CN102877147A - 胶原蛋白水溶液静电纺丝制备纳米纤维的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胶原蛋白水溶液静电纺丝制备纳米纤维的方法，其特点是将分子量大于或等于250KDa的重建胶原蛋白纤维20～300重量份，加入到用酸调节pH值为2~4的酸性水溶液1000重量份中，在温度4~30℃，采用磁力或机械搅拌溶解成均匀的溶液，制得静电纺丝原液；再将上述静电纺丝原液在电场强度为140~360kV/m；喷丝孔直径为5~7mm；接收距离为5～9cm；纺丝速率为0.2～0.5ml/h，进行静电纺丝，获得胶原蛋白纳米纤维。该胶原蛋白纳米纤维的制备过程无毒、无污染，制备得到的胶原蛋白纳米纤维变性程度低、理化性质稳定、无细胞毒性、具有生物活性及成本低廉的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种胶原蛋白水溶液静电纺丝制备纳米纤维的方法，属于生物医用材料、组织工程支架和药物缓释材料的制备领域。
背景技术
纺丝技术中胶原蛋白的静电纺丝是最令人关注的问题之一。胶原蛋白是动物结缔组织的重要组成部分，存在于组织与器官中。作为一种天然大分子，用作生物材料具有促进细胞生长、低抗原性、生物可降解性等等一系列的优点。在组织工程、药物缓释以及医疗器械等研究与开发中，获得胶原蛋白纳米级纤维富有吸引力，它是这些研究工作或产品开发的基础。令人遗憾的是，胶原蛋白的静电纺丝至今仍未找到满意的技术方法。
静电纺丝技术的关键技术之一就是大分子溶液的溶剂体系，对于易变性的蛋白质（如胶原蛋白）来说尤为重要。2002年Jamil A.Matthews用六氟异丙醇（HFP）作溶剂，首次将胶原蛋白的六氟异丙醇溶液用静电纺丝方法得到纳米纤维（Jamil A.Matthews,Gary E.Wnek,David G.Simpson,and Gary L.Bowlin.Electrospinning of Collagen Nanofibers.Biomacromolecules.2002:3:232-238）。但随后Dimitrios等研究发现，用六氟异丙醇作溶剂得到的纤维部分丧失了胶原蛋白分子三螺旋结构特性，以至于认为胶原蛋白含氟溶剂体系的静电纺丝是一种昂贵的制备明胶纤维方法（Dimitrios I.Zeugolis,Shih T.Khew d,Elijah S.Y.Yew,Andrew K.Ekaputra,Yen W.Tong,Lin-Yue L.Yung,Dietmar W.Hutmacher,Colin Sheppard,Michael Raghunat.Electro-spinning of pure collagen nano-fibres:Just an expensive way to make gelatin Biomaterials.2008:29:2293-2305）。2009年Gary E Wnek设计一种新的磷酸盐缓冲液（PBS）/乙醇溶剂体系进行胶原蛋白静电纺丝，这种方法是想通过高浓度的PBS提高溶液的导电率，乙醇加快溶剂挥发速度（Bin Dong,Olivier Arnoult,Meghan E.Smith,Gary E.Wnek.Electrospinning of Collagen Nanofiber Scaffolds from Benign Solvents.Macromol.Rapid Commun.2009:30:539-542）。但是高浓度的PBS会很快使胶原蛋白凝胶化，并堵塞喷丝口。同时切除掉端肽之后的重建胶原，很容易在有机溶剂（乙醇等）中变性。
