CN102850430A - 动物初乳来源的蛋白片段及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物初乳来源的蛋白片段及其应用。本发明首次揭示了来源于动物初乳的且分子量在3KDa以下的小分子蛋白片段具有明显的促进细胞增殖的功能及明显的抑菌作用，同时还能增加动物骨密度且不影响脂肪含量。为动物初乳的充分、合理利用提供了更宽的途径。

Description

动物初乳来源的蛋白片段及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和营养学领域；更具体地，本发明涉及动物初乳来源的蛋白片段及其在制备促细胞增殖组合物中的应用。

背景技术

初乳是哺乳动物提供给幼仔的最初食物，其功能性成分保障了动物幼仔的健康成长，作为人类的功能性食品，具有很高的应用价值。这些生理活性成分具有免疫调节、延缓衰老、促进生长发育、抑制肿瘤等一系列的生物功能，不仅可以制造功能食品，而且还具有开发天然活性生物药物的巨大潜力。

牛初乳是指健康奶牛分娩后一周之内所分泌的乳汁，牛初乳呈乳色黄，有苦味和异臭味，黏度大，特别是3天内所分泌的乳汁，初乳特征更为显著，初乳的蛋白质、脂肪、无机盐、维生素等含量显著高于常乳，其营养价值高出普通牛乳几倍到几十倍，对人类更有意义的是它含有大量的免疫因子和生长因子等活性成分，对提高人体免疫力、预防疾病具有独特的作用，如今牛初乳已经是一种相当有前景的提高机体免疫力的功能性食品，2000年被美国食品科技协会(IEF)列为21世纪最佳发展前景的非草药类天然健康食品，有“免疫之王”、“乳黄金”之称，现已成为新一代功能性食品资源库。

人类实际利用牛初乳的历史远远早于对它的研究探索。早在几千年前，印度制造牛初乳糖果，被民间视为灵丹妙药，倍受推崇至今。在北欧牛初乳布丁及其覆有蜂蜜的甜品已有一百年历史，在青霉素及其他抗生素出现以前，美国人也将牛初乳用作抗病食物。十八世纪末，科学家发现了初乳对新生幼仔存活和生长发育的意义，此后，牛初乳研究逐步深入。1955年牛初乳制品(免疫乳)被用于治疗疾病，20世纪70年代大量喂养实验证明牛初乳的优质抗病地位，1990年前后科学家才开始从功能性食品角度关注牛初乳开发问题，整理出大量有关研究报告，确认了它作为卓越天然抗病食物的地位，牛初乳可直接用于制造免疫及其他功能性的食品。

牛初乳中含有丰富的营养成分，牛初乳平均总干物质含量为14.4％，其中蛋白质5.0％、脂肪4.3％、灰分0.9％，并且含有丰富的维生素A、D、E、B12等。据测定，荷斯坦奶牛分娩后第1次挤出的初乳蛋白质含量高达15.5％，脂肪含量达6.5％，分别是常乳(普通牛乳)的5倍和2倍，初乳中的矿物元素含量也很高，第1次所挤初乳中的钙、磷、镁含量为1700、1800、500mg/kg，锌、铁、锰含量分别为20、3、0.1mg/kg；牛初乳钙含量为常乳的2倍，铁含量为常乳的3～5倍，锌含量为常乳的2～4倍，铜含量为常乳的6倍。初乳中维生素含量也大大超过常乳，V_A含量为常乳的2.5～9倍，V_E含量为常乳的2～6倍，V_B12含量为常乳的4～8倍，牛初乳不仅营养丰富，而且各营养组分的配合也非常合理。研究发现，牛初乳中不仅含有丰富的营养物质，而且含有大量的免疫因子和生长因子，如免疫球蛋白、乳铁蛋白、溶菌酶、类胰岛素生长因子、表皮生长因子等，这些独特的营养组分赋予了牛初乳的多种保健功能，主要包括免疫球蛋白(Ig)、乳铁蛋白(Lf)、乳过氧化物酶(Lp)、胰岛素、溶菌酶(Lz)以及表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等各种细胞因子，这些细胞因子虽然在初乳中含量甚微，但却具有重要的生理功能，如抗感染、抗肿瘤、免疫调节等，特别是对胃肠道的保护方面，显示了神奇的作用。牛初乳的保健功能与其特有的营养成分密切相关，医学及营养学研究表明初乳中的200多种营养化学成分和生物活性物质的协同作用使牛初乳具有多种医疗保健功能，牛初乳中免疫球蛋白在增强机体的免疫能力、有效抑制病原菌、杀死肿瘤细胞等方面发挥着重要作用，牛初乳中的功能性组分能增强白细胞和巨噬细胞的吞噬作用及抗原呈递作用，对清除肠道病原菌及其毒素、促进有益菌群的增殖、促进消化吸收、调整肠道微环境、刺激机体免疫反应非常有益；牛初乳中各种生长因子协同作用，有利于组织修复和外伤痊愈；初乳中有许多物质能提高老年人体内血清总SOD和Mn-SOD活力，降低脂质过氧化物可延缓人的衰老；牛初乳中的生长因子还能促进受伤肌肉、皮肤胶原质、软骨和神经组织的修复，具有强健肌肉、修复RNA和DNA的作用；牛初乳中还含有多种功能性蛋白质、酶、微量元素等，能降低血糖，明显改善糖尿病患者的症状；初乳中的类胰岛素生长因子和乳铬复合物可使人体内葡萄糖氧化并转化为脂肪，对II型糖尿病患者有降低血糖水平并使血压下降的特殊功效；初乳中含有2.3～3.2mg/L的双歧因子有利于乳酸菌在肠道内的增殖和生长。

