CN102861347A

CN102861347A - 99mTc标记半乳糖化RGD肿瘤诊断药物及制备方法

Info

Publication number: CN102861347A
Application number: CN2012103804250A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: ANHUI ZHUMENG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: ANHUI ZHUMENG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-10-09
Filing date: 2012-10-09
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2032-10-09
Also published as: CN102861347B

Abstract

本发明涉及一种用于intergrin α_vβ₃受体阳性肿瘤诊断的RGD多肽放射性药物及其制备方法。该药物在结构上为半乳糖化的RGD环状二聚体，通过双功能螯合剂HYNIC进行放射性核素^99mTc标记。其主要特征是：采用两个半乳糖作为RGD的连接链，降低了药物在肠道、肺等非靶器官中的摄取，从而提高了肿瘤显像的图像质量。所述的放射性药物为^99mTc-Galacto-RGD₂，为无色透明液体针剂。

Description

99mTc标记半乳糖化RGD肿瘤诊断药物及制备方法

技术领域

本发明涉及用于肿瘤诊断的放射性药物，特别涉及用于intergrin α _vβ₃受体阳性肿瘤诊断的一种RGD多肽放射性药物及其制备方法。

背景技术

据世界卫生组织（WHO）统计，全世界恶性肿瘤每年发病1100多万人，病死800多万人。恶性肿瘤发病率在我国也呈明显上升趋势，据国家卫生资料统计，近两年来我国城市居民恶性肿瘤占死亡原因的第1位，每年新增患者约220万人。

近年来恶性肿瘤的治疗手段在不断发展，不仅传统的化疗和放疗技术更加规范化和科学化，新的治疗方法，如：分子靶向治疗、免疫治疗和基因治疗等，正在逐步应用于临床。与之相适应，要求恶性肿瘤诊断技术不仅要能够进行准确的诊断，更迫切需要进一步反映恶性肿瘤的生物学行为和病理特点，为治疗方案的科学化决策提供确切的依据。恶性肿瘤的转移潜力直接关系到患者的预后，同时对于临床医师选择治疗方案具有至关重要的意义。但目前临床上还缺乏准确判定恶性肿瘤转移能力的检测方法，而主要依靠经验判断。

新生血管和淋巴管的形成在肿瘤发生、发展和转移中发挥着重要的作用，肿瘤新生血管形成促进肿瘤生长和转移，淋巴道形成与肿瘤转移直接相关。整合素（integrin）是一组跨膜糖蛋白，由一个α亚单位和β亚单位通过非共价键组成的异二聚体，也是细胞外基质蛋白的受体，与细胞外基质蛋白（如纤维结合蛋白、玻璃结合蛋白、层粘蛋白和胶原等) 的受体识别序列RGD( 精氨酸- 甘氨酸- 天冬氨酸) 特异结合。整合素调控新生血管和淋巴道的形成。诸多研究表明，整合素调控金属基质蛋白酶等蛋白水解酶，直接参与细胞外基质的降解，促使肿瘤转移；整合素的丰富表达是促使肿瘤细胞和血管内皮细胞迁移和侵袭的重要分子，它直接介导肿瘤细胞与基质蛋白的粘附和结合；参与调控胞内细胞骨架构成，细胞增殖。

α_vβ₃是目前研究最多的整合素分子，在骨肉瘤、成神经细胞瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤及浸润性黑色素瘤等多种实体肿瘤细胞表面和肿瘤新生血管均有丰富的表达，在成熟血管内皮细胞和绝大多数正常组织表达缺乏或几乎不表达。α_vβ₃受体介导肿瘤细胞粘附和移行, 在肿瘤新生血管生成和淋巴道转移发挥重要作用。α_vβ₃的表达水平与恶性肿瘤的浸润转移能力等恶性表型有关, 也可以作为评价某些恶性肿瘤预后的的指标。

