CN102911999A

CN102911999A - 用普鲁士蓝平板定量测定l-氨基酸氧化酶活力的方法

Info

Publication number: CN102911999A
Application number: CN2012102846186A
Authority: CN
Inventors: 余志良; 周宁; 裘娟萍
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: SHANGHAI BAILANG BIOTECHOLOGY
Priority date: 2012-08-10
Filing date: 2012-08-10
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2032-08-10
Also published as: CN102911999B

Abstract

本发明公开了一种利用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法：用打孔器在普鲁士蓝琼脂平板上打出直径为4~10mm的小孔，然后将小孔中加入待测液，室温静置10~300min，待测液产生的过氧化氢在所述的小孔周围形成蓝色圈，测定蓝色圈的直径，根据过氧化氢与蓝色圈直径制作的标准直线来确定过氧化氢释放量，从而推论得L-氨基酸氧化酶活力；所述待测液以交替假单胞菌B3（Pseudoalteromonas sp.B3）发酵培养获得的酶为酶源，以L-氨基酸为底物，25～50℃，pH为5～9条件下反应0.5～2h，获得的反应液即为待测液；本发明方法具有成本低，操作简单方便，适用性广，稳定性高等特点。

Description

用普鲁士蓝平板定量测定L-氨基酸氧化酶活力的方法

（一）技术领域

本发明涉及L-氨基酸氧化酶活力测试方法，特别涉及一种利用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法。

（二）背景技术

L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase,简称LAAO，酶学编号为：EC1.4.3.2)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或单核苷酸(FMN)为辅基的黄素蛋白酶。此酶能够特异性催化L-氨基酸的氧化脱氨生成α-酮酸、氨和过氧化氢。因此，它能被应用于L-氨基酸定量分析、LD-氨基酸的拆分和α-酮酸的制备。近年来有文献报道了LAAO本身具有抗菌、杀虫、抗病毒等生物活性，还具有与血小板相互作用、细胞毒性及诱导细胞凋亡的作用，其在生物医药领域具有极其广阔的应用前景。

LAAO被发现广泛存在于微生物、蛇毒、鱼的表皮粘液、老鼠、海兔子等多种生物体中。目前检测LAAO活性的常用方法有2种，即荧光法和分光光度法。这2种方法均是依据测定由LAAO催化底物所生成的H₂O₂变化量来实现的。荧光法是依据酶促反应产生的H₂O₂可使无荧光性的高香草酸等物质转变为有强烈荧光的物质，根据反应体系荧光值的变化来测定LAAO酶活。此方法虽然测定精确度、灵敏度都较高，但荧光寿命短，容易淬灭，操作时需避免长时间暴露于光和空气中，而且蛋白质中某些氨基酸对其干扰较大。分光光度法是依据酶促反应产生的H₂O₂可作用于色素原物质而使其在一定波长下产生吸光值，根据反应体系吸光值的变化来测定LAAO酶活。此方法对设备要求低，反应快，操作简单，重复性好，且价格便宜，具有明显的优势，因此分光光度法是目前测定LAAO活性的最常用方法。MacHeroux等（MacHeroux P,Seth O,Bollschweiler C,et al. L-Amino acid oxidase from the Malayan pit viper Calloselasma rhodostoma.Comparative sequence analysis and charaterization of active and inactive forms ofthe enzyme.Eur J Biochem,2001,268:1679-1686.）以邻联茴香胺（ODA）为偶联探针，用分光光度法测定不同蛇毒LAAO的活性。结果表明，测定方法具有较好的稳定性。陈洲等（陈洲,黄剑钧,薛玲,等.眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶活性检测方法的优化.海峡药学,2009,21(5):29-31.）采用邻联茴香胺、邻苯二胺(OPD)和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)三种供氢体测定LAAO的活性并比较其灵敏度和重复性，结果表明邻苯二胺方法测定LAAO酶活性具有较好的灵敏度和稳定性。以上的这些方法主要是用来定性地检测LAAO，而建立一种既简单、经济、稳定和灵敏，又能定性并定量检测LAAO活力的方法，将具有极重要的研究和应用价值。目前，定性及定量检测LAAO的方法主要是商品化的H₂O₂检测试剂盒，如美国Invitrogen公司的Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay kit。发明专利（余志良、乔华、裘娟萍.交替假单胞菌B3及其在生物氧化L-氨基酸中的应用.申请号：201110336029.3；申请日期：2011-10-28.）也用Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay kit试剂盒筛选到一株产LAAO的交替假单胞菌B3（菌种保藏号为：CGMCC NO.5353）。虽然，该试剂盒比较灵敏、稳定，被广泛使用，但是，其对设备要求高，操作复杂，价格极其昂贵（每个反应大约要几十元人民币）。

