CN102851335A

CN102851335A - 用啤酒废酵母制备饲料核苷酸的方法

Info

Publication number: CN102851335A
Application number: CN201210348607XA
Authority: CN
Inventors: 薛宏基; 赵传江; 邹益东; 赵亮; 刁海霞
Original assignee: TIANSHI FODDER CO Ltd YIXING CITY
Current assignee: TIANSHI FODDER CO Ltd YIXING CITY
Priority date: 2012-09-19
Filing date: 2012-09-19
Publication date: 2013-01-02

Abstract

本发明公开了一种用啤酒废酵母制备饲料核苷酸的方法，该方法通过破壁、抽提、酶解等优选工艺将啤酒废酵母制备成5'-核苷酸，本发明选用紫外分光光度法测定抽提液中RNA的含量，根据抽提得到的RNA含量，按每克单位RNA底物需5'-磷酸二酯酶2500-5000活力单位计算，确定并加入5'-磷酸二酯酶的量，将RNA酶解为5'核苷酸。本发明具有生产周期短，投资少，成本低，产品收率高，质量稳定，变废为宝，无污染物排放等优点，具有良好的经济价值和社会价值。

Description

用啤酒废酵母制备饲料核苷酸的方法

技术领域

本发明涉及一种核苷酸的制备方法，具体涉及一种用啤酒废酵母制备饲料核苷酸的方法。

背景技术

我国每年从啤酒生产中淘汰下来的废酵母折干有5万吨之多，啤酒酵母细胞中核糖核酸（RNA）含量高达酵母细胞的4%至6%。核糖核酸由四种单体核苷酸组成，分别是胞苷酸（5'-CMP）、尿苷酸（5'-UMP）、腺苷酸（5'-AMP）和鸟苷酸（5'-GMP)。核苷酸和核苷酸之间通过磷酸与五碳核糖环上3' 、5'位相连接，形成数百乃至数千个核苷酸组成的长链RNA大分子，在细胞自然环境中，RNA与蛋白质以核蛋白形式存在。

核苷酸已应用于饲料和养殖业，至今还把核苷酸称为新型饲料添加剂。许多哺乳动物、家禽和鱼虾，在其快速生长阶段，或遭遇到环境和生活条件急剧改变时，机体许多重要免疫器官如淋巴、骨髓、肠道、血红细胞和白细胞中内源核苷酸不能满足需要，造成机体免疫力急骤下降，诱发许多疾病。通过将近二三十年相关研究证实，适当补充外源核苷酸对养殖动物具有：1.维持机体整体免疫功能；2.促进肠道细胞分化、生长和修复；3.增强抗应激能力，减少疾病和死亡；4. 产生体内抗氧化，消除自由基；5.可诱食、增食，促进生长发育；6.提高生殖能力和繁殖系数等多方面功效。

废酵母如不加利用，既浪费资源，又对环境造成了较大的污染，增加了对排放废水治理的负担。因此，很有必要在现有技术的基础上，以啤酒废酵母为原料，变废为宝，采用优选的工艺制备得到核苷酸含量高的饲料核苷酸。

发明目的

发明目的：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种用啤酒废酵母制备饲料核苷酸的方法。该制备方法高效、工艺操作合理、生产成本低，适合工业化生产。

技术方案：为了实现以上目的，本发明所采取的技术方案为：

一种用啤酒废酵母制备饲料核苷酸的方法，具体包括以下步骤：

(1)酵母破壁、RNA酶解：将啤酒废酵母泥输送到反应罐，加入NaOH，在20~45℃条件下对啤酒废酵母进行破壁、抽提1-3小时，使RNA溶出，形成含有RNA、蛋白和多糖等多组份的悬浮抽提液，然后在抽提液内加入盐酸，使抽提液的pH为6.0~6.5，取样通过紫外分光光度法测定抽提液中RNA的含量，根据抽提得到的RNA含量，按每克单位RNA底物计算需要的5'-磷酸二酯酶量，加入5'-磷酸二酯酶，然后调整酶解液在最佳的pH值范围内5.5-6.0和最佳的温度范围65~70℃，进行酶解反应；通过定磷方法，当测得所产生的5'-核苷酸达到最高产量时，升温到90~95℃，维持10~15分钟，终止酶解反应；

(2)真空减压浓缩、喷雾干燥：将步骤(1)经5'-磷酸二酯酶酶解的料液从反应罐输送到浓缩罐，在真空减压条件下升温在70~75℃，将料液浓缩到原体积2/3-1/2，然后喷雾干燥即得。

