CN102863366A - 从胱氨酸及酪氨酸混合物中将胱氨酸及酪氨酸分离的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从胱氨酸及酪氨酸混合物中将胱氨酸及酪氨酸分离的方法，涉及氨基酸的制备及分离纯化技术领域。其特征在于先将胱氨酸及酪氨酸混合物的含水量降低，再加入酸后加热至胱氨酸及酪氨酸混合物全部溶解后加入有机醇；当酸醇体系冷却后，胱氨酸盐以沉淀的方式分离出来，进而可通过精制得到胱氨酸产品；再用余液制得酪氨酸产品。本发明解决了人们长期以来想解决而又一直未予解决的一大技术难题；不仅能从胱氨酸及酪氨酸物混合中将胱氨酸及酪氨酸实现有效分离，而且方法简便、收率高、工艺合理、成本低廉，适合工业化生产。

Description

从胱氨酸及酪氨酸混合物中将胱氨酸及酪氨酸分离的方法

技术领域

本发明涉及氨基酸的制备及分离纯化技术领域。

背景技术

 人类的必需氨基酸有8种，即赖氨酸、苯基丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸。如果人体缺乏这些氨基酸，就会影响人体的正常的生长和健康。由于人体合成胱氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸及甘氨酸等的能力较低，当需要它们的量增多时，必须在食物中添加这些氨基酸或者通过输液等方式补充这些氨基酸，这类氨基酸被称为人体“半必需氨基酸”。

 胱氨酸及酪氨酸一直是氨基酸输液和食品添加剂的重要成分。L-胱氨酸（L-Cystine）是一种氨基酸原料药及营养增补剂，用于奶粉的母乳化，能促进手术及外伤的治疗，刺激造血功能，促进白血球生成；也可作化妆品的添加剂，能促进伤口愈合，对防治皮肤过敏及治疗湿疹等作用。L-酪氨酸(L-Tyrosine)是合成多肽类激素、抗生素、L-多巴等药物的主要原料，广泛地应用于医药、食品添加剂、生物化工和饲料等领域，在医药上能用作甲状腺功能亢进症治疗。

 目前，L-胱氨酸及L-酪氨酸的最主要生产方法是以人发、羽毛、羊毛等为原料，经酸水解、提取、精制而成，结晶法是分离纯化胱氨酸及酪氨酸的传统工艺方法。上述蛋白质原料先经强酸水解成氨基酸后，用碱将水解液中和到弱酸性，将胱氨酸和酪氨酸混合物沉淀后分离出来，将得到的胱氨酸和酪氨酸混合物沉淀经重结晶可分别得到氨基酸纯品。

 实践证明，利用结晶法分离胱氨酸和酪氨酸混合物还存在一些技术困难，这是因为：1）两者的等电点很接近，（胱氨酸和酪氨酸的pI分别为5.05和5.66）；2）胱氨酸和酪氨酸在水中的溶解度都较低，而且两者随温度变化溶解度的变化也很接近[L-胱氨酸：in H₂O (g/dl)：0.011(25℃)，0.0239(50℃)，0.0523(70℃)，0.114(100℃)；酪氨酸：(in H₂O（g/dl）：0.020(0℃), 0.027(10℃), 0.038(20℃), 0.054(30℃), 0.075(40℃), 0.11(50℃), 0.15(60℃), 0.21(70℃), 0.29(80℃), 0.40(90℃), 0.57(100℃)；3)随pH变化胱氨酸和酪氨酸的溶解度变化也很接近。所以，胱氨酸和酪氨酸混合物的分离纯化十分困难。