2007年，Saito等（Saito M,et al.A Noval Agar Medium to Detect Hydrogen Peroxide-Producing Bacteria Based on the Prussion Blue-Forming Reaction.Microbiol Immunol,2007,51(9):889-892.）创建了一种新的简易的检测H₂O₂的方法来运用于检测LAAO，即普鲁士蓝琼脂平板法（Prussian Blue Agar），该方法是基于Fe³⁺和铁氰化钾混合液与H₂O₂通过氧化还原反应产生蓝色沉淀的原理检测LAAO，能够产生H₂O₂的菌株培养在含有该混合液的培养基上能产生蓝色菌落，不能产生H₂O₂的菌株则不会产生蓝色菌落而只表现其原本的形态特征，通过菌落颜色的改变可以判断出菌株是否能够产生LAAO，而且该Fe³⁺和铁氰化钾混合液对于培养基的种类没有严格的限制与要求，可以与所需的培养基进行混合培养，具有广泛的适用性，而且，该方法极其方便、简单和经济。Saito等只建立了一种定性分析LAAO的方法，如何将其发展成为一种定量的LAAO活力检测方法，显得极为重要。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法，以及所述方法的pH适用性，该方法具有成本低，操作简单方便，适用性广，稳定性高等特点。

本发明采用的技术方案是：

用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法为：（1）普鲁士蓝琼脂平板的制备：将10~30g/L氯化铁水溶液与10~30g/L铁氰化钾水溶液以体积比0.2~6:1混合制成混合液，然后将混合液与MM琼脂液以体积比1:5~20混合摇匀，在115℃下灭菌30min，倒平板，制成所述普鲁士蓝琼脂平板；所述MM琼脂液终浓度组成为：酵母膏0～10g/L、蛋白胨2～20g/L、琼脂15～30g/L，pH 5～9，溶剂为水；（2）L-氨基酸氧化酶活力的测定：取步骤(1)制得的普鲁士蓝琼脂平板，用打孔器在所述普鲁士蓝琼脂平板上打出直径为4~10mm的小孔，然后将小孔中加入待测液，室温静置10~300min，待测液产生的过氧化氢在所述的小孔周围形成蓝色圈，测定蓝色圈的直径，根据过氧化氢与蓝色圈直径标准直线来确定过氧化氢释放量，从而推论得L-氨基酸氧化酶活力；所述的过氧化氢与蓝色圈直径的标准直线是用步骤(2)同样的普鲁士蓝琼脂平板以梯度浓度的标准过氧化氢为测试样品做与待测液平行试验取得的数据得到的标准浓度的过氧化氢与蓝色圈直径线性关系图；所述待测液的制备方法为：以交替假单胞菌B3（Pseudoalteromonas sp.B3）发酵培养获得的酶为酶源，以待测L-氨基酸为底物，25～50℃，pH 5～9条件下反应0.5～2h，获得的反应液即为待测液；所述酶来自于交替假单胞菌B3发酵培养后获得的含湿菌体发酵液离心弃去沉淀后获得的上清液，所述L-氨基酸初始底物浓度为2～20mmol/L，所述上清液用量以含湿菌体发酵液中湿菌体质量计为0.5～10mg湿菌体/mmol底物，所述含湿菌体发酵液是指离心前的含湿菌体发酵液；所述L-氨基酸氧化酶活力的定义为：30℃下，1mL酶液作用底物浓度为5mmol/L的氨基酸1h后释放出1mmol/L过氧化氢即为1个酶活单位（U）。

