CN102899381A - 一种表面活性剂生产菌对石油降解协同作用的研究方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种表面活性剂生产菌对石油降解协同作用的研究方法。配置用于进行降解实验的无机盐培养基；铜绿假单胞菌GIMT1.074具有在甘油为唯一碳源的无机盐培养基中产生生物表面活性剂的能力。铜绿假单胞菌GIMT1.074和醋酸钙不动杆菌061021B分别按初始OD600为0.01的接种量进行接种，进行3组平行试验；根据铜绿假单胞菌GIMT1.074和醋酸钙不动杆菌061021B在平板中的不同表型，使用平板计数法得到相应时刻下每种菌的数量关系，考察铜绿假单胞菌GIMT1.074和醋酸钙不动杆菌061021B在石油降解过程中的协同作用。石油污染物的降解率经过两株菌的协同作用后提高了12.83%。
Description
技术领域
本发明涉及石油污染技术领域，特别涉及一种表面活性剂生产菌对石油降解协同作用的研究方法。
背景技术
石油是一种由多种烃类（正烷烃、支链烷烃、环烷烃、芳香烃、多环芳烃等）及少量非烃化合物（硫化物、氮化物、烷烃酸类等）和有机金属（钒、镍等）组成的复杂混合物，在储存、运输和加工过程中造成的环境污染已威胁到人类和其他生物的生存和发展。了解石油污染物在自然界的生物降解转化规律，研究石油污染物微生物降解的原理和方法，分离筛选和培养石油降解菌，消除和减少石油在环境中的滞留，将有利于维护和创造高质量的人类生存环境。自1989年Alaska发生原油泄漏事故后，人们对石油污染修复进行了大量的研究。发现自然界中存在许多能够以石油为碳源和能源的微生物，将石油污染物降解为环境友好物质。
石油是不溶于水的黑色粘稠物质，微生物在利用石油的过程难以与石油进行接触，石油中的物质也很难穿过微生物细胞膜进行降解，影响了微生物降解石油污染物的效率。在解决这个问题，有几种前人做过的工作，例如1989年Foght等使用化学表面活性剂来增大石油与水相的互溶能力，提高微生物与石油污染物的接触面积；2001年Stehr等用化学预处理的方法来减少石油与水相的不相溶问题；2003年Freitkenhauer等通过提高温度增加质量/扩散传递率。这些方法都能对环境有二次污染，而且花费昂贵，并且实际应用中收到的效果不理想。要提高微生物降解石油的有效方法包括三种：第一，吸收石油中可溶解的部分；第二，产生生物表面活性剂来改变石油的溶解性；第三，底物之间的相互作用。生物表面活性剂是微生物代谢过程中分泌出的具有一定表面活性的产物，典型的生物表面活性剂包括糖脂、多糖脂、脂肽等，石油中可溶部分的吸收率受石油在水相中低溶解率的限制，生物表面活性剂使得石油和水相的接触面积变大，因而提高了石油的降解率，生物表面活性剂的存在可以提高石油与微生物的接触面积，降解石油的微生物生长过程往往伴随着难溶烃类的乳化作用，乳化过程有利于微生物在石油中生长代谢。有研究表明在石油降解菌中添加生物表面活性剂可以提高石油降解的效率和降解效果，在生物修复过程中投加表面活性剂能有效的溶解那些难溶的石油类化合物和其他有机化合物，提高有机污染物质的降解率。
由于生物表面活性剂生产菌在石油污染物的降解过程中会产生生物表面活性物质，有利于石油的生物降解，因此研究石油降解过程中含生物表面活性剂生产菌与石油污染物降解菌的菌群结构变化有利于阐明石油污染物降解过程的菌群反应机理与多菌种混合降解的模式，考察石油污染物降解过程中不同菌种的降解行为，阐明表面活性剂生产菌与石油污染物降解菌之间相互作用方式，将对石油污染物的生物修复产生重要的理论指导意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种表面活性剂生产菌与石油污染物降解菌共同降解石油污染物的协同作用。
本发明的另一个目的是提供对这种协同降解石油污染物作用的考察方法。
本发明的目的还有提供一种表面活性剂生产菌与石油污染物降解菌共同降解石油污染物的协同作用的无机盐培养基的配方。
本发明的技术方案如下：
一种表面活性剂生产菌对石油降解协同作用的研究方法，按以下步骤进行混合菌群石油污染物降解过程中的协同作用的研究：
