CN102876715B - 一种用于结核/hiv共感染基因治疗的逆转录病毒载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于结核/HIV共感染基因治疗的逆转录病毒载体及其应用。本发明分离出结核肽Ag85B_199–207(KLVANNTRL)特异的TCR基因和HIV-1肽Env_120-128(KLTPLCVTL)特异的TCR基因，进一步构建携带两种病原体表位特异TCR基因的逆转录病毒载体，将该逆转录病毒载体转染的CD8⁺T细胞，获得双TCR基因转染的T细胞。该T细胞具有双特异性，可针对Mtb和HIV-1两种病原体表位发生反应，并具有细胞因子分泌功能与杀伤活性。这种双特异性使得即使其中一种病原体发生突变产生免疫逃逸时，仍可对另一种病原体产生反应。该方法制备的逆转录病毒载体可应用于Mtb/HIV双重感染者的TCR基因治疗，为Mtb/HIV双重感染的过继细胞免疫治疗研究提供新的途径。

Description

一种用于结核 /HIV 共感染基因治疗的逆转录病毒载体及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种结核肽特异性T细胞受体（TCR）和一种HIV-1肽特异性TCR，以及利用这两种TCR制备得到的一种用于结核/HIV共感染基因治疗的逆转录病毒载体，该重组逆转录病毒载体转染得到的CD8⁺ T细胞及其在制备抗结核/HIV共感染药物中的应用。

背景技术

结核菌/艾滋病病毒双重感染（TB/HIV双重感染）是结核病和艾滋病防治工作面临的严峻挑战。据WHO报道：2010年全球880万新增结核病患者中，有110万（1/8）合并HIV感染，其中约1/3患者病情迅速恶化，短期内发生死亡。目前针对TB/HIV双重感染者的治疗主要是抗结核和抗病毒药物治疗，面临服用多种药物、毒副作用大、疗程长、易产生耐药性等问题，难以获得明显疗效，因此亟须开发对双重感染者行之有效的治疗方法！

在TB/HIV双重感染者体内，免疫系统功能被极大破坏，尤其是对结核患者具有重要保护作用的细胞免疫功能，在HIV感染时遭到严重破坏。由于CD4⁺ 1型辅助性T细胞(Th1)的快速损耗和CD8⁺ 细胞毒性T细胞(CTL)的细胞因子分泌功能和杀伤活性降低，T细胞介导的细胞免疫无法控制TB病菌和HIV病毒的复制和播散。

通过过继输注效应T细胞给免疫低下或免疫缺陷的患者，可将保护性免疫传递给受者，增强受者体内效应T细胞对靶抗原的特异性识别及杀伤能力并改善患者的免疫状态。有研究表明，过继输注效应T细胞给耐药结核患者可有效清除患者体内的结核分枝杆菌；将自体体外扩增的CD8⁺ CTL过继输注治疗HIV患者也已取得了明显的疗效。但TB/HIV双重感染者体内效应T细胞数量很少，体外分离及扩增难度极大，限制了其临床应用。

T细胞受体（T cell receptor，TCR）是T细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的效应分子。近年来，有学者分离抗原特异TCR基因并将其转导至初始T细胞中，使其获得特异性识别抗原的能力，可短期内产生大量抗原特异的效应T细胞，为过继细胞免疫治疗（adoptive cellular immunotherapy，ACT）提供了新途径。抗原特异TCR基因修饰T细胞过继输注治疗白血病、转移性黑色素瘤、巨细胞病毒感染、EB病毒感染等疾病已取得了鼓舞人心的效果，被证明是一种有前景的治疗策略。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于结核/HIV共感染基因治疗的逆转录病毒载体。

本发明的另一个目的是提供一种由上述逆转录病毒转染得到的CD8⁺ T细胞。

本发明的另一个目的是提供上述逆转录病毒载体及CD8⁺ T细胞在制备抗结核/HIV共感染药物中的应用。

本发明所采用的技术方案是：

一种用于结核/HIV共感染基因治疗的重组逆转录病毒载体，其含有可同时表达结核肽Ag85B_{199 – 207}特异性TCR和HIV-1肽Env_120-128特异性TCR的融合基因；所述结核肽Ag85B_{199 – 207}特异性TCR包括α1链和β1链，其中，α1链的CDR3区含有SEQ ID NO: 5所述的序列；β1链的CDR3区含有SEQ ID NO: 6所示的序列；所述HIV-1肽Env_120-128特异性TCR包括α2链和β2链，其中，α2链的CDR3区含有SEQ ID NO: 7所述的序列；β2链的CDR3区含有SEQ ID NO: 8所示的序列。

所述结核肽Ag85B_{199 – 207}特异性TCR的α1链是由SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性β1链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β1链是由SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性α1链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。

优选的，所述结核肽Ag85B_{199 – 207}特异性TCR的α1链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示，β1链的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。

所述HIV-1肽Env_120-128特异性TCR的α2链是由SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性β2链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β2链是由SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性α2链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。

优选的，所述HIV-1肽Env_120-128特异性TCR的α2链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 25所示，β2链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 21所示。

优选的，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 27所示。

所述重组逆转录病毒载体的出发载体为pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。

上述重组逆转录病毒载体经包装后得到的逆转录病毒。

上述逆转录病毒转染的CD8⁺ T细胞。

上述重组逆转录病毒载体、逆转录病毒、逆转录病毒转染的CD8⁺ T细胞在制备抗结核/HIV共感染药物中的应用。

实现上述技术方案的具体操作如下：

1 、筛选结核肽 Ag85B_{199 – 207} 特异的 TCR 与 HIV 肽Env_120-128 特异的 TCR

① 采用淋巴细胞分离液分离HLA-A*0201型健康志愿者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）；

② 计数PBMC，调整PBMC数目为1×10⁶/孔, 每孔细胞分别加入含结核肽Ag85B_{199 – 207}、HIV肽Env_120-12850ng/ml的10% FBS-1640 培养基2ml；

③ 贴壁培养2h后，加入25U/ml IL-2, 第3天补加IL-2 至50U/ml，第5天加入IL-2 100U/ml，之后以此浓度继续培养11天；

④ 磁珠分选出CD8⁺ T细胞，提取其mRNA，并逆转录为cDNA；

⑤ 互补决定区3（complementarity determining region3，CDR3）谱型分析检测刺激前后CDR3谱型，找出刺激后呈单克隆增生的结核肽Ag85B_{199 – 207}特异的TCR α、β基因家族与HIV肽Env_120-128特异的TCR α、β基因家族。

2、构建重组逆转录病毒载体

① 根据GeneBank报道的人TCR α、β基因家族上游可变区（variable region，V）和下游恒定区（constant region，C）基因序列，设计TCR α、β链全长基因上、下游引物，扩增出结核肽Ag85B_{199 – 207}特异的α13、β16和HIV肽Env_120-128特异的α11、β18全长基因；

② 设计C区突变位点上、下游引物，采用重组PCR方法将结核肽Ag85B_{199 – 207}特异的TCR α13、β16链C区的9个关键氨基酸进行突变（参照文献：Luo W. et al. Development of genetically engineered CD4⁺ and CD8⁺ T-cells expressing TCRs specific for a 38 kDa M. tuberculosis antigen. J Mol Med. 2011,89(9):903-13）；

