗：早产羔羊的研究进行随机试验，其中在早产羔羊第一次呼吸之前分析在生理盐水（Saline）（对照）、Synsurf或衍生自猪的肺表面活性剂

（Chiesi，Safeline Pharmaceuticals）的滴注法过程中的系统氧合作用和肺力学。

方法

使用的肺表面活性剂

·Synsurf，根据实施例1中陈述的过程来制备

·

体内肺表面活性剂的活性测定

将十八只怀孕的多恩-美利奴（Dohne-Merino）母羊预先麻醉、插管并接受氟烷麻醉和间歇的正压力通气。于129-130天胎龄时（正常妊娠期150天），对标注有时间的怀孕母羊进行剖腹产术。胎儿的头部暴露，进行气管切开术并且放置不带气囊的4.5mm的气管内导管。采集10至20ml胎儿肺部流体样品来测定肺部成熟度。切断脐带；然后使动物分娩、干燥并称重，使其镇静并麻痹。在第一次呼吸之前使用肺表面活性剂。为了使肺损伤最小化，第一个30分钟内使用6-8ml/kg的呼气潮气量。然后将呼气潮气量（Vte）增加至8-10ml/kg。然后使呼吸机设置在该研究中自始至终保持在1.0的吸入氧气（FiO₂）的部分浓度，40bpm的速率，0.70秒的Ti和4cm H₂O的PEEP恒定不变。将羔羊分配到三组当中的一个组（n=6羔羊/组）。测试两种肺表面活性剂（浓度100mg/kg）：组A接受Synsurf并且组B接受并且对照组接受等体积的生理盐水。在SR之后，于30、45、60、90、120、180、240和300分钟时测量生理学变量（血压、心率、直肠温度以及如果可能，肺动脉压力）、血气和体内肺力学的测量值。5小时之后，将所有存活的动物处死。打开胸壁并且在放血之后，测定完整肺在35cm H₂O峰平台压（零PEEP）的准静态最大吸气量（MIC）。对离体肺部的前面和后面的宏观外貌进行拍照并且根据照片将肺部损伤模式分类。（a）正常外貌，（b）温和损伤模式的“典型”分布，（c）温和-中等损伤模式的“典型”分布和（d）严重损伤模式。结扎左侧主支气管并且除去左侧尾叶用于肺/水含量测量，即湿-干[w/d]的比例和肺部湿-干-湿的比例[湿重的部分]。然后在没有气胸的羔羊中，用4%的福尔马林重力填充剩余的肺部（右侧肺尾叶、肺中叶和肺顶叶）并且在25cm H₂O的恒定压力下使肺膨胀。该肺部用于组织学和形态学。

结果

总共研究18只羔羊。表8给出了三个组别的预处理参数的整体总结。所有羔羊均为严重性肺表面活性物质缺乏，因为它们的卵磷脂:鞘磷脂（L/S）比例在2以下并且羊水板层体计数在15000/μL以下（平均值5278）。所述肺表面活性剂缺乏进一步反映整体低的呼吸系统的动力学顺应性（Cdyn）（0.31±0.09ml/cmH₂O/kg）和通过低的a/A比例（0.03±0.01）和高的OI（53.68±32.10）所反映的差的氧合作用状态上。

表8：于0时的生理学变量参数（平均值±SD）

对于表中所列的不同参数未发现统计学差异。

对治疔的最初应答

在滴注空白载体之后，三个组别在30分钟内均经历氧合作用状态的改善（图10，图11）。尽管与生理盐水处理组相比，

处理的和Synsurf处理的羔羊的PaO₂/FiO₂比例之间于30分钟时间点没有显著性差异，但是Synsurf处理组具有显著较高的PaO₂/FiO₂比例（p=0.03）。于45分钟时间点，与用生理盐水处理的羔羊相比，Synsurf处理的动物已经达到显著更高的PaO₂/FiO₂比例（p=0.046）。接受肺表面活性剂的动物在30分钟至240分钟之间具有显著改善的氧合作用状态，高于用生理盐水处理的动物（图10，图11）。尽管

处理的动物在实验开始至300分钟时间点之间经历了显著改善的氧合作用状态（p=0.046），它们的平均PaO₂/FiO₂比例在30分钟至300分钟时间点之间随时间显著减小（p=0.046）。当与30分钟时间点相比时，Synsurf处理的羔羊于300分钟时具有更高的PaO₂/FiO₂比例和a/A比例。相比于用

