CN102844418A - 方法 - Google Patents
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Abstract
在一个方面，本文提供一种精制植物油的方法，所述方法包括使所述油与酶接触的步骤，所述酶能够水解叶绿素或叶绿素衍生物，其中所述酶在存在至少0.1重量％磷脂的情况下与所述油接触。
Description
技术领域
本发明涉及对植物性食品和饲料产品、尤其是植物油的工业加工。本发明可用于减少或消除由叶绿素和叶绿素衍生物产生的污染。
背景技术
叶绿素是在整个植物界广泛存在的一种绿色色素。叶绿素是光合作用所必需的，并且是地球上发现的最丰富的有机金属化合物之一。因而许多来自植物的产品(包括食物和饲料)含有相当多的叶绿素。
例如，来自含油种子(例如大豆、棕榈种子或油菜籽(卡诺拉油菜)、棉籽)的植物油和花生油通常含有一些叶绿素。然而，通常不期望植物油中存在高含量的叶绿素色素。这是因为叶绿素使油带上难看的绿色，并且在储存期间可引起油的氧化，从而导致油的变质。
已采用各种方法以除去植物油中的叶绿素。在产油过程的多个阶段，包括种子破碎、油萃取、脱胶、碱处理和漂白步骤，都可除去叶绿素。然而，漂白步骤通常对于将叶绿素残留量降至可接受含量是最为有效的。在漂白期间，加热油并使其通过吸附剂以除去叶绿素和影响成品油外观和/或稳定性的其他有色化合物。用于漂白步骤的吸附剂通常为粘土。
在可食用油加工行业中，采用上述步骤通常会将加工油中的叶绿素含量降至介于0.02至0.05ppm之间。然而，漂白步骤由于漂白粘土的夹带作用会增加加工成本和降低油产量。粘土的使用可能会将许多有用的化合物(例如类胡萝卜素和生育酚)也从油中除去。另外粘土的使用也很昂贵，这尤其是因为用过的粘土(即废料)的处理困难、危险(易于自燃)，因而处理成本高。因而已进行了用其他办法从油中除去叶绿素的尝试，例如使用叶绿素酶。
在植物中，叶绿素酶(chlorophyllase或chlase)被认为参与叶绿素降解，并催化叶绿素中酯键的水解而生成脱植基叶绿素和叶绿醇。WO2006009676描述了可降低组合物中叶绿素污染的一种工业方法，例如用叶绿素酶处理植物油。此方法中产生的水溶性脱植基叶绿素也是绿色，但是可通过水萃取法或二氧化硅处理除去。
叶绿素通常在用于产油的种子中以及从种子提取油的过程中部分降解。一种常见的修饰为卟啉(二氢卟酚)环失去镁离子形成称为脱镁叶绿素的衍生物(参见图1)。卟啉环上高极性镁离子的丢失导致脱镁叶绿素与叶绿素相比在理化性质上显著不同。通常在加工过程中，油中的脱镁叶绿素比叶绿素含量更丰富。脱镁叶绿素呈淡绿色，可通过与用于叶绿素类似的方法从油中除去，例如WO 2006009676中所述通过由具有脱镁叶绿素酶活性的酶催化的酯酶反应。在某些条件下，一些叶绿素酶能够水解脱镁叶绿素以及叶绿素，因此适于除去这两种污染物。脱镁叶绿素水解的产物为红色/褐色的脱镁叶绿酸和叶绿醇。脱镁叶绿酸也可由脱植基叶绿素(即叶绿素水解之后)失去镁离子生成(参见图1)。WO 2006009676教导了通过与脱植基叶绿素类似的方法(例如通过水萃取法或二氧化硅吸附)除去脱镁叶绿酸。
脱镁叶绿素还可通过含油种子收获和储存期间植物酶的活性或者通过精制油期间的加工条件(即热)进一步降解为焦脱镁叶绿素(参见“Behaviour of Chlorophyll Derivatives in Canola Oil Processing”，JAOCS，Vol，no.9(Sept.1993)pages 837-841(“卡诺拉油加工过程中叶绿素衍生物的行为”，《美国油脂化学协会杂志》，第9卷，1993年9月，第837-841页))。一种可能的机制是脱镁叶绿素碳环上甲酯键的酶水解，然后不稳定中间体向焦脱镁叶绿素的非酶转化。据报道来自藜(Chenopodium album)的名为脱镁叶绿酸酶的28-29kDa酶能够催化脱镁叶绿酸上类似的反应，以产生不含叶绿醇的焦脱镁叶绿素衍生物，称为焦脱镁叶绿酸(参见图26)。焦脱镁叶绿酸比脱镁叶绿酸极性低，导致焦脱镁叶绿酸与脱镁叶绿酸相比具有降低了的水溶解度和增加了的油溶解度。
根椐加工条件，在加工期间植物油中焦脱镁叶绿素可比脱镁叶绿素和叶绿素含量更为丰富(参见Table 9in volume 2.2.ofBailey’s IndustrialOil and Fat Products(2005)，6th edition，Ed.by Fereidoon Shahidi，JohnWiley&Sons(由Fereidoon Shahidi编辑、约翰威立父子出版公司于2005年出版的《贝雷工业油脂产品》，第6版，第2.2.卷的表9))。这部分地是由于在植物材料的收获和储存期间叶绿素中镁的丢失。如果使用90℃或更高温度下的延长热处理，油中焦脱镁叶绿素的量可能会增加并且可高于脱镁叶绿素的量。也可通过在压榨和萃取之前加热含油种子以及精制过程中油脱胶和碱处理降低叶绿素含量。还观察到油中的磷脂可与镁络合，从而降低叶绿素的量。因而在许多植物油中与焦脱镁叶绿素(和脱镁叶绿素)相比，叶绿素为相对微量的污染物。
因此仍然需要改进方法以从植物油中除去叶绿素和叶绿素衍生物(诸如脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素)。尤其需要一种可提高除去叶绿素和叶绿素衍生物的效率同时降低油中其他所需化合物的损失的方法。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种精制植物油的方法，该方法包括使油与能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶相接触的步骤，其中酶在存在至少0.1重量％磷脂的情况下与油接触。
在一些实施例中，按油的总重量计，在存在低于0.2重量％溶血磷脂(例如低于0.15重量％、低于0.1重量％或低于0.05重量％)的情况下，使酶与油接触。
在一个实施例中，酶在油脱胶之前与油接触。在另一个实施例中，酶在油脱胶的步骤期间与油接触。脱胶步骤可包括，例如水化脱胶、酸法脱胶、酶法脱胶和/或全脱胶/中和(例如向油中加酸，然后用碱中和)。
在一些特定的实施例中，对于酶在脱胶前与油接触的情况，酶法脱胶步骤可包括使油与磷脂酶(例如磷脂酶A1、磷脂酶A2或磷脂酶C)或酰基转移酶接触。酰基转移酶可包含，例如SEQ ID NO：23的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同一性的序列。
在另一个实施例中，该方法包括使油与该酶和在单个步骤中不产生溶血磷脂的磷脂酶(例如磷脂酶C)接触。例如，该酶可在使用磷脂酶C的酶法脱胶步骤期间与油接触，即同时使用该酶和磷脂酶C。
在另一些实施例中，该酶在存在至少0.5重量％、至少1重量％、至少1.5重量％或至少2重量％磷脂的情况下与油接触。
在另一些实施例中，该酶在低于80℃、优选地低于70℃、优选地55℃至65℃、优选地58℃至62℃(例如约60℃)的温度下与油接触。优选地，该酶在存在1至5重量％水(例如约1％或约2重量％水)的情况下与油接触。在一个实施例中，该酶在pH为6.0至6.8(例如6.3至6.5)时与油接触。
优选地，该方法不包括粘土处理步骤。该方法优选地还包括进行脱臭步骤以产生脱臭油和馏出液(例如含水馏出液或含氮馏出液)。通常，该方法与包括粘土处理步骤的方法相比在精制(脱臭或非脱臭)油和/或馏出夜中产生的类胡萝卜素和/或生育酚水平提高。
