CN102846588A

CN102846588A - 一种鸟巢烷类二萜化合物在制备抗肿瘤药物中的应用

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Publication number: CN102846588A
Application number: CN2012103524847A
Authority: CN
Inventors: 刘宏伟; 韩俊杰; 宝丽
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2012-09-20
Filing date: 2012-09-20
Publication date: 2013-01-02
Anticipated expiration: 2032-09-20
Also published as: CN102846588B

Abstract

本发明公开了式Ⅰ所示的化合物在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物或预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。式Ⅰ中，R1为乙酰基或H,R2为乙酰基或H。实验证明，采用MTT法测试了化合物11-O-acetylcyathatriol和15-O-acetylcyathatriol对人肝癌细胞HepG2、人前列腺癌细胞PC3、人肺癌细胞A549、人结直肠癌细胞HCT-15、人宫颈癌细胞Hela、人白血病K562细胞、人胃癌细胞SGC-7901、人乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用，实验证实本发明的化合物对上述八种肿瘤细胞均有增殖抑制作用。与文献报道的其他抗制备抗肿瘤药物相比，具有简单易得且活性显著的优势。

Description

一种鸟巢烷类二萜化合物在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种鸟巢烷（cyathane）类二萜化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

肿瘤是众所周知的严重危害人类健康的疾病之一（CA-Cancer J.Clin.2011,61,69-90）。在目前众多的治疗方法中，由于化疗药物可以随血液循环到达全身各部，故而化学疗法（包括免疫疗法）在原发癌、继发转移癌和白血病的治疗中发挥着不可代替的作用(Nat.Rev.Cancer 2005,5,65-72)。理想的化疗药物应具有作用靶点专一，体内特异性靶向肿瘤组织，作用机制明确，对正常组织毒副作用小等特点（Science 2001,293,58-59）。由于传统化疗药物的毒性、副作用和耐药性的不断出现，使得抗肿瘤化疗疗效降低或疗效失效，因此，寻找新型抗肿瘤药物，已经迫在眉睫。目前抗肿瘤药物研发的焦点主要从传统的细胞毒类药物转移到针对肿瘤信号转导通路的新型抗肿瘤药物。

过去几个世纪，来源于微生物的药物在治疗肿瘤和病原微生物感染等严重威胁人类健康的疾病方面发挥了巨大的作用。真菌是微生物的重要类群之一，其代谢产物种类丰富、结构类型独特，使其成为天然有机活性小分子的主要来源；真菌来源的活性物质占微生物来源的50%以上（Journal ofAntibiotics 2005,58,1–26）。来源于真菌的抗生素（如青霉素等）、抗病原真菌制剂、免疫抑制剂以及降胆固醇制剂在过去几十年已经用于临床，为人类抵抗疾病、延年益寿作出了巨大的贡献。上世纪六十年代H.J.Brodie发现的一株被命名为Cyathus helenae Brodie的鸟巢菌新种，能够很好的抑制细菌的生长（Masters Thesis.University of Alberta,Sept.1967）；于是W.A.Ayer等人对其进一步研究，发现该菌菌丝体的粗提物具有较好的抗生素活性，并从中分离得到几个命名为“cyathin”的抗生素（该类化合物具有5/6/7三环骨架），均具有很好的抗菌活性，能够抑制细菌、放线菌、一些真菌和人类病原菌等生长（Canadian Journal of Chemistry 1971,17,1401-1407）。之后，W.A.Ayer等人利用生物活性跟踪的方法又在其他Cyathus sp.中分离得到该类群的二萜，使该类型的化合物数量不断扩增。Kawagishi等在上世纪九十年代从Hericium ernaceum中分离得到erinacine；从Sarcodon scabrosus中分离得到scabronine和sarcodonin（Canadian Journal of Chemistry 1973,51,3842-3854；Tetrahedron Lett.1971,13,1917-1920.），这三类化合物同caythin具有相同5/6/7三环骨架，使该类二萜的分布范围扩大，对研究该类二萜的生物合成及其活性研究均具有重要意义。

化合物11-O-acetylcyathatriol和15-O-acetylcyathatriol最初是在Cyathus earlei Lloyd中被发现的（Canadian Journal of Chemistry 1979,57(24),3332-3337），但纯化合物产率较低（即纯化合物与粗提物质量比，7.7g粗提物中分离得到132mg 11-O-acetylcyathatriol和310mg 15-O-acetylcyathatriol）。之后又在Hericium ernaceum发现也具有11-O-acetylcyathatriol（Bioscience,Biotechnology，and Biochemistry 2004,68(8),1786-1789.），与Cyathus earlei Lloyd一样纯化合物产率较低（约0.6%，从461mg粗提物分离得到2.8mg该化合物）。