或者生理盐水处理的羔羊，Synsurf处理的羔羊于300分钟时间点处具有显著更好的PaO₂/FiO₂（相对于p=0.046；相对于生理盐水，p=0.043）和a/A比例（相对于

p=0.046；相对于生理盐水，p=0.043）。Synsurf处理的羔羊于300分钟时具有类似于

处理的羔羊的氧合作用状态，但是相比于生理盐水处理的羔羊，具有较低的氧合作用状态（p=0.345）（表9，图10，图11）。

表9：于300分钟（研究结束）时的生理学变量-参数（平均值±SD）

除了分别于180和300分钟时，Synsurf处理的羔羊具有显著更低的呼气潮气量（相对于

p=0.028；相对于生理盐水，p=0.043），各组之间没有差异（图12）。在研究开始至300分钟之间的动脉PaCO₂值（图13）表明没有显著性差异并且在研究期间所有动物的平均动脉血压在正常界限当中（平均值55.8±7.3）。

所有组的总动力学呼吸顺应性（Cdyn）（图14）随时间平稳增加，但是只有肺表面活性剂处理组在0时间点（实验开始）至300分钟时间点之间显著增加（对于Synsurf和

而言，分别为p=0.0012和p=0.00026）。对于Cdyn，在实验开始至300分钟之间没有显著地组间差异。

对于所有的研究组，脐带血具有胎血中典型的淋巴球过多症（表10）。在5小时的滴注法之后，白细胞的数目仅仅在处理组中显著变化。在该组中，平均外周白细胞计数（WCC）从1.2升至3.0（p=0.02）。在5小时的滴注法之后，所有组中均发生由脐带血中的淋巴球过多症向嗜中性为主（neutrophilic predominance）的主要转移。然而，各组之间没有显著性差异。

表10：早产羔羊出生时和5小时滴注法之后的白细胞计数和分类计数

肺表面活性剂处理组中的所有动物均存活。在研究过程中，两只动物形成气胸，生理盐水组和Synsurf处理组中分别有一只。生理盐水组中的一只动物在300分钟标记点之前死亡。

在开胸状态下测定的准静态肺体积测量值（最大吸气量（MIC））为生理盐水处理的羔羊36.22±10.21ml/kg，处理的羔羊33.95±8.03ml/kg和Synsurf处理的羔羊32.96±1.98ml/kg，彼此并无差异（p=ns）。将16只羔羊的肺部（生理盐水处理组中的2只羔羊的肺部无法使用）的宏观外貌分类（数据未显示）。大多数羔羊（n=8）的肺部外貌被分在温和-中等损伤模式和严重损伤模式下（n=5）。只有两只羔羊具有“正常外貌”的肺部，分别为生理盐水组中的一只羔羊和

处理组中的一只羔羊。Synsurf组中的一只羔羊具有温和损伤模式。关于损伤模式的分布，没有明显可见的组间差异。

表11显示了通过w/d和w/d/w比例反映的死后肺水含量的计算。以三组之间的w/d/w比例来表示的肺部湿重部分未观察到显著性差异。同样地，表示为w/d比例的肺部干重在任意组别之间显示无显著性差异。

表11：肺部湿-干（W/D）比例和肺部湿-干-湿（W/D/W）比例。平均值±SD

讨论

在第一次呼吸之前，进行对照试验来比较在生理盐水（对照）、Synsurf或衍生自猪的肺表面活性剂的滴注法之后肺表面活性剂缺乏的早产羔羊中的系统氧合作用和肺力学。采用肺表面活性剂的处理在氧合作用状态而并非动力学呼吸顺应性方面产生明显差异。在整个研究期间，与

或生理盐水处理的动物相比，用Synsurf的肺表面活性剂替代物引起更加持久的改善的氧合作用应答。

尽管动力学呼吸顺应性仅在肺表面活性剂处理组中显著增加，但是它们的时间曲线与生理盐水处理的动物的时间曲线并无显著性差异。如同实施例2，随着时间的推移，相对于氧合作用方面并发的减少再一次观察到顺应性方面的增加，但是这次仅存在于

和生理盐水处理组。如实施例2所观察到的，其中施用肺表面活性剂作为抢救处理，Synsurf组中未记载氧合作用和顺应性之间的“不关联”或分歧。

本文在动物模型研究中，已经证明合成的肺表面活性剂制剂的体内功效。尽管Synsurf影响动物中氧合作用应答的持续时间和程度的精确的机理仍需阐明，但是我们建议简单的聚合物复合物的两亲样特征（Kurutz和Lee.2002；Lipp.等人，1996；Baatz等人，1990）可能是模拟迫切需要的SP-B功能的关键。