在一个实施例中，该酶包括叶绿素酶、脱镁叶绿素酶、焦脱镁叶绿素酶或脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶。例如，该酶可包含SEQ ID NO：1、2、4、6或8至15的任何之一中所定义的多肽序列，或其功能片段或变体。优选地，该酶包含与SEQ ID NO：1、2、4、6或8至15的任何之一在例如至少50个氨基酸残基上具有至少75％的序列同一性的多肽序列。在特别优选的实施例中，该酶包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的序列或者与其具有至少90％序列同一性的序列。
在另一方面，本发明提供可通过上述所定义的方法获得的精制植物油。
在又一方面，本发明提供可通过上述所定义的方法(即如本文所述包括脱臭步骤的方法)获得的馏出液(例如含水或含氮的馏出液)。
在又一方面，本发明提供上述所定义的方法，以提高通过油的脱臭获得的精制油和/或馏出液中类胡萝卜素和/或生育酚的含量。
如本文所述，已发现油中叶绿素酶和相关酶的活性取决于油的磷脂含量。因此，在一个实施例中，本发明提供改进的精制油的方法，其中叶绿素酶或者相关酶在存在最低含量磷脂的情况下使用。此外，根据提高的溶血磷脂含量与降低的叶绿素酶活性相关这一事实，在一个实施例中，本发明提供改进的方法，其中该酶在存在低含量溶血磷脂的情况下使用。通过提高该酶的活性，本发明的方法有利地使叶绿素和叶绿素衍生物的除去更加容易，且通常无需粘土处理步骤。这也可能提高油中有效化合物(如生育酚和类胡萝卜素)的含量，这些化合物可在脱臭步骤中回收或存留在成品中。
附图说明
图1示出涉及本发明中所用叶绿素和衍生物以及酶的各反应。
图2示出拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQID NO：1)。
图3示出普通小麦(Triticum aestivum)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQID NO：2)。
图4示出编码普通小麦叶绿素酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。
图5示出莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
图6示出编码莱茵衣藻叶绿素酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。
图7示出来自拟南芥的脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶(PPH)的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。叶绿体转运肽以粗体示出。
图8示出来自拟南芥的编码脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)。SEQ ID NO：6的PPH由SEQ ID NO：7的残基173至1627编码。
图9示出毛果杨(Populus trichocarpa)PPH的多肽序列(SEQ IDNO：8)。
图10示出葡萄(Vitis vinfera)PPH的多肽序列(SEQ ID NO：9)。
图11示出蓖麻(Ricinus communis)PPH的多肽序列(SEQ ID NO：10)。
图12示出稻(Oryza sativa)(粳稻品种组)PPH的多肽序列(SEQ IDNO：11)。
图13示出玉米(Zea mays)PPH的多肽序列(SEQ ID NO：12)。
图14示出烟草(Nicotiana tabacum)PPH的多肽序列(SEQ IDNO：13)。
图15示出稻粳稻组PPH的多肽序列(SEQ ID NO：14)。
图16示出(a)小立碗藓(Physcomitrella patens)亚种PPH的多肽序列(SEQ ID NO：15)
图17示意性地示出小麦(普通小麦)叶绿素酶基因与aprE信号序列的融合。
图18示意性地示出包含小麦(普通小麦)叶绿素酶基因的质粒pBN-TRI_CHL。
图19示意性地示出莱茵衣藻叶绿素酶基因与aprE信号序列的融合。
图20示意性地示出包含莱茵衣藻叶绿素酶基因的质粒pBN-CHL_CHL。
图21示出在存在不同表面活性剂(包括大豆卵磷脂、脱水山梨糖醇单油酸酯和脱水山梨糖醇三油酸酯)的情况下，用叶绿素酶处理的精制油菜籽油的样品，如实例3中所述。
图22示出用或未用叶绿素酶和叶绿素添加处理的精制油或者精制油和粗制大豆油的混合物的样品，如实例4中所述。
图23示出在存在不同含量卵磷脂和修饰的卵磷脂(由酰基转移酶修饰)的情况下，经叶绿素酶处理后，从指示油菜籽油样品中脱镁叶绿素含量的HPLC分析中得到的相对荧光值，如实例5中所述。
图24示出在存在不同含量卵磷脂和修饰的卵磷脂(由酰基转移酶修饰)的情况下，经叶绿素酶处理后，从指示油菜籽油样品中脱镁叶绿酸含量的HPLC分析中得到的相对荧光值，如实例5中所述。
图25示出在存在不同含量卵磷脂和修饰的卵磷脂(由酰基转移酶修饰)的情况下，经叶绿素酶处理后，从指示油菜籽油样品中焦脱镁叶绿素含量的HPLC分析中得到的相对荧光值，如实例5中所述。
图26示出在存在不同含量卵磷脂和修饰的卵磷脂(由酰基转移酶修饰)的情况下，经叶绿素酶处理后，从指示油菜籽油样品中焦脱镁叶绿酸含量的HPLC分析中得到的相对荧光值，如实例5中所述。
图27示出在存在酰基转移酶、磷脂酶C或磷脂酶A1的情况下，经普通小麦或莱茵衣藻叶绿素酶处理后，从指示油菜籽油样品中脱镁叶绿素含量的HPLC分析中得到的相对荧光值，如实例6中所述。
图28示出使用吸光度检测(430nm)的HPLC色谱图，指示与如下物质相关的峰编号：1＝脱植基叶绿素b；2＝脱植基叶绿素a；3＝新叶黄素；3’＝新叶黄素异构体；4＝新色素；5＝紫黄素；6＝黄体呋喃素；7＝玉米黄二呋喃素；8＝花黄素；8’＝花黄素异构体；9＝玉米黄呋喃素；10＝叶黄素；10’＝叶黄素异构体；10”＝叶黄素异构体；11＝脱镁叶绿酸b；12＝脱镁叶绿酸a；13＝叶绿素b；13’＝叶绿素b’；14＝叶绿素a；14’＝叶绿素a’；15＝脱镁叶绿素b；15’＝脱镁叶绿素b’；16＝β-胡萝卜素；17＝脱镁叶绿素a；17’＝脱镁叶绿素a’；18＝焦脱镁叶绿素b；19＝焦脱镁叶绿素a。
图29示出使用粘土漂白的标准精制方法和使用叶绿素酶而未经粘土处理的酶法精制加工的各阶段油中脱镁叶绿素a和焦脱镁叶绿素的含量，如实例8中所述。
图30示出使用粘土漂白的标准精制方法和使用叶绿素酶而未经粘土处理的酶法精制加工的各阶段油中脱镁叶绿酸a和焦脱镁叶绿酸的含量，如实例8中所述。
图31为根据本发明的一个实施例的精制油方法的图示。
图32示出突变型杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列，在进行翻译后修饰之后发生突变Asn80Asp(SEQ ID No.23)。
图33示出叶绿素酶对油中脱镁叶绿素a的降解的影响。
图34示出pH和水％对叶绿素酶活性的影响。
图35示出脱镁叶绿素的差向异构体形式及其重排。
图36示出脱镁叶绿素a差向异构体在不同pH反应4小时后的相对比率。
图37示出用叶绿素酶处理油时温度对脱镁叶绿素水解的影响。
图38示出温度对焦脱镁叶绿素含量的影响。
图39示出温度对叶绿素和脱镁叶绿素以及焦脱镁叶绿素总含量的影响。
图40示出不同混合条件对脱镁叶绿素水解的影响。
图41示出在用叶绿素酶处理的油中脱镁叶绿素随时间和pH的变化。
图42示出在用叶绿素酶处理的油中脱镁叶绿素a异构体比率随时间和pH的变化。
图43示出在用叶绿素酶处理的油中焦脱镁叶绿素随时间和pH的变化。
图44示出在用叶绿素酶处理的油中焦脱镁叶绿素酶法水解随时间和pH的变化。
图45示出pH对叶绿素酶降解脱镁叶绿素的影响。
图46示出pH对脱镁叶绿素a和a’差向异构体的量的影响。
图47示出pH对焦脱镁叶绿素含量的影响。
图48示出pH对脱镁叶绿素与焦脱镁叶绿素总含量的影响。
图49示出pH对脱镁叶绿酸含量的影响。
