CN102901830B

CN102901830B - 高通量微流控芯片检测系统的构建方法

Info

Publication number: CN102901830B
Application number: CN201210388831.1A
Authority: CN
Inventors: 郑晓冬; 殷赟; 沙莎; 高晓莲; 周小川; 余挺
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-10-15
Filing date: 2012-10-15
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2032-10-15
Also published as: CN102901830A

Abstract

本发明公开了一种高通量微流控芯片检测系统的构建方法，主要由抗体与核苷酸交联、抗体—核苷酸交联体与微流控芯片作用，荧光二抗与微流控芯片作用等3个流程组成。抗体与核苷酸交联主要包括：抗体的修饰与脱盐、核苷酸的修饰与脱盐、修饰后抗体与核苷酸的交联与纯化等步骤；抗体—核苷酸交联体与高通量微流控芯片作用主要包括：芯片洗脱、解链、封闭、交联体与芯片反应、洗脱等步骤；荧光二抗与微流控芯片作用包括：Cy3标记二抗与芯片上已经连接的交联体抗体部分的特异性反应以及随后的洗脱、扫描、解链等步骤。

Description

高通量微流控芯片检测系统的构建方法

技术领域

本发明涉及一种基于抗体与核苷酸交联的高通量微流控芯片检测系统的构建方法。

背景技术

尽管基因芯片的研究已取得了很大进展，但仍有报道表明，其结果不适用于生命过程中真实蛋白性状的表达。随着蛋白组学概念的提出，及蛋白质作为生物活动的最终表现形式，能直接真实地反应研究结果，人们需要一种高通量分析蛋白的技术进行深入研究，蛋白芯片技术就这样应运而生。

蛋白芯片作为生命科学领域的一种新兴技术，如今已在食品卫生检疫、医学诊断、新药研制等方面得到越来越广泛的应用。而在生物样本量较少的情况下，蛋白芯片更是发挥了巨大的作用，能够同时并行检测多个指标。然而蛋白质作为生物大分子的不稳定性，蛋白芯片在发展过程中遇到了瓶颈。

蛋白芯片的制作方法主要分为两类：直接点样法和微流控法。点样法顾名思义，主要采用芯片点样仪将特异性蛋白在芯片基质上进行微阵列排列，然后点上检测样品反应，最后对反应结果进行扫描。这种方法可以比较简便地实现高通量的要求，但是其反应在基质表面进行，受外界环境影响大，容易破坏蛋白质的空间构象，使其在检测之前就变性失活，灵敏度低，更无法长期保存。

微流控法使蛋白质的特异性反应在液体环境中进行，整个系统包括泵、封闭的反应腔、流路等，负责微量流体的传感、输送、检测和控制。反应结果通常由微流控系统中的扫描仪进行定量、全面的分析。微流控法具有相当优势：长期有效，不易污染，即有效解决了抗体降解和表面沉淀问题；检测样品用量很小；全面检测和分析；应用范围广泛，可以用于卫生检疫、药物研制等各个方面。但是缺点在于，由于微流控芯片通路有限，其高通量的实现有一定难度，一般通量仅为1~2。

核苷酸与蛋白的交联技术已经较为成熟，但人们对于该领域的研究主要集中于Immuno-PCR领域，该技术基于蛋白的免疫反应，通过核苷酸与蛋白的交联，最后以PCR方法扩大免疫反应的信号，增强检测灵敏度，如Ruzicka于1992年在science上的报道。本发明首次将此类交联体用于高通量的微流体系统，而在微流控系统中使用交联体将高通量的microRNA芯片转换为高通量的抗体芯片是本发明的主要创新点。Kozlov等在2004年报道了通过腙键交联的核苷酸与蛋白交联体具有较高的稳定性。

目前尚没有将交联体运用到微流体芯片的内容被公开发表过。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于抗体与核苷酸交联的高通量微流控芯片检测系统的构建方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种高通量微流控芯片检测系统的构建方法，依次包括以下步骤：

第一步：基于μParaflo^TM微流体生物芯片原位合成若干种(例如为6种)不同序列的单链寡核苷酸，该核酸的3’端与芯片底部相连；

第二步：合成针对若干种(例如为6种)转基因蛋白的抗体-寡核苷酸链复合物探针；包括如下步骤：

1)、准备若干种(例如为6种)转基因作物蛋白的抗体探针；

2)、合成若干种(例如为6种)核酸序列；

3)、对相应抗体和寡核苷酸链进行交联；包括如下步骤：

A、抗体的修饰与脱盐：

将6种抗体分别进行以下操作：

取45~55μg抗体溶液，加入分子截留量为50kDa的超滤膜中，再加入280~320μL的pH7的修饰缓冲液(SoluLink)，离心，至膜上留下的液体为19~21μL，然后用SANH溶液(浓度为6.89×10^-2mol/L，Succinimidyl4-hydrazinonicotinate acetone hydrazone，即，琥珀酰亚胺基4-肼基烟酸盐丙酮腙)修饰，SANH与抗体之间的摩尔比为50~70：1；再放置于24~26℃的摇床中孵育修饰3~5小时；

