CN102876799A - 用于检测mll相关融合基因的多重实时定量pcr试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测MLL相关融合基因的多重实时定量PCR试剂盒。该试剂盒中含有由序列表序列1、2和3所示的三种单链DNA组成的上游引物,由序列表序列19、20和21所示的三种单链DNA组成的TaqMan探针和由序列表序列4—18所示的十六种单链DNA组成的下游引物。本发明所提供的试剂盒可检测最常见的六种MLL相关融合基因,检测结果准确可靠,操作简便、省时,成本低;可用于急性白血病患者MLL相关融合基因的快速准确筛查,为帮助临床疾病的确诊、治疗方案的确定、寻找用于疗效评价的特异性分子标志及预后提供了重要的依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测MLL相关融合基因的多重实时定量PCR试剂盒。
背景技术
混合系白血病(mixed lineage leukemia,MLL)基因位于染色体11q23上,涉及11q23的染色体易位形成的MLL相关融合基因见于白血病,其与白血病的发生相关。MLL相关融合基因(+)的白血病具有以下特点:(1)不具有类型特异性,既见于急性淋巴细胞白血病(ALL)又见于急性髓性白血病(AML),在ALL及AML的发生率均不超过10%,不过超过70%的婴儿ALL具有MLL融合基因,因此无论是ALL还是AML均需要筛查MLL融合基因;(2)伙伴基因众多,目前已发现其伙伴基因超过50种,因此采用单一的PCR逐一检测各种类型的MLL融合基因费力、耗时,不具有临床应用价值。尽管伙伴基因众多但是发生率差异很大,其中最常见的前六种伙伴基因分别是AF4(位于染色体4q21)、AF9(位于染色体9p22)、ENL(位于染色体19p13.3)、AF10(位于染色体10p12)、AF6(位于染色体6q27)和ELL(位于染色体19p13.1),这六种的发生率占到了全部MLL相关融合基因的85-90%;(3)总体预后很差,除了其中的MLL-AF9型在2008版的WHO白血病诊断标准中被列为中度预后,其它类型均预示预后很差。因此临床上很有必要尽快确定是否具有MLL相关融合基因以及其伙伴基因,以指导临床选择合适的治疗方案,尽早开始治疗。
多重PCR的原理是在一个PCR反应管中含有针对多种融合基因的多对引物,通过优化反应条件来保证扩增的特异性和灵敏度,一旦有阳性扩增条带再通过分管分别扩增来最终确定融合基因类型。因此这种PCR尤其适合分布广泛但发生率不高的多个基因的同时筛查,既省力、省时又经济。而MLL融合基因正好符合这个特点,因此采用多重PCR适于对白血病患者进行MLL相关融合基因的初筛。
基于TaqMan探针的实时定量PCR(RQ-PCR)在过去的十年里得到了广泛的推广和应用,它与普通PCR相比,除了实现了真正意义的定量之外还具有以下优点:(1)特异性增强、灵敏度提高;(2)扩增过程中闭管操作,实时收集数据,降低了污染机会,减少假阳性结果;(3)无需电泳,缩短了操作时间;(4)通过定量内参基因来评价样本质量,减少了假阴性结果。
如果基于TaqMan探针的RQ-PCR与多重PCR相结合,就能兼具多重PCR和RQ-PCR的优点,在多重PCR基础上既增加了特异性和敏感性,又更加快速简单,因此是很具有临床应用价值的MLL相关融合基因检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测MLL相关融合基因mRNA的实时定量PCR试剂盒,所述试剂盒中含有用于实时定量PCR检测MLL相关融合基因mRNA的上游引物I、下游引物I和TaqMan探针I;
所述上游引物I由序列表序列1、2和3所示的三种单链DNA组成,分别位于MLL基因外显子7、9和8上;
所述TaqMan探针I由序列表序列19、20和21所示的三种单链DNA组成,分别位于MLL基因外显子7、9和8上;