图50示出在水化脱胶方法(WDG)和全脱胶方法(TDG)中通过叶绿素处理2小时后，pH对油菜籽油中脱镁叶绿素的影响。
图51示出含水量和pH对叶绿素酶处理的油中脱镁叶绿素的影响。
图52示出含水量和pH对叶绿素酶处理的油中焦脱镁叶绿素的影响。
图53示出含水量和pH对叶绿素酶处理的油中脱镁叶绿素差向异构体的影响。
图54示出在采用不同用量叶绿素酶处理的油中，温度、pH调节和反应时间对脱镁叶绿素含量的影响。
图55示出在采用不同用量叶绿素酶处理的油中，温度、pH调节和反应时间对焦脱镁叶绿素含量的影响。
图56示出在采用不同用量叶绿素酶处理的油中，温度、pH调节和反应时间对脱镁叶绿素a差向异构体含量的影响。
具体实施方式
在一个方面，本发明涉及精制植物油的方法。通常，例如在叶绿素和/或叶绿素衍生物作为污染物存在的情况下，该方法用于从油中除去叶绿素和/或叶绿素衍生物，或者降低油中叶绿素和/或叶绿素衍生物的含量。
叶绿素和叶绿素衍生物
所谓“叶绿素衍生物”通常是指包含卟啉(二氢卟酚)环和叶绿醇基团(尾)的化合物，包括不含镁含叶绿醇的衍生物，诸如脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素。叶绿素和(含叶绿醇)叶绿素衍生物通常为绿色，这是因为有卟啉(二氢卟酚)环存在于分子中。镁从卟啉环的丢失意味着脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素颜色上比叶绿素更呈现出偏褐色。因而油中叶绿素和叶绿素衍生物的存在，可使此类油带上难看的绿色、淡绿色或褐色。在一个实施例，可用本方法以除去或降低油中存在的绿色或褐色。因此，本方法可称为漂白或脱色方法。
该方法中所用的酶可水解叶绿素和含叶绿醇的叶绿素衍生物以从二氢卟酚环裂解叶绿醇尾巴。叶绿素和叶绿素衍生物的水解通常得到诸如脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸的化合物，它们是不含叶绿醇的叶绿素衍生物。这些化合物仍包含有色卟啉环，脱植基叶绿素呈绿色而脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸则呈红棕色。在一些实施例中，也期望除去这些不含叶绿醇的衍生物以及降低油的绿色/红色/褐色。因此，在本发明的一个实施例中，该方法还可包括除去或降低油中不含叶绿醇的叶绿素衍生物含量的步骤。该方法可涉及漂白或脱色以除去油中的绿色和/或红色/褐色。
叶绿素或叶绿素衍生物可为a或b形式。因而如本文所用，术语“叶绿素”包括叶绿素a和叶绿素b。类似地，当提及脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿素、脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸时，兼指a和b形式。
植物油
任何植物油都可根据本方法进行处理，以除去由叶绿素和/或叶绿素衍生物引起的不期望的污染。油可来自任何类型的植物，以及来自植物的任何部分，包括整株植物、叶、茎、花、根、植物原生质体、种子和植物细胞及其相同后代。可以本发明方法处理的产品的来源植物种类包括高等植物，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)以及裸子植物。它包括多种倍性水平的植物，包括多倍体、二倍体、单倍体和半合子状态。
在优选的实施例中，油可包括植物油，包括由含油种子或含油果实加工得到的油(例如，诸如卡诺拉(油菜籽)油的种子油以及诸如棕榈油的果油)。合适的油的例子包括米糠、大豆、卡诺拉油菜(油菜籽)、棕榈、橄榄、棉籽、玉米、棕榈仁、椰子、花生、芝麻或向日葵。本发明的方法可结合加工精油(例如来自果实种子油，例如葡萄籽、杏、琉璃苣等的那些)的方法使用。本发明的方法可结合加工高磷油(例如大豆油)的方法使用。优选地，所述的油为粗制植物油。
油中的叶绿素和叶绿素衍生物
叶绿素和/或叶绿素衍生物(例如叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素)可作为污染物天然存在于油中，或作为不期望的组分存在于加工产品中。叶绿素和/或叶绿素衍生物(例如叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素)可以任何含量存在于油中。通常，叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素可作为天然污染物存在于油中，浓度按油的总重量计为0.001至1000mg/kg(0.001至1000ppm，10-7至10-1重量％)。在另一些实施例中，叶绿素和/或叶绿素衍生物可存在于油中，浓度按油的总重量计为0.1至100、0.5至50、1至50、1至30或1至10mg/kg。
不含叶绿醇的叶绿素衍生物也可存在于油中。例如，脱植基叶绿素、焦脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿酸可以任何含量存在于油中。通常，脱植基叶绿素、焦脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿酸在根据本发明方法采用酶处理前或处理后可存在于油中，浓度按油的总重量计为0.001至1000mg/kg(0.001至1000ppm，10-7至10-1重量％)。在另一些实施例中，脱植基叶绿素、焦脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿酸可存在于组合物中，浓度按组合物的总重量计为0.1至100、0.5至50、1至50、1至30或1至10mg/kg。
水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶
本发明的方法包括使油与能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶接触的步骤。通常，“水解叶绿素或叶绿素衍生物”是指水解叶绿素或(含叶绿醇)叶绿素衍生物中的酯键，例如从叶绿素或叶绿素衍生物中的二氢卟酚环上裂解叶绿醇基团。因此该酶通常具有酯酶或水解酶活性。优选地该酶在油相中并且任选地在水相中也具有酯酶或水解酶活性。
因而该酶可为，例如叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶。优选地，该酶能够水解叶绿素、脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素中的至少一种、至少两种或全部三种。在一个特别优选的实施例中，该酶具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和焦脱镁叶绿素酶活性。在另一些实施例中，两种或更多种酶可用于该方法中，每种酶具有不同的底物特异性。例如，该方法可包括选自叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和焦脱镁叶绿素酶的两种或三种酶的组合使用。
具有可水解叶绿素或叶绿素衍生物的活性的任何多肽可用作本发明方法中的酶。所谓“酶”意指涵盖对叶绿素或叶绿素衍生物具有水解活性的任何多肽，包括例如酶片段等。任何分离的、重组的或合成的或嵌合的(或合成和重组的组合)多肽均可使用。
酶(叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶)活性测定