放射性核素标记的RGD序列配体已经被用于肿瘤的放射性核素显像研究，用于检测转移潜力较高的integrin α_vβ₃表达阳性的肿瘤。已有的研究结果认为：RGD多肽二聚体显像剂与恶性肿瘤表面integrin α _vβ₃的亲和力更好，要优于RGD多肽四聚体。但目前已有的RGD多肽二聚体显像剂在非靶器官，特别是肠道等器官的摄取较多，腹部本底较高，干扰了腹部肿瘤的成像效果，有必要发明新型的RGD多肽二聚体显像剂，通过改变配体的结构，进一步降低显像剂在肠等非靶器官的摄取，从而降低放射性本底，提高肿瘤显像的图像质量。

发明内容

为克服已有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种非靶器官摄取更为理想的放射性核素标记RGD多肽肿瘤诊断药物。

为达到上述目的，本发明的主要技术方案如下：将HYNIC-OSu与半乳糖化的RGD肽二聚体Galacto-RGD₂相连接，制备得到配体HYNIC-Galacto-RGD₂。利用配体中HYNIC的螯合作用，实现^99mTc标记，制成RGD多肽二聚体显像药物^99mTc-Galacto-RGD₂。在配体结构中引入两个半乳糖连接链，减少了药物在肠道中的摄取，从而降低了放射性本底，提高了肿瘤显像的图像质量。

附图说明

图1 标记前体化合物HYNIC-Galacto-RGD2的合成路线示意图；

图2 ^99mTc标记的诊断药物^99mTc-Galacto-RGD₂的合成路线示意图；

图3 ^99mTc-Galacto-RGD₂的放射性HPLC图谱；

图4在过量E[c(RGDfK)]₂抑制或未经E[c(RGDfK)]₂抑制的条件下，^99mTc-Galacto-RGD₂在荷U87MG人胶质瘤裸鼠中注射后60 min的生物分布；

图5 ^99mTc-Galacto-RGD₂在荷U87MG人胶质瘤裸鼠模型中的3D和横断面的SPECT-CT图像；

图6注射前的^99mTc-Galacto-RGD₂、注射后30 min和120 min的尿样以及注射后120 min的粪便样本的放射性HPLC图谱。

具体实施方式

一．半乳糖化RGD多肽放射性药物的制备方法

1．材料和设备

化学试剂均购于美国Sigma/Aldrich公司，无需进一步纯化。Galacto-RGD肽二聚体（Galacto-RGD₂）由美国Peptides International 公司（Louisville, KY）按照常规工艺制造。HYNIC-Osu根据文献中方法合成。

ESI（电喷射离子化）质谱数据由Finnigan LCQ传统质谱仪上采集获得。^99mTcO₄ ^-从原子高科股份有限公司购得。

2. HPLC（高效液相色谱）方法

HPLC方法1：使用LabAillance色谱系统，包括紫外-可见光检测仪（波长为254 nm）和Zorbax C18半制备柱（柱宽×柱长为9.4 nm×250 mm，固定相的孔径大小为100 ?，美国Agilent Technologies公司提供）。流速为2.5 mL/min，流动相A相为含0.1% TFA的水；B相为含0.1% TFA的甲醇。流动相梯度：0-5 min，90%A->80%A；5.01-20 min，80%A->70%A。

HPLC方法2：使用LabAillance色谱系统，包括 β-ram IN/US检测仪（Tampa，FL）和Zorbax C18色谱柱（柱宽×柱长为4.6 mm×250 mm，固定相的孔径大小为300 ?，美国Agilent Technologies公司提供）。流速为1 mL/min，流动相A相为25 mM NH₄Oac；B相为乙腈。流动相梯度为0-5 min，90% A；5.01-20 min，90%A->60%A；20.01-25 min，60%A->40%A。