③ 设计TCR α、β链C区下游与CD3ζ分子融合位点的重组引物，将HIV肽Env_120-128特异的TCR α11、β18基因片段与CD3ζ分子进行融合；

第②和第③步操作的目的在于在于减少内外源性TCR α、β链的错配，因为CD8⁺ T细胞存在内源性TCR α、β基因的表达，通过突变或者是通过以CD3ζ链替换α、β全长基因部分C区可以促使外源性α与β基因表达的蛋白正确装配成TCR蛋白分子并稳定表达在CD8⁺ T细胞表面，同时利于其竞争结合CD8⁺ T细胞表面的CD3分子，增强信号传导功能，提高修饰后CD8⁺ T细胞的抗结核活性。当然，此处还可以采取其他策略来减少内外源性TCR α、β链的错配，如：在外源性α、β基因C区引入二硫键（Boulter, J.M. et al. (2003) Stable, soluble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics. Protein Eng. 16, 707-711）；突变外源性α、β基因C区关键氨基酸以改变α、β链之间的静电荷（Voss, R.H. et al. (2008) Molecular design of the Cab interface favors specific pairing of introduced TCRab in human T cells. J. Immunol. 180, 391-401）；将外源性α、β基因V区合并为一条单链TCR并与CD3ζ链融合（Willemsen, R.A. et al. (2000) Grafting primary human T lymphocytes with cancer-specific chimeric single chain and two chain TCR. Gene Ther. 7, 1369-1377）；利用2A连接外源性α、β基因实现平衡表达（Leisegang M, Engels B, Meyerhuber P, Kieback E, Sommermeyer D, Xue SA, Reuss S, Stauss H, Uckert W. Enhanced functionality of T cell receptor-redirected T cells is defined by the transgene cassette. J Mol Med. 2008, 86:573-583.）等。

④ 利用重组PCR技术，将结核肽Ag85B_{199 – 207}特异的TCR α13、β16基因片段通过自剪切多肽P2A进行连接获得最小突变TCR；

⑤ 通过F2A上的AgeI酶切位点将HIV肽Env_120-128特异的α11-CD3ζ、β18-CD3ζ融合基因进行拼接。

⑥ 通过T2A上的AatII酶切位点将上述两条α链、两条β链基因片段进行连接。上述三种基因片段经测序鉴定后插入逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP并酶切鉴定；

⑦ 采用脂质体转染法，将三种重组逆转录病毒表达质粒pMX-hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-IRES-GFP、pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP、pMX-hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP分别与包膜蛋白质粒VSV-G共转染GP2-293；

⑧ 收集48h-72h病毒上清，低温超速离心浓缩纯化病毒；

⑨ 重组病毒感染NIH3T3细胞，流式细胞术检测病毒滴度，计算公式：病毒滴度（IU/ml）=NIH3T3细胞数×GFP阳性率/病毒浓缩液量（ml）。

3、鉴定重组逆转录病毒转染的CD8⁺ T细胞的抗结核和抗HIV活性

① 采用Ficoll密度梯度离心法，分离HLA-A*0201型供者外周血PBMC；

② 磁珠分选CD8⁺ T细胞；

③ IL-2和抗CD3单抗活化分选出的T细胞；

④ 按感染复数（multiplicity of infection, MOI）=13将上述三种重组逆转录病毒感染CD8⁺ T细胞；

⑤ 使用IL-2和抗CD3单抗刺激感染后的CD8⁺ T细胞；

⑥ 流式细胞术检测病毒感染后阳性细胞的百分比；

⑦ 测定病毒转染的CD8⁺ T细胞的抗TB和抗HIV活性：

实验设置以下十组：TB/HIV Td + DC组：TB/TCR和HIV/TCR共转染的CD8⁺ T细胞+DC；UnTd+Ag85B组：未转染CD8⁺ T细胞+负载结核肽Ag85B_{199 – 207}的DC；UnTd+Env组：未转染CD8⁺ T细胞+负载HIV肽Env_120-128的DC；EmTd+Ag85B组：空载体转染CD8⁺ T细胞+负载结核肽Ag85B_{199 – 207}的DC；EmTd+Env组：空载体转染CD8⁺ T细胞+负载HIV肽Env_120-128的DC；TB/HIV Td+CMVpp65组：TB/TCR和HIV/TCR共转染的CD8⁺ T细胞+负载无关肽CMVpp65的DC；TB Td+Ag85B组：结核特异TCR转染CD8⁺ T细胞+负载结核肽Ag85B_{199 – 207}的DC；TB/HIV Td+Ag85B组：TB/TCR和HIV/TCR共转染的CD8⁺ T细胞+负载结核肽Ag85B_{199 – 207}的DC；HIV Td+Env组：HIV特异TCR转染CD8⁺ T细胞+负载HIV肽Env_120-128的DC；TB/HIV Td+Env组：TB/TCR和HIV/TCR共转染的CD8⁺ T细胞+负载HIV肽Env_120-128的DC.

用酶联免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测上述各组细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α的分泌水平；用时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmuno-assay，TRFIA）检测CD8⁺ T细胞对DC的杀伤活性。

其中，CD8⁺ T细胞是人体内的一种细胞亚群，可由人外周血中分离获得，并进行体外扩增培养，分离和培养的实验设备要求低，技术成熟。

逆转录病毒载体是由一种逆转录病毒序列构建的基因运载工具，能够携带外源基因或DNA进入宿主细胞，并整合到染色体基因组上，目前已成为商业化产品，容易购买和获得。

重组逆转录病毒载体的构建方法为本领域常用的分子克隆技术，重组逆转录病毒转染方法是目前常用的生物技术手段，除本发明中使用的人工脂质体法外，还可以使用其它化学转染法，包括：DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法；以及物理方法，包括：显微注射、电穿孔、基因枪等。

本发明的有益效果在于：

本发明分离出结核肽Ag85B_{199 – 207}(KLVANNTRL)特异的TCR基因和HIV-1肽Env_120-128 (KLTPLCVTL)特异的TCR基因，构建携带两种病原体表位特异TCR基因的逆转录病毒载体，鉴定其转染的CD8⁺ T细胞的抗结核和抗HIV活性。结果表明双TCR基因转染的T细胞具有双特异性，可针对Mtb和HIV-1两种病原体表位发生反应，并具有细胞因子分泌功能与杀伤活性。这种双特异性使得即使其中一种病原体发生突变产生免疫逃逸时，仍可对另一种病原体产生反应。该方法制备的逆转录病毒载体可应用于Mtb/HIV双重感染者的TCR基因治疗，为Mtb/HIV双重感染的过继细胞免疫治疗研究提供新的途径。

附图说明

图1结核肽Ag85B_{199 – 207}与HIV肽Env_120-128刺激前后CD8⁺ T细胞TCR α和β链CDR3谱型分析；

图2 三种重组逆转录病毒载体构建示意图；

图3重组病毒载体质粒的酶切鉴定（a. pMX-hVb16mCb-P2A-hVa13mCa-IRES-GFP重组质粒的酶切鉴定；b. pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP重组质粒的酶切鉴定；c. pMX-hVb16mCb-P2A-hVa13mCa-T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP重组质粒的酶切鉴定；1-5泳道分别为：pMX-IRES-GFP空载体、pMX-IRES-GFP空载体的XhoI酶切产物、重组病毒载体质粒、重组病毒载体质粒的XhoI酶切产物、重组病毒载体质粒的XhoI+NotI双酶切产物）；

图4荧光显微镜观察重组病毒转染后NIH3T3细胞GFP的表达(×10)（a-c. pMX-hVb16mCb-P2A-hVa13mCa-T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ- IRES-GFP转染（TB/HIVTd）NIH3T3细胞GFP的表达；d-f. pMX-hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-IRES-GFP转染（TBTd）NIH3T3细胞GFP的表达；g-i. pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP转染（HIVTd）NIH3T3细胞GFP的表达；从左到右依次为明场、荧光、叠加图）；

图5流式细胞术检测重组病毒转染后NIH3T3细胞的GFP表达阳性率（a.未转染组；b. pMX-hVb16mCb-P2A-hVa13mCa-T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A- hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP转染组；c. pMX-hVβ16mCβ-P2A- hVα13mCα- IRES-

GFP转染组；d. pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP转染组）；

图6 荧光显微镜观察重组病毒转染后CD8⁺ T细胞GFP的表达（×10；EmTd：空载体转染组；TBTd、HIVTd、TB/HIVTd：重组病毒转染组）；

图7流式细胞术检测重组病毒转染后CD8⁺ T细胞GFP的表达（UnTd：未转染组；EmTd：空载体转染组；TBTd、HIVTd、TB/HIVTd：重组病毒转染组）；

