CN102892385A - 包含二羟基苯甲酸衍生物的骨移植用或骨填充用组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种骨移植用或骨填充用组合物，其包含二羟基苯甲酸衍生物，本发明的骨移植用或骨填充用组合物被新证实其通过增加成骨细胞的活性从而诱导骨形成。

Description

包含二羟基苯甲酸衍生物的骨移植用或骨填充用组合物
技术领域
本发明涉及一种骨移植用（bone-grafting）或骨填充用（bone-filling）组合物，其包含二羟基苯甲酸衍生物，本发明的骨移植用或骨填充用组合物被新证实其通过增加成骨细胞的活性从而诱导骨形成。
背景技术
通常，牙齿及骨组织等作为生物体内唯一的硬组织，因汽车事故而引起骨折等，从而导致其丧失或缺失的情况下，会产生生物体的形态学变化及功能性障碍。目前，以修复缺损部位为目的，正在使用骨移植或骨填充方法，以上两种方法使用了同种异体移植（allograft）、异种骨移植、金属材料、高分子材料、陶瓷等。
骨移植或骨填充方法使用一种补充骨缺损部位的物质（通常称为“骨填充剂（bone-filler）”）。最近，为了增加身高，正在频繁地实施用于增加腿长或用于矫正颌骨短小的骨延伸术，因此对骨填充剂的需求在日益增加。
作为骨填充材料及骨移植材料植入到人体内的生物材料（bio-material）可以区分为生物惰性材料（bioinert material）、生物活性材料（bioactive material）、生物降解材料（biodegradable material）。生物惰性材料是指植入体内后虽然不会引起炎症和毒性，但不与人体组织结合的材料。此外，生物活性材料是指生物相容性高，以使得将其植入到体内时，与周围组织进行生化结合的材料。此外，生物降解性材料是指移植后，在体内完全吸收或降解的材料。生物材料根据材质，可以区分为金属、陶瓷材料（即，无机物）及高分子材料，像金属、陶瓷等物质主要用于牙齿、骨等硬组织的替代材料。最近，将各种材料所具有的优点进行融合，将陶瓷与高分子复合化或将金属和陶瓷混合而使用。
金属与陶瓷、高分子材料相比机械强度优异，不锈钢、钴（Co）-铬（Cr）合金、钛（Ti）和钛合金（Ti-6Al-4V）、钛和镍以1:1的原子比混合的金属化合物等作为骨填充材料及骨移植材料使用。金属主要以致密的形态使用，但根据需要也以多孔性金属形态或涂布于移植体表面上的金属（金属纤维）形态使用。以多孔性金属形态移植到生物体的情况下，骨向移植体气孔（小孔）内生长，使骨与移植体的结合更加牢固。此外，通过将金属或金属纤维涂布或附着到移植体的表面，在表面上形成凹凸，使骨向其缝隙生长，可以期待高的机械固定效果。
由于作为骨与牙齿的无机成分的磷灰石是一种陶瓷，因此陶瓷材料（即，无机物）可以和骨进行良好的化学结合。机械特性优异的氧化铝和氧化锆主要用作要求耐磨的人工关节的骨端和人工牙根。作为生物活性陶瓷有以氧化钙（CaO）和氧化硅（SiO2）为主成分的生物活性玻璃（bioactive glass）及由骨的主要成分钙和磷组成的磷酸钙系陶瓷等。氧化钠（Na2O）-氧化钙-氧化硅系结晶化玻璃，不仅具有生物活性，而且在弯曲强度、断裂韧性、疲劳寿命等机械强度被大大改善，因此被用作人工脊椎体、人工髂骨（盆骨）等。与磷灰石相似的由钙和磷形成的磷酸三钙（TCP，tricalcium phosphate，Ca3(PO4)2），由于其被移植到体内时，具有被缓慢吸收的特性，因此被广泛用作整形外科、牙科领域中使用的硬组织替代材料。生物活性陶瓷适合用作将损伤的牙齿或骨部位以块状填充的骨填充材料，这种骨填充材料主要使用多孔性磷灰石，磷灰石和磷酸三钙的复合体，或多孔性生物活性玻璃。通常制备成3~5mm颗粒型，以填充到骨缺损部位的方法实施手术。此外，可以单独使用生物活性陶瓷或将其涂布在金属表面上，以用于克服金属移植体的缺点，或将其以水泥的形态注入，活用为固定金属移植体的注入型骨水泥。将生物活性陶瓷涂布到金属移植体表面上时，可以防止金属离子溶化析出的现象，在纤维性皮膜还未形成时，金属移植体就可以与周围骨直接进行结合。目前，在市场上销售有磷灰石或涂布有磷灰石和TCP的人工髋关节。此外，还出现了涂布有生物活性陶瓷的金属螺丝、销钉。