所述下游引物I由如下1)—6)下游引物组合中的六种、任意五种、任意四种、任意三种、任意两种或任一种组成:
1)由序列表序列4、5和6所示的三种单链DNA组成,分别位于AF4基因外显子7和8、5和6上;
2)由序列表序列7和8所示的两种单链DNA组成,分别位于AF6基因外显子3和2上;
3)由序列表序列9、10、11和12所示的四种单链DNA组成,分别位于AF9基因外显子11、6、5和9上;
4)由序列表序列13、14和15所示的三种单链DNA组成,分别位于AF10基因外显子8和9、20和12上;
5)由序列表序列16所示的单链DNA组成,位于ELL基因外显子2上;
6)由序列表序列17和18所示的两种单链DNA组成,分别位于ENL基因外显子7和2上。
在上述试剂盒中,还可含有实时定量PCR检测内参基因ABL mRNA的上游引物Ⅱ、下游引物Ⅱ和TaqMan探针Ⅱ;
所述上游引物Ⅱ为序列表序列22所示的单链DNA;所述下游引物Ⅱ为序列表序列23所示的单链DNA;所述TaqMan探针Ⅱ的核苷酸序列如序列表序列24所示。
在上述试剂盒中,所述TaqMan探针I和Ⅱ的5’端连接有荧光报告基团FAM,3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
在上述试剂盒中,还可含有独立包装的荧光PCR的Master Mix。
在上述试剂盒中,还可含有阳性对照和/或阴性对照;
所述阴性对照为来源于健康人外周血单个核细胞的cDNA;
所述阳性对照为来源于MLL/AF4型白血病患者外周血单个核细胞的cDNA,和/或来源于MLL/AF6型白血病患者外周血单个核细胞的cDNA,和/或来源于MLL/AF9型白血病患者外周血单个核细胞的cDNA,和/或来源于MLL/AF10型白血病患者外周血单个核细胞的cDNA,和/或来源于MLL/ENL型白血病患者外周血单个核细胞的cDNA,和/或来源于MLL/ELL型白血病患者外周血单个核细胞的cDNA;
所述MLL/AF4型白血病患者为11q23染色体发生易位后形成的融合基因中包含了MLL和AF4基因的部分或全部;
所述MLL/AF6型白血病患者为11q23染色体发生易位后形成的融合基因中包含了MLL和AF6基因的部分或全部;
所述MLL/AF9型白血病患者为11q23染色体发生易位后形成的融合基因中包含了MLL和AF9基因的部分或全部;
所述MLL/AF10型白血病患者为11q23染色体发生易位后形成的融合基因中包含了MLL和AF10基因的部分或全部;
所述MLL/ENL型白血病患者为11q23染色体发生易位后形成的融合基因中包含了MLL和ENL基因的部分或全部;
所述MLL/ELL型白血病患者为11q23染色体发生易位后形成的融合基因中包含了MLL和ELL基因的部分或全部。
本发明所提供的试剂盒具有以下优点:
1、覆盖面广:本试剂盒包含最常见的六种MLL相关融合基因,覆盖了85%的全部MLL相关融合基因。
2、准确可靠:本试剂盒采用的是基于TaqMan探针的RQ-PCR,保证了扩增的特异性;此外,在利用多重RQ-PCR体系检测到阳性结果后,进一步分管操作分别检测,来确定融合基因类型,同时起到对多重结果的验证作用。
3、操作简便、省时,成本低:采用一管多重RQ-PCR体系同时筛查最常见的6种MLL相关融合基因,若为阴性,无需再分管操作,即可获得最终结果;扩增结束即可知道结果,无需电泳过程;此外,实验体系仅为10μl,亦降低了成本。
本发明所提供的试剂盒可用于急性白血病患者MLL相关融合基因的快速准确筛查,为帮助临床疾病的确诊、治疗方案的确定、寻找用于疗效评价的特异性分子标志及预后提供了重要的依据。
附图说明
图1为利用实施例1试剂盒检测9例来自不同患者的待测样品扩增产物的测序及比对结果。其中,A-I分别代表9例来自不同患者的结果。
图2为利用实施例1试剂盒检测1号患者cDNA样品的结果。其中,a图为扩增体系Ⅰ的结果,b图为扩增体系Ⅰ-1的结果。