作为牛初乳添加剂的生产原料应取自洁净、无污染的牧场，以保证产品的质量安全；为开发牛初乳功能性食品，采用某种特殊分离技术，从牛初乳中分离出其中的免疫球蛋白(IgG)、乳铁蛋白、胰岛素样生长因子等生物活性组分，制备成添加剂来强化食品。

然而，目前本领域对于动物初乳的研究限于其中的大分子生物活性物质，而对于其中的小分子物质成分却乏人问津。因此，本领域还需要进一步对牛初乳加以研究，以开发动物初乳的新制剂，且提高动物初乳原料的利用率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种动物初乳来源的蛋白片段。

本发明的另一目的在于提供所述蛋白片段在制备促细胞生长组合物中的应用

在本发明的第一方面，提供一种小分子蛋白片段(活性肽)混合物，所述的小分子蛋白片段混合物来源于动物初乳，其中90％以上(较佳地92％以上；更佳地95％以上；更佳地98％以上；更佳地99％以上)蛋白片段的分子量低于3KDa(如0.01-3KDa)。

在一个优选例中，所述的小分子蛋白片段混合物通过以下方法获得：

(1)对动物初乳脱脂，调节PH值至4.5-5.5(较佳地4.0-5.0)，加温至40-50℃，搅拌混匀(较佳地反应10-60分钟；更佳地20-50分钟)，离心获取上清蛋白溶液；

(2)收集(1)的蛋白溶液中分子量低于3KDa的蛋白片段，获得所述的小分子蛋白片段混合物。

在另一优选例中，所述的小分子蛋白片段中基本上不包括人转化生长因子-β2(TGF-β2)和/或人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)。

在另一优选例中，在步骤(1)中，对动物初乳脱脂后，还包括：加入蛋白酶处理。

在另一优选例中，所述的蛋白酶包括(但不限于)：胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、组织酶、枯草杆菌蛋白酶、凝乳酶等。

在本发明的另一方面，提供一种制备所述的小分子蛋白片段混合物的方法，所述方法包括：

(1)对动物初乳脱脂，调节PH值至4.5-5.5(较佳地4.0-5.0)，加温至40-50℃，搅拌混匀(较佳地反应10-60分钟；更佳地20-50分钟)，离心获取上清蛋白溶液；

(2)收集(1)的蛋白溶液中分子量低于3KDa的蛋白片段，获得所述的小分子蛋白片段混合物。

在另一优选例中，在步骤(1)中，对动物初乳脱脂后，还包括：加入蛋白酶处理。

在另一优选例中，所述的蛋白酶包括(但不限于)：胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、组织酶、枯草杆菌蛋白酶、凝乳酶等。

在另一优选例中，酶解的时间视酶的种类和活力而定，例如是10-200分钟。

在另一优选例中，步骤(1)中，离心的条件为：8000±2000g转速、4±2℃，离心30±10min。

在另一优选例中，步骤(2)中，通过超滤的方法收集分子量低于3KDa的蛋白片段。

在另一优选例中，利用3KDa超滤膜进行超滤。

在另一优选例中，首先利用30KDa超滤离心管，离心收集滤过的蛋白溶液并转入10KDa超滤离心管，再离心收集滤过的蛋白溶液并转入3KDa超滤离心管，离心收集滤过的蛋白溶液，得到分子量低于3KDa的蛋白片段。