作为高分子材料，有聚乳酸（polylactic acid，PLA）或其共聚物、如胶原蛋白等生物降解性高分子聚合物等。可以将上述高分子材料与上述金属或非金属（例如，磷灰石）进行混合，用于降低弹性系数。
作为骨移植及骨填充材料，可以列举出自体骨、同种异体骨、异种骨和由上述多种生物材料制备的合成骨，考虑到感染的危险性及经济问题，主要使用合成骨。合成骨虽将羟基磷灰石等作为主材料使用，但羟基磷灰石虽然具有优异的骨传导性（osteoconductivity），但骨诱导性（osteoinductivity）差，因此当移植到体内时，随着患者状态和年龄，在骨形成期间，具有偏差大的缺点。
为了克服这些合成骨的缺点，正在使用一些骨形态发生蛋白（BMP:bone morphogenic protein）或其它骨移植替代物等来用于诱导骨再生。例如，有关于骨形态发生蛋白2（BMP2）在诱导骨折的动物实验中，能够促进骨折愈合能力的报道（韦尔奇、R.D.等人,骨与矿物质研究杂志13(9):1483-1490，1998；Yasko、A.W.等人，骨与关节损伤杂志74A:659-671，1992（Welch，R.D.et al.，J Bone MinerRes.13(9):1483-1490，1998；Yasko,A.W.et al.，J Bone Joint Surg.74A:659-671，1992）），基于这样的研究结果，将骨形态发生蛋白2（BMP2）应用在胶原海绵及多种介质上，并得到美国FDA的批准，作为骨折治疗剂、骨移植材料、骨填充材料用于临床，。然而骨形态发生蛋白不仅非常昂贵，而且需要大量使用，因此将这种蛋白质用于骨移植或骨填充的情况下，费用高，在普遍使用上受到限制。
发明内容
要解决的技术问题
本发明人通过活化成骨细胞，并诱导成骨，广泛地检索了能够有效地适用于骨移植用或骨填充用组合物的物质。特别是由源自安全性优异的天然物（覆盆子）的化合物设计出多种衍生物，并对成骨诱导活性进行了评价。其结果，惊讶地发现，二羟基苯甲酸衍生物，特别是羟基在苯甲酸的2,4-位置或2,5位置上被取代时，碱性磷酸酶活性、钙蓄积率及牙槽骨形成能力显著地增加。
据此，本发明提供一种包含二羟基苯甲酸衍生物的骨移植用或骨填充用组合物。
技术方案
根据本发明的一个实施方式，提供一种骨移植用或骨填充用组合物，其包含选自2,3-二羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸、2,5-二羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸乙酯、3,5-二羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸乙酯、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、2,5-二羟基苯甲酸乙酯、2,6-二羟基苯甲酸乙酯及3,5-二羟基苯甲酸乙酯中的1种以上的二羟基苯甲酸衍生物。
根据上述的骨移植用或骨填充用组合物，所述二羟基苯甲酸衍生物优选3,4-二羟基苯甲酸乙酯、2,4-二羟基苯甲酸乙酯或2,5-二羟基苯甲酸乙酯，特别优选2,4-二羟基苯甲酸乙酯或2,5-二羟基苯甲酸乙酯。所述骨移植用或骨填充用组合物，其可以为人造骨、人造关节、骨接合剂或骨修复材料形态，此外，可以为人工牙、牙周组织修复材料、牙齿修复材料或牙科用种植体形态，更优选为牙科用种植体形态。