孵育完后将产物洗涤、离心，以除去多余的作为修饰剂的SANH，用pH 6的交联缓冲液(SoluLink)洗涤，使抗体被置换到交联缓冲液中，然后收集脱盐后的抗体修饰产物(使脱盐后余下的液体体积保持在40~50μL左右)；

B、核苷酸的修饰与脱盐：

用pH 7修饰缓冲液(SoluLink)将核苷酸(即单链DNA)冻干粉配置至8~12mg/mL，然后用SFB溶液(8.094×10^-2mM，Succinimidyl 4-formylbenzoate，即琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯)修饰；SFB与核苷酸之间的摩尔比为50~70：1；放置于24~26℃的摇床中，孵育修饰3~5小时；

孵育完将产物洗涤、离心，以除去多余的SFB修饰剂，再用pH 6交联缓冲液(SoluLink)洗涤，使寡核苷酸被置换到交联缓冲液中，然后离心，收集脱盐后的核苷酸修饰产物；

C、修饰后抗体与核苷酸的交联与纯化：

将修饰成功的脱盐后的核苷酸修饰产物与修饰成功的脱盐后的抗体修饰产物均匀混合，免疫球蛋白与核苷酸的摩尔比为1:8~12；于3~5℃下反应10~14小时；

所得的交联后产物再次纯化，从而除去未交联的多余的核苷酸单体；

D、抗体上残留基团的封闭：

为了避免交联过程中抗体上经修饰但未与核酸进行交联的基团与芯片表面发生反应而产生非特异性结合，交联后进一步对交联体进行基团封闭；

第三步、抗体-核苷酸交联体与微流控芯片作用：

1)、芯片循环系统的清洗：

在使用芯片系统前对芯片循环系统进行清洗；

2)、芯片表面的封闭：

将第一步中生成的芯片置入微流体杂交室中，取6×SSPE缓冲液接入循环体系，循环润洗芯片表面，赶尽芯片中气泡；

再取封闭缓冲液(6×SSPE，25%甲酰胺，1%BSA，pH 6.8)移入样品管，流速80~120μL/分钟，28~32℃循环流经芯片25~35分钟；

封闭缓冲液的制备方法：

①准备6×SSPE缓冲液，调节pH为6.8，

②取75mL上述①所得的调节pH后的6×SSPE缓冲液和25mL甲酰胺混合；

③准备BSA溶液：称取0.2mg的BSA粉末溶于1mL蒸馏水中；

④制备100μL封闭缓冲液：取5μL步骤③所得的BSA溶液加入95μL步骤②所得的溶液，混合；

3)、探针在芯片表面的固定：

将第二步制备的若干种(例如为6种)抗体-寡核苷酸复合物探针以各45~55nM的浓度混合稀释在100μL的封闭缓冲液中，连接入芯片的循环系统，28~32℃下流速15~25μL/分钟循环孵育1.5~2.5h；探针固定反应完成后，用洗涤缓冲液(1：1混合封闭缓冲液和水，0.2%SDS)洗涤芯片表面，从而将芯片表面多余未结合的抗体探针洗去；

上述洗涤缓冲液的制备方法为：将封闭缓冲液和水按照1:1的体积比混合，得混合液，在每500ml的混合液中加入1mg的SDS均匀混合；

4)、完成以上步骤后，得合成的蛋白质芯片。

作为本发明的高通量微流控芯片检测系统的构建方法的改进：

第一步中：

6种探针的序列如下：

A ：3'CAC ACG CCT TTA CGA AGA CGA T 5'；

B ：3'CAG GTC AAA AGG GTC CTT AGG GA 5'；

C ：3'TAG TGT GTT TCC GTT GAA AAC A 5'；

D ：3'TAG TTG TCT GTA ATT AAC CCG CG 5'；

E ：3'AAA CCG TTA CCA TCT TGA GTG TGG C 5'；

F ：3'TTA ACG TGC CAT AGG TAG ACA T 5'；

第二步中：

1)、6种转基因作物蛋白的抗体探针为：(1)Bt Cry1Ac兔单抗；(2)Bt Cry1c兔多抗；(3)Bt Cry1Ab兔单抗；(4)Bt Cry1F兔多抗；(5)大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)兔多抗；(6)新霉素磷酸基转移酶I基因(NPT II)兔单抗。