实施例5：作为穿过组织的药物的渗透性强化剂的肺表面活性剂

考察了本发明的表面活性剂组合物在化学试剂/药物和肽类穿过猪肺部、动脉、口腔黏膜和人类阴道黏膜的渗透性方面的作用。

方法

使用的肺表面活性剂

·Synsurf（新型合成肺表面活性剂）

·Generic Exosurf（通过标准方法制备）

·

（衍生自猪的肺表面活性剂）

·

（衍生自牛的肺表面活性剂）

材料

该研究是得到斯泰伦博斯大学健康科学学院的人类研究委员会批准的。从动物房获得猪肺和口腔黏膜。从阴式子宫切除术后的绝经后患者处获得阴道黏膜。将样本置于磷酸盐缓冲的生理盐水（PBS）或者不含L-谷氨酰胺和NaHCO₃的Eagle极限必需培养基（Eagle’s Minimum Essential Medium）（MEM）中并被转往实验室。将样本在液氮中速冻并于-85℃储存6个月。

在渗透研究中使用的，在分子尺寸和亲脂性方面存在广泛差异的药物/肽/化合物有：

·3H-17β-雌二醇（分子量=272Da）。该药物用于女性更年期过程中的激素替代治疗。

·3H-还原槟榔碱（分子量=141Da）。该生物碱具有引发口腔癌症以及黏膜下纤维化的潜能。

·3H-氢化可的松（分子量=362.4Da）。这是天然出现的皮质类固醇，主要应用其抗炎和免疫抑制作用，或者用于激素替代疗法。

·3H-地塞米松（分子量=392.5Da）。这是一种有效的皮质醇合成类似物，其用于预防和治疗脑水肿并且它是抑制ACTH产生所选的药物。

·3H-血管加压素（分子量=1084Da）。这是抗利尿肽类激素，应用其对肾脏的作用。

·FITC-标记的MDY-19（分子量=2409.5Da），一种载体肽；和FITC-标记的MEA-5（分子量=2911.4Da），一种杀微生物的肽。

提高渗透性的强化剂是基于二棕榈酰基磷酯酰胆碱（DPPC）的肺表面活性剂。如实施例1所述来制备Synsurf和Exosurf，而购买

和

扩散动力学装置

通过使用连续穿流扩散系统（continuous flow-through diffusion system）测定通过猪肺部和口腔黏膜以及人类阴道黏膜的扩散动力学。

修剪不同黏膜的组织样本并且将七片（±4mm）安装在穿流扩散细胞（暴露面积0.039cm²）中。在实验开始之前，在扩散细胞的供体和受体二者的隔室中，用PBS，pH 7.4，于20℃将组织片平衡10分钟。在平衡之后，从供体隔室中除去PBS并且用1ml的氚代的化合物/肽（0.1-1.4μCi）来代替。在数分钟之内，从七个供体隔室中的每一个当中移除等份（100μl），用于0时的供体细胞浓度（C₀）的测定。通过受体室以1.5ml/h的速率泵送PBS（pH 7.4）。以2小时的间隔收集每部分，共48h。向收集的每一份样品中添加闪烁液（10ml）并且在液体闪烁计数仪中计数直至达到1%的2-s值。在计数仪中自动纠正每一份样品的淬灭。通过以下关系计算穿膜通量值（J）：J=Q/A·t(dpm.cm^-2.min^-1)，其中Q=穿膜物质的数量（dpm）。A=膜的暴露面积（cm²）并且t=暴露时间（min）。通过荧光光谱法测定肽。

稳态动力学：当通量值（flux value）之间在至少2个连续的时间间隔中没有获得显著的统计学差异（p<0.05）（ANOVA和Duncan氏多范围检验）时，假设对于特定的样本已经到达稳态（平衡动力学）。

统计学分析：用Welch氏校正的非配对t检验考察2小时间隔的通量平均值之间可能的差异。使用p＜0.05的显著性水平。通过使用F-检验来完成整个曲线的比较。

结果

当与Exosurf相比时，Synsurf增强了槟榔碱穿过猪肺组织的通量率（flux rate）（图15）。Synsurf/槟榔碱的p值为p=3.75311E^-11，然而Exosurf/槟榔碱的p值为p=0.9554。Synsurf的n值为31；Exosurf的n值为17；并且槟榔碱的n值为33。