在另一优选例中，在对动物初乳脱脂后，还包括步骤：离心去除脂肪、大颗粒蛋白及杂质。

在另一优选例中，以上离心的条件是：5000±2000g转速、4±2℃，离心30±10min。

在另一优选例中，在对动物初乳脱脂后，还包括步骤：对脱脂后的动物初乳稀释1.5-5倍较佳地2-3倍。

在本发明的另一方面，提供所述的小分子蛋白片段混合物的用途，用于：

促进细胞生长或用于制备促细胞生长的组合物；

提高动物的骨密度或用于制备提高动物骨密度的组合物；

降低动物脂肪含量或用于制备降低动物脂肪含量的组合物；和/或

抑制微生物生长或用于制备抑制微生物生长的组合物。

在另一优选例中，以上方法或用途是体外非治疗性地方法或用途。

在本发明的另一方面，提供一种组合物，含有：有效量的前述任一所述的蛋白片段混合物。

在另一优选例中，所述的组合物是生物培养基(如细胞培养基)、饮食补充剂、食品添加剂、保健品、药物组合物、食品组合物、饲料或饲料添加剂。

在另一优选例中，所述的组合物的剂型是溶液、悬浮液、颗粒剂、片剂、胶囊、口服液、或糖浆。

在本发明的另一方面，提供一种制备所述的组合物的方法，包括：将前面任一所述的小分子蛋白片段混合物与生物培养基、或食品学上或药学上可接受的载体混合，得到所述的组合物。

在本发明的另一方面，提供一种促进细胞生长的方法，给予细胞有效量的所述的小分子蛋白片段混合物或所述的组合物。

在另一优选例中，所述的促进细胞生长的方法是体外方法，更优选地为非治疗性的方法。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、浓度为1μg/ml(图中“1”)、10μg/ml(图中“10”)、100μg/ml(图中“100”)的牛初乳各区段蛋白溶液对于细胞生长的影响。纵坐标：促细胞生长百分比(％)。

图2、牛初乳3KDa以下区段蛋白分对小鼠骨密度的影响结果。

图3、牛初乳3KDa以下区段蛋白分对小鼠脂肪含量的影响结果。

图4、牛初乳3KDa以下区段蛋白具有显著的抑菌效果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，发现将动物初乳作为原料来源，经过处理后，收集(富集)其中分子量在3KDa以下的小分子蛋白片段(活性肽)，具有明显的促进细胞生长的功能；且优于目前公认的较大分子量的蛋白片段促进细胞生长的功能。基于该发现，完成了本发明。

术语

如本文所用，所述的“小分子蛋白片段”，“小分子生物活性肽”，“小分子活性肽”，“本发明的蛋白片段”，“小分子蛋白片段(活性肽)混合物”，“动物初乳3KDa以下区段蛋白”等术语可互换使用，均是指来源于动物初乳的且90％以上(较佳地92％以上；更佳地95％以上；更佳地98％以上；更佳地99％以上)的蛋白片段分子量在3KDa以下的蛋白片段混合物。所述的“小分子蛋白片段混合物”中，还包含其它的一些来源于动物初乳的、分子量在3KDa以下的大分子或小分子物质，例如但不限于，碳水化合物、脂肪、肽、微量元素、维生素、非肽激素、细胞因子、酶、多胺和/或核苷酸。

如本文所用，蛋白片段在“分子量在3KDa以下”通常指一类短肽，通常其氨基酸序列长度低于50个氨基酸(aa)。“分子量在3KDa以下”这一术语同时包括“分子量在3KDa”这一下位概念。

如本文所用，所述的动物为在哺乳期泌乳的动物，通常为哺乳动物。例如，所述的动物是(但不限于)：牛、羊、猴、猪、狗、人等。现有技术公知，哺乳动物在产犊(仔)后若干天内(如3天)所分泌的初乳具有基本相同的成分，一般初乳中都含有碳水化合物、脂肪、肽、微量元素、维生素、非肽激素、细胞因子、酶、多胺、核苷酸。

如本文所用，术语“本发明的组合物”包括生物培养基(如细胞培养基)、饮食补充剂、如保健品组合物、或药物组合物或上述物质的添加剂、或饲料添加剂，只要它们含有本发明的小分子蛋白片段作为促进细胞生长的活性成分。

如本文所用，“食品学上或药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的物质，即有合理的效益/风险比的物质。

如本文所用，“食品学上或药学上可接受的载体”是用于将小分子蛋白片段混合物传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。

如本文所用，术语“单元剂型”是指为了服用方便，将本发明的组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。所述的单元剂型中含有对于促进细胞生长有效的本发明的组合物。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，所述的“基本上不包括”是指相应的成分在混合物或组合物中的含量非常低(可忽略不计)或没有。例如，“基本上不包括人转化生长因子-β2和/或人胰岛素样生长因子-1”，是指相对于正常的动物初乳中含有的人转化生长因子-β2和/或人胰岛素样生长因子-1，用ELISA方法进行检测，本发明的小分子蛋白片段混合物中含有的人转化生长因子-β2和/或人胰岛素样生长因子-1显著低，如低80％；更佳地低90％；更佳地低95％；更佳地低99％。