在文献“Metabolites of bird’s nest fungi.Part 11.Diterpenoid metabolites of Cyathusearlei.，Can.J.Chem.,1979,57,3332-3337.”中，作者通过核磁共振等方法确定了本发明专利中的活性化合物11-O-acetylcyathatriol和15-O-acetylcyathatriol的结构，并测试了它们对Staphyloccocus aureus的抗菌活性，结果表明，这两个化合物对所测试菌株有一定的抑制活性。

另外，在国内外专利文献报道中，均未涉及该类化合物的抗肿瘤活性报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种如式Ⅰ所示的鸟巢烷（cyathane）类二萜化合物的应用。

（式Ⅰ）

式Ⅰ中，R₁为乙酰基或H,R₂为乙酰基或H。

式Ⅰ化合物的一个应用为其在制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用。本发明中所述真核生物具体为哺乳动物。所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞具体为宫颈癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞、结直肠癌细胞、胃癌细胞或肝癌细胞。

本发明提供的式Ⅰ化合物的另一个应用为其在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。

所述肿瘤为癌；所述癌具体为肝癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、宫颈癌、血癌、胃癌或乳腺癌。

此外，式Ⅰ化合物还可作为抑制肿瘤细胞增殖的低分子生物探针用于生命科学研究。

其中，上述式Ⅰ所示的cyathane类二萜化合物优选为式II（11-O-acetylcyathatriol）和/或式III（15-O-acetylcyathatriol）所示的化合物。

(式Ⅱ） (式Ⅲ）

本发明还提供一种药物，它的有效成分为上述化合物或其药学上可接受的盐、酯或溶剂合物；所述药物为抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物或预防和/或治疗肿瘤的药物。

所述预防和/或治疗肿瘤药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

上述药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明的发明人在微生物次生代谢产物活性化合物的高通量筛选基础上，从山西五台山Cyathus africanus子实体中分离得到的一株非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）的固体发酵的提取物具有较好的抗肿瘤活性；通过活性跟踪指导下的进一步分离纯化，发现化合物11-O-acetylcyathatriol和15-O-acetylcyathatriol对肿瘤具有很好的抗性。

实验证明，采用MTT法测试了化合物11-O-acetylcyathatriol和15-O-acetylcyathatriol对人肝癌细胞HepG2（ATCC HB-8065）、人前列腺癌细胞PC3（ATCC CRL-1435）、人肺癌细胞A549（ATCC CCL-185）、人结直肠癌细胞HCT-15（ATCC CCL-225）、人宫颈癌细胞Hela（ATCC CCL-2）、人白血病K562细胞、人胃癌细胞SGC-7901（ATCC SGC-7901）、人乳腺癌细胞MCF-7（ATCC HCC1428）的抑制作用，实验证实本发明的化合物对上述八种肿瘤细胞均有增殖抑制作用。与文献报道的其他抗制备抗肿瘤药物相比，具有简单易得且活性显著的优势。

具体实施方式

下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、生产cyathane类二萜化合物11-O-acetylcyathatriol和15-O-acetylcyathatriol的菌株非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38的获得

一、非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38的分离

本发明人在微生物次生代谢产物活性化合物的高通量筛选基础上，从山西五台山Cyathus africanus子实体中分离得到的一株非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）的固体发酵的提取物具有较好的抗肿瘤活性；通过活性跟踪指导下的进一步分离纯化，得到产量较高而且易纯化到化合物的菌株，并将该菌株命名为L38。

具体分离方法，首先，用消毒酒精对采集的子实体进行表面消毒，再用无菌水清洗，然后，将小包切成小块，最后，接种在PDA培养基上，分离纯化得到菌株。

二、非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38的鉴定。

1、形态和生理生化鉴定

L38菌株的担子果为倒锥形，高6-8mm，口部宽5-8mm，基部的菌丝垫明显，直径5.5mm；包被外侧浅色，内侧浅褐色，无明显纵条纹，口缘平整无流苏；小包具单层皮层和膜，扁圆，1.9-2.5*1.8-2.0mm；担孢子，卵形，具有一小尖，9-12.0*6.5-8.0μm。

该L38菌株符合下述非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）模式DAOM200370描述的特征：