 另一方面，原料药级胱氨酸产品和原料药级酪氨酸产品总是严格限制另一种氨基酸的存在，胱氨酸产品和酪氨酸产品均分别把酪氨酸或胱氨酸作为主要的杂质氨基酸进行检验。

 由于胱氨酸及酪氨酸是氨基酸中溶解度最低的两种氨基酸，在工业化生产中，这两种氨基酸总是处于同一个组分中。目前，主要利用在pH2.0左右胱氨酸的溶解度随温度的增加较酪氨酸的溶解度增加小这一特点，采用在提高溶液温度的条件下用碱（例如氨水或氢氧化钠等）进行中和结晶来实现将胱氨酸分离出来。为保证胱氨酸的纯度，碱中和终点的pH较低（pH2.0±0.5）。在此条件下，约有3O～45％的胱氨酸和酪氨酸没有沉析出来而留在母液中。所以，如何实现胱氨酸和酪氨酸的有效分离对提高胱氨酸和酪氨酸的生产收率至关重要。

 为实现胱氨酸和酪氨酸的分离，前人采用了以下方法：

    1、反复酸溶结晶。传统的分离方法是将混杂有另一种氨基酸的胱氨酸或酪氨酸样品反复酸溶后再用碱中和结晶（例如，郑达华，氨基酸和生物资源，1983，4，3）。这种方法不仅费工费时，还造成原辅料的消耗和产品的流失，成本高昂。这种方法不仅分离效果不理想，而且所得到的L-酪氨酸产品的比旋光度和透过率两项指标较低，产品质量较难达标，工业化生产实施困难。

2、活性炭吸附分离。利用活性炭先吸附胱氨酸及酪氨酸，然后通过控制洗脱活性炭实现胱氨酸及酪氨酸的分离（例如，符浩勇，张春力，氨基酸杂志，1992，14：21～22；邹学满，CN101148416A, CN1515544A；王先兵等CN101182297A）。

3、大孔树脂分离。利用可与酪氨酸形成氢键和疏水作用的大孔乙酰氨甲基聚苯乙烯树脂来实现酪氨酸与胱氨酸分开（刘国栋等，应用化学，2002，19（9）：894-897）。但是，从淋洗图可以看出，大孔树脂的选择性有限，对胱氨酸也有一定吸附，在生产规模如何有效实现胱氨酸和酪氨酸的有效分离仍然是个问题。

4、碱性条件下分离胱氨酸及酪氨酸。用氨水等将胱氨酸及酪氨酸混合物溶解，并调节pH至9～12.5后加热至60℃～85℃。因为胱氨酸及酪氨酸随pH上升二者的溶解度差异不显著，所以此方法采用在碱性条件下加热将胱氨酸降解的方式来达到去除胱氨酸杂质的目的。由于在碱性条件下加热可能引起酪氨酸的消旋，所以这一方法在生产中难以采用（孙复兴：1231284 A; 陈士安：CN102260183 A；鲁伟等，氨基酸和生物资源，2010，34(3)：80～82）。

5）电解法分离（罗成龙等，CN 1062347 A）设备成本高昂，实现工业化生产的困难很大。

 如何实现将胱氨酸及酪氨酸有效分离，是胱氨酸及酪氨酸工业化生产中，人们长期以来想解决而又一直未予解决的一大技术难题。

发明内容

本发明提供一种从胱氨酸及酪氨酸物混合中将胱氨酸及酪氨酸分离的方法，不仅能从胱氨酸及酪氨酸物混合中将胱氨酸及酪氨酸实现有效分离，且方法简便、工艺合理、成本低廉，适合工业化生产。

本发明的主要技术方案是：一种从胱氨酸及酪氨酸混合物中将胱氨酸及酪氨酸分离的方法，其特征在于先将胱氨酸及酪氨酸混合物的含水量降低，再加入酸后加热至胱氨酸及酪氨酸混合物全部溶解后加入有机醇；当酸醇体系冷却后，胱氨酸盐以沉淀的方式分离出来，进而可精制得到胱氨酸产品；再用余液可制得酪氨酸产品。