图8 ELISA检测CD8⁺ T细胞IFN-γ的分泌水平；

图9ELISA检测CD8⁺ T细胞TNF-α的分泌水平；

图10 TRFIA检测CD8⁺ T细胞的杀伤活性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件操作，例如Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(第三版) (Sambrook J, Russell DW，Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例中，所有计量资料结果用±s表示，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）比较各组间细胞因子IFN-γ、TNF-α分泌水平的差异，方差不齐时用Welch校正，采用LSD法进行各组间两两比较，方差不齐时采用Dunnett’s T3法校正。检验水准α=0.05，双侧检验。采用SPSS17.0 for windows统计软件包进行数据分析。

实施例

1. 筛选结核肽 Ag85B_{199 – 207} (KLVANNTRL) 特异的 TCR 与 HIV 肽 Env_120-128 (KLTPLCVTL) 特异的 TCR

1.1 密度梯度离心法分离纯化PBMC

(1) 在15ml刻度无菌离心管加入适量Ficoll淋巴细胞分离液；

(2) 取肝素抗凝的外周静脉血与等量RPMI 1640液充分混匀稀释，用巴斯德滴管吸取2倍体积的抗凝血沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液上，注意保持界面完整。18~20°C，1800~2000rpm/min水平离心20~30min；

(3) 离心后管内液体分为四层，上层为血浆和稀释液，管底主要为红细胞和粒细胞层。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的灰白色云雾层；

(4) 用吸管插到灰白色层，吸取单个核细胞，置于另一离心管内，加入5倍以上体积的RPMI 1640液，18~20°C，1500rpm/min离心10min，洗涤细胞两次去除大部分混杂的血小板后为PBMC；

(5) 细胞计数及细胞活力检测：PBMC细胞悬液与1/10体积的0.4 %台酚蓝染液混合，于血球计数板上计数板上角上四个大方格总细胞数，总细胞数的四分之一数乘以10⁴即为每毫升浓度；死细胞可着色台盼蓝，活的不着色，计数200个淋巴细胞，计算活细胞百分率［活细胞率%=（活细胞数/总细胞数）×100%］。

1.2 制备结核肽Ag85B_{199 – 207}、HIV肽Env_120-128特异T细胞克隆：

(1) 计数PBMC，调整PBMC数目为1×10⁶/孔,分别加入含结核肽Ag85B_{199 – 207}、HIV肽Env_120-128 50ng/ml的10% FBS-1640培养基2ml；

(2) 37°C、5% CO₂条件下培养2h后，加入IL-2 25U/ml；

(3) 第3天补加IL-2至50U/ml，第5天加入IL-2 100U/ml，之后以此浓度继续培养11天。

1.3免疫磁珠（德国美天旎生物公司）分选CD8⁺ T细胞。

1.4总RNA提取试剂盒（OMEGA）提取上述收集到的细胞沉淀的总RNA。

1.5逆转录(RT)试剂盒（Fermentas）合成cDNA。

(1) 取总RNA 22μl，加oligo(dT) primer（0.5μg/μl）2μl，轻柔混匀，70°C，5min；

(2) 加5×buffer 8μl，RiboLock™ Ribonuclease Inhibitor（20u/μl）2μl，10mM dNTP 4μl，轻轻混匀，37°C，5min；

(3) 加RevertAid™ H Minus M-MuLV（200u/μl）2μl，总体积40μl，42°C，60min，70°C，10min。

1.6 PCR扩增34 个TCR Vα基因家族CDR3片段：

利用34条TCR Vα家族特异性上游引物和共用下游Cα外、内侧引物（参照文献：XIN-SHENG等，2006，Clinical & Laboratory Haematology, 28: 405-415. doi: 10.1111/j.1365-2257.2006.00827.x）做半巢式PCR：

第一轮PCR：每样本做34 个PCR反应管，第1~34管分别加入TCR Vα1至Vα34家族上游引物，每管加共用下游Cα外侧引物1μl，各引物浓度均为10μM。每PCR反应管体积为25μl，含cDNA模板1.0μl，10mmol/L dNTP 0.5μl，10×Buffer 2.5μl，25mmol/LMgCl₂1.5μl，Taq DNA聚合酶0.625U。PCR反应条件：95°C预变性3min；95°C 30s，60°C 30s，72°C 1min，35个循环；72°C延伸10min。

第二轮PCR：反应总体积为25μl，含第一轮PCR产物2μl，10mmol/L dNTP 0.5μl，10×Buffer 2.5μl，25mmol/L MgCl₂ 1.5μl，Taq DNA聚合酶0.625U，TCR Vα 34条家族上游引物1μl，下游FAM标记内侧Cα引物1μl，各引物浓度均为10μM。PCR反应条件：95°C 2min；60°C 2min，72°C 10min，4个循环。

1.7 PCR扩增24个TCR Vβ基因家族CDR3片段（参照文献：XIN-SHENG等，2006，Clinical & Laboratory Haematology, 28: 405–415. doi: 10.1111/j.1365-2257.2006.00827.x）：

每样本做24个PCR反应管，每管加入TCR Cβ-FAM下游引物1μl，第1至第24管分别加入TCR Vβ1至TCR Vβ24上游引物1μl，各引物浓度均为10μM。PCR反应体积为25μl，含cDNA模板1μl，10mmol/L dNTP 0.5μl， 10×Buffer 2.5μl，25mmol/L MgCl₂ 1.5μl，Taq DNA聚合酶0.625U。PCR反应条件：94°C变性3min；94°C 1min，55°C 1min，72°C 1min，35个循环；72°C延伸10min。

1.8琼脂糖凝胶电泳：

取34个TCR Vα和24个TCR Vβ基因家族PCR产物各5μl，2%琼脂糖凝胶电泳，110V，20min，采用凝胶成像系统照相。剩余PCR产物-20°C保存备用。

1.9 CDR3谱型分析：

取34个Vα、24个Vβ基因家族FAM荧光标记PCR产物2μl，在373DNA序列分析仪（ABI，Perkin Elmer）上进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，收集电泳过程中不同时间出现的不同强度的荧光信号，GeneScan 672软件自动分析收集的数据，转换为不同位置、高度和形态的峰，代表各TCR家族CDR3成员出现的频率，由此反映各TCR家族的克隆性。其中，具有单峰分布的TCR家族即是抗原特异性单克隆增生的TCR家族。

CDR3谱型分析结果显示，抗原肽刺激CD8⁺ T细胞后，部分TCR基因家族谱型发生改变，由原来的8个或多于8个峰型的高斯分布变为少于8个峰的单寡峰分布，表明这些家族是由于抗原肽持续刺激引起的寡克隆或单克隆增生。比较刺激前后CDR3谱型的变化，找出刺激前为多克隆，结核肽Ag85B_{199 – 207}和HIV肽Env_120-128刺激后分别呈单克隆扩增的Vα13、Vβ16和Vα11、Vβ18基因家族（图1）。

测序显示，Vα13、Vβ16和Vα11、Vβ18 CDR3区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 1~4所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5~8所示。

2. 构建重组逆转录病毒载体

2.1 引物合成：

依据GeneBank报道的Vα13、Vβ16和Vα11、Vβ18基因家族V区序列设计全长基因上、下游引物，依据9个关键氨基酸突变后的C区序列分别设计突变位点处的上、下游引物，依据文献报道设计与CD3ζ分子融合处的重组引物，依据2A肽连接序列设计重组引物，全部引物Invitrogen由上海英骏生物技术有限公司合成，引物名称和序列（5’ to 3’）如下：

2.2 重组 PCR 扩增 hV β 16mC β -P2A-hV α 13mC α融合基因：

(1) 以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P1和P2，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增hVβ16hCβ基因上游至hCβ上第一群突变位点之间的序列B1（hVβ16mCβ-1区），其中hVβ16hCβ基因序列如SEQ ID NO: 9所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。

(2) 以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P3和P4，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增hCβ上第一群突变位点至第二群突变位点之间的序列B2（mCβ-2区）。

(3) 以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P5和P6，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增hCβ区上第二群突变位点至hCβ下游之间的序列及5’端P2A序列B3（mCβ-3-5’端P2A区）。

(4) 以步骤(2)得到的B2和步骤(3)得到的B3作为模板，利用引物P3和P6，Pfu DNA聚合酶，重组PCR扩增hCβ上第一群突变位点至至hCβ下游之间的序列及5’端P2A序列B4（mCβ-2-5’端P2A区）。

