CN102924570B - 荧光标记多肽及其制备方法和应用 - Google Patents

荧光标记多肽及其制备方法和应用 Download PDF

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一种荧光标记多肽，其氨基酸序列为TSRHK(Ac)-CONH2，以Fmoc-Lys(Ac)-Rink酰胺4-甲基二苯甲胺树脂等为原料制备而成。本发明制备的荧光标记多肽可以作为组蛋白去乙酰化酶的底物，反应后通过迁移率变动实验来直接检测底物的转化率，从而计算出检测化合物对酶活性的抑制程度，来筛选和鉴定组蛋白去乙酰化酶抑制剂。使用本发明的荧光标记多肽作为底物来筛选去乙酰化酶抑制剂，由于不再需要第二步酶偶联反应，与现有技术相比，具有快速(1个半小时以内得到结果)、经济(成本为试剂盒方法的一半甚至四分之一)、直接准确(假阳/阴性率低)的特点，并可用于大规模筛选化合物库来鉴定组蛋白去乙酰化酶抑制剂。

Description

荧光标记多肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术，尤其涉及一种荧光标记多肽及其制备方法和应用。
背景技术
组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDAC)是一类从组蛋白赖氨酸残基上去除ε-N-乙酰基的酶家族。真核生物中，染色质的基本单位是核小体。核小体由核心组蛋白(H2A，H2B，H3，H4)构成的八聚体、一段146个碱基的DNA片段和连接组蛋白H1组成。核心组蛋白的C端疏水氨基酸位于核小体的内部，N端氨基酸则伸出核小体外，并被各种组蛋白修饰酶进行特异性位点的修饰，包括磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化等。通过对组蛋白赖氨酸残基的修饰并导致组蛋白过乙酰化，组蛋白去乙酰化酶可以调控特定基因的表达并参与各种生理病理过程的调控。
人类组蛋白去乙酰化酶家族共有18个成员，并根据其与酵母组蛋白去乙酰化酶的同源性分成四类，其中一类和二类被认为是“典型的”组蛋白去乙酰化酶，其特点是可以被trichostation A抑制；第三类酶的催化活性依赖于NAD+辅因子的存在，并不受trichostation A的影响；第四类酶(HDAC11)的催化中心保留了和一二类组蛋白去乙酰化酶相同的基团。
组蛋白去乙酰化酶抑制剂主要通过调节细胞凋亡、诱导活性氧生成、阻止血管生成等作用机制发挥其抗癌作用，并已成为全球抗肿瘤药物的研究的热点。目前只有两种组蛋白去乙酰化酶抑制剂Vorinostat和Romidepsin被美国食品药品监督管理局批准并被用于治疗表皮T细胞淋巴瘤。因此，建立一个准确高效的组蛋白乙酰化酶抑制剂体外筛选平台在此类药物的临床前研发中显得十分重要和急迫。
目前体外筛选组蛋白乙酰化酶抑制剂体外多使用市售试剂盒来完成，其检测是通过两步法来实现的，第一步是将去乙酰化酶和底物孵育，反应去除底物上的乙酰基，第二步是加入特异识别并切割去乙酰基化的底物的酶，并释放出有色或者荧光基团用于检测。这种体外筛选方法成本较高，且由于反应过程需要加入一步酶偶联反应作为显色反应，在筛选过程中容易得到假阳性或者假阴性结果，从而对后续的研发工作带来许多障碍，并不适用于现代医药产业新药研发的需求。
发明内容
本发明的目的，就是为了解决上述现有技术存在的问题，提供一种荧光标记多肽及其制备方法和应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种荧光标记多肽，其氨基酸序列为TSRHK(Ac)-CONH2，该氨基酸序列第五位赖氨酸残基上的乙酰基团可被组蛋白去乙酰化酶识别并切除。
上述荧光标记多肽的制备方法，包括以下顺序进行的步骤：
A、取Fmoc-Lys(Ac)-Rink酰胺4-甲基二苯甲胺树脂(Fmoc-Lys(Ac)-RinkAmide-MBHAResin)置于反应容器中，以N，N-二甲基甲酰胺溶胀树脂，然后用脱保护液反应2次后，抽出脱保护液；
B、依次向反应容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、Fmoc-His(trt)-OH、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑和N，N-二异丙基乙胺，振荡反应；然后抽出反应液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；
C、向反应容器中加入脱保护液反应2次，然后抽出脱保护液，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；
D、依次向反应容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑和N，N-二异丙基乙胺，振荡反应，然后抽出反应液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；
E、向反应容器中加入脱保护液振荡反应2次，然后抽出脱保护液，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；
F、依次向反应容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser(Boc)-OH、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑和N，N-二异丙基乙胺，振荡反应，然后抽出反应液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；