发明效果
通过本发明，发现二羟基苯甲酸衍生物，在骨形成、骨折恢复及牙齿生长和发育过程中，通过促进必要的成骨细胞活性，可以作为骨移植用或骨填充用组合物而有效地使用。特别是2,4-二羟基苯甲酸乙酯及2,5-二羟基苯甲酸乙酯表现出显著增加的碱性磷酸酶的活性、钙蓄积率及牙槽骨的形成能力。因此，上述2,4-二羟基苯甲酸乙酯及2,5-二羟基苯甲酸乙酯等二羟基苯甲酸衍生物可以有效地用于人造骨、人造关节、骨接合剂、骨替代材料、骨修复材料等整形外科用骨移植及骨填充；及人工牙、牙周组织修复材料、牙齿修复材料、牙科用种植体等牙科用骨移植及骨填充上。
具体实施方式
本发明提供一种骨移植用或骨填充用组合物，其包含选自2,3-二羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸、2,5-二羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸乙酯、3,5-二羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸乙酯、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、2,5-二羟基苯甲酸乙酯、2,6-二羟基苯甲酸乙酯及3,5-二羟基苯甲酸乙酯中的1种以上的二羟基苯甲酸衍生物。
本发明人用源自覆盆子的化合物设计出多种衍生物，并对骨形成诱导活性进行了评价。特别是设计出去除了酯键的被水解的形态及羟基取代基的取代位置不同的多种衍生物，并对成骨诱导活性进行了评价。其结果，非常惊讶地发现，多种二羟基苯甲酸衍生物，特别是羟基在苯甲酸的2,4-位置或2,5位置上被取代时，碱性磷酸酶的活性、钙蓄积率及牙槽骨的形成能力显著地增加。因此，上述2,4-二羟基苯甲酸乙酯、2,5-二羟基苯甲酸乙酯等二羟基苯甲酸的衍生物，可以经济地、有效地用于整形外科、牙科用骨移植及骨填充用组合物上。
在上述二羟基苯甲酸衍生物中，优选3,4-二羟基苯甲酸乙酯、2,4-二羟基苯甲酸乙酯或2,5-二羟基苯甲酸乙酯，特别优选的化合物为2,4-二羟基苯甲酸乙酯（下述化学式1所示的化合物）、2,5-二羟基苯甲酸乙酯（下述化学式2所示的化合物）或它们的混合物。
[化学式1]
Figure BDA00002325816700051
[化学式2]
Figure BDA00002325816700061
本发明的组合物可以是适合用于整形外科的形态，即，可以是通常适用于骨折等患者上的骨移植及骨填充形态，例如，可以是人造骨（artificial bone）、人造关节（artificial joint）、骨接合剂（bone cement）或骨修复材料（bone substitute）形态。
例如，人造骨或人造关节的情况下，可以通过在钛等金属；或在羟基磷灰石、TCP（磷酸三钙）陶瓷、生物玻璃、碳陶瓷、氧化铝成分等非金属表面上，涂布上述二羟基苯甲酸的衍生物或通过混合来成形为人造骨或人造关节的形态，或通过在由上述金属或非金属成形的人造骨或人造关节表面上，涂布上述二羟基苯甲酸衍生物来形成。上述涂布可以通过将上述金属或非金属浸渍到含有二羟基苯甲酸衍生物的溶液（例如水性溶液）中，或通过喷涂并干燥，得以实施。
此外，骨接合剂的情况下，可以通过在羟基磷灰石、TCP（磷酸三钙）陶瓷、生物玻璃、碳陶瓷、氧化铝成分、聚甲基丙烯酸甲酯（PolyMetaMethylAcrylate，PMMA）及聚乳酸或其共聚物等的非金属表面上，涂布上述二羟基苯甲酸的衍生物或混合来成形为骨接合剂的形态。上述涂布通过将上述非金属浸渍到含有二羟基苯甲酸衍生物的溶液（例如水性溶液）中，或通过喷涂并干燥，得以实施。