Synsurf和Exosurf二者均增强了槟榔碱穿过人类阴道黏膜的通量率（图16）。Synsurf和Exosurf之间的数值差异不显著。Synsurf/槟榔碱的p值为p=1.0388E^-5，Exosurf/槟榔碱的p值为p=1.807E^-14；并且Synsurf/Exosurf的p值为=0.74029。Synsurf的n值为18；Exosurf的n值为17；并且槟榔碱的n值为7。

Synsurf和Exosurf二者均增强了雌二醇穿过猪肺组织的通量率（图17）。然而，用Synsurf的增强更加巨大。Synsurf/雌二醇的p值为p=4.51E^-26，Exosurf/雌二醇的p值为p=8.9E^-10；并且Synsurf/Exosurf的p值为p=1.3E^-9。Synsurf的n值为24；Exosurf的n值为13；并且雌二醇的n值为15。

当与Exosurf相比时，Synsurf增强了槟榔碱穿过猪口腔黏膜的通量率（图18）。Synsurf/槟榔碱的p值为p=5.58E^-10；Synsurf/Exosurf的p值为p=3.5E^-12；并且Exosurf/槟榔碱的p值为p=0.1355。Synsurf的n值为11；Exosurf的n值为17；并且槟榔碱的n值为12。

Synsurf和

二者均增强了槟榔碱穿过猪肺组织的通量率（没有统计学差异），然而

未显示增强（统计学不显著）（图19）。Synsurf/槟榔碱的p值为p=3.75E^-11；

/槟榔碱的p值为p=1.7E^-10；

/槟榔碱的p值为p=0.1183；并且Synsurf/

的p值为p=0.4745。Synsurf的n值为31；

的n值为17；

的n值为16；并且槟榔碱的n值为33。

Synsurf增强了雌二醇穿过猪肺动脉组织的通量率（图20）。Synsurf/雌二醇的p值为p=8.15E^-6，并且Synsurf的n值为14，雌二醇的n值为10。

稀释的（1/2浓度）和未稀释的Synsurf二者均增强了血管加压素穿过猪肺组织的通量率（图21）。Synsurf[1]/血管加压素的p值为p=2.4E^-25；并且Synsurf[0.5]/血管加压素的p值为p=2.44E^-35。Synsurf[0.5]的n值为15；Synsurf[1]的n值为18；并且血管加压素的n值为26。

稀释的（1/2浓度和1/4浓度）Synsurf增强了地塞米松穿过猪肺组织的通量率，然而未稀释的Synsurf延迟了穿过肺组织的通量（图22）。Synsurf[0.25]/地塞米松的p值为p=2.02E^-11；Synsurf[0.5]/地塞米松的p值为p=0.00014。Synsurf[0.25]的n值为20；Synsurf[0.5]的n值为18；地塞米松的n值为22；并且Synsurf[1]的n值为21。

Synsurf统计学显著地增强了氢化可的松穿过猪肺组织的通量率（图23）。Synsurf/氢化可的松的p值为p=4.37E^-5；并且Synsurf的n值为24，氢化可的松的n值为26。

整个曲线的比较未显示出含有Synsurf的载体肽MDY-19在统计学上的增强（图24）。Synsurf+MDY-19的p值为p=0.1652；并且MDY-19的n值为38；MEA-5的n值为16；并且MDY-19+Synsurf的n值为20。

讨论

在这些研究中，申请人发现合成的基于DPPC的肺表面活性剂Synsurf提高了不同分子量（141-2911.4Da）的化合物/肽/药物穿过肺、口腔、动脉和阴道组织的渗透作用。尽管仍需进一步考察其作为渗透强化剂的临床关联性，但是在上述结果中显示的Synsurf的潜能可以产生对于各种各样药物试剂的数个新的递送制剂。

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Claims (29)

1.一种组合物，其包含：

脂质类载体；

多聚-L-赖氨酸或其药学上可接受的盐；和

多聚-L-谷氨酸、多聚-L-天冬氨酸或其药学上可接受的盐。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多聚-L-赖氨酸或其药学上可接受的盐与多聚-L-谷氨酸、多聚-L-天冬氨酸或其药学上可接受的盐彼此形成肽复合物。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的组合物，其中所述多聚-L-赖氨酸的盐是多聚-L-赖氨酸氢溴酸盐。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述多聚-L-赖氨酸氢溴酸盐是式（I）并且n是从大约100至大约135