所述的先将胱氨酸及酪氨酸混合物的含水量降低至≤50%较好，先将胱氨酸及酪氨酸混合物的含水量降低至≤20%更佳。

所述的酸指盐酸、硫酸、硝酸、磺酸、甲基磺酸、乙基磺酸、苯磺酸、磷酸、三氯乙酸或三氟乙酸等，酸的用量以物料在加酸及常压下加热后胱氨酸及酪氨酸混合物全部溶解为准。

所述的醇指液态的醇：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇或异丁醇等，有机醇的用量为物料干重的一倍以上，V/W，较好；有机醇的用量为物料干重的3倍～10倍，V/W，更佳。

所述的酸式胱氨酸以沉淀的方式分离出来后，可通过离心或过滤等方式得到胱氨酸粗品，此粗品再通过在水溶液体系中酸溶后中和至pH2±1即得到胱氨酸精品结晶。

所述的用余液再制得酪氨酸产品的方法为：减压蒸馏回收有机醇后，用碱中和酸醇液至pH4以下，将冷却后所得的沉淀分离即得到酪氨酸粗品。此粗品再通过在水溶液体系中酸溶后中和即得到酪氨酸精品结晶。

所述的胱氨酸及酪氨酸混合物为将角蛋白水解物中和后所得的胱氨酸及酪氨酸混合物，为下列中的一种：

a）、将角蛋白酸水解成氨基酸后，用碱中和至pH4.5±1后静置沉淀，离心所得到的沉淀经过再次加酸溶解后加碱中和，静置沉淀后离心所得到的W沉淀；

b）、将上述的W沉淀经加酸溶解后加热并用碱中和,收获胱氨酸结晶后的母液（即精母），经浓缩后得到的以酪氨酸、胱氨酸含量高的沉淀；

c）、经过活性炭吸附氨基酸母液并洗脱出来的含有酪氨酸、胱氨酸含量高的沉淀；

d）、其他任何胱氨酸及酪氨酸混合物，包括含有酪氨酸杂质胱氨酸产品，以及含有胱氨酸杂质的酪氨酸产品。

所述的角蛋白是以角蛋白为主的蛋白质原料，包括人类毛发、羽毛、哺乳动物毛发或哺乳动物的角、蹄、爪等角蛋白含量丰富的物料。  

本发明的积极效果是显著的：解决了人们长期以来想解决而又一直未予解决的一大技术难题；不仅能从胱氨酸及酪氨酸物混合中将胱氨酸及酪氨酸实现有效分离，而且方法简便、收率高、工艺合理、成本低廉，适合工业化生产。本发明：

    1）、可一次性将胱氨酸及酪氨酸分开。在酸醇体系中，酪氨酸溶解于酸醇液相之中，而胱氨酸则以沉淀方式析出，避免了传统的工艺中复杂的反复酸溶后中和结晶、也避免了用于吸附胱氨酸及酪氨酸的活性炭及大孔树脂消耗及洗脱过程中的辅料消耗。此过程不破坏任何胱氨酸及酪氨酸，产品收率高。