3. 标记前体化合物HYNIC-Galacto-RGD₂的制备方法

将HYNIC-Osu（5.4 mg, 12 μmol）和Galacto-RGD₂（6.5 mg, 3 μmol）溶于DMF（2 mL）。滴加过量的DIEA（5 滴）至上述混合液，室温搅拌至反应结束（约5天）。将2 mL水加至反应液中，用三氟乙酸（TFA）调节pH至3~4。产品经HPLC分离纯化（HPLC方法1），收集保留时间为14.5 min的组分，冷冻干燥后得到3.5 mg目标产物HYNIC-Galacto-RGD₂（图1）。ESI-MS（C₁₀₄H₁₄₆N₃₂O₃₆S）：实验值为2452.3（[M + H]⁺），计算值为2451.03 （[M]⁺）。

4. ^99mTc-Galacto-RGD₂的制备方法

将1.0~1.5 mL 含有1110~1850 MBq Na^99mTcO₄ 的生理盐水加至含有20 μg HYNIC-Galacto-RGD₂、5 mg TPPTS、6.5 mg tricine、40 mg甘露醇、38.5 mg六水合琥珀酸二钠和12.7 mg 琥珀酸的冻干瓶中。将上述反应液在沸水浴中反应10~30 min，然后在室温中放置5 min，采用HPLC对反应产物进行分析（HPLC方法2）（图2）。

将上述反应液配制成约30 μCi/mL的生理盐水溶液用于生物分布研究，配制成约1 mCi/mL的生理盐水溶液用于显像研究。用于上述两个实验的^99mTc-Galacto-RGD₂，其放化纯>90%。在给动物注射前，溶液均经0.20 μm Millex-LG滤膜过滤，每只动物注射0.1 mL。

从^99mTc-Galacto-RGD₂的放射性HPLC图谱（图3）可见，^99mTc-Galacto-RGD₂具有高的放射化学纯度，RCP>90%。

二．动物实验

生物分布及显像研究依据美国国家卫生研究院动物实验指南进行，并符合动物伦理的要求。

U87MG胶质瘤细胞株用含厄尔平衡盐缓冲液的MEM培养基培育，并培养基中添加了10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素。肿瘤细胞于37°C，含有5% CO₂的培养箱中培养。所有细胞单层生长，待达到90%汇合度时收获。选择雌性4-5周龄裸鼠，将肿瘤细胞悬于生理盐水中，数量调整为5 × 10⁷个/mL, 取0.1 mL细胞悬液植于裸鼠肩侧。所有步骤均于超净台内进行。待肿瘤长至0.1 ~0.5 g时进行实验。

1. ^99mTc-Galacto-RGD₂在荷U87MG人胶质瘤的裸鼠中的生物分布实验

随机选择4只荷瘤小鼠（20~25 g），均于尾静脉注射约3 μCi ^99mTc-Galacto-RGD₂。在注射5、30、60和120 min后，将动物用过量的戊巴比妥钠（约200 mg/kg）麻醉处死。从心脏取血样，再取出肿瘤及正常器官（脑、眼、心、脾、肺、肝、肾、肉和肠），用生理盐水洗涤后擦干称重，并用Perkin Elmer Wizard 1480 γ计数器（Shelton, CT）测计数，从而计算出各组织的单位质量注射剂量百分数（%ID/g）和瘤与正常组织的比值。表1列出了^99mTc-Galacto-RGD₂在荷U87MG人胶质瘤的裸鼠中不同时相的生物分布数据；表2对荷U87MG人胶质瘤裸鼠注射后60 min后，^99mTc-Galacto-RGD₂和^99mTc-3P-RGD₂的生物分布数据进行了比较。