5.根据权利要求4所述的组合物，其中n是从大约103至大约135。

6.根据权利要求4所述的组合物，其中n是从大约103至大约119。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述多聚-L-谷氨酸的盐是多聚-L-谷氨酸钠盐。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述多聚-L-谷氨酸钠盐是式（II）并且x至少是50

9.根据权利要求8所述的组合物，其中x至少是68。

10.根据权利要求8所述的组合物，其中x至少是86。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述多聚-L-赖氨酸链比所述多聚-L-谷氨酸或多聚-L-天冬氨酸链长出至少17个残基。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述多聚-L-赖氨酸链比所述多聚-L-谷氨酸或多聚-L-天冬氨酸链长出至少50个残基。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述多聚-L-赖氨酸链比所述多聚-L-谷氨酸或多聚-L-天冬氨酸链长出至少85个残基。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述脂质类载体包含二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、磷脂酰甘油（PG）、十六烷醇、胆固醇、泰洛沙泊或氯化钠的一种或多种。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其包含：

二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）；

磷脂酰甘油（PG）；

十六烷醇；

泰洛沙泊；

多聚-L-赖氨酸氢溴酸盐；

多聚-L-谷氨酸钠盐；和

氯化钠。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其用于预防或治疗与肺表面活性物质障碍或缺乏相关的疾病。

18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述疾病是肺透明膜疾病（HMD）、呼吸窘迫综合征（RDS）、烃类中毒、接近溺死、HIV/AIDS相关的肺部疾病、成人呼吸窘迫综合征（ARDS）或急性肺损伤（ALI）、哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、结核病（TB）或严重急性呼吸综合征（SARS）。

19.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其进一步包含用于预防、治疗或缓解疾病或医学病症的药物化合物或组合物。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其是用于在增加药物化合物或组合物穿过受试者的膜的渗透性的方法中使用。

21.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其是用作药物化合物或组合物的载体。

22.根据权利要求19至21中任一项所述的组合物，其中所述药物化合物或组合物是抗癌剂、抗炎剂、免疫抑制剂、抗利尿剂、载体肽、杀微生物的肽、ACTH抑制剂、皮质醇类似物或激素替代疗法剂。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物，其适合于通过吸入法、插管法或直接肺部施用来施用。

24.一种用于制备根据权利要求1至23中任一项所述的组合物的方法，所述方法包含下列步骤：

在有机溶剂中混合二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、十六烷醇和磷脂酰甘油（PG）；

除去有机溶剂并且获得磷脂膜；

在水溶液中混合多聚-L-赖氨酸或其药学上可接受的盐以及多聚-L-谷氨酸或者多聚-L-天冬氨酸或其药学上可接受的盐，并且获得肽复合物；

将肽复合物添加到磷脂膜中；

搅拌混合物，和

添加泰洛沙泊。

25.根据权利要求1至23中任一项所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在预防或治疗与受试者肺表面活性物质障碍或缺乏相关的疾病的方法中使用，所述方法包含向受试者施用有效量的所述组合物。

26.根据权利要求25所述的用途，其中所述疾病是肺透明膜疾病（HMD）、呼吸窘迫综合征（RDS）、烃类中毒、接近溺死、HIV/AIDS相关的肺部疾病、成人呼吸窘迫综合征（ARDS）或急性肺损伤（ALI）、哮喘、慢性阻塞性肺病（COPD）、结核病（TB）或严重急性呼吸综合征（SARS）。

27.一种治疗或预防与受试者肺表面活性物质障碍或缺乏相关的疾病的方法，所述方法包含向受试者施用有效量的根据权利要求1至23中任一项所述的组合物。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述疾病是肺透明膜疾病（HMD）、呼吸窘迫综合征（RDS）、烃类中毒、接近溺死、HIV/AIDS相关的肺部疾病、成人呼吸窘迫综合征（ARDS）或急性肺损伤（ALI）、哮喘、慢性阻塞性肺病（COPD）、结核病（TB）或严重急性呼吸综合征（SARS）。

29.一种向受试者施用药物化合物或组合物的方法，所述方法包含向受试者施用有效量的药物化合物或组合物和有效量的根据权利要求1至16中任一项所述的组合物的步骤。

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