2）、工艺简单，节约试剂，有机溶剂可以回收重复使用。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。

生产实施工艺流程：

1、将角蛋白水解物中和后所得的胱氨酸及酪氨酸混合物；角蛋白指以角蛋白为主的蛋白质原料，包括人体毛发、羽毛、哺乳动物毛发及其角、蹄、爪角蛋白含量丰富的原料。

    a）、以角蛋白酸水解成氨基酸后，用碱中和至pH4.5±1后静置沉淀，离心所得到的沉淀物，经过再次加酸溶解后加碱中和，静置沉淀后离心所得到的W沉淀；

b）、将上述的W沉淀经加酸溶解后加热并用碱调节至pH2±1,收获胱氨酸结晶后的母液即精母，经浓缩后得到的酪氨酸、胱氨酸含量高的沉淀；

c）、经过活性炭吸附氨基酸母液并洗脱出来的酪氨酸、胱氨酸含量高的沉淀；

d）、其他任何胱氨酸及酪氨酸混合物：含有酪氨酸杂质胱氨酸产品，以及含有胱氨酸杂质的酪氨酸产品。

2、将胱氨酸及酪氨酸混合物的含水量降低后，再加入酸后加热至混合物全部溶解后加入有机醇；当酸醇体系冷却后，酸式胱氨酸以沉淀的方式分离出来，进而精制可得到胱氨酸产品；用余液再制得酪氨酸产品。所述的酸指盐酸、硫酸、硝酸、磺酸、甲基磺酸、乙基磺酸、苯磺酸、磷酸、三氯乙酸或三氟乙酸，酸的用量以物料在加酸及常压下加热后胱氨酸及酪氨酸混合物全部溶解为准。所述的醇指液态的醇：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇，有机醇的用量（V/W）为物料干重的一倍以上。

3、酸醇体系冷却后，胱氨酸盐以沉淀的方式分离出来得到胱氨酸粗品，进而制得胱氨酸精品结晶。

4、用余液再制得酪氨酸产品。

 实施例 1：

 1、把5公斤人体毛发用10mol/L盐酸水解成氨基酸，水解液经减压排酸处理后冷却，用氨水或其他碱液中和至pH4.5±1后冷却静置24～48小时后，离心分离所得的沉淀经过酸溶后再次中和至pH4.0±1后静置，离心所得沉淀烘干。

2、取300 g粉碎后的沉淀（含水量约为30%），加入工业盐酸（～30%）并加热至完全溶解后加入1200 ml异丙醇，加热至70℃后保温一小时，室温冷却后抽滤。沉淀用薄层色谱分析表明胱氨酸与酪氨酸之比为11：1。将此沉淀在水溶液体系中脱色后采用常规胱氨酸结晶技术得到的胱氨酸结晶产品满足AJI第八版（97版）要求。

3、取精制胱氨酸后的母液（精母）10升，加入盐酸酸化后减压浓缩至约2000毫升，室温冷却后抽滤去除NH₄Cl固体结晶。剩余母液用50g活性炭加热脱色1小时后趁热抽滤，活性炭渣用20ml浓盐酸后再300 ml水洗涤，抽滤后合并滤液。滤液用浓氨水调pH至3.9，4℃静置过夜后抽滤，滤渣在75℃烘箱烘干。称取150 g滤渣（含水量约10%）用30%硫酸加热溶解后加入800 ml无水乙醇，在60℃下保温一小时后室温冷却。薄层色谱分析抽滤所得的沉淀表明胱氨酸与酪氨酸之比为10：1。将此沉淀在水溶液体系中脱色后，采用常规胱氨酸结晶技术得到精品，产品满足AJI第八版（97版）要求。

 4、含有机醇的滤液减压蒸馏回收有机醇，向剩余液中加入1000毫升去离子水，用碱中和至pH3.5后冷却，过滤得到以酪氨酸为主的沉淀。薄层色谱分析表明酪氨酸的含量约60%，其中主要杂质氨基酸为亮氨酸等疏水氨基酸。进一步酸溶后用稀碱中和即得酪氨酸精品。L-酪氨酸的主要质量指标均达到日本味之素(AJl92)和中国药典(CP2000)标准。

 实施例2：

1、取肉鸡羽毛用盐酸完全水解成氨基酸后的水解液经过碱中和后所得的沉淀，经过再次酸溶中和后的沉淀经75℃烘箱烘干。取烘干后的沉淀300克（含水量约10%），加入30%硝酸加热溶解后加入2500 ml无水甲醇，加热至70℃后保温1小时后冷却。抽滤所得到的沉淀用薄层色谱分析表明胱氨酸与酪氨酸之比为8：1。其他步骤参照实施例1。

 实施例3：

 1、取胱氨酸精母5000 mL缓慢通过一含1kg糖用活性炭的色谱柱，再用1200mL 10%的热盐酸溶液洗脱，用碱中和所得到的洗脱液的pH至4.0后室温冷却静置过夜，抽滤所得的沉淀75℃烘箱烘干。