2)、六种核酸的序列以及待与其交联的抗体种类如下：

a：5'GTG TGC GGA AAT GCT TCT GCT A 3'，抗Cry1Ac兔单抗；

b：5'GTC CAG TTT TCC CAG GAA TCC CT 3'，抗Cry1c兔多抗；

c：5'ATC ACA CAA AGG CAA CTT TTG T 3'，抗Cry1Ab兔单抗；

d：5'ATC AAC AGA CAT TAA TTG GGC GC 3'，抗Cry1F兔多抗；

e：5'TTT GGC AAT GGT AGA ACT CAC ACC G 3'，抗SBTI兔多抗；

f：5'AAT TGC ACG GTA TCC ATC TGT A 3'，抗NPT II兔单抗。

备注说明：序列a与第一步中的A互补，b与B互补，c-C互补，d-D互补，e-E互补，f-F互补。

作为本发明的高通量微流控芯片检测系统的构建方法的进一步改进：

第二步中的修饰后抗体与核苷酸的交联与纯化步骤中：

所得的交联后产物再次纯化，从而除去未交联的多余的核苷酸单体；具体操作为：将交联后产物用pH 8的0.1mM EDTA溶液洗涤、离心，收集纯化后的交联产物(即，纯化后的抗体-核苷酸交联体)。

作为本发明的高通量微流控芯片检测系统的构建方法的进一步改进：第二步中的抗体上残留基团的封闭步骤中：

基团封闭的方法为：向交联体(即纯化后的抗体-核苷酸交联体)中加入4~6倍抗体摩尔量的苯甲醛(2sulfobenzaldehyde)，反应过程具体如下：

取抗体4~6倍摩尔量的2sulfobenzaldehyde(0.5mM)加入交联体溶液中，混匀，36.5~37.5℃避光孵育25~35min；

封闭后脱盐收集，具体如下：

将产物洗涤、离心，以除去多余的封闭试剂，用PBS缓冲液(PH=7.2)洗涤，使交联产物置换到PBS缓冲液中；然后离心，收集。

第三步中：

合成的蛋白质芯片的表面探针分布为：

A1-A6：检Cry1Ac蛋白，

B1-B6:检Cry1c蛋白，

C1-C6:检Cry1Ab蛋白，

D1-D6:检Cry1F蛋白，

E1-E6:检SBTI蛋白，

F1-F6:检NPT II蛋白。

在本发明的第三步中，在使用芯片系统前对芯片循环系统进行清洗是个常规步骤。在微流体杂交室中装入一张旧芯片(非本发明第一步中生成的芯片)，用1mL预热到95℃的洗涤液(1%SDS，以蒸馏水作为溶剂)装入样品管并接入循环系统，40℃下高转速循环清洗30分钟；再用3mL去离子水常温冲洗。接着换用1mL预热到95℃的去离子水，40℃下高转速循环清洗系统10分钟；然后用3mL常温去离子水冲洗。

备注说明：将旧芯片装入微流体杂交窒的目的是接通整个微流体系，这样才能使洗涤液在系统内流动对其进行洗涤。在清洗结束后，将旧芯片取出，将试剂盒中有相应探针合成的芯片置于杂交室内，而后进行下面的后续步骤。

本发明是以腙键交联的核苷酸与蛋白交联体作用微流控芯片，建立高通量的检测系统。

为了在保证蛋白质活性的同时实现多个指标的并行检测，我们必须研制新型的高通量微流控蛋白芯片，完成其检测系统构建。基于抗体与核苷酸交联的高通量微流控芯片检测系统的构建，是将原有的μParaflo^TM mouse microRNA微流控芯片(LC-SCIENCE Inc.提供)，通过互补序列与抗体交联、使交联体被微流控芯片捕获、最后用二抗荧光鉴定的方式完成的。而微流控芯片上的序列来自mouse microRNA的数据库，序列之间的碱基差别很大，可以通过选择不同的序列跟不同的抗体交联(选择原则是互相之间序列差别大，以及在芯片上排列距离较为合理的，不能太远也不能太近)，最后实现在μParaflo^TM mousemicroRNA微流控芯片上实现同个样品的多个蛋白质指标检测。

本发明的技术方案，主要由抗体与核苷酸交联、抗体-核苷酸交联体与微流控芯片作用，荧光二抗与微流控芯片作用等3个流程组成。抗体与核苷酸交联主要包括：抗体的修饰与脱盐、核苷酸的修饰与脱盐、修饰后抗体与核苷酸的交联与纯化等步骤；抗体-核苷酸交联体与高通量微流控芯片作用主要包括：芯片洗脱、解链、封闭、交联体与芯片反应、洗脱等步骤；荧光二抗与微流控芯片作用包括：Cy3标记二抗与芯片上已经连接的交联体抗体部分的特异性反应以及随后的洗脱、扫描、解链等步骤。