静电纺丝过程中溶剂及产品中残余溶剂的毒性是用各种含氟溶剂面临的极难解决的问题。无论静电纺丝过程中加入细胞、细胞因子或生长因子，或纺丝产品作为药物、基因载体、细胞支架及器械，溶剂或残余溶剂的毒性（如各种含氟溶剂）都是不可忽视的问题，各种除去静电纺丝产品残余溶剂方法都可能导致胶原变性、生长因子失活、细胞死亡。由此可见，溶剂体系使胶原蛋白变性、残留物细胞毒性、凝胶堵塞以及价格昂贵等等问题阻碍了胶原蛋白静电纺丝，寻找或发明一种新的能保证胶原蛋白活性的，无细胞毒性的、价格低廉的溶剂体系用于胶原蛋白静电纺丝有着十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种胶原蛋白水溶液静电纺丝制备纳米纤维的方法，其特点是该方法采用胶原蛋白的酸性水溶液进行静电纺丝，制备得到胶原蛋白纳米纤维，具有不变性、理化性质稳定、无细胞毒性、具生物活性以及成本低廉的优点。
本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外均为重量份数。
胶原蛋白纳米纤维的制备方法包括以下步骤：
（1）胶原蛋白静电纺丝原液的制备
将分子量大于或等于250KDa的重建胶原蛋白纤维20～300重量份，加入到用酸调节pH值为2～4的酸性水溶液1000重量份中，在温度4～30℃，采用磁力或机械搅拌溶解成均匀的溶液，制得静电纺丝原液；
（2）胶原蛋白纳米纤维的静电纺丝
将上述静电纺丝原液在电场强度为140～360KV/m；喷丝孔直径为5～7mm；接收距离为5～9cm；纺丝速率为0.2～0.5ml/h的条件下进行静电纺丝，获得胶原蛋白纳米纤维。
所述重建胶原蛋白纤维的分子量大于或等于250KDa。
所述的酸为柠檬酸、甲酸、醋酸、草酸、乳酸、磷酸、盐酸、硝酸、硫酸及其上述酸的金属盐中的至少一种。
所述胶原蛋白纳米纤维的制备方法制备得到的胶原蛋白纳米纤维。
所述胶原蛋白纳米纤维用于生物医用材料、组织工程、药物缓释、纳米传感器和过滤领域。
性能测试：
1、采用扫描电镜观察胶原纤维
如图1所示，结果表明胶原纤维为纳米级纤维。
2、采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的方法分析
如图2所示，结果表明胶原蛋白的三螺旋结构较完整，与未经过静电纺丝过程的胶原蛋白比较，变性率小于10%。
3、采用红外光谱分析
如图3所示，结果表明胶原蛋白的三螺旋结构较完整，与未经过静电纺丝过程的胶原蛋白比较，变性率小于20%。
本发明具有如下优点：
胶原蛋白纳米纤维的制备过程无毒、无污染，制备得到的胶原蛋白纳米纤维变性程度低、理化性质稳定、无细胞毒性、具有生物活性及成本低廉的优点。
附图说明
图1为胶原蛋白静电纺丝纤维扫描电镜照片
纯胶原纳米纤维，纤维直径范围为60-300nm。
图2为酸性溶液和HFP溶液静电纺丝后胶原蛋白材料的SDS-PAGE分析图
a：胶原对照样，b：主要溶剂为六氟异丙醇（HFP），c：主要溶剂为醋酸。
d，e，f分别是a，b，c胃蛋白酶处理后的样品材料。
变性率的计算方法为胃蛋白酶处理后αI带含量减少的百分比。
图3为酸性溶液和HFP溶液静电纺丝胶原蛋白后材料的红外光谱分析图
NC：胶原对照样，HFP：主要溶剂为六氟异丙醇，HAc：主要溶剂为醋酸，Gelatin：明胶。
变性率的计算方法以A（1235cm-1）/A(1450cm-1)的比值在1.0左右时，胶原的三螺旋结构保持完整，完全降解的明胶（认为三螺旋结构不存在）R＝A(1235cm-1)/A(1450cm-1)比值在0.5为基准计算。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。
实施例1
胶原蛋白纳米纤维的制备方法包括以下步骤：
（1）胶原蛋白静电纺丝原液的制备
将分子量大于或等于250KDa的重建胶原蛋白纤维20mg，加入到用醋酸调节pH值为 2的酸性水溶液1g中，在温度30℃，采用磁力或机械搅拌溶解成均匀的溶液，制得静电纺丝原液；
（2）胶原蛋白纳米纤维的静电纺丝
将上述静电纺丝原液在电场强度为360KV/m；喷丝孔直径为5mm；接收距离为9cm；纺丝速率为0.2ml/h，进行静电纺丝，获得胶原蛋白纳米纤维。
实施例2