小分子蛋白片段混合物

在本领域中，以往对于动物初乳的研究集中于其中的一些免疫相关因子以及生长因子。例如免疫球蛋白(Ig)、乳铁蛋白(Lf)、乳过氧化物酶(Lp)、胰岛素、溶菌酶(Lz)以及表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等，这些细胞因子虽然在初乳中含量甚微，但却具有重要的生理功能，如抗感染、抗肿瘤、免疫调节等。这些因子都是大分子蛋白，其分子量均大于5KDa，显著高于3KDa。

本领域技术人员一般都认为动物初乳中发挥生物活性作用的是那些大分子物质(蛋白)；而本发明人克服了本领域人员固有的技术偏见，意外地发现了动物初乳中小分子多肽也具有促进细胞生长的作用，所述的低于3KDa的小分子蛋白片段混合物可以作为一种混合形式的细胞生长因子。

本发明人进一步的研究还发现，所述的动物初乳低于3KDa的小分子蛋白片段还具有其它一系列的有益功能，包括：提高动物的骨密度，降低动物的脂肪含量和抑制微生物生长。

基于本发明人的新发现，本发明提供了一种小分子蛋白片段(活性肽)混合物，所述的小分子蛋白片段混合物来源于动物初乳，其中90％以上(较佳地92％以上；更佳地95％以上；更佳地98％以上；更佳地99％以上)蛋白片段的分子量低于3KDa。所述的小分子蛋白片段中基本上不包括人转化生长因子-β2(TGF-β2)和/或人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)。所述的小分子蛋白片段混合物可用于促细胞生长。

以动物初乳为原料，制备所述的低于3KDa的蛋白片段混合物的方法可以是多种多样的，包括酶处理方法或其他任何可用于从复杂成分中分离出指定分子量的蛋白的方法。例如通过超滤分离的方法，或分子筛的方法等。这些方法都可应用于本发明。

酪蛋白作为一种大分子蛋白，在动物初乳中占了相当大的比例。由于本发明需要获得小分子的蛋白片段。因此，在制备本发明的小分子蛋白片段时，较佳地先除去酪蛋白或进行酶解处理。较佳地，通过调节pH值至4.5-5.5，加温至40-50℃，搅拌混匀，离心去除酪蛋白。

作为本发明的一种优选方式，所述的小分子蛋白片段混合物，通过以下方法获得：(1)对动物初乳脱脂，调节PH值至4.5-5.5，加温至40-50℃，搅拌混匀，离心获取上清蛋白溶液；(2)收集(1)的蛋白溶液中分子量低于3KDa的蛋白片段，获得所述的小分子蛋白片段混合物。较佳地步骤(2)中，通过超滤的方法收集分子量低于3KDa的蛋白片段。

作为本发明的一种优选方式，在分离分子量低于3KDa的蛋白片段之前，对动物初乳进行蛋白酶处理，这将更加有利于富集分子量低于3KDa的蛋白片段。所述的蛋白酶是一些可以切割蛋白链的酶，包括但不限于：胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、组织酶、枯草杆菌蛋白酶、凝乳酶等。

在获得了所述的小分子蛋白片段混合物后，可以通过冻干等常规的蛋白保存方法进行保存。

组合物

本发明的小分子蛋白片段混合物可直接用于细胞的培养，例如作为生物培养基的添加成分。生物培养基是为细胞提供生长营养的物质，而小分子蛋白片段混合物的添加进一步地促进了细胞的生长。

本发明的实施例中，证明了本发明的小分子蛋白片段混合物对于不同种类的多种细胞，包括人胚成纤维细胞(HFL-I)、人肝细胞(HL-7702)、人胚肾细胞(293)均有生长促进作用。因此各种细胞培养基中均可添加本发明的小分子蛋白片段混合物。

也可将本发明的小分子蛋白片段混合物与适当的食品学载体或药学载体混合，制备成药物组合物或食品组合物的形式。所述的药物组合物或食品组合物对于需要的群体(例如术后恢复期的患者，虚弱的患者)是有用的。

本发明的小分子蛋白片段混合物的组合物可以以多种剂型存在。小分子蛋白片段混合物一般与生物培养基、药学上、饲料学上或食品上可接受的载体混合。

生物培养基可以是固态的或液态的。各种商业可购买的生物培养基中均可添加本发明的小分子蛋白片段混合物。添加的量通常在0.01-1000μg/mL；更佳地在0.1-100μg/mL。