作为优选方案，以上所述的用啤酒废酵母制备饲料核苷酸的方法，步骤(1)将啤酒废酵母破壁和抽提RNA，加入NaOH使NaOH的浓度为0.6~1.2%，并使含有的折干酵母浓度达到8-10%，在20-45℃条件下作用1-3小时。本发明通过大量实验优选得到酵母破壁和RNA抽提的最佳条件。实验结果表明，在上述所述条件组合下，啤酒废酵母细胞破壁率最高，抽提得到的核糖核酸含量最高。

作为优选方案，以上所述的用啤酒废酵母制备饲料核苷酸的方法，步骤(1)对于破壁、抽提形成的多组份悬浮抽提液，如何运用5'磷酸二酯酶对其中的RNA单独降解，形成5'核苷酸，是本发明的关键之一，通过大量实验筛选，确定科学合理的酶量，按每克单位RNA底物需5'-磷酸二酯酶2500-5000活力单位计算、确定5'-磷酸二脂酶量进行酶解。以确保酶作用的必需浓度，从而可专一地、高效地将RNA大分子内切降解成5'-腺苷酸、5'-尿苷酸、5'-胞苷酸和5'-鸟苷酸，取得了很好的技术效果。

酶解过程中，本发明对酶解温度和酶解时抽提液的pH最佳范围进行了大量实验筛选，因为不同的酶解温度和酶解pH值对核糖核酸的水解效率具有较大的影响，尤其是本方法所涉及的是多组份的混合体系，通过大量实验优选得到最佳的酶解温度和酶解pH范围，可最大程度地提高酶解效率，使产品收率更高，产品的质量稳定有保证。

有益效果：本发明提供的用啤酒废酵母制备饲料核苷酸的方法与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明提供的用啤酒废酵母制备饲料核苷酸的方法，通过大量实验优选得到最佳的破壁、抽提、酶解工艺条件，本发明工艺将原料的处理、酵母的破壁、RNA的抽提和酶解RNA生成四种核苷酸都在一罐内完成，不需酵母洗涤罐，不需RNA沉淀槽等，且不需冷冻降温设备，不需离心和板框固液分离，不需脱色装置，也不需层析分离装置，生产成本和能耗大幅度降低，作为饲料添加剂可规模化地应用推广，有良好的经济效益和社会效益。

2、本发明提供的用啤酒废酵母制备饲料核苷酸的方法，选用紫外分光光度法测定抽提液中RNA的含量，根据抽提得到的RNA含量，按每克单位RNA底物需5'-磷酸二酯酶2500-5000活力单位计算，确定并加入5'-磷酸二酯酶的量，比现有技术能提高30%的酶解率，并能提高酶解速度。

3、本发明可充分利用啤酒废酵母资源，变废为宝，整个生产周期缩短，可在四季常温条件下生产，可克服现有技术只能在5-10℃的低温下操作，且得到的核苷酸复合产品质量稳定，收率可高达90~98%。

附图说明

图1为四种核苷酸的标准色谱图。

图2为本发明制备得到的饲料核苷酸的色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1

1、一种用啤酒废酵母制备饲料核苷酸的方法，具体包括以下步骤：

(1)酵母破壁、RNA酶解：将啤酒废酵母泥8L（相当于折干酵母890克）加入到10L反应罐，称固体氢氧化钠90克溶于少量水中，在搅拌下加入到酵母泥中，最后加水至9L，升温到40℃条件下对啤酒废酵母进行破壁和RNA抽提2小时，然后在抽提液内加入盐酸，使抽提液的pH为6.5，取样通过以下紫外分光光度法测定抽提液中RNA的含量为4.14毫克/毫升，根据抽提得到的RNA含量，按每克单位RNA底物需5'-磷酸二酯酶2500-5000活力单位计算，确定并加入5'-磷酸二酯酶酶液1460mL，然后调整酶解液pH值在5.6-5.8，温度控制在65-70℃，进行酶解反应3小时；通过以下定磷方法，测得5'-核苷酸含量为2.5mg/ml时，升温到90℃，维持10分钟，终止酶解反应；

(2)真空减压浓缩、喷雾干燥：将步骤(1)经5'-磷酸二酯酶酶解的料液从反应罐输送到浓缩罐，采用循环水式真空泵，使真空度达0.06-0.07mpa，在真空减压条件下升温在效70~75℃，将料液浓缩到5000mL，然后将浓缩液在喷雾干燥机上喷雾，调节进口温度190-195℃，出口温度90-95℃，共收获饲料核苷酸粉剂850克，经高效液相色谱仪测定5'-核苷酸含量为3.24%；粗蛋白含量为50%；免疫多糖包括β葡聚糖和甘露聚糖总含量为20%；为一种营养全面，核苷酸含量高的功能性饲料核苷酸。