（一）配置用于进行降解实验的无机盐培养基，将100mL的无机盐培养基分装在250mL的三角瓶中，密封后在121℃的高温蒸汽灭菌锅中下灭菌20分钟，置于室温中冷却待用；
（二）铜绿假单胞菌GIMT1.074具有在甘油为唯一碳源的无机盐培养基中产生生物表面活性剂的能力。铜绿假单胞菌GIMT1.074和醋酸钙不动杆菌061021B分别按初始OD600为0.01的接种量进行接种，进行3组平行试验；
（三）在接种后的摇瓶中添加0.5mL的石油，置于25-35℃，200rpm的摇床中进行培养；
（四）每隔8小时从摇瓶中取出1mL的样品，稀释10-6、10-7、10-8倍后，均匀涂布在LB琼脂培养基中，在35℃的恒温培养箱中倒置培养2-3天；
（五）根据铜绿假单胞菌GIMT1.074和醋酸钙不动杆菌061021B在平板中的不同表型，使用平板计数法得到相应时刻下每种菌的数量关系，考察铜绿假单胞菌GIMT1.074和醋酸钙不动杆菌061021B在石油降解过程中的协同作用。
步骤（一）中所用到的无机盐培养基的配方是：硝酸钠0.5-2g/L、磷酸二氢钾0.5-1.5g/L、磷酸二氢钾0.5-1.5g/L、硫酸铵2-4g/L、NaCl3-7g/L，硫酸镁0.5-2g/L；微量元素10mL/L，运用精密电子pH调节电极进行测量，使用2mol/L的盐酸或2mol/L的NaOH溶液调节pH到6.5-7.5。
所用到的其中的微量元素的配方是：每升培养液中含有0.2g Na2MoO4·2H2O，0.5g ZnSO4·7H2O，0.3g CuSO4·5H2O，2.0g FeSO4·7H2O，1.0g CaCl 2，5.0g NaSO4，0.4g MnSO4·4H2O和0.5g H3BO3。
步骤（二）中考察铜绿假单胞菌GIMT1.074生产生物表面活性剂的方法：此株铜绿假单胞菌GIMT1.074能在以甘油为唯一碳源的无机盐培养基中发酵并产生表面活性剂；具体的说是在步骤（二）中所述的无机盐培养基中加入2g/L的甘油后，放置于30℃，200rpm的摇床中进行培养发酵，发现在培养过程中会产生很多泡沫，经过排油圈实验发现产生10cm以上的排油圈；进一步对表面活性物质进行提取后，得到了糖脂类的生物表面活性剂的粗提物；证明了铜绿假单胞菌GIMT1.074产生生物表面活性剂的能力。
步骤（四）中所述的平板计数法的具体操作如下：用无机盐培养基稀释不同时刻取出的培养液至原始浓度的10-6、10-7和10-8倍，取10微升的稀释液均匀涂布在LB营养培养基中，放置于35℃的恒温培养箱中培养3天，对每种菌的数量进行计数，得到每组实验的菌体浓度和菌群组成变化。
本发明的表面活性剂生产菌——铜绿假单胞菌GIMT1.074，具有耐受石油污染物的能力，而且能在甘油为唯一碳源的无机盐培养基中产生表面活性剂，研究发现，在石油污染物中，铜绿假单胞菌GIMT1.074仅能耐受却不能降解石油污染物,铜绿假单胞菌在以石油为底物的无机盐培养基中培养3天后，生物量维持在OD600为0.01不变。
本发明的一种石油降解菌——醋酸钙不动杆菌061021B，具有降解石油污染物的能力，对5%体积比的原油在10天内，降解率达到74.32%。
以最终10天的原油降解实验发现，相对比与单独醋酸钙不动杆菌061021B的74.32%的降解率，混合菌的10天降解率为87.29%，石油污染物的降解率经过两株菌的协同作用后提高了12.83%。
附图说明
图1是在石油降解过程中，醋酸钙不动杆菌061021B和铜绿假单胞菌GIMT1.074协同降解石油污染物与醋酸钙不动杆菌061021B单独降解石油污染物的菌体生物量的比较。
图2是在原油降解过程中，醋酸钙不动杆菌061021B和铜绿假单胞菌GIMT1.074协同降解与醋酸钙不动杆菌061021B单独降解的原油降解率之间的比较。
具体实施方式