所述的药学上或食品上可接受的载体可以是固态的或液态的，一般根据所用的给予方式而选择类型。小分子蛋白片段混合物可以以片剂或胶囊形式(作为附聚的粉末)，或者以液体形式一起给予。固态载体的例子包括(但并不限于)：乳糖、蔗糖、明胶和琼脂。胶囊或片剂可以容易地制备，并且便于吞咽或咀嚼；其他的固体形式包括颗粒。片剂可含有适当的粘合剂、润滑剂、稀释剂、崩解剂、着色剂、调味剂等。液体剂型的例子包括：在水、药学上可接受的脂肪或油、醇或其他有机溶剂(包括酯)中的溶液或悬浮液、乳剂、糖浆、酏剂、用非泡腾颗粒再生的溶液和/或悬浮液、以及用泡腾颗粒再生的泡腾制剂。这样的液体剂型可含有，例如，适当的溶剂、防腐剂、乳化剂、悬浮剂、稀释剂、甜味剂、增稠剂和助溶剂。口服剂型可含调味剂和着色剂。肠胃外和静脉内给予的剂型还可含有矿物质和其他物质，以便使它们与注射或所选的释放系统类型相配伍。

较佳地，可将本发明的药物或食品组合物制备成单元剂型的形式，每剂含有1-1000mg，较佳地10-500mg，更佳地100-500mg。

例如，可将小分子蛋白片段混合物制备成胶囊的形式，便于服用和存放。

在本发明中，作为活性成分的小分子蛋白片段混合物可用任何合适的剂量，取决于动物或人的体重、身体状况等因素。一般地，小分子蛋白片段混合物合适的剂量是约0.02-200mg/kg体重，较佳地0.2-100mg/kg体重，更佳地2-100mg/kg体重。

所述的生物培养基、药学上或食品上可接受的载体中，还可包括蛋白稳定剂，以使得本发明的小分子蛋白片段混合物更加稳定。蛋白稳定剂的种类以及添加剂量均是本领域技术人员熟知的。

本发明的主要优点在于：

本发明人克服了本领域人员固有的技术偏见，意外地发现了动物初乳中小分子蛋白(多肽)片段具有促进细胞生长的作用，为动物初乳的充分、合理利用提供了更宽的途径，为细胞培养提供了一种有用的促进剂。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、利用超滤方法收集牛初乳中不同区段的蛋白

一、超滤离心法获取牛初乳不同区段蛋白

1.牛初乳的预处理

获得的新鲜牛初乳首先进行脱脂，4℃、5000g离心30分钟，去除上层脂肪和大颗粒蛋白及杂质沉淀；然后加蒸馏水对倍稀释(即：稀释至原体积的2倍)，用2mol/l HCl调PH至4.5左右，放置45℃水浴加温，充分搅拌混匀，反应30分钟，在8000g转速、4℃条件下离心30min，取上清蛋白溶液。

2.超滤离心预处理过的牛初乳获得不同区段的蛋白

利用30KDa超滤离心管(含30KDa超滤膜)，在20℃、4000g条件下离心20min，收集上层蛋白溶液(含30KDa以上蛋白)，把下层蛋白溶液转入10KDa超滤离心管(含10KDa超滤膜)，在20℃、4000g条件下离心20min，收集上层蛋白液体(含10～30KDa以上蛋白)，把下层蛋白溶液转入3KDa超滤离心管(含3KDa超滤膜)，在20℃、4000g条件下离心20min，分别收集上层(含3～10KDa蛋白)和下层(含3KDa以下蛋白)蛋白液体，这样就得到了不同区段的蛋白溶液，包括30KDa以上蛋白、10～30KDa区间的蛋白、3～10KDa区间的蛋白以及3KDa以下的蛋白。

3.从牛初乳中获得不同区段的蛋白样品收集

把收集的不同区段的蛋白溶液及去除的酪蛋白分别放入茄型瓶中，冻干后收集，称重，记录获得的质量数据：每50ml牛初乳得到样品质量见表1。

表1

二、酶处理及超滤离心法获取牛初乳不同区段蛋白

在“牛初乳的预处理”步骤中，在对新鲜牛乳进行脱脂后，进行胰蛋白酶处理过程。具体如下：

调节脱脂初乳pH值7.8，每升初乳加入700mg胰蛋白酶(Sigma，酶活2500U)，37℃水浴处理75分钟。酶解75分钟后，调节pH值至7.0，在100℃灭活胰蛋白酶5分钟。室温放置20分钟后，酶解样品离心取上清蛋白。用2mol/lHCl调PH至4.5左右，放置45℃水浴加温，充分搅拌混匀，反应30分钟，在8000g转速、4℃条件下离心30min，取上清蛋白溶液。