非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）属黑蛋巢菌属（Cyathus），其主要形态特征是担子果呈杯形、倒圆锥形或漏斗形，高5-8mm，口部宽5-8mm，直径可达6mm，基部具菌丝垫；包被有三层（中间为拟薄壁组织），外侧沙土色、污棕黄色、橄榄色、浅褐色至褐色，被有粉黄、淡黄、沙土色、棕黄色的细绵毛，常紧贴于包被壁，有时也结成小簇，平滑无条纹；内侧一般比外侧稍浅些，多数平滑，口缘平整。顶部盖有一白色薄盖膜，成熟时一般消失。小包扁，宽椭圆形，2-2.5*1.8-2.3mm，灰色或黑色，具单层皮层，一层浅黄至浅褐色的膜。担孢子卵形，多数一端具小尖，8.5-11.0(-14.0)*(5.5-)6.5-8.0(-9.0)μm壁较薄，无色，非淀粉质，一般壁厚；菌丝无色，具有明显的锁状联合；地生、腐木生、粪生或生于枯枝落叶层上。

对L38菌株的分子鉴定表明，其18Sr DNA的序列如序列表中序列1所示，与美国国家生物技术信息中心（NCBI）中登录号为DQ463342.1非洲黑蛋巢的序列相似度，达到100%，根据以上形态学、生理生化特征以及18Sr DNA，将菌株L38鉴定为非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）。

非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38已于2012年07月04日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC NO.6259。

实施例2、利用非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38生产11-O-acetylcyathatriol和15-O-acetylcyathatriol

一、菌株活化、发酵培养

1、种子液的获得：

将非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38接种到PDA试管琼脂培养基斜面上，进行预培养；预培养的条件为：25℃，避光培养7天（PDA培养基组成：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g，纯净水定容至1L(pH自然)）。待菌丝长满整个斜面后，在无菌条件下将菌丝体转接到液体培养基中进行培养，得到种子培养液；液体培养的条件为：25℃，避光培养7天。液体培养基：葡萄糖4.0g/L，麦芽提取物（Malt Extract）10.0g/L，酵母（Yeast Extract）4.0g/L，水定容至1L；酵母提取物（Yeast Extract）购自Oxoid Ltd.，批号为1074139。

2、固体发酵培养：

取10毫升种子培养液分别接种到经过灭菌的装有固体培养基（固体培养基由80g籼米和120ml水组成）的500毫升三角瓶中，接种10瓶，25℃，避光发酵培养30天。（每个三角瓶发酵后的菌丝体干重为75.5g）。

二、化合物的提取分离

1、有机溶剂提取

固体发酵结束后，将300毫升乙酸乙酯分别加到各个三角瓶中，常温浸泡提取一周，重复提取3次，合并乙酸乙酯提取液减压蒸馏干燥，得浸膏，即12.5g乙酸乙酯提取物（提取率为12.5/755=1.66%）。

2、化合物的分离纯化

将乙酸乙酯提取物经过硅胶开放柱色谱（青岛海洋化工有限公司200-300目,柱层析硅胶150g；Φ4.5×80cm）分离，氯仿-丙酮混合溶剂梯度洗（100:0,100:1,50:1,30:1,20:1,10:1,5:1,3:1,2:1;体积比），每个梯度洗脱溶剂1500毫升，每350毫升收集为一个流份。将氯仿-丙酮10:1洗脱的第二个流份减压浓缩干燥后溶解于10毫升甲醇溶液中，室温静置过夜，析出无色结晶，得到式Ⅱ所示化合物(11-O-acetylcyathatriol,2.1g（纯化合物产率为2.1/12.5=16.8%）)。将氯仿-丙酮10:1洗脱的第三个流份减压浓缩干燥后溶解于10毫升甲醇溶液中，室温静置过夜，析出无色结晶，得到式Ⅲ所示的化合物（15-O-acetylcyathatriol，0.32g，纯化合物产率为0.32/12.5=2.56%）。

3、化合物结构确证

式Ⅱ化合物：无色晶体；比旋光度值

(c 0.47,MeOH)；HRESIMS m/z385.2357[M+Na]⁺；氢谱（¹H-NMR）和碳谱（¹³C-NMR）见表1。依据化合物的理化性质、氢谱、碳谱数据，并与参考文献数值比对（Can.J.Chem.,1979,57(24),3332-3337；Biosci.Biotechnol.Biochem.,2004,68(8),1786-1789.），确定该化合物的结构与11-O-acetylcyathatriol相同。

式Ⅲ化合物：无色油状；比旋光度值

HRESIMS m/z385.2340[M+Na]⁺；氢谱（¹H-NMR）见表1。依据化合物的理化性质、氢谱数据，并与参考文献数值比对（Can.J.Chem.,1979,57(24),3332-3337），确定该化合物的结构与15-O-acetylcyathatriol相同。

表1.化合物的NMR数据

^a ¹H NMR at 500Hz,¹³C NMR at 125Hz in CD₃OD.