G、向反应容器中加入脱保护液振荡反应2次，然后抽出脱保护液，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；
H、依次向反应容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Thr(tBu)-OH、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑和N，N-二异丙基乙胺，振荡反应，然后抽出反应液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；
I、向反应容器中加入脱保护液振荡反应2次，然后抽出脱保护液，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；
J、依次向反应容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、5-FAM、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑和N，N-二异丙基乙胺，振荡反应，然后抽出反应液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽出洗涤液，即得到存在于洗涤液中的荧光标记多肽，洗涤液中的荧光标记多肽再通过C18反相柱利用HPLC分离提纯得到荧光标记多肽产品。
上述荧光标记多肽的制备方法，其中，所述的脱保护液为含有20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液。
上述荧光标记多肽的应用，是以所述荧光标记多肽为底物，筛选组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
上述荧光标记多肽的应用，其中，所述筛选组蛋白去乙酰化酶抑制剂的方法是：
1)将检测化合物用DMSO梯度稀释为化合物溶液；
2)在384孔微孔板中，每孔加入1微升梯度稀释后的化合物溶液；
3)每孔加入15微升含16微摩尔/升荧光标记多肽的反应缓冲液；
3)每孔加入15微升含0.4单位SIRT 1酶(或者合适浓度的其他HDAC酶)的反应缓冲液；
4)放入30℃孵箱中反应60分钟；
5)每孔加入45微升反应终止液；
7)使用迁移率变动实验测量所述荧光标记多肽的转化率并计算检测化合物的半数抑制浓度IC50，如半数抑制浓度IC50小于10微摩尔/升，则所述检测化合物为组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
上述荧光标记多肽的应用，其中，所述化合物溶液的配制方法是，取浓度为10毫摩尔/升的检测化合物溶液，用DMSO按照半对数梯度稀释的方法稀释至所用终浓度的30倍浓度。
上述荧光标记多肽的应用，其中，所述反应缓冲液的配制方法是，取25毫升1摩尔/升的Tris溶液，137毫升1摩尔/升的氯化钠溶液，2.7毫升1摩尔/升的氯化钾溶液，1毫升1摩尔/升的氯化镁溶液，0.1克BSA粉末以及5毫升0.1摩尔/升的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液，加入蒸馏水定容至1升。
上述荧光标记多肽的应用，其中，所述反应终止液的配制方法是，取100毫升1摩尔/升的HEPES缓冲液，20毫升0.5摩尔/升的EDTA溶液，1.33毫升30％的Brij35溶液和1毫升5毫摩尔/升的suramin溶液，加入蒸馏水定容至1升。
上述荧光标记多肽的应用，其中，所述的化合物所用终浓度根据检测化合物的特性和实验设计而不同，最高终浓度为100微摩尔/升。
本发明制备的荧光标记多肽可以作为组蛋白去乙酰化酶的底物，反应后通过迁移率变动实验来直接检测底物的转化率，从而计算出检测化合物对酶活性的抑制程度。使用本发明的荧光标记多肽作为底物来筛选去乙酰化酶抑制剂，由于不再需要第二步酶偶联反应，因此与现有技术相比，具有快速(1个半小时以内得到结果)、经济(成本为试剂盒方法的一半甚至四分之一)、直接准确(假阳/阴性率低)的特点，可用于大规模筛选化合物库来鉴定组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
附图说明
图1为制备多肽的HPLC分析图；
图2为制备多肽的质谱分析图；
图3为检测化合物的半数抑制浓度(IC50)分析图。
具体实施方式
实施例1荧光标记多肽的制备方法
1)精确称取10克的Fmoc-Lys(Ac)-Rink酰胺4-甲基二苯甲胺树脂加入200毫升的反应容器中，并加入100毫升N，N-二甲基甲酰胺溶胀树脂30分钟，抽干，再用N，N-二甲基甲酰胺振荡洗涤3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干，加入50毫升脱保护试剂(含20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺)振荡反应2次，每次15分钟中间再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤1次，抽出脱保护液，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次，抽干，取少许树脂做茚三酮检测，呈阳性。