可使用任何合适的检测分析技术，例如基于本文所述的检测分析法，检测叶绿素或叶绿素衍生物的水解活性。例如，可使用荧光技术检测水解活性。在一个合适的检测分析中，将要检测其叶绿素或叶绿素衍生物水解活性的多肽在存在底物的情况下温育，并且通过荧光测量法监测产物或底物含量。合适的底物包括例如叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素。可检测的产物包括脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸、焦脱镁叶绿酸和/或叶绿醇。
用于检测叶绿素或叶绿素衍生物水解的检测分析方法在以下文献中公开：例如Ali Khamessan et al.(1994)，Journal of Chemical Technology&Biotechnology，60(1)，pages 73-81(Ali Khamessan等人，1994年，《化学技术与生物技术杂志》，第60卷第1期，第73-81页)；Klein andVishniac(1961)，J.Biol.Chem.236：2544-2547(Klein和Vishniac，1961年，《生物化学杂志》，第236卷，第2544-2547页)；以及Kiani et al.(2006)，Analytical Biochemistry 353：93-98(Kiani等人，2006年，《分析生物化学》，第353卷，第93-98页)。
作为另外一种选择，合适的检测分析可在加入某种酶后基于底物或产物含量的HPLC检测和定量，例如基于如下所述的技术。在一个实施例中，检测分析可按Hornero-Mendez et al.(2005)，Food ResearchInternational 38(8-9)：1067-1072(Hornero-Mendez等人，2005年，《国际食品研究》，第38卷，第8-9期，第1067-1072页)中所述进行。在另一个实施例中，可使用以下检测分析法：
向pH 7.0的170μl mM HEPES中添加溶解于丙酮的20μl 0.3mM叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素。将酶溶解于pH 7.0的50mM HEPES中。将10μl酶溶液添加到190μl底物溶液中引发反应，并在40℃下温育不同时间。通过添加350μl丙酮终止反应。离心(在18,000g下离心2min)后，通过HPLC分析上清液，并确定(i)叶绿素和脱植基叶绿素(ii)脱镁叶绿素和脱镁叶绿酸或者(iii)焦脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿酸的量。
一单位酶活性定义为例如采用本文所述的检测分析方法，在40℃下每分钟水解一微摩尔底物(例如叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素)的酶的量。
在一些优选的实施例中，本方法中所用的酶按例如通过本文所述检测分析方法确定的每克纯化酶的活性单位计，具有至少1000U/g、至少5000U/g、至少10000U/g或者至少50000U/g的叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性。
叶绿素酶
在一个实施例中，该酶至少能够水解叶绿素。任何能催化叶绿素酯键水解以生成脱植基叶绿素和叶绿醇的多肽都可用于该方法。例如，叶绿素酶(chlorophyllase)、叶绿素酶(chlase)或叶绿素脱植基叶绿素水解酶或具有相似活性的多肽(例如，叶绿素-脱植基叶绿素水解酶1或叶绿素酶1(chlase 1)，或者叶绿素-脱植基叶绿素水解酶2或叶绿素酶2(chlase2)，分别参见例如NCBI P59677-1和P59678)可用于该方法。
在一个实施例中，该酶在酶命名分类(E.C.3.1.1.14)下分类为叶绿素酶。任何分离出的、重组的或合成的或嵌合的(合成和重组的组合)多肽(例如酶或催化性抗体)均可使用，参见例如Marchler-Bauer(2003)Nucleic Acids Res.31：383-387(Marchler-Bauer，2003年，《核酸研究》，第31卷，第383-387页)。在一个方面，叶绿素酶可为如WO 0229022或WO 2006009676中所述的酶。例如，拟南芥叶绿素酶可按例如NCBI条目NM_123753中所述使用。因而叶绿素酶可为包含SEQ ID NO：1序列的多肽(参见图2)。在另一个实施例中，叶绿素酶来自藻类，例如来自三角褐指藻(Phaeodactylum trtcornutum)。
在另一个实施例中，叶绿素酶来自小麦，例如来自小麦属(Triticumsp.)，尤其是来自普通小麦。例如，叶绿素酶可为包含SEQ ID NO：2序列的多肽(参见图3)，或可由SEQ ID NO：3核苷酸序列编码(参见图4)。
在另一个实施例中，叶绿素酶来自衣藻属(Chlamydomonas sp.)，尤其是来自莱茵衣藻。例如，叶绿素酶可为包含SEQ ID NO：4序列的多肽(参见图5)，或可由SEQ ID NO：5核苷酸序列编码(参见图6)。
脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶
在一个实施例中，该酶能够水解脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素。例如，该酶可为脱镁叶绿素酶或脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶(PPH)，例如在Schelbert et al.，The Plant Cell 21：767-785(2009)(Schelbert等人，《植物细胞》，第21期，第767-785页，2009年)中所述的酶。
除脱镁叶绿素之外，PPH和相关酶也能够水解焦脱镁叶绿素。然而，PPH对叶绿素是惰性的。如在Schelbert等人的文献中所述，PPH直系同源基因通常存在于真核光合作用生物体。PPH代表在系统发生上区别于叶绿素酶定义的α/β水解酶亚族，这两个族在序列同源性和底物上是不同的。
在本发明的具体实施例中，该酶可为来自任何物种的任何已知PPH或它们的功能性变体或片段，或可衍生自任何已知的PPH酶。例如，在一个实施例，该酶为来自拟南芥的PPH，例如包含SEQ ID NO：6氨基酸序列的多肽(参见图7)，或由SEQ ID NO：7核苷酸序列编码的多肽(参见图8，NCBI登录号NP_196884，GenBank ID No.15240707)，或者它们的功能性变体或片段。
在另一些实施例中，该酶可为来自以下任何一种物种的PPH：拟南芥、毛果杨、葡萄、稻、玉米、烟草、团藻(Ostreococcus lucimarinus)、青绿藻(Ostreococcus taurii)、小立碗藓、三角褐指藻、莱茵衣藻或微单胞菌属(Micromonas sp.)RCC299。例如，该酶可为包含氨基酸序列的多肽，或由核苷酸序列编码的多肽(在表1中所示的以下数据库条目之一中定义)，或者它们的功能性片段或变体：
表1
例如，该酶可为在SEQ ID NO：8至15任何一个中所定义的多肽(图9至16)，或者它们的功能性片段或变体。
变体和片段
水解叶绿素或叶绿素衍生物的已知序列的功能性变体和片段也可用于本发明。所谓“功能性”是指所述片段或变体保留着对叶绿素或叶绿素衍生物的可检测水解活性。通常此类变体和片段显示出与已知叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶序列具有同源性，例如与已知叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶氨基酸序列，如与SEQ ID NO：l或SEQ ID NO：1、2、4、6或8至15的任何一者，如序列的至少约10、20、30、50、100、200、300、500或1000或更多个残基的区域，或整个长度具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。