进一步，所述氯化铁水溶液优选为15~25g/L，更优选为20g/L；铁氰化钾水溶液的质量浓度优选为15~25g/L，更优选为20g/L。

进一步，所述氯化铁水溶液和铁氰化钾水溶液的体积配比优选为0.4～2.5:1，更优选为1:1。

进一步，所述MM琼脂液终浓度组成优选为：酵母膏2～5g/L、蛋白胨3～7g/L、琼脂18～25g/L，pH 6～8，溶剂为水；所述MM琼脂液终浓度组成更优选为酵母膏3g/L、蛋白胨5g/L、琼脂20g/L，pH 7.5，溶剂为水。

进一步，所述氯化铁水溶液和铁氰化钾水溶液的混合液与MM琼脂液体积配比优选为1:7~15，更优为1:9。

进一步，所述打孔器打出小孔的直径优选为5~7mm，更优选为6mm。

进一步，所述每孔中加入的待测液为30～70μL，更优选为50μL。

进一步，所述小孔加入待测液后室温静置15~60min，更优选为30min。

进一步，所述L-氨基酸为L-亮氨酸(L-Leu)、L-精氨酸(L-Arg)、L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-赖氨酸(L-Lys)、L-胱氨酸(L-cystine)、L-色氨酸(L-Trp)、 L-甲硫氨酸(L-Met)、L-异亮氨酸(L-Ile)、L-天冬酰胺(L-Asn)、L-高苯丙氨酸(L-Hpa)、L-酪氨酸(L-Tyr)、L-苯甘氨醇(L-Phg)、L-天冬氨酸(L-Asp)、L-谷氨酸(L-Glu)、L-半胱氨酸(L-Cys)、L-缬氨酸(L-Val)、L-脯氨酸(L-Pro)、L-甘氨酸(L-Gly)、L-丝氨酸(L-Ser)和β-丙氨酸(β-Ala)，优选为L-亮氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸、L-胱氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-天冬酰胺、L-高苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-苯甘氨醇或L-缬氨酸。

进一步，所述酶源按如下步骤制备：（1）斜面培养：将交替假单胞菌B3接种于斜面培养基（即MM固体培养基），20～37℃培养12～24h，获得斜面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为：酵母膏1.5～6g/L，蛋白胨2.5～10g/L，海盐15～45g/L，琼脂15～25g/L，pH 7～8，溶剂为水；（2）种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌株接种至种子培养基（即MM液体培养基），20～37℃培养18～24h，获得种子液，所述种子培养基终浓度组成为：酵母膏1.5～6g/L，蛋白胨2.5～10g/L，海盐15～45g/L，pH 7～8，溶剂为水；（3）发酵培养：将种子液以体积浓度1～10%的接种量接种至发酵培养基（即MM液体培养基），20～37℃培养48～120h，获得发酵液，将发酵液经8000～12000rpm，离心5～10min后，弃去沉淀，收集上清液，获得所述酶源；所述发酵培养基终浓度组成为：酵母膏1.5～6g/L，蛋白胨2.5～10g/L，海盐15～45g/L，pH 7～8，溶剂为水。

更进一步，所述的交替假单胞菌B3产LAAO活力的测定方法为：（1）普鲁士蓝琼脂平板的制备：将20g/L氯化铁水溶液与20g/L铁氰化钾水溶液以体积比1:1混合制成混合液，然后将混合液与MM琼脂液以体积比1:9混合摇匀，在115℃下灭菌30min，倒平板，制成所述普鲁士蓝琼脂平板，用打孔器在上述普鲁士蓝琼脂平板上打出直径为6mm的小孔；所述MM琼脂液终浓度组成为：酵母膏3g/L、蛋白胨5g/L、琼脂20g/L，pH 6.8，溶剂为水；（2）L-氨基酸氧化酶活力的测定为：以交替假单胞菌B3发酵培养后的含湿菌体发酵液离心获得的上清液为酶源，以待测L-氨基酸为底物，在30℃，pH7.0的条件下反应30min，使L-氨基酸氧化释放出过氧化氢，获得反应液，即为待测液；取50μL反应液加入到上述普鲁士蓝琼脂平板的6mm小孔，室温放置30min后，待测液产生的过氧化氢在所述的小孔周围形成蓝色圈，测定蓝色圈的大小，根据过氧化氢与蓝色圈直径标准直线来确定过氧化氢释放量，从而推论得L-氨基酸氧化酶活力；所述待测液的制备方法为：以交替假单胞菌B3（Pseudoalteromonas sp.B3）发酵培养获得的酶为酶源，以待测L-氨基酸为底物，25～50℃，pH 5～9条件下反应0.5～2h，获得的反应液即为待测液；所述酶来自于交替假单胞菌B3发酵培养后获得的含湿菌体发酵液离心弃去沉淀后获得的上清液，所述L-氨基酸初始底物浓度为5mmol/L，所述上清液用量以含湿菌体发酵液中湿菌体质量计为4mg湿菌体/mmol底物。