2)依次向反应容器中加入50毫升N，N-二甲基甲酰胺，12.65克Fmoc-His(trt)-OH，8.30克苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯，2.7克1-羟基苯并三氮唑，2.4毫升N，N-二异丙基乙胺，振荡30分钟，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性。抽出反应液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
3)加入50毫升脱保护试剂(含20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺)振荡反应2次，每次15分钟中间再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤1次，取少许树脂做茚三酮检测，呈阳性，抽出脱保护液，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次，抽干。
4)依次向反应容器中加入50毫升N，N-二甲基甲酰胺，7.72克Fmoc-Arg(Pbf)-OH，8.30克苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯，2.7克1-羟基苯并三氮唑，2.4毫升N，N-二异丙基乙胺，振荡30分钟，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性。抽出反应液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
5)加入50毫升脱保护试剂(含20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺)振荡反应2次，每次15分钟中间再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤1次，取少许树脂做茚三酮检测，呈阳性，抽出脱保护液，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次，抽干。
6)依次向反应容器中加入50毫升N，N-二甲基甲酰胺，9.24克Fmoc-Ser(Boc)-OH，8.30克苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯，2.7克1-羟基苯并三氮唑，2.4毫升N，N-二异丙基乙胺，振荡30分钟，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性。抽出反应液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
7)加入50毫升脱保护试剂(含20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺)振荡反应2次，每次15分钟中间再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤1次，取少许树脂做茚三酮检测，呈阳性，抽出脱保护液，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次，抽干。
8)依次向反应容器中加入50毫升N，N-二甲基甲酰胺，6.24克Fmoc-Thr(tBu)-OH，8.30克苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯，2.7克1-羟基苯并三氮唑，2.4毫升N，N-二异丙基乙胺，振荡30分钟，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性。抽出反应液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
9)加入50毫升脱保护试剂(含20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺)振荡反应2次，每次15分钟中间再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤1次，取少许树脂做茚三酮检测，呈阳性，抽出脱保护液，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次，抽干。
10)依次向反应容器中加入50毫升N，N-二甲基甲酰胺，9.24克5-FAM，8.30克苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯，2.7克1-羟基苯并三氮唑，2.4毫升N，N-二异丙基乙胺，振荡30分钟，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性，抽出反应液。再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
11)取所得的样品做HPLC和MS分析(图1，图2)以检测制备多肽的质量。
实施例2迁移率变动实验中的化合物溶液和反应溶液的配制方法
1)取浓度为10毫摩尔/升的化合物溶液，用DMSO按照半对数稀释的方法稀释至所用终浓度的30倍浓度，放置备用，此为化合物溶液。
2)取25毫升1摩尔/升的Tris溶液，137毫升1摩尔/升的氯化钠溶液，2.7毫升1摩尔/升氯化钾溶液和1毫升1摩尔/升的氯化镁，0.1克BSA粉末以及5毫升0.1摩尔/升的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液加入750毫升蒸馏水中，并调节pH值到8.0，再用1升的容量瓶定容至1升，并用0.45微米孔径的滤器过滤后备用，此为反应缓冲液。