超滤离心及后续操作同前述“一”中内容。

实施例2、利用ELISA方法检测牛初乳中不同区段蛋白IGF-1(人胰岛素样生长因子-1)、TGF-β2(人转化生长因子-β2)的含量

1、IGF-1(人胰岛素样生长因子-1)的检测

(1)准备试剂

IGF-1检测试剂盒购自上海麦约尔生物技术有限公司，自带IGF-1标准品、稀释液、洗涤液、底物、一抗、二抗、终止液等。

a.蛋白溶液的配制：称取各10mg的不同区段蛋白(前述实施例1“一”制备)，加入相同体积1ml的蒸馏水，使其完全溶解，配制出相同浓度的蛋白溶液。

b.标准品液的配制：使用前在IGF-1标准品安培瓶中加入0.3ml蒸馏水混匀，配成80ng/ml的溶液，设标准管8管，每管加入标本稀释液300μl，在第一管中加入80ng/ml的标准品溶液300μl混匀后用加样器吸出300μl，移至第二管，如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出300μl弃去，第八管为空白对照。

c.10×标本稀释液用蒸馏水作1∶10倍稀释。

d.洗涤液：用重蒸水1∶20稀释。

(2)检测程序

a.加样：每孔各加入标准品或待测样品100μl，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。

b.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

c.每孔中加入第一抗体(抗IGF-1抗体)工作液100μl。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。

d.洗板：同前。

e.每孔加酶标抗体(二抗)工作液100μl。将反应板置37℃30分钟。

f.洗板：同前。

g.每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗处反应15分钟。

h.每孔加入100μl终止液混匀。

i.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

(3)结果计算与判断

a.所有OD值都应减除空白值后再行计算。

b.以标准品40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0ng/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

c.根据样品OD值在该曲线图上查出相应IGF-1含量。

计算结果：只有在3～10KDa的蛋白区段中含有IGF-1，检测浓度为1.25ng/ml，其它蛋白区段中不含有IGF-1。

2、TGF-β2(人转化生长因子-β2)的检测

(1)准备试剂

TGF-β2检测试剂盒购自上海麦约尔生物技术有限公司，自带IGF-1标准品、稀释液、洗涤液、底物、一抗、二抗、终止液等等。

a.蛋白溶液的配制：分别称取的不同区段蛋白，各加入1ml的蒸馏水，使其完全溶解，配制出相同浓度的蛋白溶液。

b.标准品液配制：使用前在TGF-β2标准品安培瓶中加入0.5ml蒸馏水混匀，配成4000pg/ml的溶液，设标准管8管，每管加入标本稀释液300μl，在第一管中加入4000pg/ml的标准品溶液300μl混匀后用加样器吸出300μl，移至第二管，如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出300μl弃去，第八管为空白对照。

c.10×标本稀释液用蒸馏水作1∶10倍稀释。

d.洗涤液：用重蒸水1∶20稀释。

(2)蛋白激活

a.将410μl上述步骤a中配制好的各区段蛋白溶液加入到一支1.5ml离心管内。

b.加20μl1N HCL，盖紧，上下混匀，2-8℃放置60min。

c.加20μl1N NaOH，盖紧，上下混匀。

d.即用，或放-20℃以下保存3天。

(3)检测程序

a.加样：每孔各加入标准品或待测样品100μl，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。

b.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

c.每孔中加入第一抗体工作液100μl，将反应板充分混匀后置37℃60分钟。

d.洗板：同前。

e.每孔加酶标抗体工作液100μl，将反应板置37℃30分钟。

f.洗板：同前。

g.每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗处反应15分钟。

h.每孔加入100μl终止液混匀。

i.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

(4)结果计算与判断

1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2.以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应TGF-β2含量，再乘上稀释倍数即可。

计算结果：在10～30KDa、30KDa以上的蛋白区段中含有TGF-β2，检测浓度分别为156pg/ml和257pg/ml。

实施例3、从牛初乳中获得不同区段蛋白对细胞生长作用实验

1.检测细胞增殖的试剂

采用上海碧云天生物技术有限公司的Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)进行检测。WST-8(产品编号C0037)是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的Formazan(见以下反应式)。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

WST-8是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的Formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-8和XTT、MTS产生的Formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-8产生的Formazan比XTT和MTS产生的Formazan更易溶解；再次，WST-8比XTT和MTS更加稳定，使实验结果更加稳定，另外，WST-8和MTT、XTT等相比线性范围更宽，灵敏度更高。

2.检测牛初乳中不同区段蛋白对细胞生长作用的实验方法

(1)取人胚肾细胞(293，ATCC)，用MEM Aipha培养基(购自GIBCO公司)(含10％胎牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素)调细胞终浓度为1×10⁶/ml，接种于10cm²细胞培养瓶，置37℃、5％CO₂培养箱中培养；

(2)培养48小时后，取对数生长期的细胞，去除培养上清，加入PBS溶液洗涤，加入胰蛋白酶溶液消化细胞，收集单细胞悬浮溶液，1500rpm离心，去上清，加入MEM Aipha培养基(含10％胎牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素)调细胞终浓度为2×10⁴/ml；