 2、取100克（含水量为30%）的沉淀，加入工业盐酸加热溶解后加入正丁醇600mL，保温一小时后室温冷却，抽滤所得的沉淀经薄层色谱分析表明胱氨酸与酪氨酸之比为9：1。其他步骤参照实施例1。

    实施例4：

 取95克胱氨酸样品中加入5克酪氨酸制成100克含有5%酪氨酸杂质的胱氨酸样品，加入工业稀盐酸加热溶解后加入异丙醇500mL，保温一小时后室温冷却，抽滤所得的沉淀经酸溶后稀氨水中和至pH2.2。抽滤得到的胱氨酸精品用薄层色谱分析表明，胱氨酸精品中无酪氨酸杂斑。胱氨酸的精制步骤参照实施例1。

 实施例5：

 取95克酪氨酸样品中加入5克胱氨酸制成100克含有5%胱氨酸杂质的酪氨酸样品。向此样品加入20%的甲基磺酸加热溶解后加入正丙醇600mL，保温一小时后室温冷却，抽滤去除胱氨酸沉淀。剩余的母液减压蒸馏回收正丙醇后在水溶液体系中用稀氨水中和至pH2.5。冷却后抽滤得到的酪氨酸粗品。用薄层色谱分析表明，酪氨酸精品中无胱氨酸杂斑。

 实施例6～12见表1。

 表1几点说明：

     1、胱氨酸及酪氨酸混合物用下列中的一种：

     a）、以角蛋白酸水解成氨基酸后，用碱中和至pH4.5±1后静置沉淀，离心所得到的沉淀物，经过再加酸溶解加碱中和后静置沉淀离心所得到的W沉淀；

 b）、将上述的W沉淀经加酸溶解后加热并用碱调节pH2±1,收获胱氨酸结晶后的母液即精母，经浓缩后得到的以酪氨酸、胱氨酸为主的沉淀；

 c）、经过活性炭吸附氨基酸母液并洗脱出来的含有酪氨酸、胱氨酸为主的沉淀；

 d）、其他任何胱氨酸及酪氨酸混合物：含有酪氨酸杂质胱氨酸产品，或是含有胱氨酸杂质的酪氨酸产品。

2、加入酸量为至胱氨酸及酪氨酸混合物经加热后全部溶解为止。

3、有机醇的用量为物料干重的1倍～10倍，V/W。

4、加热温度可致溶液沸腾为上限。

5、其他工艺同上，略

表1

实施其他有关说明：

1、关于加热的问题。加热是指在常压下加热，目的是加快混合物的溶解；

2、关于所用的酸的种类及酸的用量问题。

加酸的目的是利用酸式胱氨酸及酸式酪氨酸的溶解度大幅度提高的特点来加快这些氨基酸的溶解。为了达到使胱氨酸及酪氨酸的羧基的完全质子化，凡是酸性强于氨基酸α-羧基的所有酸（例如盐酸、硫酸、硝酸、磺酸、甲基磺酸、乙基磺酸、苯磺酸、磷酸、三氯乙酸或三氟乙酸等）均可采用。

酸的用量与酸的强度有关，盐酸、硫酸、硝酸等强酸的用量较小，磺酸、磷酸、三氯乙酸或三氟乙酸等相对较弱的酸的用量较多。酸用量的标准是：在常压加热至沸腾后混合物全部溶解。

2、胱氨酸及酪氨酸混合物指待加工的物料，酸醇与物料的混合物指向胱氨酸及酪氨酸混合物中(待加工的物料中) 加入酸溶解并加热溶解后加入有机醇后的混合物。

3、胱氨酸及酪氨酸混合物在80℃的烘箱中经连续24小时烘干后的含水量设定为0%。

4、向胱氨酸及酪氨酸混合物中加入酸以后的加热温度可至沸腾，但是加入有机醇后的保温温度应略低于有机醇的沸点。

5、胱氨酸粗品精制成胱氨酸结晶精品的技术可同现有的通用纯化胱氨酸技术。

6、酪氨酸粗品制得酪氨酸结晶精品的技术可同现有的通用纯化酪氨酸技术。

Claims (10)