序列同一性的百分比可以用序列比较算法分析或通过肉眼检查确定。在一个方面，序列比较算法是BLAST算法，例如BLAST 2.2.2版算法。
其他适用于本方法的具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性的酶可以通过确定存在于例如已知叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶序列中的保守序列基序的存在性而鉴定。例如，存在于PPH酶中的保守序列基序包括以下序列：LPGFGVG(SEQ ID NO：16)、DFLGQG(SEQ ID NO：17)、GNSLGG(SEQ ID NO：18)、LVKGVTLLNATPFW(SEQ ID NO：19)、HPAA(SEQ ID NO：20)、EDPW(SEQ ID NO：21)和SPAGHCPH(SEQ ID NO：22)。在一些实施例中，适用于本发明的酶可包含一个或多个这些序列。GNSLGG(SEQ ID NO：18)基序包含活性位点丝氨酸残基。具有合适活性的多肽序列可以通过搜索基因组数据库，例如微生物组宏基因组数据库(美国能源部联合基因组研究所(JGI-DOE，USA))中这些基序的存在来鉴定。
酶的分离和制备
适用于本发明的酶可以从它们的天然来源分离，或可以例如使用重组DNA技术制备。编码具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的核苷酸序列可以分离或构建并且用于产生相应的多肽。
例如，可使用来自产生该多肽的生物体的染色体DNA或信使RNA，来构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果该多肽的氨基酸序列已知，则可合成出经标记的寡核苷酸探针，并用它从由该生物制备的基因组库鉴定编码多肽的克隆(polypeptide-encoding clones)。或者，可使用含有与另一已知的多肽的基因同源的序列的标记寡核苷酸探针来鉴定编码多肽的克隆。在后一种情况中，使用较低严格性的杂交和洗涤条件。
或者，可如下鉴定编码多肽的克隆：将基因组DNA的片段插入到表达载体(如质粒)中，用所得的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，然后将经转化的细菌接种到含有被该多肽抑制的酶的琼脂上，从而让表达该多肽的克隆得以鉴定出来。
在又一个另选方案中，编码该多肽的核苷酸序列可以通过已确立的标准方法合成制备，例如Beucage S.L.el al(1981)Tetrahedron Letters 22，p 1859-1869(Beucage S.L.等人，1981年，《四面体通讯》，第22卷，第1859-1869页)所描述的亚磷酰胺方法，或Matthes et al(1984)EMBOJ.3，p 801-805(Matthes等人，1984年，《欧洲分子生物学学会杂志》，第3卷，第801-805页)所述的方法。在亚磷酰胺方法中，寡核苷酸例如在自动DNA合成仪中合成，将其纯化、退火、连接并克隆进适当的载体中。
核苷酸序列可以为混合的基因组和合成起源、混合的合成和cDNA起源或混合的基因组和cDNA起源，根据标准技术通过连接合成、基因组或cDNA起源的片段制备(视情况而定)。每一连接的片段对应整个核苷酸序列的各个部分。DNA序列还可使用特定引物通过聚合酶链反应(PCR)制备，例如US 4,683,202或Saiki R K等人(Science(1988)239，pp487-491)(《科学》，1988年，第239卷，第487-491页)所描述。
本文所用的术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物(如其部分)。该核苷酸序列可以来自基因组或者来自合成或者来自重组，无论代表正义链还是反义链都可以是双链或单链。
通常，编码具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的核苷酸序列使用重组DNA技术制备。然而，在本发明的可供选择的实施例中，可以使用本领域熟知的化学方法来合成该核苷酸序列的全部或部分(参见Caruthers MH et al(1980)Nuc Acids Res Symp Ser215-23(Caruthers MH等人，1980年，《核酸研究论文集系列》，第215-223页)和Horn T et al(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232(Horn T等人，1980年，《核酸研究论文集系列》，第225-232页))。
酶序列的修饰
一旦分离了酶编码核苷酸序列，或者鉴定了推定的酶编码核苷酸序列，可能需要修饰选定的核苷酸序列，例如可能需要将该序列突变以制备本发明的酶。
可用合成的寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有所需突变位点旁侧的核苷酸序列。合适的方法在Morinaga等人(Biotechnology(1984)2，p646-649(《生物技术》，1984年，第2卷，第646-649页))中有所公开。向酶编码核苷酸序列引入突变的另一种方法在Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，p 147-151(《分析生物化学》，1989年，第180卷，第147-151页))中有描述。
可以例如使用市售的试剂盒，如来自Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒或者来自Clontech的Diversify PCR随机诱变试剂盒，来随机引入突变，而不是如上所述进行定点诱变。EP 0583265提到了优化基于PCR的诱变的方法，也可将它们与诱变DNA类似物(mutagenicDNA analogue)(如EP 0866796中描述的那些)组合使用。易错PCR技术适用于产生水解叶绿素和/或叶绿素衍生物的具有优选特性的酶变体。WO0206457提到了脂肪酶的分子进化。
第三种获得新序列的方法是，用多种限制性内切核酸酶或者诸如Dnase I的酶将不相同的核苷酸序列片段化，然后重新组装出编码功能蛋白的完全核苷酸序列。或者，可以使用一条或多条不相同的核苷酸序列，并在完全核苷酸序列的重新组装过程中引入突变。DNA改组和家族改组技术适用于产生具有优选特性的酶变体。进行“改组”的合适方法可在EP0752008、EP1138763、EP1103606中找到。也可将改组与其他形式的DNA诱变进行组合，如US 6,180,406和WO 01/34835中所描述。
因此，有可能在体内或体外对核苷酸序列作出多个定点突变或随机突变，并且随后通过各种方法筛选所编码的多肽的改进的功能性。例如，采用计算机和exo介导的(in silico and exo mediated)重组方法(参见WO00/58517、US 6,344,328、US 6,361,974)，可进行分子进化，其中所产生的变体保留很低的与已知酶或蛋白质的同源性。由此获得的此类变体可以与已知叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶具有显著的结构相似性，但是具有非常低的氨基酸序列同源性。
另外，作为一个非限制性例子，可将多核苷酸序列的突变或自然变体与野生型或其他突变或自然变体进行重组，以产生新的变体。也可以针对所编码的多肽的功能性改善对这种新的变体进行筛选。