表1 ^99mTc-Galacto-RGD₂在荷U87MG人胶质瘤的裸鼠中的生物分布数据（%ID/g）

器官	5 min (n = 5)	30 min (n = 5)	60 min (n = 8)	120 min (n = 8)
					血	1.10 ± 0.16	0.92 ± 0.33	0.56 ± 0.25	0.22 ± 0.03
脑	0.41 ± 0.10	0.22 ± 0.06	0.35 ± 0.28	0.14 ± 0.12
					眼	1.54 ± 0.49	1.20 ± 0.50	0.81 ± 0.39	0.52 ± 0.15
心	2.36 ± 0.29	1.65 ± 1.10	1.27 ± 0.61	0.56 ± 0.08
					肠	3.78 ± 0.52	4.24 ± 1.54	5.45 ± 1.47	3.37 ± 1.32
肾	18.75 ± 2.79	13.13 ± 4.75	11.70 ± 4.06	6.04 ± 1.92
					肝	4.00 ± 0.10	2.82 ± 1.25	3.07 ± 2.14	1.54 ±0.43
肺	5.41 ± 0.58	4.24 ± 1.71	2.93 ± 0.94	1.31 ± 0.23
					肉	2.73 ± 0.89	1.10 ± 0.25	0.88 ± 0.34	0.47 ± 0.12
脾	2.97 ± 0.43	2.53 ± 0.85	1.99 ± 0.71	1.46 ± 0.26
					肿瘤	10.30 ± 1.67	8.37 ± 2.13	6.86 ± 1.33	5.61 ± 1.52
肿瘤/血	9.43 ± 1.19	9.65 ± 2.03	15.94 ± 8.85	26.48 ± 8.71
					肿瘤/肝	2.66 ± 0.51	3.25 ± 0.85	3.05 ± 1.69	4.03 ± 2.04
肿瘤/肺	1.90 ± 0.21	2.19 ± 0.75	2.73 ± 1.33	4.38 ± 1.34
					肿瘤/肌肉	3.98 ± 0.75	7.97 ± 2.53	9.40 ± 5.11	12.91 ± 4.95

[0035] 表2 注射后60 min，^99mTc-Galacto-RGD₂与^99mTc-3P-RGD₂在荷U87MG人胶质瘤裸鼠中的生物分布数据比较（%ID/g）

从表1中可以看出，注射后5、30、60和120 min，^99mTc-Galacto-RGD₂的肿瘤摄取依次为10.30 ± 1.67、8.37 ± 2.13、6.86 ± 1.33和5.61 ± 1.52 %ID/g，注射后60 min内的肿瘤摄取与^99mTc-3P-RGD₂相似。

注射后5、30、60和120 min，^99mTc-Galacto-RGD₂在肝中的摄取依次为4.00 ±1.10、2.82 ± 1.25、3.07 ± 2.14和1.54 ±0.43%ID/g，肿瘤/肝摄取比值依次为2.66 ± 0.51、3.25 ± 0.85、3.05 ± 1.69和4.03 ± 2.04。注射后60min内，^99mTc-Galacto-RGD ₂在肝中的摄取与^99mTc-3P-RGD₂ 相比没有明显的差异。

^99mTc-Galacto-RGD₂与^99mTc-3P-RGD₂最主要的区别在于肠道的摄取。注射后60 min，^99mTc-Galacto-RGD₂的摄取值为5.45 ± 1.47 %ID/g，明显低于^99mTc-3P-RGD₂的9.45 ± 1.31 %ID/g，p < 0.01（表2）。因此，认为^99mTc-Galacto-RGD₂在肠道中的摄取更低，其性能优于^99mTc-3P-RGD₂。

2. ^99mTc-Galacto-RGD₂在荷U87MG人胶质瘤的裸鼠中的抑制实验

随机选择4只荷瘤小鼠（20-25 g），均于尾静脉共注射约3 μCi ^99mTc-Galacto-RGD₂和约350 μg（约14 mg/kg）的经典整合素α_vβ ₃拮抗剂E[c(RGDfK)]₂（RGD₂）。在注射60 min后，将动物用过量的戊巴比妥钠（约200 mg/kg）麻醉处死。从心脏取血样，再取出肿瘤及正常器官（脑、眼、心、脾、肺、肝、肾、肉和肠），用生理盐水洗涤后擦干称重，并用Perkin Elmer Wizard 1480 γ计数器（Shelton, CT）测计数，从而计算出各组织的单位质量注射剂量百分数（%ID/g）。抑制实验的结果见图4。