此外，骨修复材料（或可以称为“骨替代剂”）的情况下，可以通过在羟基磷灰石、TCP（磷酸三钙）陶瓷、生物玻璃、碳陶瓷、氧化铝成分，聚甲基丙烯酸甲酯及聚乳酸或它们的共聚物等的非金属表面上，涂布上述二羟基苯甲酸的衍生物或混合来成形为骨修复材料的形态，或通过在由上述非金属成形的骨修复材料表面上，涂布上述二羟基苯甲酸衍生物来形成。上述涂布通过将上述非金属浸渍到含有二羟基苯甲酸衍生物的溶液（例如水性溶液）中，或通过喷涂并干燥，得以实施。
在根据本发明的用于整形外科的骨移植用及骨填充用组合物中，上述二羟基苯甲酸衍生物优选3,4-二羟基苯甲酸乙酯、2,4-二羟基苯甲酸乙酯或2,5-二羟基苯甲酸乙酯。优选地，2,4-二羟基苯甲酸乙酯或2,5-二羟基苯甲酸乙酯的使用量可以根据患者的年龄、疾病的程度等有所不同，例如对成人可以在1mg/kg~2000mg/kg的范围内使用，根据需要可以分为1~3次使用。
本发明的组合物也可以为用于牙科的适宜形态，即，可以为通常适用于牙齿骨折、牙周疾病（例如，上颌窦及下颌窦牙槽骨缺损等）等患者的骨移植及骨填充形态，例如，人工牙（artificial tooth）、牙周组织修复材料（periodontal tissue regenerate）、牙齿修复材料（toothregenerate）或牙科用种植体（dental implant）形态。
例如，人工牙或牙科用种植体的情况下，可以通过在钛等金属或非金属表面上，涂布上述二羟基苯甲酸的衍生物或混合来成形为人工牙或牙科用种植体的形态，或通过在由上述金属或非金属成形的人工牙或牙科用种植体表面上，涂布上述二羟基苯甲酸衍生物来形成。上述涂布可以通过将上述金属或非金属浸渍到含有二羟基苯甲酸衍生物的溶液（例如水性溶液）中，或通过喷涂并干燥，得以实施。
此外，牙周组织修复材料或牙齿修复材料的情况下，可以通过在羟基磷灰石、TCP（磷酸三钙）陶瓷、生物玻璃、碳陶瓷、氧化铝成分，聚甲基丙烯酸甲酯及聚乳酸或其共聚物等非金属表面上，涂布上述二羟基苯甲酸的衍生物或混合来成形为牙周组织修复材料或牙齿修复材料的形态。上述涂布可以通过将上述非金属浸渍到含有二羟基苯甲酸衍生物的溶液（例如水性溶液）中，或通过喷涂并干燥，得以实施。
优选地，用于牙科的骨移植或骨填充用组合物为包含上述的二羟基苯甲酸衍生物的牙科用种植体形态，优选包含3,4-二羟基苯甲酸乙酯、2,4-二羟基苯甲酸乙酯或2,5-二羟基苯甲酸乙酯的牙科用种植体形态，特别优选包含2,4-二羟基苯甲酸乙酯或2,5-二羟基苯甲酸乙酯的牙科用种植体的形态。在根据本发明的用于牙科的骨移植及骨填充用组合物中，上述二羟基苯甲酸衍生物的使用量根据患者的年龄、疾病的程度等会有所不同，例如，对成人可以在1mg/kg~2000mg/kg的范围内使用，根据需要也可以分为1~3次使用。
下面，通过实施例对本发明更详细地进行说明。但是这些实施例只是为了例示本发明，本发明的范围并不仅限于这些实施例。
实施例1化合物的设计
设计了包含有3,4-二羟基苯甲酸酯化合物的多种衍生物，并对成骨诱导活性进行了评价。上述化合物包含去除了酯键的被水解的形态及羟基取代基的取代位置不同的衍生物，上述化合物的化学名称及结构式如下表1所示。表1所示的化合物均为公知的化合物，购自西格玛奥德里奇公司。
表1
Figure BDA00002325816700081
Figure BDA00002325816700091
实施例2碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性测定