2、以上所述的用啤酒废酵母制备饲料核苷酸的方法，紫外分光光度法测定抽提液中RNA的含量操作方法为：

取两支离心管，分别加入2ml核糖核酸抽提溶液，甲管加2ml蒸馏水，乙管加2ml钼酸铵-过氯酸试剂，摇匀，置冰箱或者冰浴中冷却30min，3000rpm离心15分钟，然后分别取上清液0.4ml定容到100ml，在260nm下测O.D值。

核糖核酸含量（微克/毫升）=

0.02为根据核糖核酸摩尔消光系数计算出每毫升含1微克核糖核酸的260nm下的O.D读数。

核糖核酸总量（克）=

3、以上所述的用啤酒废酵母制备饲料核苷酸的方法，其中包括

(1)麦芽根5′-磷酸二酯酶的抽提方法：取粉碎到60目麦芽根粉，按每100克麦芽根粉，加NaCl11.7g和ZnSO40.16g，并加麦芽根粉的10倍量的水混匀，调PH到5，升温到60℃抽提2h，然后升温到68-70℃维持10分钟终止抽提，滤除固形物，将上清酶液迅速降温，备用。

(2)5'-磷酸二酯酶酶活力单位的测定方法：称取100毫克核糖核酸标准品溶于5ml蒸馏水，即为2%的核糖核酸标准溶液。

取甲、乙两支试管，分别加入1毫升2%核糖核酸标准液和0.8毫升0.2M pH5醋酸缓冲液，在63℃预热10分钟，然后甲管加0.2毫升待测酶液，继续保温30分钟，甲、乙两管再分别加0.2毫升钼酸铵-过氯酸试剂，随后乙管再补加0.2毫升待测酶液，混匀，冷却，3000rpm离心15分钟，分别取0.1毫升上清液加9.9毫升蒸馏水，测O.D260nm值。

酶活力（单位/毫升）=

4、以上所述的用啤酒废酵母制备饲料核苷酸的方法，5'-核苷酸的测定方法为：

(1)、反应原理：5'-核苷酸核糖上的2,3位羟基可被过碘酸氧化成双醛化合物，并在甲胺作用下5'-核苷酸分子上的磷落下成为无机磷，故可用定磷试剂显色测定。

(2)、微量定磷试剂的配制：6N硫酸：重蒸馏水：2.5%钼酸铵：10%抗坏血酸的体积比为1：2：1：1。

(3)、5'-核苷酸磷的测定

(3.1)、取以上5'-磷酸二酯酶酶降解液经3000rpm离心15分钟，然后吸上清液1毫升定容到100毫升。取三支试管，按下表1中所示的顺序加样品，然后在45℃水浴保温10分钟，再分别加定磷试剂3毫升，继续保温20分钟，冷却至室温后，以空白为对照测O.D值（660nm），根据标准曲线查磷含量。甲（氧化）和乙（未氧化）含磷量之差即为5'-核苷酸磷含量。

表1 定磷样品的加入顺序

Figure 201210348607X100002DEST_PATH_IMAGE007

5'-核苷酸（克）=

简化为：5'-核苷酸（克）=（甲-乙）含磷量(微克/毫升)×1.097×酶解液总体积（升）

式中： 31为磷原子量；340为四种单核苷酸平均分子量；100为样品的稀释倍数； (3.2)、制作5'-核苷酸磷的标准曲线

标准磷溶液配制：取KH₂PO₄（分子量136.09）105℃烘干到恒重，准确称取0.2195克（含磷50毫克）定容至500ml，即为含磷100微克/毫升，使用前稀释10倍，按下表2所示的要求进行。