本发明中菌株B3所产生的L-氨基酸氧化酶是被分泌到细胞外的，因此，交替假单胞菌B3发酵培养后获得的含湿菌体发酵液离心后去除菌体，获得的上清液中含有酶，即酶源。所以本发明中以交替假单胞菌B3发酵液离心后获得的上清液而不是湿菌体来进行酶促反应。所述上清液的用量以离心前含湿菌体发酵液中湿菌体的质量来计。

所述的过氧化氢浓度与蓝色圈直径大小的标准曲线制作及方程拟合过程为：配置浓度为0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、25mmol/L和30mmol/L的过氧化氢标准水溶液；各取50μL以上不同浓度的过氧化氢水溶液，加入到普鲁士蓝琼脂平板的6mm小孔中，室温放置30min后，测定蓝色圈的大小；以过氧化氢浓度为横坐标（X），蓝色圈直径为纵坐标（Y），用Origin作图软件绘制直线；由Origin软件自动拟合出X-Y之间的关系方程式Y=0.561X+1.068，其中R²=0.993。

交替假单胞菌B3（Pseudoalteromonas sp.B3），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为：CGMCC NO.5353，保藏日期为2011年10月17日。所述交替假单胞菌B3已在先前的专利申请中进行了保藏，申请号为2011103360293。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法，以及所述方法的pH适用性为pH4~12，该方法具有成本低，操作简单方便，适用性广，稳定性高等特点。

（四）附图说明

图1pH对过氧化氢作用下普鲁士蓝琼脂显色的影响；

图2不同浓度过氧化氢作用下普鲁士蓝琼脂平板的蓝色圈大小；

图3过氧化氢浓度和普鲁士蓝琼脂平板的蓝色圈直径之间的拟合曲线及所拟合的方程式；

图4过氧化氢浓度和普鲁士蓝琼脂平板的蓝色圈直径之间的标准直线及所拟合的方程式；

图5交替假单胞菌B3所产LAAO对L-Leu和L-Met的活力；

图6交替假单胞菌B3所产LAAO对20种常见氨基酸活力大小的比较。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1普鲁士蓝琼脂平板的制备

称取1g的FeCl₃·6H₂O溶于50mL的水中，配置成溶液A；称取1g的铁氰化钾（赤血盐，K₃Fe(CN)₆）溶于50mL的水中，配置成溶液B；将50mL的溶液A和50mL的溶液B混合摇匀，配成溶液C；配置900mL的MM琼脂液(酵母膏3g/L,蛋白胨5g/L，琼脂20g/L，pH 7.2，溶剂为水)，然后将100mL的溶液C与900mL的MM琼脂液混合摇匀，于115℃下灭菌30min后，倒入培养皿配置普鲁士蓝琼脂平板50块；待琼脂冷却凝固后，用打孔器在普鲁士蓝琼脂平板上打出直径为6mm的小孔（平板往往略显浅绿色）。所述MM琼脂液终浓度组成更优选为酵母膏3g/L、蛋白胨5g/L、琼脂20g/L，pH 7.5，溶剂为水。

实施例2过氧化氢于不同pH值下对普鲁士蓝琼脂显色性能的影响

（1）用6N的HCl水溶液和6N的NaOH水溶液分别配制pH为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14的水溶液，用移液器分别移取50μL的上述pH1～14的水溶液，分别转入实施例1方法制备的普鲁士蓝琼脂平板的小孔内（直径6mm），室温（25℃）放置30min后观察普鲁士蓝琼脂显色结果，见图1第1行所示。