(5) 以步骤(1)得到的B1和步骤(4)得到的B4作为模板，利用引物P1和P6，Pfu DNA聚合酶，重组PCR扩增hVβ16上游至hCβ下游之间的序列及5’端P2A序列，即hVβ16mCβ-5’端P2A区的序列B5，其中，hVβ16mCβ段的序列如SEQ ID NO: 11所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示。

(6) 以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P7和P8，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增3’端P2A及 hVα13 hCα全长基因上游至hCα上突变位点之间的序列A1（3’端P2A-hVα13mCα-1区）。其中，hVα13 hCα全长基因序列如SEQ ID NO: 13所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示。

(7) 以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P9和P10，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增hCα上突变位点至hCα下游之间的序列A2（hVα13mCα-2区）。

(8) 以步骤(6)得到的A1和步骤(7)得到的A2作为模板，利用引物P7和P10，Pfu DNA聚合酶，重组PCR扩增3’端P2A及 hVα13上游至hCα下游之间的序列，即3’端P2A-hVα13mCα区序列A3。其中，hVα13mCα基因序列如SEQ ID NO: 15所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示。

(9) 以步骤(5)得到的B5和步骤(8)得到的A3作为模板，利用引物P1和P10，Pfu DNA聚合酶，重组PCR扩增hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-5’端T2A基因片段。

(10) 以步骤(5)得到的B5和步骤(8)得到的A3作为模板，利用引物P1和P10’，重组PCR扩增hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα全长基因（SEQ ID NO: 17）。

以上常规PCR反应体系25μl，含10×Buffer 2.5μl，10mmol/L dNTP 0.5μl，Pfu DNA聚合酶0.2U，10μM引物各0.8μl，模板DNA 1μl。PCR反应条件：95°C 变性5min；95°C 1min，72°C 90s，35个循环；72°C延伸10min。

重组PCR反应体系25μl，含10×Buffer 2.5μl，10mmol/L dNTP 0.5μl，Pfu DNA聚合酶0.2U，10μM引物各0.8μl，两种PCR产物模板各3μl。PCR反应条件：95°C变性5min；95°C 30s，50°C 45s，72°C 45s，3个循环；95°C 45s，72°C 90s，32个循环；72°C延伸10min。

2.3 重组 PCR 扩增及酶切连接制备 hV β 18hC β -CD3 ζ -F2A-hV α 11hC α -CD3 ζ融合基因：

(1) 以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P11与P12，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增3’端T2A-hVβ18hCβ序列中至hCβ 393bp处片段及连接序列ggggat与5’端CD3ζ的序列S1（3’端T2A-hVβ18hCβ区）。

(2) 以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P11’与P12，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增hVβ18hCβ全长基因中至hCβ 393bp处片段及连接序列ggggat与5’端CD3ζ的序列S1’。hVβ18hCβ的基因序列SEQ ID NO: 18所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示。

(3) 以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P13与P14，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增hCβ 393bp前部分序列、连接序列ggggat、CD3ζ全长序列及5’端F2A序列S2（hCβ_393bp -CD3ζ-5’端F2A区）。

(4) 以步骤(1)得到的S1和步骤(3)得到的S2作为模板，利用引物P11与P14，Pfu DNA聚合酶，重组PCR扩增3’端T2A-hVβ18hCβ_393bp-CD3ζ-5’端F2A基因片段S3。其中，hVβ18hCβ_393bp-CD3ζ段的序列如SEQ ID NO: 20所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 21所示。

(5) 以步骤(2)得到的S1’和步骤(3)得到的S2作为模板，利用引物P11’与P14，Pfu DNA聚合酶，重组PCR扩增hVβ18hCβ_393bp-CD3ζ-5’端F2A基因片段S3’。

(6) 以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P15与P16，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增3’端F2A-hVα11hCα中至hCα 284bp处片段及连接序列ggggat与5’端CD3ζ的序列S4（3’端F2A -hVα911hCα区）。其中，hVα11hCα基因序列如SEQ ID NO: 22所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 23所示。

(7) 以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P17与P18，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增hCα 284bp前部分序列、连接序列ggggat及CD3ζ全长序列S5（hCα_284bp-CD3ζ区）。

(8) 以步骤(4)得到的S4和步骤(5)得到的S5作为模板，利用引物P15与P18，Pfu DNA聚合酶，重组PCR扩增3’端F2A-hVα11hCα_284bp-CD3ζ序列S6。其中，hVα11hCα_284bp-CD3ζ段的基因序列如SEQ ID NO: 24所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 25所示。

(9) 利用限制性内切酶AgeI单酶切步骤(4)制备的S3与步骤(8)制备的S6，凝胶回收试剂盒（Omega）分离回收酶切后的片段并用T4 DNA连接酶进行连接以获得3’端T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ基因片段。

(10) 利用限制性内切酶AgeI单酶切步骤(5)制备的S3’与步骤(8)制备的S6，胶回收酶切后的片段并用T4 DNA连接酶进行连接以获得hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ（SEQ ID NO: 26）全长基因。

以上常规PCR反应体系25μl，含10×Buffer 2.5μl，10mmol/L dNTP 0.5μl，Pfu DNA聚合酶0.2U，10μM引物各0.8μl，模板DNA 0.5μl。常规PCR反应条件：95°C 变性5min；95°C 1min，63°C 1min，72°C 1min，35个循环；72°C延伸10min。

重组PCR反应体系25μl，含10×Buffer 2.5μl，10mmol/L dNTP 0.8μl，Pfu DNA聚合酶0.2U，10μM引物各0.6μl，两种PCR产物模板各6μl。PCR反应条件：95°C变性5min；95°C 1min，50°C 30s，72°C 1min，3个循环；95°C 90s，65°C 30s，72°C 90s，32个循环；72°C延伸10min。

2.4 限制性酶切连接制备 hV β 16mC β -P2A-hV α 13mC α -T2A-hV β 18hC β - CD3 ζ -F2A-hV α 11hC α -CD3 ζ全长融合基因：

利用T2A序列中的AatII酶切位点，用限制性内切酶AatII单酶切步骤2.2 (9)与步骤2.3 (9)制备的基因片段，胶回收酶切产物并用T4 DNA连接酶进行连接以获得hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ融合基因片段（SEQ ID NO: 27）。

2.5 分别构建含hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα、hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ、hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ基因片段的克隆载体

(1) 用胶回收试剂盒（Omega）分别回收hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα、hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ、hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ基因片段。

(2) 用DNA A-Tailing试剂盒（TaKaRa）在上述3个基因片段末尾加A后，分别接入pGEM-T载体中，连接反应总体系10ml：pGEM-T载体1ml、10´ligation Buffer 1ml、T4 DNA连接酶1ml、0.2 pmol已加A纯化的基因片段，16°C连接过夜。

(3) 将连接正确的质粒转化E.coli DH5α感受态菌。然后将菌均匀涂布在含4ml 200mg/ml IPTG、40ml 20 mg/ml X-gal的氨苄平板上，培养过夜。重组质粒转化的菌落呈白色，而空质粒转化的菌落呈蓝色。选择在平板上长出的白色菌落，挑至装有Amp⁺ 3ml LB液体培养基的试管中，37°C 220rpm振摇16-20h。

(4) 用质粒抽提试剂盒（Omega）提取质粒，用相应的内切酶对初筛阳性重组质粒进行酶切鉴定，并以重组质粒为模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小。最后将初筛阳性质粒送Invitrogen上海英骏生物技术有限公司进行测序。测序结果表明，上述重组质粒含有的外源基因序列与预测序列均完全一致。

2.6重组逆转录病毒载体的构建：

(1) 用Xho I、Not I分别酶切含hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα、hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ、hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ基因片段的T载体与pMX-IRES-GFP空质粒，分别胶回收上述3种目的基因片段与载体基因片段（方法同步骤2.3）；

(2)分别将上述3种目的基因片段经T4 DNA连接酶连接装入pMX-IRES-GFP载体（方法同步骤2.3）后，转化感受态细菌XL-10，涂布于含氨苄青霉素的固体培养基培养12-16h后，挑选单个菌落，摇菌过夜；