图3为利用实施例1试剂盒的扩增体系Ⅰ检测3号患者cDNA样品的灵敏度。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
荧光PCR的Master mix:购自美国ABI公司。
实施例1、检测MLL相关融合基因的多重实时定量PCR试剂盒
一、MLL相关融合基因的实时定量PCR(RQ-PCR)扩增体系
1、多重MLL相关融合基因的实时定量PCR(RQ-PCR)扩增体系Ⅰ组成
1)上游引物Ⅰ:3条位于MLL基因上的引物1、2及3,反应终浓度各为0.3μM;
2)下游引物Ⅰ:15条分别位于六个伙伴基因上的引物4—18,反应终浓度各为0.3μM;
3)TaqMan探针Ⅰ:3条位于MLL基因上的TaqMan探针19—21,反应终浓度各为0.2μM;
4)荧光PCR的Master mix。
2、MLL-AF4融合基因的RQ-PCR扩增体系Ⅰ-1组成
1)上游引物Ⅰ:3条位于MLL基因上的引物1、2及3,反应终浓度各为0.3μM;
2)下游引物Ⅰ-1:3条位于AF4基因上的引物4—6,反应终浓度各为0.3μM;
3)TaqMan探针Ⅰ:3条位于MLL基因上的TaqMan探针19—21,反应终浓度各为0.2μM;
4)荧光PCR的Master mix。
3、MLL-AF6融合基因的RQ-PCR扩增体系Ⅰ-2组成
1)上游引物Ⅰ:3条位于MLL基因上的引物1、2及3,反应终浓度各为0.3μM;
2)下游引物Ⅰ-2:2条位于AF6基因上的引物7和8,反应终浓度各为0.3μM;
3)TaqMan探针Ⅰ:3条位于MLL基因上的TaqMan探针19—21,反应终浓度各为0.2μM;
4)荧光PCR的Master mix。
4、MLL-AF9融合基因的RQ-PCR扩增体系Ⅰ-3组成
1)上游引物Ⅰ:3条位于MLL基因上的引物1、2及3,反应终浓度各为0.3μM;
2)下游引物Ⅰ-3:4条位于AF9基因上的引物9—12,反应终浓度各为0.3μM;
3)TaqMan探针Ⅰ:3条位于MLL基因上的TaqMan探针19—21,反应终浓度各为0.2μM;
4)荧光PCR的Master mix。
5、MLL-AF10融合基因的RQ-PCR扩增体系Ⅰ-4组成
1)上游引物Ⅰ:3条位于MLL基因上的引物1、2及3,反应终浓度各为0.3μM;
2)下游引物Ⅰ-4:3条位于AF10基因上的引物13-15,反应终浓度各为0.3μM;
3)TaqMan探针Ⅰ:3条位于MLL基因上的TaqMan探针19-21,反应终浓度各为0.2μM;
4)荧光PCR的Master mix。
6、MLL-ELL融合基因的RQ-PCR扩增体系Ⅰ-5组成
1)上游引物Ⅰ:3条位于MLL基因上的引物1、2及3,反应终浓度各为0.3μM;
2)下游引物Ⅰ-5:1条位于AF10基因上的引物16,反应终浓度各为0.3μM;
3)TaqMan探针Ⅰ:3条位于MLL基因上的TaqMan探针19—21,反应终浓度各为0.2μM;
4)荧光PCR的Master mix。
7、MLL-ENL融合基因的RQ-PCR扩增体系Ⅰ-6组成
1)上游引物Ⅰ:3条位于MLL基因上的引物1、2及3,反应终浓度各为0.3μM;
2)下游引物Ⅰ-6:2条位于ENL基因上的引物17和18,反应终浓度各为0.3μM;
3)TaqMan探针Ⅰ:3条位于MLL基因上的TaqMan探针19—21,反应终浓度各为0.2μM;
4)荧光PCR的Master mix。
上述引物1-18及探针19-21的序列如表1所示。
表1.MLL相关融合基因RQ-PCR扩增的引物及探针序列
引物 | 名称 | 序列(5'-3') | 序列表 | 位置 |
1 | MLLF1 | CGCCTCAGCCACCTACTACAG | 序列1 | MLL的外显子7上 |
2 | MLLF2 | AGGAGAATGCAGGCACTTTGA | 序列2 | MLL的外显子9上 |