1.一种从胱氨酸及酪氨酸混合物中将胱氨酸及酪氨酸分离的方法，其特征在于先将胱氨酸及酪氨酸混合物的含水量降低，加酸后加热至胱氨酸及酪氨酸混合物全部溶解后加入有机醇；当酸醇体系冷却后，胱氨酸盐以沉淀的方式分离出来，进而可制得到胱氨酸产品；再用余液制得酪氨酸产品。

2.根据权利要求1所述的从胱氨酸及酪氨酸混合物中将胱氨酸及酪氨酸分离的方法，其特征在于先将胱氨酸及酪氨酸混合物的含水量降低至小于≤50%。

3.根据权利要求2所述的从胱氨酸及酪氨酸混合物中将胱氨酸及酪氨酸分离的方法，其特征在于先将胱氨酸及酪氨酸混合物的含水量降低至≤20%。

4. 根据权利要求1所述，其特征在于所述的酸指盐酸、硫酸、硝酸、磺酸、甲基磺酸、乙基磺酸、苯磺酸、磷酸、三氯乙酸或三氟乙酸，酸的用量以物料在加酸及常压下加热至沸腾后胱氨酸及酪氨酸混合物全部溶解为准。

5.根据权利要求1所述的从胱氨酸及酪氨酸混合物中将胱氨酸及酪氨酸分离的方法，其特征在于所述的醇指液态醇：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇或异丁醇，有机醇的用量为物料干重的一倍以上，V/W。

6.根据权利要求5所述的从胱氨酸及酪氨酸混合物中将胱氨酸及酪氨酸分离的方法，其特征在于所述的有机醇的用量为物料干重的3倍～10倍，V/W。

7.根据权利要求1所述的从胱氨酸及酪氨酸混合物中将胱氨酸及酪氨酸分离的方法，其特征在于胱氨酸盐以沉淀的方式分离出来后，通过离心或过滤等方式得到胱氨酸粗品，此粗品再通过在水溶液体系中酸溶后碱中和至pH2±1即得到胱氨酸精品结晶。

8.根据权利要求1所述的从胱氨酸及酪氨酸混合物中将胱氨酸及酪氨酸分离的方法，其特征在于所述的用余液再制得酪氨酸产品的方法为：减压蒸馏回收有机醇后，用碱中和酸醇液至pH4以下，将冷却后所得的沉淀分离即得到酪氨酸粗品，此粗品再通过在水溶液体系中酸溶后碱中和即得到酪氨酸精品结晶。

9.根据权利要求1所述的从胱氨酸及酪氨酸混合物中将胱氨酸及酪氨酸分离的方法，其特征在于所述的胱氨酸及酪氨酸混合物为角蛋白水解物碱中和后所得的胱氨酸及酪氨酸混合物，为下列中的一种：

a）、角蛋白酸水解后，用碱中和至pH4.5±1后静置沉淀，离心所得到的沉淀物经过再次加酸溶解加碱中和后静置沉淀离心所得到的W沉淀；

b）、将上述的W沉淀经加酸溶解后加热并用碱调节pH,收获胱氨酸结晶后的母液即精母，经浓缩后得到的以酪氨酸、胱氨酸含量高的沉淀；

c）、经过活性炭吸附氨基酸母液后并洗脱出来的含有酪氨酸、胱氨酸的沉淀；

d）、其他任何胱氨酸及酪氨酸混合物，包括含有酪氨酸杂质胱氨酸产品，或是含有胱氨酸杂质的酪氨酸产品。

10.根据权利要求9所述的从胱氨酸及酪氨酸混合物中将胱氨酸及酪氨酸分离的方法，其特征在于所述的角蛋白是以角蛋白为主的蛋白质原料，包括人类毛发、羽毛、哺乳动物毛发或哺乳动物的角、蹄、爪等角蛋白含量丰富的原料。