将成骨细胞株MC3T3-E1细胞（RIKEN细胞库，日本），在96-孔板上以每孔5×103个细胞的量进行接种，培养12小时后，去除培养基，加入了添加有作为成骨细胞分化因子的β-甘油磷酸盐（β-glycerophosphate）和抗坏血酸（ascorbic acid）的α-MEM培养基。将实施例1的化合物添加到培养液中，使最终浓度分别为5ug/ml，培养7天。在培养的细胞中添加100ul细胞裂解液（cell lysis buffer，Sigma代码MCL1）后，在37℃下处理30分钟。将所得到的50ul细胞处理液，在底物对硝基苯磷酸二乙酯（nitrophenyl phosphate）存在下，与0.1N甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH 9.8）一起，在37℃下反应30分钟，利用酶标仪（美国宝特仪器有限公司，Bio-Tek instrument），在405nm下测定吸光度，计算从底物中游离出的对硝基苯酚（p-nitrophenol）的量。阳性对照组用BMP2进行了处理，使得最终浓度为100ng/ml，根据与没有使用化合物进行处理的阴性对照组相对吸光度差异，计算出碱性磷酸酶的活性度。其结果如表2所示。
表2
化合物代号 成骨细胞碱性磷酸酶活性度(%)
阴性对照组 100
阳性对照组（BMP2） 150
NP21 147
NP22 153
NP23 152
NP31 200
NP32 155
NP33 430
NP34 149
NP35 560
NP36 157
NP37 153
从上述表2的结果，可知实施例1中设计的二羟基苯甲酸衍生物显示出了优异的ALP活性，羟基在苯甲酸的2,4-位置或2,5-位置上被取代的NP33及NP35的化合物表现出了最高的ALP活性。
实施例3测定成骨细胞的试管内（体外（invitro）)的骨形成（bonenodule）
将成骨细胞株MC3T3-E1细胞（RIKEN细胞库，日本），在24-孔板上以每孔2×103个细胞的量进行接种，培养24小时后，替换为添加有作为成骨细胞分化因子的β-甘油磷酸盐和抗坏血酸的α-MEM培养基。将实施例1的化合物添加到培养液中，使最终浓度分别为5ug/ml，每3天~4天更换一次培养基，培养27天。阳性对照组用BMP2进行了处理，使得最终浓度为100ng/ml，，阴性对照组没有用化合物进行处理。为了定量地测定蓄积在细胞内的钙（Ca）的量，将细胞用生理盐水清洗后，用0.5N HCl溶液进行处理，在搅拌培养箱内对钙进行提取，共提取6小时。将100ul提取液，在钙试剂（CalciumReagent，美国西格玛奥德里奇公司）存在下，反应5分钟后，利用酶标仪（美国宝特仪器有限公司，Bio-Tek instrument），在575nm下测定了吸光度。根据与没有使用化合物进行处理的阴性对照组的相对吸光度差异，计算出蓄积在细胞内的钙的量。其结果如下表3所示。
表3
化合物代号 钙的蓄积率
阴性对照组 100
阳性对照组（BMP2） 160
NP21 132
NP22 159
NP23 163
NP31 180
NP32 163
NP33 420
NP34 158
NP35 580
NP36 160
NP37 159
从上述表3的结果，可知实施例1中设计的二羟基苯甲酸衍生物表现出了优异的细胞内钙蓄积率，羟基在苯甲酸的2,4-位置或2,5-位置上被取代的NP33及NP35的化合物表现出了最高的细胞内钙蓄积率。
实施例4牙槽骨（alveolar bone）形成能力试验
将实施例1的化合物分别溶于生理盐水中，使浓度为1mg/ml进行准备，将主要用作骨移植材料的胶原成分小珠（bead）（直径：1×2mm，Gibco公司）在37℃下，使其浸沉45分钟。包含在小珠中的化合物溶液的量约为1-2ul，化合物浓度约为1-2ug左右。在从鼠分离出的牙根生成前的下颌骨的臼齿上，使用小镊子将浸湿有化合物的小珠植入到牙髓（dental pulp）的中央后，移植到了雌鼠（C57BL/6）的肾脏（kidney）中。将生长3周后的臼齿，用福尔马林溶液固定，再用Morse's溶液进行染色，用显微镜（Olympus IX71）将染色的部位的影像进行影像化，通过测定影像的面积（imageWarp软件,英国伦敦），将阴性对照组设为100，用百分比评价了对牙槽骨形成的影响。