(3) 抽提质粒，酶切鉴定结果显示，上述3种基因片段插入正确（见图3）；

(4) 选择阳性菌落进行扩增培养，大量抽提质粒DNA。

2.7逆转录病毒重组载体的包装：

将含不同目的基因片段的重组质粒分别与包膜蛋白质粒VSV-G以1:1的比例混合，采用脂质体转染法转染GP2-293细胞，包装得到携带不同目的基因的3种重组逆转录病毒。实验按Invitrogen的Lipofectamine 2000试剂盒说明操作。

2.8重组逆转录病毒的浓缩纯化：

(1) 收集病毒上清，50000g，4°C离心1.5h；

(2) 1%原体积的无菌TNE重悬沉淀，病毒完全溶解后，分装，-80°C贮存。

2.9流式细胞术测定病毒滴度：

(1) 预先将NIH3T3细胞（2×10⁵/孔）接种培养24h；

(2) 加入聚凝胺（PB）至终浓度8mg/mL，加入10μl待测滴度的病毒上清；

(3) 感染24h后，更换新鲜培养液，去除假病毒颗粒；

(4) 37°C继续培养3d后，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达；

(5) 37°C继续培养5d，胰酶消化、PBS洗涤3次后，用200-300μl PBS重悬，制备密度为1-5×10⁶/ml的单细胞悬液，流式细胞术检测其GFP表达阳性率，按下列公式计算病毒滴度：病毒滴度（GFU/ml）=NIH3T3细胞数×阳性率/转染病毒上清量（ml）。

荧光显微镜下观察，三种经GP2-293细胞包装所得的逆转录病毒感染的NIH3T3细胞均表达绿色荧光，表明GFP在细胞中表达（图4）。计算得三种重组病毒的滴度分别为8×10⁶ IU/ml、1.59×10⁷ IU/ml和2.14×10⁷ IU/ml（图5）。

3．鉴定重组逆转录病毒转染的CD8⁺ T细胞的抗结核和抗HIV活性

3.1 重组病毒感染CD8⁺ T细胞

(1) 将CD8⁺ T细胞感染前一天以 5×10⁵个/孔接种于24孔板；

(2) 转染当日弃细胞培养旧液，按MOI为13加入病毒贮存液，加入PB至终浓度为8mg/L，37°C培养4h；

(3) 加入培养基，稀释PB至2mg/L，继续培养5天；

(4) 离心收集细胞，PBS洗涤2次，2%多聚甲醛固定；

(5) 流式细胞仪分析CD8⁺ T细胞GFP表达阳性率，在pMX-hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-IRES-GFP转染细胞中为33.1%，在pMX- hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP转染细胞中为29.5%，在pMX-hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-T2A-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP转染细胞中为28.1%（图6、7）。

3.2 ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）测定CD8⁺ T细胞IFN-γ、TNF-α分泌水平

实验设置如下：

① TB/HIVTd+TB-DC组内比较包括：阴性对照组（TB/HIVTd+DC组：结核肽Ag85B_{199 – 207}+HIV肽Env_120-128特异TCRs基因共修饰的CD8⁺ T细胞+ DC）、未转染（un-transfected）组（UnTd+TB-DC组：未转染CD8⁺ T细胞+负载结核肽Ag85B_{199 – 207}的DC）、空载体转染（empty vector-transfected）组（EmTd +TB-DC组：空载体转染CD8⁺ T细胞+负载结核肽Ag85B_{199 – 207}的DC）、无关肽组（TB/HIVTd+CMV-DC组：结核肽Ag85B_{199 – 207}+HIV肽Env_120-128特异TCRs基因共修饰的CD8⁺ T细胞+负载CMVpp65的DC）、TBTd+TB-DC组（结核肽Ag85B_{199 – 207}特异TCR基因修饰的CD8⁺ T细胞+负载结核肽Ag85B_{199 – 207}的DC）、TB/HIVTd+TB-DC组（结核肽Ag85B_{199 – 207}+HIV肽Env_120-128特异TCRs基因共修饰的CD8⁺ T细胞+负载结核肽Ag85B_{199 – 207}的DC）；

② TB/HIVTd+HIV-DC组内比较包括：阴性对照组（TB/HIVTd+DC组：结核肽Ag85B_{199 – 207}+HIV肽Env_120-128特异TCRs基因共修饰的CD8⁺ T细胞+DC）、未转染组（UnTd+HIV-DC组：未转染CD8⁺ T细胞+负载HIV肽Env_120-128的DC）、空载体转染组（EmTd+HIV-DC组：空载体转染CD8⁺ T细胞+负载HIV肽Env_120-128的DC）、无关肽组（TB/HIVTd+CMV-DC组：结核肽Ag85B_{199 – 207}+HIV肽Env_120-128特异TCRs基因共修饰的CD8⁺ T细胞+负载CMVpp65的DC）、HIVTd+HIV-DC组（HIV肽Env_120-128特异TCR基因修饰CD8⁺ T细胞+负载HIV肽Env_120-128的DC）、TB/HIVTd+HIV-DC组（结核肽Ag85B_{199 – 207}+HIV肽Env_120-128特异TCRs基因共修饰的CD8⁺ T细胞+负载HIV肽Env_120-128的DC）；

实验步骤如下，实验重复3次：

(1) DC以5×10³个/孔接种于96孔板，按已摸索好的E:T（测IFN-γ的分泌量时E:T=7，测TNF-α的分泌量时E:T=20）加入CD8⁺ T细胞，每组设三个复孔；

(2) CD8⁺ T细胞与DC混合培养一定时间（测IFN-γ时混合培养18h，测TNF-α时混合培养24h），收集各孔培养上清，按试剂盒说明书进行操作。

ELISA结果显示：

① 在效靶比（E:T）=7，与负载结核肽Ag85B_{199 – 207}的DC混合培养18h时，TB/HIVTd+TB-DC组CD8⁺ T细胞的IFN-γ分泌水平为1117.921±10.631 pg/ml，显著高于TB/HIVTd+DC组（11.495±0.395 pg/ml，P=0.004），UnTd+TB-DC组（15.622±3.977 pg/ml，P<0.001），EmTd+TB-DC组（86.264±8.499 pg/ml，P<0.001）和TB/HIV Td+CMV-DC组（118.248±10.190 pg/ml，P<0.001），但略低于TBTd+TB-DC组（1427.930±63.714 pg/ml，P=0.550）。

在效靶比（E:T）=7，与负载HIV肽Env_120-128的DC混合培养18h时，TB/HIVTd+HIV-DC组CD8⁺ T细胞的IFN-γ分泌水平为655.336±33.426 pg/ml，显著高于TB/HIVTd+DC组（11.495±0.395 pg/ml，P=0.004），UnTd+HIV-DC组（30.564±2.109 pg/ml，P=0.004），EmTd+HIV-DC组（87.58±14.859 pg/ml，P=0.001）和TB/HIVTd+CMV-DC组（118.248±10.190 pg/ml，P=0.003），但低于HIVTd+HIV-DC组（1401.667±81.969 pg/ml，P=0.007）（图8）。

②在E:T=20，与负载结核肽Ag85B_{199 – 207}的DC混合培养24h时，TB/HIVTd+TB-DC组CD8⁺ T细胞的TNF-α分泌水平为738.840±46.864 pg/ml，显著高于TB/HIVTd+DC组（32.141±1.695 pg/ml，P=0.008），UnTd+TB-DC组（65.644±4.781 pg/ml，P=0.008），EmTd+TB-DC组（49.697±0.629 pg/ml，P=0.008）和TB/HIVTd+CMV-DC组（55.735±6.689 pg/ml，P=0.007），但低于TBTd+TB-DC组（1040.184±31.769 pg/ml，P=0.013）。

在E:T=20，与负载HIV肽Env_120-128的DC混合培养24h时，TB/HIVTd+HIV-DC组CD8⁺ T细胞的TNF-α分泌水平为660.337±88.892 pg/ml，显著高于TB/HIVTd+DC组（32.141±1.695 pg/ml，P=0.029），UnTd+HIV-DC组（60.478±7.153 pg/ml，P=0.031），EmTd+HIV-DC组（42.211±15.515 pg/ml，P=0.026）和TB/HIVTd+CMV-DC组（53.570±5.296 pg/ml，P=0.031），但低于HIVTd+HIV-DC组（1009.22 ± 67.073 pg/ml，P=0.049）（图9）。