(3)取96孔细胞培养板，每孔加入100μl上述细胞悬液，同时分别加入10μl浓度为10μg/ml的牛初乳各区段蛋白(前述实施例1“一”制备)溶液，然后每孔加入10μl WST-8溶液，置37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，以不加入细胞的人胚成纤维细胞(HFL-I)培养基为空白对照(Blank)；以加入相同量的细胞但不加入牛初乳不同区段蛋白的培养基溶液为阴性对照；

(4)在细胞培养箱中培养4小时，在450nm测定吸光度，比较细胞生长情况。

3.牛初乳不同区段蛋白及其不同组合对细胞生长OD值的影响

(1)牛初乳不同区段蛋白代号的设定

A：3KDa以下区段蛋白；

B：3-10KDa区段蛋白；

C：10-30KDa区段蛋白；

D：30KDa以上区段蛋白。

(2)结果如表3，结果中的OD值均为三次实验的均值。

表3

从以上结果可以看出，牛初乳3KDa以下区段蛋白对细胞生长具有明显的促进作用。而其它区段蛋白对细胞生长没有明显的促进作用。

实施例4、其它细胞的试验

为了进一步明确牛初乳3KDa以下区段蛋白对细胞的促生长作用，本实验选用了两株人正常细胞人肝细胞(HL-7702，美国模式培养物集存库(American typeculture collection，ATCC))、人胚肾细胞(293，ATCC)进行促细胞生长实验，作为对照，本实验采用了牛初乳3～10KDa、10KDa以上两个不同的区段蛋白(前述实施例1“二”制备)。检测方法同实施例3，实验结果如4。

表4

表中字母A、B、C分别表示：A：3KDa以下牛初乳多肽；B：3～10KDa牛初乳多肽；C：10KDa以上牛初乳多肽。

从以上结果可以看出，牛初乳3KDa以下区段蛋白对细胞生长具有明显的促进作用。

实施例5、剂量效应实验

为明确牛初乳3KDa以下区段蛋白促细胞生长的效果，以下进行了剂量效应实验。

1.实验方法

(1)取人胚成纤维细胞(HFL-I，获自中国科学院上海生命科学研究院细胞库)、人肝细胞(HL-7702)、人胚肾细胞(293)用高糖的DMEM培养基(Gibco公司的)(含10％胎牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素)调细胞终浓度为1×10⁶/ml，接种于10cm²细胞培养瓶中，置37℃、5％CO₂培养箱中培养；

(2)培养48小时后，取对数生长期的细胞，去除培养上清，加入PBS溶液洗涤，加入胰蛋白酶溶液消化细胞，收集单细胞悬浮溶液，1500rpm离心，去上清，加入细胞培养基(含10％胎牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素)调细胞终浓度为2×10⁴/ml；

(3)取96孔细胞培养板，每孔加入100μl上述细胞悬液，同时分别加入10μl浓度为1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml的牛初乳各区段蛋白(前述实施例1“一”制备)溶液，然后每孔加入10μl WST-8溶液，置37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，以细胞培养基为空白对照；

(4)在细胞培养箱中培养4小时，在450nm测定吸光度，比较细胞生长情况。促细胞生长百分比按照文献报道的方法计算(J Dairy Sci.1997Mar；80(3)：488-495.)。

2.实验结果

经促细胞生长实验结果对比，牛初乳3KDa以下区段蛋白显示出具有促进细胞生长的功能，且表现出随着浓度的增加，其促进细胞生长的作用愈明显的剂量效应，结果如图1所示。

从上述结果可以看出，牛初乳3KDa以下区段蛋白对人正常细胞具有明显的促进生长作用，且这种促进作用具有剂量效应。

实施例6、骨密度及脂肪含量试验

实验使用3周龄断奶的雄性Balb/c小鼠20只，4只小鼠为1笼，共5笼。

小鼠数量如表5。

表5

牛初乳人体推荐日服量：2g/60kg bw，即0.033g/kg bw。查文献可知，小鼠日服水量为2.5ml/10g bw。

以每只小鼠10g计，则浓度为：

10倍日服量组：0.0013g/ml。

30倍日服量组：0.0039g/ml。

实验为10倍组：0.26g+200ml水；30倍组：0.78g+200ml水。于服用4周后将小鼠处死。

主要测定指标：活体检测小鼠骨密度值(BMC单位：g/cm²)

检测单位：上海交通大学医学院附属第九人民医院骨科，仪器为：双能X线骨密度仪(Dual X-Ray Densitometer)，生产厂商：Hologic。

牛初乳3KDa以下区段蛋白(前述实施例1“一”制备)分对小鼠骨密度的影响结果如图2所示，可见与对照组相比，服用牛初乳3KDa以下区段蛋白后，动物的骨密度可显著提高。