从图1第1行可见，pH4情况下，普鲁士蓝琼脂平板产生一个蓝色小圈，随着pH的下降，蓝色圈变大，说明普鲁士蓝琼脂对pH4及以下pH值比较敏感；在pH5～8情况下，普鲁士蓝琼脂平板没有颜色变化；而在pH9～14情况下，有白偏黄的圈产生，这是因为在碱性条件下，平板中的三价铁与氢氧根离子形成沉淀所致，随着pH的增加，白偏黄的圈变大。

（2）用水配制浓度为5mmol/L的过氧化氢水溶液（pH均为6），分别取50μL，转入实施例1方法制备的普鲁士蓝琼脂平板的小孔内（直径6mm），室温放置30min后观察普鲁士蓝琼脂显色结果（图1第2行所示），从图1第2行可见，14个小孔周围均形成了大小基本一致的蓝色圈，这是因为在过氧化氢作用下，铁氰化钾中的Fe^Ⅲ(CN)₆ ^3-变成了Fe^Ⅱ(CN)₆ ^4-，然后与FeCl₃中的Fe³⁺作用，形成了蓝色物质Fe^Ⅲ _4[Fe^Ⅱ(CN)₆]₃，普鲁士蓝琼脂可被用来检测过氧化氢。

（3）用6N的HCl水溶液和6N的NaOH水溶液混合水溶液调节过氧化氢水溶液的pH值分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14，并使过氧化氢水溶液的终浓度为5mmol/L，依次取50μL，转入实施例1方法制备的普鲁士蓝琼脂平板的小孔内（直径6mm），室温放置30min后观察普鲁士蓝琼脂显色结果（图1第3行所示），从图1第3行可见，当pH为4～12情况下，普鲁士蓝琼脂平板上均形成了大小基本一致的蓝色圈，这是因为在过氧化氢作用下形成了蓝色物质Fe^Ⅲ ₄[Fe^Ⅱ(CN)₆]₃；而在pH为1～3情况下，低pH值的背景干扰较大，影响对过氧化氢的检测；虽然在pH为13下，也形成了蓝色圈，但是，圈相对较小；而在pH为14下，没有形成蓝色圈，不能检测过氧化氢；综上可见，在pH为4～12情况下，普鲁士蓝琼脂平板能被用来检测过氧化氢。

实施例3不同过氧化氢浓度下的普鲁士蓝琼脂平板上的蓝色圈直径大小

用水分别配制浓度为0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、25mmol/L和30mmol/L的过氧化氢标准溶液（pH约为6），各取50μL，转入实施例1方法制备的普鲁士蓝琼脂平板的6mm直径小孔内（每个过氧化氢浓度做三个平行），室温放置30min后观察普鲁士蓝琼脂显色结果（图2所示）。从图2可见，不同浓度过氧化氢作用下，普鲁士蓝琼脂平板均形成了蓝色圈，实验的平行性较理想；而且，随着过氧化氢浓度的增加，蓝色圈直径随之增加；当过氧化氢浓度达到20mmol/L，蓝色圈直径基本达到最大，进一步增加过氧化氢浓度，蓝色圈直径基本不再变化。用尺量取不同过氧化氢浓度下蓝色圈大小（平行实验取平均值），见表1所示。

以过氧化氢浓度为横坐标，普鲁士蓝琼脂平板的蓝色圈直径为纵坐标，用Origin作图软件拟合曲线，结果如图3所示，拟合曲线呈现指数形式；用作图软件自带工具进行方程式拟合后发现，方程式为Y=2.451-2.047/(1+(X/4.571)^0.491)，其中R²=0.992，说明拟合良好。在过氧化氢浓度为0.5～20mmol/L范围内，以过氧化氢浓度的对数值为横坐标（即X为lgC，C为过氧化氢浓度），普鲁士蓝琼脂平板的蓝色圈直径为纵坐标（Y），用Origin作图软件拟合标准直线，结果如图4所示，用作图软件自带工具进行方程式拟合后发现，方程式为Y=0.561X+1.068，其中R²=0.993，说明线性关系良好。综上可见，在过氧化氢浓度为0.5～20mmol/L范围内，过氧化氢浓度与普鲁士蓝琼脂平板的蓝色圈直径有较好的对应关系，两者呈现较好的指数关系；尤其是在过氧化氢浓度为0.5～20mmol/L范围内，过氧化氢浓度的对数值与普鲁士蓝琼脂平板的蓝色圈直径大小有较好线性关系。过氧化氢浓度大小可以通过普鲁士蓝琼脂平板上蓝色圈直径大小来度量。