通过下面结合具体实例将有助于进一步理解本发明，但本发明的保护范围并不限制于此：一种表面活性剂生产菌与石油污染物降解菌共同降解石油污染物的协同作用，具体的说是铜绿假单胞菌GIMT1.074与醋酸钙不动杆菌061021B共存的条件下，前期生产表面活性剂的铜绿假单胞菌GIMT1.074的生长受到抑制，菌体难以生长，不产生生物表面活性剂，而石油污染物降解菌醋酸钙不动杆菌061021B能够利用石油大量生长，石油污染物被降解；在中期，醋酸钙不动杆菌061021B继续利用石油污染物生长，而铜绿假单胞菌GIMT1.074利用石油污染物降解的中间产物大量生长，并开始产生生物表面活性剂，降低培养液的表面张力；在后期，铜绿假单胞菌GIMT1.074继续生长，表面张力持续降低，培养液中的石油污染物几乎被完全降解，这时石油降解菌醋酸钙不动杆菌061021B的生长周期进入衰亡期，菌体开始解体；最终，降解体系中的石油污染物被充分降解，铜绿假单胞菌GIMT1.074含量丰富，表面张力降至最低，而石油降解菌醋酸钙不动杆菌061021B的存活细胞数目逐渐减少，最终基本消失。
一种表面活性剂生产菌与石油污染物降解菌协同降解石油污染物的研究方法，具体的说是将表面活性剂生产菌铜绿假单胞菌GIMT1.074与石油降解菌醋酸钙不动杆菌061021B接种至250mL的三角瓶中，其中含有100mL无机盐培养基，初始接种的含量为OD600为0.1，并添加浓度为0.5%的柴油作为唯一碳源。在30℃，200rpm的恒温摇床中进行培养，每隔8小时观察培养液的颜色变化，并取出1mL培养液，分别稀释10-6、10-7和10-8倍，取出10微升的稀释液，用涂布棒均匀涂布于LB固体平板培养基中。放置于35℃的恒温培养箱中倒置培养3天后，观察计数平板中两种细菌的菌落数量，得到活菌的数目，计算得到菌体含量变化规律。
实施例1
利用混合菌群降解石油污染物的培养方法
在配方为硝酸钠0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸铵2g/L、NaCl3g/L，硫酸镁0.5g/L，微量元素10mL/L，调节pH到6.5后的无机盐培养基中，添加5mL的原油后和初始OD600为0.01的醋酸钙不动杆菌061021B，置于30℃，200rpm的恒温培养箱中进行石油污染物的降解实验，降解10天后，使用正己烷萃取培养基中未被降解的原油，采用比重法比较降解前后石油重量的变化，实验结果发现对原油的降解率为61.27%。
实施例2
利用混合菌群降解石油污染物的培养方法
在配方为硝酸钠1g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸铵3g/L、NaCl5g/L，硫酸镁1g/L，微量元素10mL/L，调节pH到7.0后的无机盐培养基中，添加5mL的原油后和初始OD600为0.01的醋酸钙不动杆菌061021B，置于30℃，200rpm的恒温培养箱中进行石油污染物的降解实验，降解10天后，使用正己烷萃取培养基中未被降解的原油，采用比重法比较降解前后石油重量的变化，实验结果发现对原油的降解率为74.32%。
实施例3
利用混合菌群降解石油污染物的培养方法
在配方为硝酸钠1.5g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、硫酸铵5g/L、NaCl7g/L，硫酸镁1.5g/L，微量元素10mL/L，调节pH到7.5后的无机盐培养基中，添加5mL的原油后和初始OD600为0.01的醋酸钙不动杆菌061021B，置于30℃，200rpm的恒温培养箱中进行石油污染物的降解实验，降解10天后，使用正己烷萃取培养基中未被降解的原油，采用比重法比较降解前后石油重量的变化，实验结果发现对原油的降解率为54.91%。
实施例4
利用混合菌群降解石油污染物的培养方法
在配方为硝酸钠0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸铵2g/L、NaCl3g/L，硫酸镁0.5g/L，微量元素10mL/L，调节pH到6.5后的无机盐培养基中，添加5mL的原油后和初始OD600为0.01的醋酸钙不动杆菌061021B和初始OD600为0.01的铜绿假单胞菌GIMT1.074，置于30℃，200rpm的恒温培养箱中进行石油污染物的降解实验，降解10天后，使用正己烷萃取培养基中未被降解的原油，采用比重法比较降解前后石油重量的变化，实验结果发现对原油的降解率为70.41%。
实施例5