3. 3时间分辨荧光免疫分析试剂盒（PerkinElmer）测定CD8⁺ T细胞杀伤活性，按试剂盒说明书进行操作。

时间分辨免疫荧光检测结果显示：

在E:T=30，与负载结核肽Ag85B_{199 – 207}的DC混合培养4h时，TB/HIVTd+TB-DC组CD8⁺ T细胞的杀伤率为35.162±2.670%，显著高于TB/HIVTd+DC组（2.900± 0.334%，P<0.001), UnTd+TB-DC组（3.886±0.346%，P<0.001），EmTd+TB-DC组（2.818±0.438%，P<0.001）和TB/HIVTd+CMV-DC组（8.611±0.470%，P<0.001），但低于TBTd+TB-DC组（57.499±3.060%，P<0.001）。

同样，在E:T=30，与负载HIV肽Env_120-128的DC混合培养4h时，TB/HIVTd+HIV-DC组CD8⁺ T细胞的杀伤率为23.885±3.257%，显著高于TB/HIVTd+DC组（2.900±0.334%，P=0.033），UnTd+HIV-DC组（2.283±0.321%，P=0.032）和EmTd+HIV-DC组（2.281±0.435%，P=0.030），略高于TB/HIVTd+CMV-DC组（8.611±0.470%，P=0.061），但低于HIVTd+HIV-DC组（46.446±3.677%，P=0.014）见图10。

上述的实验结果显示：携带双病原体表位特异TCRs基因的逆转录病毒转染的CD8⁺ T细胞可成功表达两种外源性TCR基因，特异性识别两种抗原表位并介导IFN-γ、TNF-α细胞因子分泌和细胞毒活性，具有结核/HIV双重感染基因治疗的应用价值，可为结核/HIV双重感染的过继细胞免疫治疗开辟新径。

<110> 南方医科大学

<120> 一种用于结核/HIV共感染基因治疗的逆转录病毒载体及其应用

<130>

<160> 47

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 60

<212> DNA

<213> human

<400> 1

aatggtgcta caaacaagct catctttgga actggcactc tgattgttgt cctgcccaat 60

<210> 2

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<212> DNA

<213> human

<400> 2

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<210> 3

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<212> DNA

<213> human

<400> 3

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<210> 4

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<212> DNA

<213> human

<400> 4

gcccgggacg gttcctacga gcagtacttc gggccgggca ccaggctcac ggtcaca 57

<210> 5

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<212> PRT

<213> human

<400> 5

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1 5 10 15

Val Leu Pro Asn

20

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<212> PRT

<213> human

<400> 6

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1 5 10 15

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20

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<211> 21

<212> PRT

<213> human

<400> 7

Ala Ser Gly Gly Tyr Gln Lys Val Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu

1 5 10 15

Gln Val Ile Pro Asn

20

<210> 8

<211> 19

<212> PRT

<213> human

<400> 8

Ala Arg Asp Gly Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu

1 5 10 15

Thr Val Thr

<210> 9

<211> 954

<212> DNA

<213> human

<400> 9

atgctcgagg ccaggatggt ttccaggctc ctcagtttag tgtccctttg tctcctggga 60

gcaaagcaca tagaagctgg agttactcag ttccccagcc acagcgtaat agagaagggc 120

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gtggagctga gctggtgggt gaatgggaag gaggtgcaca gtggggtcag cacggacccg 600

cagcccctca aggagcagcc cgccctcaat gactccagat actgcctgag cagccgcctg 660

agggtctcgg ccaccttctg gcagaacccc cgcaaccact tccgctgtca agtccagttc 720

tacgggctct cggagaatga cgagtggacc caggataggg ccaaacccgt cacccagatc 780

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<212> PRT

<213> human

<400> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<210> 15

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Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val

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<210> 17

<211> 1818

<212> DNA

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<400> 17

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<212> DNA

<213> human

<400> 18

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Asp Thr Arg Val Leu Cys Cys Ala Val Ile Cys Leu Leu Gly Ala Gly

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Leu Ser Asn Ala Gly Val Met Gln Asn Pro Arg His Leu Val Arg Arg

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Glu Arg Phe Ser Ala Glu Phe Pro Lys Glu Gly Pro Ser Ile Leu Arg

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Ser Arg Ala Arg Asp Gly Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr

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Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala

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Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu

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Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp

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Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys

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Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg

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Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp

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Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala

245 250 255

Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln

260 265 270

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275 280 285

Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met

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Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly

305 310

<210> 20

<211> 1224

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

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gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 780

ggtagagcag actgtgggga tctggatccc aaactctgct acctgctgga tggaatcctc 840

ttcatctatg gtgtcattct cactgccttg ttcctgagag tgaagttcag caggagcgca 900

gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 960

agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 1020

ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1080

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1140

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 21

Asp Thr Arg Val Leu Cys Cys Ala Val Ile Cys Leu Leu Gly Ala Gly

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Leu Ser Asn Ala Gly Val Met Gln Asn Pro Arg His Leu Val Arg Arg

20 25 30

Arg Gly Gln Glu Ala Arg Leu Arg Cys Ser Pro Met Lys Gly His Ser

35 40 45

His Val Tyr Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Glu Glu Gly Leu Lys Phe Met

50 55 60

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65 70 75 80

Glu Arg Phe Ser Ala Glu Phe Pro Lys Glu Gly Pro Ser Ile Leu Arg

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Ser Arg Ala Arg Asp Gly Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr

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Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu

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Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp

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Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys

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Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg

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Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp

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Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala

245 250 255

Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Asp Leu Asp Pro Lys Leu Cys

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Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala

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Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

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Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

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Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

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Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe

405 410 415

Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly

420 425 430

<210> 22

<211> 813

<212> DNA

<213> human

<400> 22

atgaagccca ccctcatctc agtgcttgtg ataatattta tactcagagg aacaagagcc 60

cagagagtga ctcagcccga gaagctcctc tctgtcttta aaggggcccc agtggagctg 120

aagtgcaact attcctattc tgggagtcct gaactcttct ggtatgtcca gtactccaga 180

caacgcctcc agttactctt gagacacatc tctagagaga gcatcaaagg cttcactgct 240

gaccttaaca aaggcgagac atctttccac ctgaagaaac catttgctca agaggaagac 300

tcagccatgt attactgtgc tctaagtgcc tctgggggtt accagaaagt tacctttgga 360

actggaacaa agctccaagt catcccaaat atccagaacc ctgaccctgc cgtgtaccag 420

ctgagagact ctaaatccag tgacaagtct gtctgcctat tcaccgattt tgattctcaa 480

acaaatgtgt cacaaagtaa ggattctgat gtgtatatca cagacaaaac tgtgctagac 540

atgaggtcta tggacttcaa gagcaacagt gctgtggcct ggagcaacaa atctgacttt 600

gcatgtgcaa acgccttcaa caacagcatt attccagaag acaccttctt ccccagccca 660

gaaagttcct gtgatgtcaa gctggtcgag aaaagctttg aaacagatac gaacctaaac 720

tttcaaaacc tgtcagtgat tgggttccga atcctcctcc tgaaagtggc cgggtttaat 780

ctgctcatga cgctgcggct gtggtccagc tga 813

<210> 23

<211> 269

<212> PRT

<213> human

<400> 23

Lys Pro Thr Leu Ile Ser Val Leu Val Ile Ile Phe Ile Leu Arg Gly

1 5 10 15

Thr Arg Ala Gln Arg Val Thr Gln Pro Glu Lys Leu Leu Ser Val Phe

20 25 30

Lys Gly Ala Pro Val Glu Leu Lys Cys Asn Tyr Ser Tyr Ser Gly Ser

35 40 45

Pro Glu Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Ser Arg Gln Arg Leu Gln Leu

50 55 60

Leu Leu Arg His Ile Ser Arg Glu Ser Ile Lys Gly Phe Thr Ala Asp

65 70 75 80

Leu Asn Lys Gly Glu Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Phe Ala Gln