进一步而言，本发明的高通量微流控芯片，包括基片、反应腔、流体通道和防护玻片等部件，共有3968个合成反应腔，已包含由光敏试剂在各个反应腔原位合成的3968个不同序列；这3968个序列可以根据自己的要求自由选择序列要求并合成。芯片上的序列来自mouse microRNA数据库，序列之间碱基差别很大，可以通过选择不同的序列跟不同的抗体交联，最后在mouse microRNA微流控芯片上实现同个样品的多个蛋白质指标检测。

本发明的高通量微流控芯片不但可以作为小鼠的micro RNA高通量检测芯片使用，还可以通过抗体与核苷酸交联的方式，将micro RNA芯片转变成高通量的蛋白芯片使用，进一步降低芯片制作成本。

本发明的高通量微流控芯片，可以同时检测一个样品的上千个RNA指标，实现高通量。具体为：在构建系统后的实际检测中，以抗体-核苷酸交联体与芯片作用后再以含有兽药、抗生素残留等小分子的样品与抗体反应，最后以Cy3标记的抗原实现竞争反应，测得食品样品中的兽药、抗生素残留含量。

本发明具有如下优点：

1、首次成功构建了高通量微流体蛋白芯片的模型，为蛋白芯片的高通量检测奠定了基础，突破了以往蛋白芯片通量过低的瓶颈。

2、用此种方法构建的蛋白芯片，由于整个反应过程处于液体封闭环境，避免了直接在芯片表面点样，最大限度地保持了蛋白芯片的活性，提高了芯片检测的灵敏度。

3、可以灵活地使microRNA芯片与蛋白芯片之间实现互相转换。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为荧光二抗反应后芯片扫描所得图像。

图中：抗体固定于μParafloTM mouse microRNA微流控芯片(LC-SCIENCE Inc.提供)，形成抗体芯片，并捕捉抗原得到阳性检测信号(黑色圆圈标记)。

具体实施方式

以下实施例中所用反应原料均能通过市购的形式获得，例如：Cy3标记羊抗鼠购自Proteintech Grooup公司，Cy3标记链霉亲和素购自KPL公司，核苷酸由上海生工生物工程公司合成，交联体试剂盒购自Solulink公司，YM-100离心管购自Millipore公司。文中所提到的几种转基因兔单(多)克隆抗体均可购自宜康(杭州)生物技术有限公司。

实施例1、高通量微流体转基因蛋白芯片的构建

第一步：基于μParaflo^TM微流体生物芯片原位合成六种不同序列的单链寡核苷酸，该核酸的3’端与芯片底部相连。对每种探针(即单链寡核苷酸)位置分别作A-F编号，每种探针重复6个位点，对每个位点编号，例如A种探针计为A1，A2，…A5，A6，其他种类探针类同。故，芯片上一共有36个探针位点。每种探针的序列及编号如下表1：

表1、探针的序列及编号

将此步合成的核酸芯片置于常温长期稳定保存(保存期一般可长达2年)。

第二步：合成针对6种转基因蛋白的抗体-寡核苷酸链复合物探针，步骤具体如下：

1)、准备6种转基因作物蛋白的抗体探针：(1)Bt Cry1Ac兔单抗；(2)Bt Cry1c兔多抗；(3)Bt Cry1Ab兔单抗；(4)Bt Cry1F兔多抗；(5)大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)兔多抗；(6)新霉素磷酸基转移酶I基因(NPT II)兔单抗。

上述(1)~(6)例如可购自宜康(杭州)生物技术有限公司。

2)、合成六种核酸序列，3’端作NH2修饰，由上海生工生物公司合成，核酸的序列以及待与其交联的抗体种类具体如下表2：

表2

3)、参照SoluLink^TM交联试剂盒对相应抗体和寡核苷酸链(如表2所述)进行交联；

具体操作如下：

1)、抗体与核苷酸交联：6组抗体和寡核苷酸的交联均按以下操作进行。

A、抗体的修饰与脱盐：

将6种抗体(如表2所述)分别进行以下操作：

取50μg抗体溶液，加入分子截留量为50kDa的超滤膜中，再加入300μL的pH 7的修饰缓冲液(SoluLink)，4℃，5000×g离心，至膜上留下液体为20μL左右，将膜上液体收集到另外的干净离心管保存，此时抗体溶液(即，市购而得的抗体)中的Rabbit IgG被置换到修饰缓冲液中，浓度约为2-3mg/mL。用SANH溶液(浓度为6.89×10^-2mol/L，Succinimidyl4-hydrazinonicotinate acetone hydrazone，即，琥珀酰亚胺基4-肼基烟酸盐丙酮腙)修饰，SANH与抗体之间的摩尔比为60：1。将SANH溶液与抗体溶液均匀混合，放置于25℃的摇床中，以100转/分钟的转速孵育修饰4小时。