胶原蛋白纳米纤维的制备方法包括以下步骤：
（1）胶原蛋白静电纺丝原液的制备
将分子量大于或等于250KDa的重建胶原蛋白纤维25mg，加入到用盐酸调节pH值为2的酸性水溶液1g中，在温度20℃，采用磁力或机械搅拌溶解成均匀的溶液，制得静电纺丝原液；
（2）胶原蛋白纳米纤维的静电纺丝
将上述静电纺丝原液在电场强度为340KV/m；喷丝孔直径为6mm；接收距离为7cm；纺丝速率为0.4ml/h，进行静电纺丝，获得胶原蛋白纳米纤维。
实施例3
胶原蛋白纳米纤维的制备方法包括以下步骤：
（1）胶原蛋白静电纺丝原液的制备
将分子量大于或等于250KDa的重建胶原蛋白纤维100mg，加入到用柠檬酸调节pH值为3的酸性水溶液1g中，在温度10℃，采用磁力或机械搅拌溶解成均匀的溶液，制得静电纺丝原液；
（2）胶原蛋白纳米纤维的静电纺丝
将上述静电纺丝原液在电场强度为280KV/m；喷丝孔直径为7mm；接收距离为8cm；纺丝速率为0.3ml/h，进行静电纺丝，获得胶原蛋白纳米纤维。
实施例4
胶原蛋白纳米纤维的制备方法包括以下步骤：
（1）胶原蛋白静电纺丝原液的制备
将分子量大于或等于250KDa的重建胶原蛋白纤维200mg，加入到用磷酸调节pH值为2.5的酸性水溶液1g中，在温度4℃，采用磁力或机械搅拌溶解成均匀的溶液，制得静电纺丝原液；
（2）胶原蛋白纳米纤维的静电纺丝
将上述静电纺丝原液在电场强度为220KV/m；喷丝孔直径为5mm；接收距离为8cm；纺丝速率为0.4ml/h，进行静电纺丝，获得胶原蛋白纳米纤维。
实施例5
胶原蛋白纳米纤维的制备方法包括以下步骤：
（1）胶原蛋白静电纺丝原液的制备
将分子量大于或等于250KDa的重建胶原蛋白纤维250mg，加入到用醋酸和醋酸钠调节pH值为3.5的酸性水溶液1g中，在温度15℃，采用磁力或机械搅拌溶解成均匀的溶液，制得静电纺丝原液；
（2）胶原蛋白纳米纤维的静电纺丝
将上述静电纺丝原液在电场强度为180KV/m；喷丝孔直径为6mm；接收距离为7cm；纺丝速率为0.5ml/h，进行静电纺丝，获得胶原蛋白纳米纤维。
实施例6
胶原蛋白纳米纤维的制备方法包括以下步骤：
（1）胶原蛋白静电纺丝原液的制备
将分子量大于或等于250KDa的重建胶原蛋白纤维300mg，加入到用乳酸调节pH值为4的酸性水溶液1g中，在温度25℃，采用磁力或机械搅拌溶解成均匀的溶液，制得静电纺丝原液；
（2）胶原蛋白纳米纤维的静电纺丝
将上述静电纺丝原液在电场强度为140KV/m；喷丝孔直径为7mm；接收距离为9cm；纺丝速率为0.4ml/h，进行静电纺丝，获得胶原蛋白纳米纤维。
Claims (5)
1.胶原蛋白纳米纤维的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
（1）胶原蛋白静电纺丝原液的制备
将分子量大于或等于250KDa的重建胶原蛋白纤维20～300重量份，加入到用酸调节pH值为2～4的酸性水溶液1000重量份中，在温度4～30℃，采用磁力或机械搅拌溶解成均匀的溶液，制得静电纺丝原液；
（2）胶原蛋白纳米纤维的静电纺丝
将上述静电纺丝原液在电场强度为140~360KV/m，喷丝孔直径为5～7mm，接收距离为5～9cm，纺丝速率为0.2～0.5ml/h的条件下进行静电纺丝，获得胶原蛋白纳米纤维。
2.如权利要求1所述胶原蛋白纳米纤维的制备方法，其特征在于所述重建胶原蛋白纤维的分子量大于或等于250KDa。
3.如权利要求1所述胶原蛋白纳米纤维的制备方法，其特征在于所述的酸为柠檬酸、甲酸、醋酸、草酸、乳酸、磷酸、盐酸、硝酸、硫酸及其上述酸的金属盐中的至少一种。
4.如权利要求1所述胶原蛋白纳米纤维的制备方法制备得到的胶原蛋白纳米纤维。
5.如权利要求4所述胶原蛋白纳米纤维用于生物医用材料、组织工程、药物缓释、纳米传感器和过滤领域。
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