由实验结果可知，未注射过量RGD₂时，^99mTc-Galacto-RGD₂的肿瘤摄取为6.86 ± 1.33 %ID/g，而共注射过量RGD₂后，肿瘤摄取降至0.59 ± 0.28 %ID/g，可见过量的RGD₂显著抑制了^99mTc-Galacto-RGD₂在肿瘤中的摄取。同样地，RGD₂也抑制了^99mTc-Galacto-RGD₂在正常组织中的摄取。未经抑制时，^99mTc-Galacto-RGD₂在肠、肺和脾的摄取分别为5.45 ± 1.47、2.93 ± 0.94和1.99 ± 0.71 %ID/g，而抑制后它们相应的摄取依次降至0.88 ± 0.26、0.85 ± 0.39和0.51 ± 0.03 %ID/g。上述实验清楚地证明，^99mTc-Galacto-RGD₂在肿瘤中的定位是具有integrin α_vβ₃特异性的。

3. ^99mTc-Galacto-RGD₂在荷U87MG人胶质瘤的裸鼠中的SPECT-CT显像研究

SPECT/CT显像采用配有0.6 mm多针孔准直器的u-SPECT-II/CT 扫描仪 (Milabs, Utrecht, The Netherlands)。荷胶质瘤的小鼠经尾静脉注射剂量为37.0~55.5 MBq的 ^99mTc-Galacto-RGD₂，体积为0.1mL。注射后60 min后将其置于连有异氟醚麻醉装置的屏蔽室内(Univentor, Zejtun, Malta)，通过流速为350 mL/min含有3.0%异氟醚的气流进行麻醉。麻醉完毕后，立即将动物仰卧在扫描床上进行SPECT-CT扫描，并将气流调整为流速250 mL/min，含有2.0%异氟醚。显像结束后，SPECT图像采用迭代法（6次迭代，16个子集）进行重建，并进行SPECT图像与CT图像的融合。显像结果见图5，可见肿瘤部位放射性浓聚，显影清晰，肺、肠道等器官放射性本底较低。

Claims

1.一种^99mTc标记的RGD多肽放射性药物，该药物在结构上为半乳糖化的RGD环状二聚体，通过双功能螯合剂HYNIC进行放射性核素^99mTc标记，其主要特征是：采用两个半乳糖作为RGD的连接链，降低了药物在肠道、肺等非靶器官中的摄取，从而提高了肿瘤显像的图像质量，所述的放射性药物为^99mTc-Galacto-RGD₂，为无色透明液体针剂。

2.权利要求1中所述的^99mTc标记RGD多肽放射性药物的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

a. 标记前体化合物HYNIC-Galacto-RGD₂的制备方法

将HYNIC-Osu（5.4 mg, 12 μmol）和Galacto-RGD₂（6.5 mg, 3 μmol）溶于DMF（2 mL）。滴加过量的DIEA（5 滴）至上述混合液，室温搅拌至反应结束（约5天）；将2 mL水加至反应液中，用三氟乙酸（TFA）调节pH至3~4；产品经HPLC分离纯化，收集保留时间为14.5 min的组分，冷冻干燥后得到3.5 mg目标产物HYNIC-Galacto-RGD₂；ESI-MS（C₁₀₄H₁₄₆N₃₂O₃₆S）：实验值为2452.3（[M + H]⁺），计算值为2451.03 （[M]⁺）；

b. ^99mTc-Galacto-RGD₂的制备方法

将1.0~1.5 mL 含有1110~1850 MBq Na^99mTcO₄ 的生理盐水加至含有20 μg HYNIC-Galacto-RGD₂、5 mg TPPTS、6.5 mg tricine、40 mg甘露醇、38.5 mg六水合琥珀酸二钠和12.7 mg 琥珀酸的冻干瓶中，将上述反应液在沸水浴中反应10~30 min，然后在室温中放置5 min。