其结果如表4所示。
表4
化合物代号 牙槽骨形成（%）
灭菌生理盐水 100
阳性对照组（BMP2） 120
NP21 110
NP22 121
NP23 119
NP31 150
NP32 123
NP33 300
NP34 130
NP35 450
NP36 121
NP37 122
由上述表4的结果，可知实施例1中设计的二羟基苯甲酸衍生物表现出了优异的牙槽骨形成能力，羟基在苯甲酸的2,4-位置或2,5-位置上被取代的NP33及NP35的化合物表现出了最高的牙槽骨形成能力。
实施例5细胞毒性试验
为了确认实施例1中设计的化合物的细胞毒性，将L929细胞（RIKEN细胞库，日本），在96-孔板上以每孔1×104个细胞的量进行接种，培养12小时后，以一定的浓度用化合物进行处理，培养48小时。培养后，去除培养基，用MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四氮唑溴盐）溶液，以每孔100μl进行处理，培养4小时。在培养结束后，去除上清液，用DMSO溶液以每孔100μl进行处理，在室温下反应10分钟，提取沉淀的染色剂，利用酶标仪（美国宝特仪器有限公司，Bio-Tek instrument），在550nm下测定了吸光度。通过与没有用化合物进行处理的对照组进行比较分析，确定CC50（半数细胞毒性浓度（Concentration）50%）。其结果如下表5所示。
表5
化合物代码 牙槽骨形成（%）
DMSO-
NP21 150
NP22 150
NP23 200
NP31 100
NP32 150
NP33 100
NP34 150
NP35 150
NP36 200
NP37 150
由上述表4的结果，可知实施例1中设计的二羟基苯甲酸衍生物，其CC50值为100ug/ml以上，毒性低。

Claims (6)

1.一种骨移植用或骨填充用组合物，其包含选自2,3-二羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸、2,5-二羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸乙酯、3,5-二羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸乙酯、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、2,5-二羟基苯甲酸乙酯、2,6-二羟基苯甲酸乙酯及3,5-二羟基苯甲酸乙酯中的1种以上的二羟基苯甲酸衍生物。
2.根据权利要求1所述的骨移植用或骨填充用组合物，其特征在于，所述二羟基苯甲酸衍生物为3,4-二羟基苯甲酸乙酯、2,4-二羟基苯甲酸乙酯或2,5-二羟基苯甲酸乙酯。
3.根据权利要求1所述的骨移植用或骨填充用组合物，其特征在于，所述二羟基苯甲酸衍生物为2,4-二羟基苯甲酸乙酯或2,5-二羟基苯甲酸乙酯。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的骨移植用或骨填充用组合物，其为人造骨、人造关节、骨接合剂或骨修复材料形态。
5.根据权利要求1~3中任一项所述的骨移植用或骨填充用组合物，其为人工牙、牙周组织修复材料、牙齿修复材料或牙科用种植体形态。
6.根据权利要求5所述的骨移植用或骨填充用组合物，其为牙科用种植体形态。
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