表1.不同过氧化氢浓度下蓝色圈直径大小

实施例4以L-Leu和L-Met为底物时交替假单胞菌B3所产LAAO的活力

（1）斜面培养：将交替假单胞菌B3接种于斜面培养基，25℃培养18h，获得斜面菌体（MM固体培养基），所述斜面培养基终浓度组成为：酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海盐30g/L，琼脂20g/L，pH 7.2，溶剂为水；（2）种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌株接种至种子培养基（MM液体培养基），25℃培养24h，获得种子液，所述种子培养基终浓度组成为：酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海盐30g/L，pH 7.2，溶剂为水；（3）发酵培养：将种子液以体积浓度10%的接种量接种至发酵培养基（MM液体培养基），25℃培养120h，获得发酵液，将发酵液经12000rpm，离心5min后，收集上清液，所述发酵培养基终浓度组成为：酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海盐30g/L，pH 7.2，溶剂为水；（4）生物氧化及测定：分别取3mL上述发酵上清液作为酶液（湿菌体浓度：1mg/mmol底物），分别与3mL的10mmol/L的L-亮氨酸（L-Leu）和3mL的10mmol/L的L-甲硫氨酸（L-Met）在温度30℃，pH7.0，反应30min，使L-氨基酸被氧化释放出过氧化氢，分别获得反应液；分别取50μL反应液加入到实施例1方法制备的普鲁士蓝琼脂平板的6mm小孔内，室温放置30min后，测定蓝色圈的大小，结果如图5所示。

当底物为L-Leu时（左边第1孔），蓝色圈直径为1.19（D=1.19），代入实施例3中所拟合的直线方程式（图4所示），可求出所产生的过氧化氢浓度约为1.65mmol/L；用浓度为1.65mmol/L的标准过氧化氢溶液按实施例3方法进行普鲁士蓝琼脂平板显色实验进行验证，结果如图5（左边第2孔）所示，蓝色圈直径为1.19（D=1.19），说明普鲁士蓝琼脂平板能准确反映实验结果，也就是当以终浓度5mmol/L的L-Leu为底物时，交替假单胞菌B3所产LAAO的活力为1.1U。

当底物为L-Met时，蓝色圈直径为1.15（D=1.15）（左边第3孔），代入实施例3中所拟合的直线方程式（图4所示），可求出所产生的过氧化氢浓度约为1.40mmol/L；用浓度为1.40mmol/L的标准过氧化氢溶液按实施例3方法进行普鲁士蓝琼脂平板显色实验进行验证，结果如图4（最右边孔）所示，蓝色圈直径为1.16（D=1.16），与理论只有0.01（1.16-1.15=0.01）的偏差，说明普鲁士蓝琼脂平板能较准确反映实验结果，也就是当以5mmol/L的L-Met为底物时，交替假单胞菌B3所产LAAO的活力为0.933U。