85 90 95

Glu Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Leu Ser Ala Ser Gly Gly

100 105 110

Tyr Gln Lys Val Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Gln Val Ile Pro

115 120 125

Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys

130 135 140

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr

145 150 155 160

Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr

165 170 175

Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala

180 185 190

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser

195 200 205

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp

210 215 220

Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe

225 230 235 240

Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala

245 250 255

Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

260 265

<210> 24

<211> 1095

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

atgaagccca ccctcatctc agtgcttgtg ataatattta tactcagagg aacaagagcc 60

cagagagtga ctcagcccga gaagctcctc tctgtcttta aaggggcccc agtggagctg 120

aagtgcaact attcctattc tgggagtcct gaactcttct ggtatgtcca gtactccaga 180

caacgcctcc agttactctt gagacacatc tctagagaga gcatcaaagg cttcactgct 240

gaccttaaca aaggcgagac atctttccac ctgaagaaac catttgctca agaggaagac 300

tcagccatgt attactgtgc tctaagtgcc tctgggggtt accagaaagt tacctttgga 360

actggaacaa agctccaagt catcccaaat atccagaacc ctgaccctgc cgtgtaccag 420

ctgagagact ctaaatccag tgacaagtct gtctgcctat tcaccgattt tgattctcaa 480

acaaatgtgt cacaaagtaa ggattctgat gtgtatatca cagacaaaac tgtgctagac 540

atgaggtcta tggacttcaa gagcaacagt gctgtggcct ggagcaacaa atctgacttt 600

gcatgtgcaa acgccttcaa caacagcatt attccagaag acaccttctt ccccagccca 660

gaaagttcct gtggggatct ggatcccaaa ctctgctacc tgctggatgg aatcctcttc 720

atctatggtg tcattctcac tgccttgttc ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 780

gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 840

gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 900

cagagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 960

gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 1020

ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 1080

ctaccccctc gctaa 1095

<210> 25

<211> 363

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 25

Lys Pro Thr Leu Ile Ser Val Leu Val Ile Ile Phe Ile Leu Arg Gly

1 5 10 15

Thr Arg Ala Gln Arg Val Thr Gln Pro Glu Lys Leu Leu Ser Val Phe

20 25 30

Lys Gly Ala Pro Val Glu Leu Lys Cys Asn Tyr Ser Tyr Ser Gly Ser

35 40 45

Pro Glu Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Ser Arg Gln Arg Leu Gln Leu

50 55 60

Leu Leu Arg His Ile Ser Arg Glu Ser Ile Lys Gly Phe Thr Ala Asp

65 70 75 80

Leu Asn Lys Gly Glu Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Phe Ala Gln

85 90 95

Glu Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Leu Ser Ala Ser Gly Gly

100 105 110

Tyr Gln Lys Val Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Gln Val Ile Pro

115 120 125

Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys

130 135 140

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr

145 150 155 160

Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr

165 170 175

Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala

180 185 190

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser

195 200 205

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Gly

210 215 220

Asp Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile

225 230 235 240

Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

245 250 255

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

260 265 270

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

275 280 285

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn

290 295 300

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

305 310 315 320

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

325 330 335

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

340 345 350

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

355 360

<210> 26

<211> 2391

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

atggacacca gagtactttg ctgtgcggtc atctgtcttc tgggggcagg tctctcaaat 60

gccggcgtca tgcagaaccc aagacacctg gtcaggagga ggggacagga ggcaagactg 120

agatgcagcc caatgaaagg acacagtcat gtttactggt atcggcagct cccagaggaa 180

ggtctgaaat tcatggttta tctccagaaa gaaaatatca tagatgagtc aggaatgcca 240

aaggaacgat tttctgctga atttcccaaa gagggcccca gcatcctgag gatccagcag 300

gtagtgcgag gagattcggc agcttatttc tgtgccagct cacgcgcccg ggacggttcc 360

tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggacct gaaaaacgtg 420

ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 480

gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 540

gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag 600

cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 660

tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 720

gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 780

ggtagagcag actgtgggga tctggatccc aaactctgct acctgctgga tggaatcctc 840

ttcatctatg gtgtcattct cactgccttg ttcctgagag tgaagttcag caggagcgca 900

gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 960

agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 1020

ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1080

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1140

ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1200

gccctacccc ctcgcggctc cggagcaccg gtgaaacaga ctttgaattt tgaccttctc 1260

aagttggcgg gagacgtgga gtccaaccca gggcccatga agcccaccct catctcagtg 1320

cttgtgataa tatttatact cagaggaaca agagcccaga gagtgactca gcccgagaag 1380

ctcctctctg tctttaaagg ggccccagtg gagctgaagt gcaactattc ctattctggg 1440

agtcctgaac tcttctggta tgtccagtac tccagacaac gcctccagtt actcttgaga 1500

cacatctcta gagagagcat caaaggcttc actgctgacc ttaacaaagg cgagacatct 1560

ttccacctga agaaaccatt tgctcaagag gaagactcag ccatgtatta ctgtgctcta 1620

agtgcctctg ggggttacca gaaagttacc tttggaactg gaacaaagct ccaagtcatc 1680

ccaaatatcc agaaccctga ccctgccgtg taccagctga gagactctaa atccagtgac 1740

aagtctgtct gcctattcac cgattttgat tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat 1800

tctgatgtgt atatcacaga caaaactgtg ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc 1860

aacagtgctg tggcctggag caacaaatct gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac 1920

agcattattc cagaagacac cttcttcccc agcccagaaa gttcctgtgg ggatctggat 1980

cccaaactct gctacctgct ggatggaatc ctcttcatct atggtgtcat tctcactgcc 2040

ttgttcctga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 2100

aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 2160

agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgcaga gaaggaagaa ccctcaggaa 2220

ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 2280

aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 2340

accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctac cccctcgcta a 2391

<210> 27

<211> 4269

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

atggtttcca ggctcctcag tttagtgtcc ctttgtctcc tgggagcaaa gcacatagaa 60

gctggagtta ctcagttccc cagccacagc gtaatagaga agggccagac tgtgactctg 120

agatgtgacc caatttctgg acatgataat ctttattggt atcgacgtgt tatgggaaaa 180

gaaataaaat ttctgttaca ttttgtgaaa gagtctaaac aggatgagtc cggtatgccc 240

aacaatcgat tcttagctga aaggactgga gggacgtatt ctactctgaa ggtgcagcct 300

gcagaactgg aggattctgg agtttatttc tgtgccagca gccgccttgg acaggggatg 360

aacactgaag ctttctttgg acaaggcacc agactcacag ttgtagagga cctgaacaag 420

gtgttcccac ccgaggtcgc tgtgtttgag ccatcaaaag cagagatcgc acacacccaa 480

aaggccacac tggtgtgcct ggccacaggc ttcttccctg accacgtgga gctgagctgg 540

tgggtgaatg ggaaggaggt gcacagtggg gtcagcacgg acccgcagcc cctcaaggag 600

cagcccgccc tcaatgactc cagatactgc ctgagcagcc gcctgagggt ctcggccacc 660

ttctggcaga acccccgcaa ccacttccgc tgtcaagtcc agttctacgg gctctcggag 720

aatgacgagt ggacccagga tagggccaaa cccgtcaccc agatcgtcag cgccgaggcc 780

tggggtagag cagactgtgg cattacctcg gcatcctacc accaaggggt cctgtctgcc 840

accatcctct atgagatcct gctagggaag gccaccctgt atgctgtgct ggtcagcgcc 900

cttgtgttga tggccatggt caagagaaag gatttcggct ccggagccac gaacttctct 960

ctgttaaagc aagcaggaga cgtggaagaa aaccccggtc ccatggcttt gcagagcact 1020

ctgggggcgg tgtggctagg gcttctcctc aactctctct ggaaggttgc agaaagcaag 1080

gaccaagtgt ttcagccttc cacagtggca tcttcagagg gagctgtggt ggaaatcttc 1140

tgtaatcact ctgtgtccaa tgcttacaac ttcttctggt accttcactt cccgggatgt 1200

gcaccaagac tccttgttaa aggctcaaag ccttctcagc agggacgata caacatgacc 1260

tatgaacggt tctcttcatc gctgctcatc ctccaggtgc gggaggcaga tgctgctgtt 1320

tactactgtg ctgtgaatgg tgctacaaac aagctcatct ttggaactgg cactctgatt 1380

gttgtcctgc ccaatatcca gaaccctgac cctgccgtgt accagctgag agactctaaa 1440

tccagtgaca agtctgtctg cctattcacc gattttgatt ctcaaacaaa tgtgtcacaa 1500

agtaaggatt ctgatgtgta tatcacagac aaaactgtgc tagacatgag gtctatggac 1560

ttcaagagca acagtgctgt ggcctggagc aacaaatctg actttgcatg tgcaaacgcc 1620

ttcaacaaca gcattattcc agaagacacc ttcttcccca gctcagacgt tccctgtgat 1680

gtcaagctgg tcgagaaaag ctttgaaaca gatacgaacc taaactttca aaacctgtca 1740

gtgattgggt tccgaatcct cctcctgaaa gtggccgggt ttaatctgct catgacgctg 1800

cggctgtggt ccagcggctc cggagagggc agaggaagtc tgctaacatg cggtgacgtc 1860

gaggagaatc ctggcccaat ggacaccaga gtactttgct gtgcggtcat ctgtcttctg 1920

ggggcaggtc tctcaaatgc cggcgtcatg cagaacccaa gacacctggt caggaggagg 1980

ggacaggagg caagactgag atgcagccca atgaaaggac acagtcatgt ttactggtat 2040

cggcagctcc cagaggaagg tctgaaattc atggtttatc tccagaaaga aaatatcata 2100

gatgagtcag gaatgccaaa ggaacgattt tctgctgaat ttcccaaaga gggccccagc 2160

atcctgagga tccagcaggt agtgcgagga gattcggcag cttatttctg tgccagctca 2220

cgcgcccggg acggttccta cgagcagtac ttcgggccgg gcaccaggct cacggtcaca 2280

gaggacctga aaaacgtgtt cccacccgag gtcgctgtgt ttgagccatc agaagcagag 2340

atctcccaca cccaaaaggc cacactggtg tgcctggcca caggcttcta ccccgaccac 2400

gtggagctga gctggtgggt gaatgggaag gaggtgcaca gtggggtcag cacagacccg 2460

cagcccctca aggagcagcc cgccctcaat gactccagat actgcctgag cagccgcctg 2520

agggtctcgg ccaccttctg gcagaacccc cgcaaccact tccgctgtca agtccagttc 2580

tacgggctct cggagaatga cgagtggacc caggataggg ccaaacctgt cacccagatc 2640

gtcagcgccg aggcctgggg tagagcagac tgtggggatc tggatcccaa actctgctac 2700

ctgctggatg gaatcctctt catctatggt gtcattctca ctgccttgtt cctgagagtg 2760

aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 2820

gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 2880

cctgagatgg ggggaaagcc gcagagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 2940

ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 3000

aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 3060

gacgcccttc acatgcaggc cctaccccct cgcggctccg gagcaccggt gaaacagact 3120

ttgaattttg accttctcaa gttggcggga gacgtggagt ccaacccagg gcccatgaag 3180

cccaccctca tctcagtgct tgtgataata tttatactca gaggaacaag agcccagaga 3240

gtgactcagc ccgagaagct cctctctgtc tttaaagggg ccccagtgga gctgaagtgc 3300

aactattcct attctgggag tcctgaactc ttctggtatg tccagtactc cagacaacgc 3360

ctccagttac tcttgagaca catctctaga gagagcatca aaggcttcac tgctgacctt 3420

aacaaaggcg agacatcttt ccacctgaag aaaccatttg ctcaagagga agactcagcc 3480

atgtattact gtgctctaag tgcctctggg ggttaccaga aagttacctt tggaactgga 3540

acaaagctcc aagtcatccc aaatatccag aaccctgacc ctgccgtgta ccagctgaga 3600

gactctaaat ccagtgacaa gtctgtctgc ctattcaccg attttgattc tcaaacaaat 3660

gtgtcacaaa gtaaggattc tgatgtgtat atcacagaca aaactgtgct agacatgagg 3720

tctatggact tcaagagcaa cagtgctgtg gcctggagca acaaatctga ctttgcatgt 3780

gcaaacgcct tcaacaacag cattattcca gaagacacct tcttccccag cccagaaagt 3840

tcctgtgggg atctggatcc caaactctgc tacctgctgg atggaatcct cttcatctat 3900

ggtgtcattc tcactgcctt gttcctgaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc 3960

gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 4020

tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgcagaga 4080

aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 4140

tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 4200

cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctaccc 4260

cctcgctaa 4269

<210> 28

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

cgctcgaggc caggatggtt tccaggctcc tcagtttagt gt 42

<210> 29

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tgtgtgcgat ctctgctttt gatggctcaa acacagc 37

<210> 30

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

atcaaaagca gagatcgcac acacccaaaa ggc 33

<210> 31

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ggtggtagga tgccgaggta atgccacagt ctgctctac 39

<210> 32

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gcattacctc ggcatcctac caccaagggg tcctgtct 38

<210> 33

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gttttcttcc acgtctcctg cttgctttaa cagagagaag ttcgtggctc cggagccgaa 60

atcctttctc ttgaccatg 79

<210> 34

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

cttctctctg ttaaagcaag caggagacgt ggaagaaaac cccggtccca tggctttgca 60

gagcactctg g 71

<210> 35

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

atcacaggga acgtctgagc tggggaagaa ggtgtct 37

<210> 36

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

agctcagacg ttccctgtga tgtcaagctg gtc 33

<210> 37

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

ggattctcct cgacgtcacc gcatgttagc agacttcctc tgccctctcc ggagccgctg 60

gaccacagcc gcagcgtc 78

<210> 38

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

gataagaatg cggccgctca gctggaccac agccgcagcg tc 42

<210> 39

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

ccgctcgagg ccaggatgga caccagagta ctttgctg 38

<210> 40

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

ccgctcgagg ccaggatgga caccagagta ctttgctg 38

<210> 41

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

agagtttggg atccagatcc ccacagtctg ctctacccca gg 42

<210> 42

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

ggtagagcag actgtgggga tctggatccc aaactctgct acctg 45

<210> 43

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

gtttcaccgg tgctccggag ccgcgagggg gtagggcctg catgtg 46

<210> 44

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

gcaccggtga aacagacttt gaattttgac cttctcaagt tggcgggaga cgtggagtcc 60

aacccagggc ccatgaagcc caccctcatc tcagtgc 97

<210> 45

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

agagtttggg atccagatcc ccacaggaac tttctgggct gg 42

<210> 46

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

cccagaaagt tcctgtgggg atctggatcc caaactctgc tac 43

<210> 47

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

ataagaatgc ggccgcttag cgagggggta gggcctgcat gt 42

Claims (6)

1.一种用于结核/HIV共感染基因治疗的重组逆转录病毒载体，其含有可同时表达结核肽Ag85B_199–207特异性TCR和HIV-1肽Env_120-128特异性TCR的融合基因；所述结核肽Ag85B_199–207特异性TCR包括α1链和β1链，其中，α1链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示，β1链的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；所述HIV-1肽Env_120-128特异性TCR包括α2链和β2链，其中，α2链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 25所示，β2链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 21所示；

编码α1链、β1链、α2链和β2链的基因序列通过自剪切多肽2A序列链接。

2.根据权利要求1所述的重组逆转录病毒载体，其特征在于，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 27所示。

3.根据权利要求1所述的重组逆转录病毒载体，其特征在于，出发载体包括pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。

4.权利要求1所述的重组逆转录病毒载体经包装后得到的逆转录病毒。

5.权利要求4所述的逆转录病毒转染的CD8⁺ T细胞。

6.权利要求1所述的重组逆转录病毒载体、权利要求4所述的逆转录病毒、权利要求5所述的逆转录病毒转染的CD8⁺ T细胞在制备抗结核/HIV共感染药物中的应用。