备注说明：pH 7的修饰缓冲液(SoluLink)为S-HyNic(SANH)Kit货号(S-9002-2)，修饰缓冲液包含在试剂盒中，名称为10×Modification Buffer,用之前用蒸馏水做10倍稀释处理，至1×Modification Buffer。

孵育完后将产物移入密理博的YM-100滤管里面，用pH 8的0.1mM EDTA溶液洗涤、然后离心(5000rcf离心6分钟)和过滤，重复上述洗涤、离心和过滤2次；以除去多余的作为修饰剂的SANH，用pH 6的交联缓冲液(SoluLink)洗涤2次，使抗体被置换到交联缓冲液中，然后倒扣YM-100滤管离心(5000rcf离心10分钟)，收集脱盐后的抗体修饰产物，使脱盐后余下的液体体积保持在40-50μL左右，从而使抗体溶度浓度在1mg/mL左右。

备注说明：pH 6的交联缓冲液(SoluLink)包含在试剂盒中，名称为10×ConjugationBuffer，用之前用蒸馏水做10倍稀释处理，至1×Conjugation Buffer。

将步骤A所得的脱盐后的抗体修饰产物取少量，通过对硝基苯甲醛与2-肼吡啶二盐酸盐鉴定基团修饰是否成功；

操作步骤：

(1)设置反应组和对照组，在反应组中取1μL修饰后抗体溶液，加入5μL4-nitrobenzaldehyde (0.5mM)混合；对照组中取1μL空白修饰缓冲液，加入5μL4-nitrobenzaldehyde(0.5mM)混合，将两组均置于37℃，避光，反应30min。

(2)用Nanodrop进行UV测定，以对照组作为“blank”后，测定反应组的UV吸收光谱，得到390nm处吸收峰。如有特异吸收峰出现，可判定为修饰成功。若没有特异吸收峰，则无法判定是否修饰成功，需要重新优化修饰方法。但在对某种特定的抗体样品(RabbitIgG等)修饰方法已经成熟且可重复操作时，为节省样品可省略鉴定的步骤。

B、核苷酸的修饰与脱盐：

用pH 7修饰缓冲液(SoluLink)将核苷酸(即表2所示的单链DNA)冻干粉配置至10mg/mL，然后用SFB溶液(8.094×10^-2mM，Succinimidyl 4-formylbenzoate，即琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯)修饰。SFB与核苷酸之间的摩尔比为60：1。将SFB溶液与核苷酸溶液均匀混合，放置于25℃的摇床中，以100转/分钟的转速孵育修饰4小时。

孵育完将产物移入密理博的YM-3滤管里，用pH 8的0.1mM EDTA溶液洗涤、离心(13000rcf离心77分钟)、过滤，除去多余的SFB修饰剂，用pH 6交联缓冲液(SoluLink)洗涤2次，使寡核苷酸被置换到交联缓冲液中，然后倒扣YM-3滤管离心(13000rcf离心15分钟)，收集脱盐后的核苷酸修饰产物。测得脱盐后的核苷酸修饰产物中核苷酸的浓度为3~4ug/uL；收集待用。

将上述步骤B所得的脱盐后的核苷酸修饰产物通过对硝基苯甲醛与2-肼吡啶二盐酸盐鉴定基团修饰是否成功，并测量核酸修饰率；

操作步骤：

(1)设置反应组和对照组，在反应组中取1μL修饰后寡核苷酸溶液，加入5μL2-hydrazinopyridine (0.5mM)混合；对照组中取1μL空白修饰缓冲液，加入5μL2-hydrazinopyridine (0.5mM)混合，将两组均置于37℃，避光，反应30min。

(2)用Nanodrop进行UV测定，以对照组作为“blank”后，测定反应组的UV吸收光谱，得到360nm处吸收峰。如有特异吸收峰出现，可判定为修饰成功。

(3)测定寡核苷酸修饰比率MSR值。可通过以下公式计算获得(MSR)。

MSR=c(hydrazone)/c(oligo)----------(1)

c(hydrazone)=[A₃₆₀/(k₁*b)]-----------(2)

A₃₆₀：反应后得到腙键在390nm处特异吸收峰值

K₁：腙键吸光系数K1=18000

b=0.1

c(oligo)=[(A260*k2*)/(b*10³)]/M------------(3)