实施例5交替假单胞菌B3所产LAAO对20种常见氨基酸活力大小的比较

分别以L-亮氨酸(L-Leu)、L-精氨酸(L-Arg)、L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-赖氨酸(L-Lys)、L-胱氨酸(L-cystine)、L-色氨酸(L-Trp)、L-甲硫氨酸(L-Met)、L-异亮氨酸(L-Ile)、L-天冬酰胺(L-Asn)、L-高苯丙氨酸(L-Hpa)、L-酪氨酸(L-Tyr)、L-苯甘氨醇(L-Phg)、L-天冬氨酸(L-Asp)、L-谷氨酸(L-Glu)、L-半胱氨酸(L-Cys)、L-缬氨酸(L-Val)、L-脯氨酸(L-Pro)、L-甘氨酸(L-Gly)、L-丝氨酸(L-Ser)和β-丙氨酸(β-Ala)为底物，按实施例4所述方法，用交替假单胞菌B3发酵上清液进行生物氧化反应，释放过氧化氢后，取各自反应液用普鲁士蓝琼脂平板检测蓝色圈大小，比较交替假单胞菌B3所产LAAO对20种常见氨基酸活力的大小，以浓度为0.5、1、2、5、10和20mM的过氧化氢标准水溶液作为阳性对照（即直接以过氧化氢标准溶液替代反应液），以CK1和CK2（即不加氨基酸底物的交替假单胞菌B3发酵上清液代替反应液）作阴性对照，结果如图6所示。

图6可以看出，如阳性对照（浓度为0.5mM～20mM的过氧化氢标准溶液，即第1行）所示，当以L-Leu、L-Lys、L-Phe、L-Asn、L-cystine、L-Met、L-Trp、L-Ile、L-Tyr、L-Arg、L-Hpa、L-Phg和L-Val为底物时，普鲁士蓝琼脂平板上均形成蓝色圈，说明交替假单胞菌B3所产LAAO对这些氨基酸有氧化活力，产生了过氧化氢而被普鲁士蓝琼脂平板所检测到；同时，可以看到，以不同氨基酸为底物，在普鲁士蓝琼脂平板上所形成蓝色圈的大小不一样，说明交替假单胞菌B3所产LAAO对这些氨基酸的氧化活力不同，根据蓝色圈大小可以看出，LAAO作用氨基酸的氧化活力高低依次为：L-Leu>L-Lys≈L-Phe≈L-Asn>L-Trp>L-Met>L-Arg≈L-Ile≈L-Tyr>L-cystine>L-Hpa>L-Phg>L-Val。在平板上还可以看出，如阴性对照（CK1和CK2，即不加氨基酸底物的交替假单胞菌B3发酵上清酶液）所示，当以L-Glu、L-Asp、L-Cys、L-Pro、L-Gly、L-Ser和β-Ala为底物时，没有形成蓝色圈，说明交替假单胞菌B3所产LAAO对这些氨基酸没有氧化活性。

Claims

1.用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述方法为：（1）普鲁士蓝琼脂平板的制备：将10~30g/L氯化铁水溶液与10~30g/L铁氰化钾水溶液以体积比0.2~6:1混合制成混合液，然后将混合液与MM琼脂液以体积比1:5~20混合摇匀，在115℃下灭菌30min，倒平板，制成所述普鲁士蓝琼脂平板；所述MM琼脂液终浓度组成为：酵母膏0～10g/L、蛋白胨2～20g/L、琼脂15～30g/L，pH 5～9，溶剂为水；（2）L-氨基酸氧化酶活力的测定：取步骤(1)制得的普鲁士蓝琼脂平板，用打孔器在所述普鲁士蓝琼脂平板上打出直径为4~10mm的小孔，然后将小孔中加入待测液，室温静置10~300min，待测液产生的过氧化氢在所述的小孔周围形成蓝色圈，测定蓝色圈的直径，根据过氧化氢与蓝色圈直径标准直线来确定过氧化氢释放量，从而推论得L-氨基酸氧化酶活力；所述的过氧化氢与蓝色圈直径的标准直线是以所取用步骤(2)同样的普鲁士蓝琼脂平板以梯度浓度的标准过氧化氢为测试样品做与待测液平行试验取得的数据得到的标准浓度的过氧化氢与蓝色圈直径线性关系图；所述待测液的制备方法为：以交替假单胞菌B3（Pseudoalteromonas sp.B3）发酵培养获得的酶为酶源，以待测L-氨基酸为底物，25～50℃，pH 5～9条件下反应0.5～2h，获得的反应液即为待测液；所述酶来自于交替假单胞菌B3发酵培养后获得的含湿菌体发酵液离心弃去沉淀后获得的上清液，所述L-氨基酸初始底物浓度为2～20mmol/L，所述上清液用量以含湿菌体发酵液中湿菌体质量计为0.5～10mg湿菌体/mmol底物；所述L-氨基酸氧化酶活力的定义为：30℃下，1mL酶液作用底物浓度为5mmol/L的L-氨基酸1h后释放出1mmol/L过氧化氢即为1个酶活单位（U）。