上述的和类似的分子进化方法的应用，使得可以在事先不知道蛋白质结构或功能的情况下鉴定和选择具有优选特性的本发明酶的变体，并使得可以生产非可预测但有利的突变或变体。在本领域中有许多将分子进化应用于优化或改变酶活性的例子，这些例子包括(但不限于)如下中的一种或多种：优化在宿主细胞中或体外的表达和/或活性，增加酶活性，改变底物和/或产物特异性，增加或减少酶或结构稳定性，改变优选环境条件，如温度、pH、底物下的酶活性/特异性。
本领域技术人员会明白，使用分子进化工具，可对酶进行改变以改进其功能性。合适地，编码用于本发明的酶(例如叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶)的核苷酸序列可以编码变体酶，即当与亲本酶比较时，变体酶可以包含至少一个氨基酸置换、缺失或插入。变体酶保留至少1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％或99％的与亲本酶的同一性。合适的亲本酶可以包括具有叶绿素和/或叶绿素衍生物的水解活性的任何酶。
多肽序列
本发明还涵盖能编码供在本发明的方法和/或用途的任一者中使用的焦脱镁叶绿素酶的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的用途。
如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”同义。氨基酸序列可以从合适的来源制备/分离，或可以合成制备或可以使用重组DNA技术制备。合适地，氨基酸序列可通过标准的技术从本文教导的分离多肽获得。
一种从分离多肽确定氨基酸序列的合适方法如下。可将纯化了的多肽进行冷冻干燥，并可将100μg的冷冻干燥材料溶于50μl的8M尿素和0.4M碳酸氢铵(pH 8.4)混合物中。可将溶解的蛋白质变性，并在覆盖氮气和加入5μl的45mM二硫苏糖醇后在50℃下还原15分钟。冷却到室温后，可加入5μl的100mM碘代乙酰胺，以让半胱氨酸残基在氮气下在暗处室温下衍生化15分钟。
可向以上反应混合物加入135μl水和溶于5μl水的5μg内切蛋白酶Lys-C，然后可在氮气、37℃下进行消化24小时。所得的多肽可以在VYDAC C 18柱(0.46×15cm；10μm；美国加利福尼亚州分离集团(TheSeparation Group，California，USA))上使用溶剂A：溶于水的0.1％TFA和溶剂B：溶于乙腈的0.1％TFA通过反相HPLC分离。可将选定的肽在Develosil C18上用相同的溶剂体系再进行色谱分离后，进行N末端测序。可根据厂商说明书(美国加利福尼亚州应用生物系统公司(AppliedBiosystems，California，USA))使用Applied Biosystems 476A测序仪，采用脉冲液体快速循环进行测序。
序列比较
在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可以等同于“同一性”。同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应能提供和/或编码保留着功能活性和/或增强酶活性的多肽。
在本说明书的语境中，同源序列意指：包括这样的氨基酸序列，其可与主题序列有至少75、85或90％同一性、优选至少95或98％同一性。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本说明书的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。
在本说明书的语境中，同源序列意指：包括这样的核苷酸序列，其可与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)有至少75、85或90％同一性、优选至少95或98％同一性。通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本说明书的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。
同源性比较可通过眼，或更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些可商购获得的计算机程序可计算两个或更多个序列之间的％同源性。可以对连续序列计算％同源性，即一个序列与其他序列比对，并且一个序列中的每个氨基酸直接与其他序列中相应的氨基酸比较，每次一个残基。这称为“不产生空位的”比对。通常，这种不产生空位的比对仅在相对较短数目的残基上进行。
尽管这是十分简单和可靠的方法，但其不能考虑，例如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而在进行全局比对时可能导致％同源性有大的降低。因此，大多数序列比较方法被设计产生最佳的比对，该最佳比对考虑可能的插入和缺失而不会罚掉过多的整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。
然而，这些更复杂的方法给比对中出现的每一个空位赋给“空位罚分”使得，对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对(反映两条比较序列之间相关性较高)将获得比具有许多空位的序列比对更高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gap costs)”，其对空位的存在征收相对较高的成本，对空位中每一个后续的残基征收较少的罚分。这是最通常使用的空位打分系统。高的空位罚分将当然会产生具有较少空位的最佳比对。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。
最大％同源性的计算因而首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。适用于进行这种比对的计算机程序是Vector NTI AdvanceTM 11(Invitrogen Corp.)。其他可进行序列比较的软件的例子包括(但不限于)BLAST软件包(参见Ausubel et al 1999 Short Protocols in MolecularBiology，4th Ed-Chapter 18(Ausubel等人，《精编分子生物学方案》，第4版，第18章))和FASTA(Altschul et al 1990J.Mol.Biol.403-410(Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第403-410页))。BLAST和FASTA均可供进行离线和在线搜索(参见Ausubel等人，1999，第7-58至7-60页)。然而，对于一些应用，使用Vector NTI AdvanceTM11程序是优选的。称为BLAST 2 Sequences的新型工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)：247-50(《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》，1999年，第174卷第2期，第247-250页)和FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8(《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》，1999年，第177卷第1期，第187-188页))。