3)取100毫升1摩尔/升的HEPES缓冲液，20毫升0.5摩尔/升EDTA溶液，1.33毫升30％Brij 35溶液，1毫升5毫摩尔/升suramin溶液加入800毫升蒸馏水中，并调节pH值到7.5，再用1升的容量瓶定容至1升，并用0.45微米孔径的滤器过滤后备用，此为反应终止液。
实施例3荧光标记多肽作为底物筛选组蛋白去乙酰化酶抑制剂的方法
1)取1微升梯度稀释后的化合物溶液加入384孔微孔板中
2)每孔加入15微升含16微摩尔/升荧光标记多肽的反应缓冲液。
3)每孔加入15微升含0.4单位SIRT 1酶(或者合适浓度的其他HHDAC酶)的反应缓冲液。
4)放入30℃孵箱中反应60分钟(或者合适的反应时间)。
5)每孔加入45微升反应终止液。
6)使用迁移率变动实验(可以使用Caliper EZ Reader II来读取反应信号，也可以使用凝胶电泳和凝胶成像仪来分析实验结果)测量底物的转化率并计算化合物的半数抑制浓度(IC50)。
图1为制备多肽的HPLC分析图；图2为制备多肽的质谱分析图；图3为检测化合物的半数抑制浓度(IC50)分析图。
序列表
<110>辉源生物科技(上海)有限公司
<120>荧光标记多肽及其制备方法和应用
<160>1
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
TSRHK(Ac)-CONH2

Claims (3)

1.一种荧光标记多肽，其氨基酸序列为TSRHK(Ac)-CONH2，该氨基酸序列第五位赖氨酸残基上的乙酰基团可被组蛋白去乙酰化酶识别并切除。
2.如权利要求1所述的荧光标记多肽的制备方法，其特征在于：包括以下顺序进行的步骤：
A、取Fmoc-Lys(Ac)-Rink酰胺4-甲基二苯甲胺树脂（Fmoc-Lys(Ac)-RinkAmide-MBHA Resin）置于反应容器中，以N,N-二甲基甲酰胺溶胀树脂，然后用脱保护液反应2次后，抽出脱保护液；
B、依次向反应容器中加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-His(trt)-OH、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑和N,N-二异丙基乙胺，振荡反应；然后抽出反应液，再用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；
C、向反应容器中加入脱保护液反应2次，然后抽出脱保护液，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；
D、依次向反应容器中加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑和N,N-二异丙基乙胺，振荡反应，然后抽出反应液，再用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；
E、向反应容器中加入脱保护液振荡反应2次，然后抽出脱保护液，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；
F、依次向反应容器中加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser(Boc)-OH、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑和N,N-二异丙基乙胺，振荡反应，然后抽出反应液，再用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；
G、向反应容器中加入脱保护液振荡反应2次，然后抽出脱保护液，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；
H、依次向反应容器中加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Thr(tBu)-OH、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑和N,N-二异丙基乙胺，振荡反应，然后抽出反应液，再用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；
I、向反应容器中加入脱保护液振荡反应2次，然后抽出脱保护液，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；
J、依次向反应容器中加入N,N-二甲基甲酰胺、5-FAM、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑和N,N-二异丙基乙胺，振荡反应，然后抽出反应液，再用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽出洗涤液，即得到存在于洗涤液中的荧光标记多肽，洗涤液中的荧光标记多肽再通过C18反相柱利用HPLC分离提纯得到荧光标记多肽产品。
3.根据权利要求2所述的荧光标记多肽的制备方法，其特征在于：所述的脱保护液为含有20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液。
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