表2 5'-核苷酸磷的标准曲线的制作

Figure 201210348607X100002DEST_PATH_IMAGE009

加定磷试剂后在45℃保温20分钟，冷却至室温后测O.D（660nm），以含磷量和O.D(660nm)读数值制作5'-核苷酸磷的标准曲线。

实施例2

1、酵母破壁、抽提、酶解RNA

取啤酒厂新鲜废酵母泥，测得含水量为89%，称出酵母泥3636g（相当于折干酵母400g），于10L不锈钢搅拌反应罐，称固体NaOH 40g溶于水，搅拌下加入罐内，使总体积达到4000ml，升温到25℃，连续搅拌反应3h，随后用工业盐酸调PH6.5，按以上实施例1所述方法测定RNA的含量，按每克单位RNA底物需5'-磷酸二酯酶2500-5000活力单位计算，加入从麦芽根抽提的5'-磷酸二酯酶液706ml，迅速升温到65℃，在最适PH5.6和最适温度65℃下酶解2h，按以上实施例1所述的定磷方法测得5'-核苷酸含量，最后升温到90℃、10min停止酶解反应。

2、真空减压浓缩：将上述灭酶核苷酸水溶液，利用循环水式真空泵，使真空度达到0.07MPa，升温维持温度在75-78℃范围内，真空减压浓缩，最终浓缩到约3000ml。

3、喷雾干燥：将浓缩液送到喷雾干燥机喷雾，调节进样温度190-195℃，出口温度90-95℃，共收获到饲料核苷酸粉剂360g。产品经本厂高效液相色谱仪测定，核苷酸含量为3.05% ，粗蛋白含量为51%；免疫多糖包括β葡聚糖和甘露聚糖总含量为23%。

实施例3

1、酵母破壁、抽提、酶解RNA

取啤酒厂新鲜酵母泥，测得含水量为89.6%，通过标准桶计量共进罐新鲜酵母泥800L，相当于折干酵母83.2Kg，在搅拌下加30%NaOH 27.6Kg，总体积为830L，升温到30℃，搅拌反应1.5h，随后用30%工业盐酸调PH到6.0，按以上实施例1所述方法测定RNA的含量，按每克单位RNA底物需5'-磷酸二酯酶2500-5000活力单位计算，加入从麦芽根抽提的5'-磷酸二酯酶液130L，迅速升温到70℃，维持最适PH5.6-5.8和最适温度65-68℃下酶解3h，按以上实施例1所述的定磷方法测得5'-核苷酸含量，最后升温到90℃，维持10min停止酶解。

2、真空减压浓缩

将上述灭酶核苷酸水解液约960L进真空减压浓缩罐，当抽真空达到0.07-0.08MPa过程同时升温到70-75℃范围内，真空减压浓缩，最终浓缩到550L左右（通过冷凝水计量），将冷凝水分段收集，通过酒精检测计测量，开始馏出的冷凝水中含有酒精，留着做酒精回收处理，其余均可做循环水回用。

3、喷雾干燥

将浓缩液在离心式喷雾机上，在进口温度190-195℃和出口温度90-95℃控制下进行喷雾，共收集到饲料核苷酸78.2Kg。产品经江南大学测试中心高效液相色谱仪测定，四种核苷酸标准色谱图和饲料核苷酸的色谱图分别如图1和图2所示，核苷酸含量为2.86%。粗蛋白含量为52%；免疫多糖包括β葡聚糖和甘露聚糖总含量为21%；为一种营养全面，核苷酸含量高的功能性饲料核苷酸。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.用啤酒废酵母制备饲料核苷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)酵母破壁、RNA酶解：将啤酒废酵母泥输送到反应罐，加入NaOH，在20~45℃条件下对啤酒废酵母进行破壁、抽提1-3小时，然后在抽提液内加入盐酸，使抽提液的pH为6.0~6.5，取样通过紫外分光光度法测定抽提液中RNA的含量，根据抽提得到的RNA含量，按每克单位RNA底物计算需要的5'-磷酸二酯酶量，加入5'-磷酸二酯酶，随后调整酶解液的pH值在5.5-6.0和温度在65~70℃，进行酶解反应；通过定磷方法，当测得5'-核苷酸达到最高产量时，升温到90~95℃，维持10~15分钟，终止酶解反应；

2.根据权利要求1所述的用啤酒废酵母制备饲料核苷酸的方法，其特征在于，步骤(1)加入NaOH使NaOH的浓度为0.6~1.2%。

3.根据权利要求1所述的用啤酒废酵母制备饲料核苷酸的方法，其特征在于，步骤(1)啤酒废酵母进行破壁处理时，啤酒废酵母泥的折干酵母为反应罐溶液体系重量的8-10%。

4.根据权利要求1所述的用啤酒废酵母制备饲料核苷酸的方法，步骤(1)由破壁、抽提得到的RNA，按每克单位RNA底物需5'-磷酸二酯酶2500-5000活力单位计算、确定5'-磷酸二脂酶量进行酶解。