尽管最终的同源性百分数(％)也可以同一性来度量，但比对过程本身通常不是基于要么全有要么全无的成对比较。相反，通常使用标度化相似性打分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离给每一成对比较赋给分值。通常使用的这种矩阵的实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(对于进一步的细节请参见用户手册)。对于某些应用，优选使用Vector NTI AdvanceTM 11程序包的默认值。
作为另外一种选择，百分比同一性可用Vector NTI AdvanceTM 11(英杰公司(Invitrogen Corp.))中的多比对功能计算，该功能基于类似于CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244(HigginsDG和Sharp PM，1988年，《基因》，第73卷第1期，第237-244页))的算法。一旦该软件产生了最佳比对，则有可能计算％同源性，优选％序列同一性。作为序列比较的一部分该软件通常进行这些计算，并产生数值结果。
如果确定序列同一性时使用空位罚分，则可优选地使用程序的默认参数于成对比对。例如，以下参数是BLAST 2成对比对的当前默认参数：
在一个实施例中，优选地核苷酸序列和/或氨基酸序列的序列同一性可以通过BLAST2(blastn)使用如上定义的打分参数设置确定。
出于本发明的目的，同一性的程度是基于相同的序列元件的数目。根据本发明氨基酸序列的同一性程度可合适地通过本领域已知的计算机程序例如Vector NTI AdvanceTM 11(英杰公司(Invitrogen Corp.))确定。对于成对比对，所使用的打分参数优选地为BLOSUM62，其中空位存在罚分为11，空位延伸罚分为1。
合适地，关于核苷酸序列的同一性程度是在至少20个连续核苷酸上，优选在至少30个连续核苷酸上，优选在至少40个连续核苷酸上，优选在50个连续核苷酸上，优选在至少60个连续核苷酸上，优选在至少100个连续核苷酸测定。合适地，关于核苷酸序列的同一性程度可在整个序列上测定。
氨基酸突变
序列还可具有氨基酸残基的插入或置换，该插入或置换产生了沉默改变和导致功能等价的物质。可基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性作出有意的氨基酸置换，只要该物质的二级结合活性得以保留。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；以及具有类似亲水性值的含不带电的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯基丙氨酸和酪氨酸。
可例如根据下表进行保守置换。第二列同一区组中的氨基酸，优选第三列同一行中的氨基酸可彼此置换：
本发明还涵盖可能出现的同源置换(在本文中，置换和取代都用来指将现有的氨基酸残基用另选的残基进行交换)，即对等置换，如碱性对碱性，酸性对酸性，极性对极性等。非同源置换也可能出现，即从一类残基置换成另一类残基，或者涉及到加入非自然氨基酸，如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。置换还可通过非天然氨基酸进行。
变体氨基酸序列可包括可在序列的任何两个氨基酸残基之间插入的合适的间隔基团，这些间隔基团除了氨基酸间隔物如甘氨酸或β-丙氨酸残基外还包括烷基基团如甲基、乙基或丙基基团。变异的另一种形式(涉及存在类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基)将是本领域技术人员十分了解的。为了避免疑惑，“类肽形式”用于指其中α-碳取代基处于残基的氮原子而不是α-碳上的变体氨基酸残基。用于制备类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ et al.，PNAS(1992)89(20)，9367-9371(Simon RJ等人，《美国国家科学院院刊》，1992年，第89卷第20期，第9367-9371页)和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134(Horwell DC，《生物技术趋势》，1995年，第13卷第4期，第132-134页)。
核苷酸序列
供在本发明中使用的核苷酸序列或者编码具有本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列，可在其中包含合成的或修饰的核苷酸。对寡核苷酸的多种不同类型的修饰是本领域已知的。这包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3′和/或5′端添加吖啶或多聚赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解本文所描述的核苷酸序列可通过本领域可用的任何方法修饰。可进行此类修饰以提高核苷酸序列的体内活性或寿命。
本发明还涵盖与本文所讨论的序列互补的核苷酸序列或其任何衍生物、片段或衍生物的用途。如果序列与其片段互补，则该序列可用作探针来鉴别其他生物体中的相似编码序列等等。
不与本发明的序列100％同源但处于本发明的范围之内的多核苷酸可以多种方式获得。本文描述的序列的其他变体可例如通过用探针探测(probing)从一系列个体，例如来自不同种群的个体制备的DNA文库来获得。此外，可获得存在于植物细胞的其他病毒/细菌或细胞同源物，特别是细胞同源物，此类同源物及其片段通常将能够选择性地与本文序列表中所示的序列杂交。此类序列可通过如下方法获得：探测从其他植物物种制备的cDNA文库或基因组DNA文库，并且在中等至高严格性条件下用包含随附的序列表中的序列中的任一条的全部或部分的探针探测此类文库。可应用类似的考虑来获得本发明的多肽或核苷酸序列的种同源物和等位基因变体。
变体和株系/物种同源物还可用简并PCR获得，简并PCR将使用这样一种引物，该引物设计用于靶向变体和同源物内编码本发明序列内的保守氨基酸序列的序列。保守序列可例如通过将来自数种变体/同源物的氨基酸序列进行比对来预测。序列比对可用本领域已知的计算机软件来进行。例如，广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。
简并PCR中使用的引物将含有一个或多个简并位置并将在比从已知序列用单序列引物克隆序列所用的严格性条件低的严格性条件下使用。
作为另外一种选择，这种多核苷酸可通过对已表征的序列进行定点诱变来获得。在例如需要沉默密码子序列改变来优化多核苷酸序列在其中表达的特定宿主细胞的密码子偏好的情形中这可能是有用的。为了引入限制多肽识别位点，或者为了改变被多核苷酸所编码的多肽的性质或功能，可能需要其他的序列改变。
本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可用于产生引物(例如PCR引物)、备选的扩增反应的引物、探针(例如用放射性或非放射性标记通过常规手段标记有显示标记的探针)，或者可将该多核苷酸克隆进载体中。这种引物、探针和其他片段将长为至少15个，优选至少20个，例如至少25、30或40个核苷酸，并且也为本文所用的术语本发明的多核苷酸所涵盖。
根据本发明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探针可重组产生、合成产生或通过本领域技术人员可用的任何手段产生。它们还可以通过标准技术克隆。
通常，引物将通过合成手段产生，涉及所需核酸序列的逐步制备，一次一个核苷酸。利用自动化技术完成该过程的技术是本领域容易获得的。