3 | MLLF3 | TCAGGTCCAGAGCAGAGCAAA | 序列3 | MLL的外显子8上 |
4 | AF4R1 | AGGTCGTCTTCGAGCATGGA | 序列4 | AF4的外显子7和8上 |
5 | AF4R2 | GCGGCCATGAATGGGTC | 序列5 | AF4的外显子5上 |
6 | AF4R3 | TTTGGTTTTGGGTTACAGAAC | 序列6 | AF4的外显子6上 |
7 | AF6R1 | TTCCCGATCATCTTTGTTC | 序列7 | AF6的外显子3上 |
8 | AF6R2 | CATCACTCCATGGAACTCCAAA | 序列8 | AF6的外显子2上 |
9 | AF9R1 | TCACGATCTGCTGCAGAATGT | 序列9 | AF9的外显子11上 |
10 | AF9R2 | TGGCAGGACTGGGTTGTTC | 序列10 | AF9的外显子6上 |
11 | AF9R3 | GCTGCTGCTGCTGGTATGAAT | 序列11 | AF9的外显子5上 |
12 | AF9R4 | GATTTGCTTTGCTTTATTGG | 序列12 | AF9的外显子9上 |
13 | AF10R1 | GGCAAACTGAGCGCATGTTAC | 序列13 | AF10的外显子8和9上 |
14 | AF10R2 | CTGGTTGATCATAGCGAATC | 序列14 | AF10的外显子20上 |
15 | AF10R3 | AGCGCTTCAATGATCCAGATATAGA | 序列15 | AF10的外显子12上 |
16 | ELLR1 | GCTTCCTTGAAATCGGATAG | 序列16 | ELL的外显子2上 |
17 | ENLR1 | GGAGTTGGACGGGCTTGAC | 序列17 | ENL的外显子7上 |
18 | ENLR2 | GGACAAACACCATCCAGTC | 序列18 | ENL的外显子2上 |
探针 | 名称 | 序列(5'-3') | 序列表 | 位置 |
19 | MLL-T1 | CGCCAAGAAAAGAAGTTCCCAAAACCACT | 序列19 | MLL的外显子7上 |
20 | MLL-T2 | CATCCTCAGCACTCTCTCCAATGGCAATA | 序列20 | MLL的外显子9上 |
21 | MLL-T3 | AGAAAAAAGTGGCTCCCCGCCCAA | 序列21 | MLL的外显子8上 |
注:探针的5’端连接有荧光报告基团FAM,3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
二、内参基因ABL的RQ-PCR扩增体系Ⅱ组成
1、上游引物Ⅱ(位于ABL外显子2):5’-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’(序列表序列22所示),终浓度为0.3μM;
2、下游引物Ⅱ(位于ABL外显子3):5’-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’(序列表序列23所示),终浓度为0.3μM;
3、TaqMan探针Ⅱ(位于ABL外显子3):5’-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-3’(序列表序列24所示),浓度为0.2μM,该TaqMan探针Ⅱ的5’端连接有荧光报告基团FAM,3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
4、荧光PCR的Master mix。
三、阴性对照及阳性对照
阴性对照:取离体的1例正常人外周血单个核细胞,提取总RNA并反转录为cDNA。