利用混合菌群降解石油污染物的培养方法
在配方为硝酸钠1g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸铵3g/L、NaCl5g/L，硫酸镁1g/L，微量元素10mL/L，调节pH到7.0后的无机盐培养基中，添加5mL的原油后和初始OD600为0.01的醋酸钙不动杆菌061021B和初始OD600为0.01的铜绿假单胞菌GIMT1.074置于30℃，200rpm的恒温培养箱中进行石油污染物的降解实验，降解10天后，使用正己烷萃取培养基中未被降解的原油，采用比重法比较降解前后石油重量的变化，实验结果发现对原油的降解率为87.29%。
实施例6
利用混合菌群降解石油污染物的培养方法
在配方为硝酸钠1.5g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、硫酸铵5g/L、NaCl7g/L，硫酸镁1.5g/L，微量元素10mL/L，调节pH到7.5后的无机盐培养基中，添加5mL的原油后和初始OD600为0.01的醋酸钙不动杆菌061021B和初始OD600为0.01的铜绿假单胞菌GIMT1.074置于30℃，200rpm的恒温培养箱中进行石油污染物的降解实验，降解10天后，使用正己烷萃取培养基中未被降解的原油，采用比重法比较降解前后石油重量的变化，实验结果发现对原油的降解率为66.24%。
实施例7
混合菌降解石油污染物协同作用的研究
在配方为硝酸钠1g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸铵3g/L、NaCl5g/L，硫酸镁1g/L，微量元素10mL/L，调节pH到7.0后的无机盐培养基中，添加0.5mL的石油后和初始OD600为0.01的醋酸钙不动杆菌061021B和初始OD600为0.01的铜绿假单胞菌GIMT1.074。在25℃，200rpm的摇床中进行培养，在第8小时取出1mL的样品，稀释到10-6倍后，均匀涂布在LB琼脂培养基中，培养2天。平板计数法得到铜绿假单胞菌GIMT1.074为7.41×106个/毫升，醋酸钙不动杆菌061021B为30.96×106个/毫升。
实施例8
混合菌降解石油污染物协同作用的研究
在配方为硝酸钠1g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸铵3g/L、NaCl5g/L，硫酸镁1g/L，微量元素10mL/L，调节pH到7.0后的无机盐培养基中，添加0.5mL的石油后和初始OD600为0.01的醋酸钙不动杆菌061021B和初始OD600为0.01的铜绿假单胞菌GIMT1.074。在30℃，200rpm的摇床中进行培养，在第24小时取出1mL的样品，稀释到107倍后，均匀涂布在LB琼脂培养基中，培养3天。平板计数法得到铜绿假单胞菌GIMT1.074为36.81×106个/毫升，醋酸钙不动杆菌061021B为208.91×106个/毫升。
实施例9
混合菌降解石油污染物协同作用的研究
在配方为硝酸钠1g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸铵3g/L、NaCl5g/L，硫酸镁1g/L，微量元素10mL/L，调节pH到7.0后的无机盐培养基中，添加0.5mL的石油后和初始OD600为0.01的醋酸钙不动杆菌061021B和初始OD600为0.01的铜绿假单胞菌GIMT1.074。在35℃，200rpm的摇床中进行培养，在第80小时取出1mL的样品，稀释到10-7倍后，均匀涂布在LB琼脂培养基中，培养3天。平板计数法得到铜绿假单胞菌GIMT1.074为300.14×106个/毫升，醋酸钙不动杆菌061021B为381.02×106个/毫升。
实施例10
混合菌降解石油污染物协同作用的研究