A₂₆₀：寡核苷酸在260nm处特异吸收峰值

K₂：寡核苷酸吸光系数K2=33ng

M:寡核苷酸分子量；6781.42

b=0.1cm

当计算得到MSR在0.5～1范围内时，证明核酸修饰成功。如小于0.5，说明修饰程度低，需再次进行修饰；如大与1，说明脱盐不彻底，需重复脱盐操作。

上述步骤B所得的脱盐后的核苷酸修饰产物，经检测，MSR=0.856(85.6%)。

C、修饰后抗体与核苷酸的交联与纯化：

将鉴定结果为修饰成功的脱盐后的核苷酸修饰产物与鉴定结果为修饰成功的脱盐后的抗体修饰产物均匀混合(免疫球蛋白与核苷酸的摩尔比为1:10)；放置4℃下充分反应12小时。

备注说明：寡核苷酸可一次修饰大量(一般50D)，对修饰后的寡核苷酸用NanoDrop进行浓度测定，计算10倍抗体摩尔量的核酸量，取相应体积与修饰后的抗体混合反应。修饰后寡核苷酸可保存半年左右，所以可进行多次使用。

所得的交联后产物需要再次纯化，从而除去未交联的多余的核苷酸单体。因此将上述交联后产物移入密理博的YM-100滤管里面，用pH 8的0.1mM EDTA溶液洗涤、离心(5000rcf离心6分钟)过滤3次，倒扣滤管离心收集(5000rcf离心6分钟)，收集纯化后的交联产物(纯化后的抗体-核苷酸交联体)。在350nm下测定吸光值；所形成的基团(即纯化后的交联产物)在350nm波长下有明显的吸收峰，测得OD₃₅₀=0.083，证明交联成功。

D、抗体上残留基团的封闭：

为了避免交联过程中抗体上经修饰但未与核酸进行交联的基团与芯片表面发生反应而产生非特异性结合，交联后进一步对交联体进行基团封闭。方法为向交联体(即纯化后的抗体-核苷酸交联体)中加入5倍抗体摩尔量的苯甲醛(2-sulfobenzaldehyde)，反应过程具体如下：

取抗体5倍摩尔量的相应量2-sulfobenzaldehyde(0.5mM)加入交联体溶液中，混匀，37℃，避光，孵育30min。

封闭后脱盐收集待用，具体如下：

将产物移入密理博的YM-100滤管里面，用pH 8的0.1mM EDTA溶液洗涤、然后离心(5000rcf离心6分钟)和过滤，重复上述洗涤、离心和过滤2次；以除去多余封闭试剂，用PBS缓冲液(PH=7.2)洗涤2次，使交联产物置换到PBS缓冲液中。然后倒扣YM-100滤管离心(5000rcf离心10分钟)，收集。

第三步、抗体-核苷酸交联体与微流控芯片作用：

1)芯片循环系统的清洗

在使用芯片系统前对芯片循环系统进行清洗。在微流体杂交室中装入一张旧芯片(非第一步中生成的芯片)，用1mL预热到95℃的洗涤液(1%SDS，以蒸馏水作为溶剂)装入样品管并接入循环系统，40℃下高转速循环清洗30分钟；再用3mL去离子水常温冲洗。接着换用1mL预热到95℃的去离子水，40℃下高转速循环清洗系统10分钟；然后用3mL常温去离子水冲洗。

备注说明：将旧芯片装入微流体杂交窒的目的是接通整个微流体系，这样才能使洗涤液在系统内流动对其进行洗涤。在清洗结束后，将旧芯片取出，将试剂盒中有相应探针合成的芯片置于杂交室内，而后进行下面的步骤2)。

2)芯片表面的封闭

将第一步中生成的芯片置入微流体杂交室中，取100μL 6×SSPE缓冲液接入循环体系，循环润洗芯片表面，赶尽芯片中气泡。取100μL封闭缓冲液(6×SSPE，25%甲酰胺，1%BSA，pH 6.8)移入样品管，流速100μL/分钟，30℃循环流经芯片30分钟。

封闭缓冲液的制备方法：

④准备6×SSPE缓冲液，调节pH为6.8。

⑤取75mL上述①所得的调节pH后的6×SSPE缓冲液和25mL甲酰胺混合。

⑥准备BSA溶液：称取0.2mg的BSA粉末溶于1mL蒸馏水中。

④制备100μL封闭缓冲液：取5μL步骤③所得的BSA溶液加入95μL步骤②所得的溶液，混合。

3)探针在芯片表面的固定

将第二步制备的6种抗体-寡核苷酸复合物探针以各50nM的浓度混合稀释在100μL的封闭缓冲液中，连接入芯片的循环系统，30℃下流速20μL/分钟循环孵育2h。反应初始时交替改变几次液体流向，确保将芯片表面的气泡赶除，以免在芯片中造成盲点。将控制液体流向的开关打至“AUTO”档，循环系统中的液体每隔2分钟自动转变流向，使样品能够充盈整个芯片表面并流经每个反应窒。在此过程中，交联抗体探针通过DNA互补链配对与DNA 芯片上的探针结合，分别固定到芯片的相应位置。探针固定反应完成后，将1mL洗涤缓冲液(1：1混合封闭缓冲液和水，0.2%SDS)移入样品管中，30℃下20μL/分钟循环洗涤芯片表面20分钟，将芯片表面多余未结合的抗体探针洗去。