阳性对照1:取离体的1例经细胞形态学、免疫分型、染色体核型分析和RQ-PCR确诊为MLL/AF4型白血病患者的外周血单个核细胞,提取总RNA并反转录为cDNA。
阳性对照2:取离体的1例经细胞形态学、免疫分型、染色体核型分析和RQ-PCR确诊为MLL/AF6型白血病患者的外周血单个核细胞,提取总RNA并反转录为cDNA。
阳性对照3:取离体的1例经细胞形态学、免疫分型、染色体核型分析和RQ-PCR确诊为MLL/AF9型白血病患者的外周血单个核细胞,提取总RNA并反转录为cDNA。
阳性对照4:取离体的1例经细胞形态学、免疫分型、染色体核型分析和RQ-PCR确诊为MLL/AF10型白血病患者的外周血单个核细胞,提取总RNA并反转录为cDNA。
阳性对照5:取离体的1例经细胞形态学、免疫分型、染色体核型分析和RQ-PCR确诊为MLL/ENL型白血病患者的外周血单个核细胞,提取总RNA并反转录为cDNA。
阳性对照6:取离体的1例经细胞形态学、免疫分型、染色体核型分析和RQ-PCR确诊为MLL/ELL型白血病患者的外周血单个核细胞,提取总RNA并反转录为cDNA。
四、使用方法
1、取离体的待测病人的骨髓或外周血单个核细胞,提取总RNA并反转录,获得待测样品的cDNA。
2、取步骤1待测样品的cDNA,先用多重MLL相关融合基因的RQ-PCR扩增体系Ⅰ进行扩增,若无扩增产物,则判定待测样品呈阴性,无MLL相关融合基因;若有扩增产物,则判定待测样品呈阳性,有MLL相关融合基因,再将该待测样品分别用RQ-PCR扩增体系Ⅰ-1—Ⅰ-6进行第二轮扩增,有扩增产物的扩增体系即表明待测样品含有相应类型的MLL相关融合基因。
每个待测样品需同时用扩增体系Ⅱ扩增内参基因ABL,每批MLL的RQ-PCR所用的每种扩增体系均需扩增一个步骤三的阴性对照,每批MLL的RQ-PCR所用的每种扩增体系均需扩增一个步骤三的阳性对照;若待测样品在扩增体系Ⅱ中有扩增产物,且阴性对照在扩增体系Ⅰ及Ⅰ-1—Ⅰ-6中均无扩增产物,阳性对照在扩增体系Ⅰ及其相应的扩增体系Ⅰ-1—Ⅰ-6中有扩增产物,则说明结果有效,否则结果无效。
反应程序:50℃2min,1个循环;95℃10min,1个循环;95℃15s,62℃1min,40个循环。
反应体系:样品cDNA 1μL和扩增体系9μL混合。
五、储存条件
4℃避光储存1个月;-20℃避光储存1年。
实施例2、实施例1试剂盒的特异性检测
取离体的13例经临床、细胞形态学、免疫分型、细胞化学染色和染色体核型分析确诊为急性白血病患者的外周血单个核细胞,分别按照实施例1中步骤四的方法进行RQ-PCR检测,确定为阳性并确定出其伙伴基因。将得到的扩增产物测序,分析比对扩增产物序列在MLL的位置及其伙伴基因。
结果:有效,如表2、图1和图2所示。结果表明,实施例1的试剂盒具有一管扩增可检出MLL相关融合基因,进一步扩增可特异检出MLL/AF4、MLL/AF6、MLL/AF9、MLL/AF10、MLL/ELL和MLL/ENL六种常见MLL相关融合基因类型的特性。测序显示这13例患者共有6种融合类型(MLL/AF9有3例,MLL/AF10有2例,MLL/AF4有2例、MLL/AF6有2例、MLL/ELL有3例,MLL/ENL有1例),其中9例患者的测序结果如图1所示,测序结果与本试剂盒检测结果一致反映了本试剂盒的特异性很好。
图2为患者1的检测结果。利用多重MLL相关融合基因的实时定量PCR(RQ-PCR)扩增体系Ⅰ检测到有指数扩增(图2a),CT值=26.7,说明该患者具有本试剂盒所包含的MLL相关融合基因中的一种;为确定MLL的伙伴基因,再分别用扩增体系Ⅰ-1-Ⅰ-6检测各种类型,其中扩增体系Ⅰ-1(检测MLL/AF4)的扩增曲线如图2b所示,CT值=26.6,其余各管均无扩增,因此该患者具有MLL相关融合基因,类型为MLL/AF4。
表2.13例患者的检测结果
实施例3、实施例1试剂盒的灵敏度检测