同时，还检测了牛初乳3KDa以下区段蛋白分对小鼠脂肪含量的影响，结果如图3所示，可见与对照组相比，服用牛初乳3KDa以下区段蛋白后，动物的脂肪含量有一定的减少。

实施例7、牛初乳3KD以下小分子蛋白片段的抑菌试验

前述实施例1“一”收集到的牛初乳3KD以下小分子蛋白片段经过冷冻干燥后用液体LB培养基配制成100mg/ml的溶液，再过滤灭菌备用。

在无杂菌条件下取200μl大肠杆菌菌液于10ml液态LB培养基中，置于37℃摇床培养过夜，第二天早上将活化好的菌液取100μl至10ml液态LB培养基中，震荡混匀后加入96孔板中，每孔滴加100μl，获得96孔板-菌悬液。

在96孔板-菌悬液中分别滴加牛初乳3KD以下小分子蛋白片段溶液100μl(即50mg/ml组)及50μl、再加液态LB培养基补足至100μl(即25mg/ml组)，并设置一组重复。阴性对照则用液态LB培养基替代活性肽溶液，阳性对照用LB培养基配制的卡那霉素作对照(当获得图4结果时，浓度是0.25mg/ml)，以不加大肠杆菌的LB培养基作为空白对照，再置于37℃培养箱中震荡培养，每隔1小时在酶标仪上用600nm的波长检测一次。

结果如图4，可见牛初乳3KDa以下区段蛋白具有显著的抑菌效果，且随着其浓度的增加抑菌效果也更佳。

实施例8、细胞培养添加剂

将上述获得的牛初乳3KDa以下区段蛋白作为细胞培养添加剂。具体为：

配制培养基：取MEM Aipha培养基(含10％胎牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素)，在其中加入有效剂量(如：1μg/ml；5μg/ml；10μg/ml)的3KDa以下牛初乳3KDa以下区段蛋白，混合。

获得的培养基更有利于细胞的生长。

实施例9、胶囊组合物

本发明的牛初乳3KDa以下区段蛋白可制备成胶囊的形式。按照常规制备药物或保健品胶囊的方式，将前述制备的牛初乳3KDa以下区段蛋白进行冷冻干燥，过100目筛后，与固体载体一起机制填充0号胶囊，每粒装量0.3g，压塑铝箔板，每板12粒。检验合格后，可包装为成品。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (15)

1.一种小分子蛋白片段混合物，其特征在于，所述的小分子蛋白片段混合物来源于动物初乳，其中90％以上蛋白片段的分子量低于3KDa。

2.如权利要求1所述的小分子蛋白片段混合物，其特征在于，所述的小分子蛋白片段混合物通过以下方法获得：

(1)获得动物初乳；

(2)收集(1)的动物初乳中分子量低于3KDa的蛋白片段，获得所述的小分子蛋白片段混合物。

3.如权利要求2所述的混合物，其特征在于，在步骤(1)中，还包括：对动物初乳脱脂，调节PH值至4-5.5，离心获取上清蛋白溶液。

4.如权利要求3所述的混合物，其特征在于，在步骤(1)中，对动物初乳脱脂后，还包括：加入蛋白酶处理。

5.一种制备权利要求1所述的小分子蛋白片段混合物的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)获得动物初乳；

(2)收集(1)的动物初乳中分子量低于3KDa的蛋白片段，获得所述的小分子蛋白片段混合物。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，还包括：对动物初乳脱脂，调节PH值至4-5.5，离心获取上清蛋白溶液。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，对动物初乳脱脂后，还包括：加入蛋白酶处理。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，离心的条件为：8000±2000g转速、4±2℃，离心30±10min。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，通过超滤的方法收集分子量低于3KDa的蛋白片段。

10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在对动物初乳脱脂后，还包括步骤：离心去除脂肪、大颗粒蛋白及杂质。

11.权利要求1-4任一所述的小分子蛋白片段混合物的用途，用于：

促进细胞生长或用于制备促细胞生长的组合物；

提高动物的骨密度或用于制备提高动物骨密度的组合物；

降低动物脂肪含量或用于制备降低动物脂肪含量的组合物；和/或

抑制微生物生长或用于制备抑制微生物生长的组合物。

12.一种组合物，其特征在于，含有：权利要求1-4任一所述的蛋白片段混合物。

13.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述的组合物是生物培养基、饮食补充剂、食品添加剂、保健品、药物组合物、食品组合物、饲料或饲料添加剂。

14.一种制备权利要求12或13所述的组合物的方法，其特征在于，包括：将权利要求1-4任一所述的小分子蛋白片段混合物与生物培养基、或食品学上、饲料学上或药学上可接受的载体混合，得到所述的组合物。

15.一种促进细胞生长的方法，其特征在于，给予细胞有效量的权利要求1-4任一所述的小分子蛋白片段混合物或权利要求12或13所述的组合物。

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