^b ¹H NMR at 500Hz in CDCl₃.

实施例3、式Ⅰ所示化合物的抗肿瘤细胞增殖活性试验

人肝癌细胞HepG2（ATCC HB-8065）、人前列腺癌细胞PC3（ATCC CRL-1435）、人肺癌细胞A549（ATCC CCL-185）、人结直肠癌细胞HCT-15（ATCC CCL-225）、人宫颈癌细胞Hela（ATCC CCL-2）、人白血病K562细胞、人胃癌细胞SGC-7901（ATCCSGC-7901）、人乳腺癌细胞MCF-7（ATCC HCC1428）均购自中山医科大学动物实验室。

人肝癌HepG2细胞，人前列腺癌PC3细胞用含10%（体积百分含量）胎牛血清的DMEM培养液培养，人肺癌A549细胞、人结直肠癌细胞HCT-15、人宫颈癌Hela细胞、人白血病K562细胞、人胃癌SGC-7901细胞、人乳腺癌细胞MCF-7用含10%（体积百分含量）胎牛血清的RPMI 1640培养液培养。上述细胞的培养条件均为37℃、5%CO₂培养箱中常规培养，隔天传代。

被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例2中分离结晶获得的式Ⅱ所示的化合物(11-O-acetylcyathatriol)和式Ⅲ所示的化合物（15-O-acetylcyathatriol）。准确称取适量样品1.66mg，用DMSO配制成50mM溶液，倍半稀释8个浓度，供活性测试。五氟尿嘧啶用DMSO配制成2mM溶液，倍半稀释8个不同浓度。

采用细胞增殖抑制活性测试方法(MTT法)测试式Ⅰ所示化合物的抗肿瘤细胞增殖活性，其原理是，活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的溴化3-(4，5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑为蓝紫色的不溶于水的甲臜(formazan)，甲臜的量可通过酶标仪测定其吸收度求得。由于甲臜的量与活细胞数成正比，所以可根据吸收度计算得出活细胞的数目，从而获得药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。

用MTT方法，取对数生长期的上述各种肿瘤细胞（人肝癌HepG2细胞，人前列腺癌PC3细胞用含10%（体积百分含量）胎牛血清的DMEM培养液培养，人肺癌A549细胞、人结直肠癌细胞HCT-15、人宫颈癌Hela细胞、人白血病K562细胞、人胃癌SGC-7901细胞或人乳腺癌细胞MCF-7），分别用胰酶消化，制成每毫升含1×10⁵个细胞的单细胞悬液，接种于96孔板内（每孔200μL），每组设3个平行孔。在37℃下24小时后加入2ul上述不同浓度式Ⅱ所示的化合物或式Ⅲ所示的化合物的样品溶液（DMSO溶解，给药组），培养48小时，同时设空白对照组（空白对照：2ul DMSO）和阳性对照组（五氟尿嘧啶：2ul不同浓度溶液）。然后加入20μL含MTT的IPMI-1640溶液(5mg/L)，再培养4小时，移出150μL培养液后加入150μL DMSO溶解甲臜，在540nm处测定其吸收度，计算抑制率(%)。五氟尿嘧啶作为阳性对照，

抑制率(%)的计算公式：（1-给药组OD值/空白对照组OD值）×100%。

计算IC₅₀值：IC₅₀=[CL(IH-50)+CH(50-IL)]/(IH-IL）

CL：低浓度值；CH：高浓度值；IH：高浓度下的抑制率；IL：低浓度下的抑制率

表2：化合物的抗肿瘤活性

注：5-FU是作为抗肿瘤的阳性对照。

结果如表2所示，实验证明，式Ⅱ和式Ⅲ所示化合物均对上述肿瘤细胞具有抑制作用，式Ⅰ化合物显示了较强的抗肿瘤活性。因此，本发明制备的式I可作为抗肿瘤剂(即抗肿瘤药物)用于肿瘤的治疗，也可作为细胞增殖抑制的低分子生物探针用于探索生命现象本质的生命科学实验研究中。