取实施例2中MLL融合基因类型不同的6例患者的cDNA样品进行系列稀释(起始浓度记为1,稀释后的浓度依次记为:10-1、10-2、10-3、10-4),用实施例1的试剂盒扩增MLL相关融合基因,能够检测出MLL相关融合基因的cDNA稀释度即为该样品的检测灵敏度,灵敏度结果如表3所示,说明对于各种融合基因类型,灵敏度至少达到10。3号患者cDNA样品灵敏度检测的扩增曲线如图3所示。
表3.不同类型的6例患者cDNA样品的灵敏度检测结果
患者编号 | MLL融合基因类型 | 灵敏度 |
1 | MLL/AF4 | 10-3 |
3 | MLL/AF6 | 10-3 |
6 | MLL/AF9 | 10-4 |
8 | MLL/AF10 | 10-3 |
11 | MLL/ELL | 10-4 |
13 | MLL/ENL | 10-3 |
实施例4、实施例1试剂盒的准确率检测
取离体的711例经临床、细胞形态学、免疫分型和细胞化学染色确诊为急性白血病的患者的骨髓单个核细胞,提取总RNA并反转录为cDNA,作为待测样品。将上述711个待测样品分别按照实施例1中步骤四的方法进行RQ-PCR检测,结果有677例呈阴性,无MLL相关融合基因,有34例(4.8%)呈阳性,其中,MLL/AF4型的有11例,MLL/AF6型的有6例,MLL/AF9型的有11例,MLL/AF10型的有2例,MLL/ELL型的有3例,MLL/ENL型的有1例。这711份样本的染色体核型分析结果与本试剂盒检测结果的比较如表4所示。
表4.711例样本分别用实施例1试剂盒和染色体核型分析的检测结果比较
表4的结果表明:实施例1试剂盒与常规核型分析相比能够更加敏感而准确地检测到常见MLL相关融合基因类型。
Claims (5)
1.用于检测MLL相关融合基因mRNA的实时定量PCR试剂盒,其特征在于:所述试剂盒中含有用于实时定量PCR检测MLL相关融合基因mRNA的上游引物I、下游引物I和TaqMan探针I;
所述上游引物I由序列表序列1、2和3所示的三种单链DNA组成;
所述TaqMan探针I由序列表序列19、20和21所示的三种单链DNA组成;
所述下游引物I由如下1)—6)下游引物组合中的六种、任意五种、任意四种、任意三种、任意两种或任一种组成:
1)由序列表序列4、5和6所示的三种单链DNA组成;
2)由序列表序列7和8所示的两种单链DNA组成;
3)由序列表序列9、10、11和12所示的四种单链DNA组成;
4)由序列表序列13、14和15所示的三种单链DNA组成;
5)由序列表序列16所示的单链DNA组成;
6)由序列表序列17和18所示的两种单链DNA组成。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒中含有实时定量PCR检测内参基因ABL mRNA的上游引物Ⅱ、下游引物Ⅱ和TaqMan探针Ⅱ;
所述上游引物Ⅱ为序列表序列22所示的单链DNA;所述下游引物Ⅱ为序列表序列23所示的单链DNA;所述TaqMan探针Ⅱ的核苷酸序列如序列表序列24所示。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒,其特征在于:所述TaqMan探针I和Ⅱ的5’端连接有荧光报告基团FAM,3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂或试剂盒,其特征在于:所述试剂盒中含有独立包装的荧光PCR的Master Mix。
5.根据权利要求1-4中任一所述的试剂或试剂盒,其特征在于:所述试剂盒中含有阳性对照和/或阴性对照。
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2012
- 2012-10-18 CN CN201210397680.6A patent/CN102876799B/zh active Active
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