在配方为硝酸钠1g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸铵3g/L、NaCl5g/L，硫酸镁1g/L，微量元素10mL/L，调节pH到7.0后的无机盐培养基中，添加0.5mL的石油后和初始OD600为0.01的醋酸钙不动杆菌061021B和初始OD600为0.01的铜绿假单胞菌GIMT1.074。在35℃，200rpm的摇床中进行培养，在第120小时取出1mL的样品，稀释到107倍后，均匀涂布在LB琼脂培养基中，培养3天。平板计数法得到铜绿假单胞菌GIMT1.074为536.25×106个/毫升，醋酸钙不动杆菌061021B为45.875×106个/毫升。
Claims (6)
1.一种表面活性剂生产菌对石油降解协同作用的研究方法，其特征在于按以下步骤进行混合菌群石油污染物降解过程中的协同作用的研究：
（一）配置用于进行降解实验的无机盐培养基，将100mL的无机盐培养基分装在250mL的三角瓶中，密封后在121℃的高温蒸汽灭菌锅中下灭菌20分钟，置于室温中冷却待用；
（二）铜绿假单胞菌GIMT1.074具有在甘油为唯一碳源的无机盐培养基中产生生物表面活性剂的能力。铜绿假单胞菌GIMT1.074和醋酸钙不动杆菌061021B分别按初始OD600为0.01的接种量进行接种，进行3组平行试验；
（三）在接种后的摇瓶中添加0.5mL的石油，置于25-35℃，200rpm的摇床中进行培养；
（四）每隔8小时从摇瓶中取出1mL的样品，稀释10-6、10-7、10-8倍后，均匀涂布在LB琼脂培养基中，在35℃的恒温培养箱中倒置培养2-3天；
（五）根据铜绿假单胞菌GIMT1.074和醋酸钙不动杆菌061021B在平板中的不同表型，使用平板计数法得到相应时刻下每种菌的数量关系，考察铜绿假单胞菌GIMT1.074和醋酸钙不动杆菌061021B在石油降解过程中的协同作用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（一）中所用到的无机盐培养基的配方是：硝酸钠0.5-2g/L、磷酸二氢钾0.5-1.5g/L、磷酸二氢钾0.5-1.5g/L、硫酸铵2-4g/L、NaCl3-7g/L，硫酸镁0.5-2g/L；微量元素10mL/L，运用精密电子pH调节电极进行测量，使用2mol/L的盐酸或2mol/L的NaOH溶液调节pH到6.5-7.5。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所用到的其中的微量元素的配方是：每升培养液中含有0.2g Na2MoO4·2H2O，0.5g ZnSO4·7H2O，0.3g CuSO4·5H2O，2.0g FeSO4·7H2O，1.0g CaCl 2，5.0g NaSO4，0.4g MnSO4·4H2O和0.5g H3BO3。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（二）中考察铜绿假单胞菌GIMT1.074生产生物表面活性剂的方法：此株铜绿假单胞菌GIMT1.074能在以甘油为唯一碳源的无机盐培养基中发酵并产生表面活性剂，具体的说是在步骤（二）中所述的无机盐培养基中加入2g/L的甘油后，放置于30℃，200rpm的摇床中进行培养发酵，发现在培养过程中会产生很多泡沫，经过排油圈实验发现产生10cm以上的排油圈；进一步对表面活性物质进行提取后，得到了糖脂类的生物表面活性剂的粗提物；证明了铜绿假单胞菌GIMT1.074产生生物表面活性剂的能力。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（四）中所述的平板计数法的具体操作如下：用无机盐培养基稀释不同时刻取出的培养液至原始浓度的10-6、10-7和10-8倍，取10微升的稀释液均匀涂布在LB营养培养基中，放置于35℃的恒温培养箱中培养3天，对每种菌的数量进行计数，得到每组实验的菌体浓度和菌群组成变化。
6.根据权利要求1所述的研究混合菌群降解石油污染物过程中协同作用，其特征在于最终10天的原油降解实验发现，相对比与单独醋酸钙不动杆菌061021B的74.32%的降解率，混合菌的10天降解率为87.29%，石油污染物的降解率经过两株菌的协同作用后提高了12.83%。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130130 |