上述洗涤缓冲液的制备方法为：将封闭缓冲液和水按照1:1的体积比混合，得混合液，在每500ml的混合液中加入1mg的SDS均匀混合。

4)完成以上步骤后，合成的蛋白质芯片的表面探针分布为：

A1-A6：检Cry1Ac蛋白

B1-B6:检Cry1c蛋白

C1-C6:检Cry1Ab蛋白

D1-D6:检Cry1F蛋白

E1-E6:检SBTI蛋白

F1-F6:检NPT II蛋白。

应用实例1：

在实现的微流体高通量转基因蛋白芯片基础上，对转基因样品(转基因CrylAc水稻叶片)进行检测试验。

1.取5g转基因水稻叶片(事先确定含有Cry1Ac基因)和非转基因水稻叶片分别进行以下操作：

置于不同离心管中，加入1mLPBS缓冲液(PH=7.2)，用枪头轻压叶片约2min，至浸出液呈绿色。离心5min后分离澄清液，置于4℃放置30min；得样品检测液；

备注说明：2种样品检测液是分别进行以下步骤2~7的操作。

2.将50μL样品检测液接入微流体系，将流速设置为20μL/min，在4℃条件下过夜孵育。反应结束后用PBST缓冲液(PH=7.2)在30℃下洗涤芯片20min，洗去芯片表面未结合的样品。

3.准备检测溶液：取500μL反应缓冲液，将试剂盒中6种检测抗体分别以5000-10000倍稀释混合到反应缓冲液中，将2种显色物质(Cy3标记链霉亲和素，KPL公司)；②Cy3标记的羊抗鼠抗体(Proteintech Group公司)均以1000倍稀释至反应缓冲液中。

即，

Cry1Ac、Cry1c：0.1μL(稀释5000倍)

Cry1F、Cry1Ab、SBTI、NPTI:将原液稀释10倍后取0.1μL(即，稀释50000倍)

Cy3标记链霉亲和素(总100μL，为试剂规格)：取0.1μL

Cy3标记羊抗鼠抗体(总100μL，为试剂规格)：取0.1μL；

备注说明：反应缓冲液(含1%BSA的PBS溶液，pH=7.2)，配置方法：将0.01gBSA溶于1mLPBS溶液(pH=7.2)中。

4.将检测溶液接入循环系统，窒温(25℃)下反应2小时，窒温下用PBST缓冲液(PH=7.2)对芯片洗涤20min，洗去多余的检测抗体和显色物质。

5.扫描：取出芯片，用芯片扫描仪Genepix^TM4000B对芯片结果进行阅读。选择PMT500，焦距190。

6.检测结果：图1显示Cry1Ac转基因叶片和非转基因叶片的检测结果，结果表明，转基因样品在A号位点上获得明显信号(A1:5587，A2:5153，A3:4508，A4:5186，A5:6558，A6:6098；平均值：5515；标准偏差：733)，即检出Cry1Ac蛋白成分；芯片上的6组重复一致性良好。非转基因检测结果上无信号。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.高通量微流控芯片检测系统的构建方法，其特征是依次包括以下步骤：

第一步、

基于μParafloTM微流体生物芯片原位合成6种不同序列的单链寡核苷酸，该核酸的3’端与芯片底部相连；

6种探针的序列如下：

A：3'CAC ACG CCT TTA CGA AGA CGA T5'；

B：3'CAG GTC AAA AGG GTC CTT AGG GA5'；

C：3'TAG TGT GTT TCC GTT GAA AAC A5'；

D：3'TAG TTG TCT GTA ATT AAC CCG CG5'；

E：3'AAA CCG TTA CCA TCT TGA GTG TGG C5'；

F：3'TTA ACG TGC CAT AGG TAG ACA T5'；

第二步、合成针对6种转基因蛋白的抗体-寡核苷酸链复合物探针；包括如下步骤：

1)、准备6种转基因作物蛋白的抗体探针；

2)、合成6种核酸序列；

3)、对相应抗体和寡核苷酸链进行交联；包括如下步骤：

A、抗体的修饰与脱盐：

将6种抗体分别进行以下操作：

取45～55μg抗体溶液，加入分子截留量为50kDa的超滤膜中，再加入280～320μL的pH7的修饰缓冲液，离心，至膜上留下的液体为19～21μL，然后用SANH溶液修饰，SANH与抗体之间的摩尔比为50～70：1；再放置于24～26℃的摇床中孵育修饰3～5小时；