2.如权利要求1所述利用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述氯化铁水溶液的质量浓度均为15~25g/L，所述铁氰化钾水溶液的质量浓度为15~25g/L。

3.如权利要求1所述利用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述氯化铁水溶液和铁氰化钾水溶液的体积配比为0.4~2.5:1，所述氯化铁水溶液和铁氰化钾水溶液的混合液与MM琼脂液体积配比为1:7~15。

4.如权利要求1所述利用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述MM琼脂液终浓度组成为：酵母膏2～5g/L、蛋白胨3～7g/L、琼脂18～25g/L，pH 6～8，溶剂为水。

5.如权利要求1所述利用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述打孔器打出小孔的直径为5~7mm。

6.如权利要求1所述利用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述每孔中加入的待测液为30～70μL。

7.如权利要求1所述利用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述小孔加入待测液后室温静置15~60min。

8.如权利要求1所述利用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述L-氨基酸为L-亮氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸、L-胱氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-天冬酰胺、L-高苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-苯甘氨醇或L-缬氨酸。

9.如权利要求1所述利用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述的方法按如下步骤进行：（1）普鲁士蓝琼脂平板的制备：将20g/L氯化铁水溶液与20g/L铁氰化钾水溶液以体积比1:1混合制成混合液，然后将混合液与MM琼脂液以体积比1:9混合摇匀，在115℃下灭菌30min，倒平板，制成所述普鲁士蓝琼脂平板，用打孔器在上述普鲁士蓝琼脂平板上打出直径为6mm的小孔；所述MM琼脂液终浓度组成为：酵母膏3g/L、蛋白胨5g/L、琼脂20g/L，pH 6.8，溶剂为水；（2）L-氨基酸氧化酶活力的测定为：以交替假单胞菌B3发酵培养后的含湿菌体发酵液离心获得的上清液为酶源，以待测L-氨基酸为底物，在30℃，pH7.0的条件下反应30min，使L-氨基酸氧化释放出过氧化氢，获得反应液，即为待测液；取50μL反应液加入到步骤（1）制备的普鲁士蓝琼脂平板的小孔内，室温放置30min后，待测液产生的过氧化氢在所述的小孔周围形成蓝色圈，测定蓝色圈的大小，根据过氧化氢与蓝色圈直径标准直线来确定过氧化氢释放量，从而推论得L-氨基酸氧化酶活力；所述待测液的制备方法为：以交替假单胞菌B3（Pseudoalteromonas sp.B3）发酵培养获得的酶为酶源，以待测L-氨基酸为底物，25～50℃，pH 5～9条件下反应0.5～2h，获得的反应液即为待测液；所述酶来自于交替假单胞菌B3发酵培养后获得的含湿菌体发酵液离心弃去沉淀后获得的上清液，所述L-氨基酸初始底物浓度为5mmol/L，所述上清液用量以含湿菌体发酵液中湿菌体质量计为4mg湿菌体/mmol底物。

10.如权利要求1所述利用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述酶源按如下步骤制备：（1）斜面培养：将交替假单胞菌B3接种于斜面培养基，20～37℃培养12～24h，获得斜面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为：酵母膏1.5～6g/L，蛋白胨2.5～10g/L，海盐15～45g/L，琼脂15～25g/L，pH 7～8，溶剂为水；（2）种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌株接种至种子培养基，20～37℃培养18～24h，获得种子液，所述种子培养基终浓度组成为：酵母膏1.5～6g/L，蛋白胨2.5～10g/L，海盐15～45g/L，pH 7～8，溶剂为水；（3）发酵培养：将种子液以体积浓度1～10%的接种量接种至发酵培养基，20～37℃培养48～120h，获得发酵液，将发酵液经8000～12000rpm，离心5～10min后，弃去沉淀，收集上清液，获得所述酶源；所述发酵培养基终浓度组成为：酵母膏1.5～6g/L，蛋白胨2.5～10g/L，海盐15～45g/L，pH 7～8，溶剂为水。