孵育完后将产物洗涤、离心，以除去多余的作为修饰剂的SANH，用pH6的交联缓冲液洗涤，使抗体被置换到交联缓冲液中，然后收集脱盐后的抗体修饰产物；

B、核苷酸的修饰与脱盐：

用pH7修饰缓冲液将核苷酸冻干粉配置至8～12mg/mL，然后用SFB溶液修饰；SFB与核苷酸之间的摩尔比为50～70：1；放置于24～26℃的摇床中，孵育修饰3～5小时；

孵育完将产物洗涤、离心，以除去多余的SFB修饰剂，再用pH6交联缓冲液洗涤，使寡核苷酸被置换到交联缓冲液中，然后离心，收集脱盐后的核苷酸修饰产物；

C、修饰后抗体与核苷酸的交联与纯化：

将修饰成功的脱盐后的核苷酸修饰产物与修饰成功的脱盐后的抗体修饰产物均匀混合，免疫球蛋白与核苷酸的摩尔比为1:8～12；于3～5℃下反应10～14小时；

D、抗体上残留基团的封闭：

6种转基因作物蛋白的抗体探针为：(1)Bt Cry1Ac兔单抗；(2)Bt Cry1c兔多抗；(3)Bt Cry1Ab兔单抗；(4)Bt Cry1F兔多抗；(5)大豆胰蛋白酶抑制剂兔多抗；(6)新霉素磷酸基转移酶Ⅱ基因兔单抗；

六种核酸的序列以及待与其交联的抗体种类如下：

a：5'GTG TGC GGA AAT GCT TCT GCT A3'，抗Cry1Ac兔单抗；

b：5'GTC CAG TTT TCC CAG GAA TCC CT3'，抗Cry1c兔多抗；

c：5'ATC ACA CAA AGG CAA CTT TTG T3'，抗Cry1Ab兔单抗；

d：5'ATC AAC AGA CAT TAA TTG GGC GC3'，抗Cry1F兔多抗；

e：5'TTT GGC AAT GGT AGA ACT CAC ACC G3'，抗SBTI兔多抗；

f：5'AAT TGC ACG GTA TCC ATC TGT A3'，抗NPTⅡ兔单抗；

第三步、抗体—核苷酸交联体与微流控芯片作用：

1)、芯片循环系统的清洗：

在使用芯片系统前对芯片循环系统进行清洗；

2)、芯片表面的封闭：

再取封闭缓冲液移入样品管，流速80～120μL/分钟，28～32℃循环流经芯片25～35分钟；

封闭缓冲液的制备方法：

①准备6×SSPE缓冲液，调节pH为6.8，

③准备BSA溶液：称取0.2mg的BSA粉末溶于1mL蒸馏水中；

3)、探针在芯片表面的固定：

将第二步制备的6种抗体-寡核苷酸复合物探针以各45～55nM的浓度混合稀释在100μL的封闭缓冲液中，连接入芯片的循环系统，28～32℃下流速15～25μL/分钟循环孵育1.5～2.5h；探针固定反应完成后，用洗涤缓冲液洗涤芯片表面，从而将芯片表面多余未结合的抗体探针洗去；

4)、完成以上步骤后，得合成的蛋白质芯片。

2.根据权利要求1所述的高通量微流控芯片检测系统的构建方法，其特征是：

所述第二步中的修饰后抗体与核苷酸的交联与纯化步骤中：

所得的交联后产物再次纯化，从而除去未交联的多余的核苷酸单体；具体操作为：将交联后产物用pH8的0.1mM EDTA溶液洗涤、离心，收集纯化后的交联产物。

3.根据权利要求2所述的高通量微流控芯片检测系统的构建方法，其特征是：

所述第二步中的抗体上残留基团的封闭步骤中：

基团封闭的方法为：向交联体中加入4～6倍抗体摩尔量的苯甲醛，反应过程具体如下：

取抗体4～6倍摩尔量的2-sulfobenzaldehyde加入交联体溶液中，混匀，36.5～37.5℃避光孵育25～35min；

封闭后脱盐收集，具体如下：

将产物洗涤、离心，以除去多余的封闭试剂，用PBS缓冲液洗涤，使交联产物置换到PBS缓冲液中；然后离心，收集。

4.根据权利要求3所述的高通量微流控芯片检测系统的构建方法，其特征是：

所述第三步中：

合成的蛋白质芯片的表面探针分布为：

A1-A6：检Cry1Ac蛋白，

B1-B6:检Cry1c蛋白，

C1-C6:检Cry1Ab蛋白，

D1-D6:检Cry1F蛋白，

E1-E6:检SBTI蛋白，

F1-F6:检NPTⅡ蛋白。