较长的多核苷酸将通常用重组手段产生，例如用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。这将涉及到制备与焦脱镁叶绿素酶序列的需要进行克隆的区域侧接的一对引物(例如约15至30个核苷酸的引物)，使引物与从植物细胞获得的mRNA或cDNA接触，在能引起所需要的区域的扩增的条件下进行聚合酶链反应，分离扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物来分离)和回收扩增的DNA。引物可被设计为含有合适的限制性酶识别位点使得可将扩增的DNA克隆进合适的克隆载体中。
酶的配制和剂量
用于本发明方法的酶可以配制或改性而成，例如化学改性，以提高油溶解度、稳定性、活性或用于固定。例如，用于本发明方法的酶可以配制为两亲或更亲脂的。例如，用于本发明方法的酶可以包埋在例如脂质体或凝胶，如藻酸盐水凝胶或藻酸盐微珠或等同物中。用于本发明方法的酶可以在胶束体系，例如三元胶束(TMS)或反胶束体系(RMS)介质中配制。用于本发明方法的酶可以如Yi(2002)J.of Molecular Catalysis B：Enzymatic，Vol.19，pgs 319-325(Yi，2002年，《分子催化杂志，B辑：酶催化》，第19卷，第319-325页)中所述配制。
本发明方法的酶促反应，例如将油与水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶接触的步骤，可在一个反应容器或多个容器中进行。在一个方面，本发明方法的酶促反应在植物油精制设备或工厂中进行。
本发明的方法可用固定化酶实施，例如固定化叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶。该酶可以固定在任何有机或无机载体上。示例性无机载体包括氧化铝、硅藻土、Dowex-1-氯化物、玻璃微珠和硅胶。示例性有机载体包括DEAE-纤维素、藻酸盐水凝胶或藻酸盐微珠或等同物。在本发明的各个方面，酶的固定化可以通过物理吸附于无机载体上而优化。用于实施本发明的酶可固定在不同的介质，包括水、Tris-HCl缓冲溶液以及包含Tris-HCl缓冲溶液、己烷和表面活性剂的三元胶束体系。酶可固定在任何类型的基底，例如过滤器、纤维、柱、微珠、胶体、凝胶、水凝胶、网片等等。
酶可以任何合适的量加入油中。例如，酶可以约0.001至10U/g组合物，优选地0.01至1U/g，例如0.01至0.1U/g油的范围加入。一单位(U)定义为例如在J.Biol.Chem.(1961)236：2544-2547(《生物化学杂志》，1961年，第236卷，第2544-2547页)中所述的检测条件下，在40℃每分钟水解1μmol底物(例如叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素)的酶量。
磷脂含量
在本发明的方法中，酶在存在至少0.1重量％磷脂的情况下与油接触。例如，在酶与油温育期间的至少一部分时间(例如至少在酶加入油的时候)，如按油组合物的总重量计，油的磷脂含量可以为至少0.1重量％。
在一些实施例中，例如酶在脱胶步骤期间加入时，在酶与油温育期间油的磷脂含量可以减少。然而，只要在至少部分与酶温育时间内(例如在温育开始时)油中的磷脂含量在0.1重量％或以上，则该酶就可是很有活性的。因此，在一些实施例中，油的磷脂含量在与酶的部分温育期间可以小于0.1重量％。
磷脂通常作为粗制植物油的天然组分存在，虽然在一些实施例中，磷脂可以加入需要用酶处理的油。通常存在于粗制植物油中的磷脂包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酸(PA)。在优选的实施例中，磷脂包括PC、PI、PE、PS和PA中的一种或多种。磷脂通常以卵磷脂的形式存在于粗制油中，卵磷脂的主要组分为PC。因此在一个实施例中，磷脂包括卵磷脂。如本文所用，术语“卵磷脂”涵盖磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和磷脂酸。
油的磷脂(例如PC、PI、PE、PS、PA和/或卵磷脂)含量在接触酶期间为至少0.1重量％。在特定实施例中，如按油的总重量计，磷脂含量为至少0.2重量％、0.3重量％、0.4重量％、0.5重量％、0.6重量％、0.7重量％、0.8重量％、0.9重量％、1.0重量％、1.1重量％、1.2重量％、1.3重量％、1.4重量％、1.5重量％、1.6重量％、1.7重量％、1.8重量％、1.9重量％、2.0重量％、2.1重量％、2.2重量％、2.3重量％、2.4重量％、2.5重量％、2.6重量％、2.7重量％、2.8重量％、2.9重量％、或至少3.0重量％。优选地，磷脂含量为最多5.0重量％、最多4.0重量％或最多3.0重量％。例如，如按油的总重量计，油的磷脂含量可以为0.1至5.0重量％、0.1至4.0重量％、0.1至3.0重量％、0.3至5.0重量％、0.3至4.0重量％、0.3至3.0重量％、0.5至5.0重量％、0.5至4.0重量％、0.5至3.0重量％、1.0至5.0重量％、1.0至4.0重量％、1.0至3.0重量％、2.0至5.0重量％、2.0至4.0重量％、或2.0至3.0重量％。
植物油的磷脂含量随着油的具体来源和性质以及精制方法的阶段不同而不同。粗制植物油的磷脂含量在加工开始时可以为最多5重量％，但是在水化脱胶步骤后，磷脂含量通常降至1重量％或更低，例如约0.3重量％。在酶法脱胶步骤(例如使用磷脂酶)或全脱胶步骤(例如包括酸处理/碱中和)后，磷脂含量可以降至更低，例如按油的总重量计低于0.1重量％或甚至低于0.01重量％。一些常见油中的典型磷脂含量(重量％)在下面示出：
上表的数值摘自Bailey’s Industrial Oil and Fat Products(2005)，6thedition，Ed.by Fereidoon Shahidi，John Wiley&Sons(《贝雷工业油脂产品》，2005年，第6版，Fereidoon Shahidi编辑，约翰威立父子出版公司)，其他油的磷脂含量在该书中也有所描述，或者已为本领域所熟知。油的磷脂含量可以用标准方法测定。例如，油的磷脂含量可以按照J.Amer.Oil.Chem.Soc.58，561(1981)(《美国油脂化学家协会杂志》，第58卷，第561页，1981年)中所述方法测定。在一个实施例中，磷脂含量可以通过薄层色谱(TLC)分析确定，例如WO 2006/008508或WO03/100044中所述的。油的磷脂含量也可以通过(a)AOCS推荐准则Ca19-86(2009年重新批准)“Phospholipids in Vegetable Oils NephelometricMethod(浊度法确定植物油中的磷脂含量)”或(b)AOCS官方方法Ca20-99(2009年重新批准)“Analysis for Phosphorus in Oil by InductivelyCoupled Plasma Optical Emission Spectroscopy(通过电感耦合等离子体光发射光谱分析油中的磷)”测定。
因此，在一个优选的实施例中，使酶与粗制植物油(例如包含至少0.5重量％、至少1.0重量％或至少2重量％磷脂的油)接触。在另一个实施例中，使酶与水化脱胶植物油(例如包含0.1至1重量％磷脂的油)接触。
溶血磷脂含量
在该方法的一个优选实施例中，当油中溶血磷脂的浓度尽可能低时，使酶与油接触。例如，酶可以在存在少于0.2重量％溶血磷脂的情况下与油接触。所谓“在存在少于0.2重量％溶血磷脂的情况下”是指如按油组合物的总重量计，在酶与油温育期间的至少一部分时间内(例如至少在酶加入油的时候)，油中溶血磷脂的含量少于0.2重量％。油中溶血磷脂的含量可以是小于0.2重量％的任何值，包括零。
在一些实施例中，例如酶在脱胶步骤期间加入时，油的溶血磷脂含量可在酶与油温育期间增加。对于方法包括使用产生溶血磷脂的酶进行酶法脱胶步骤的情况，尤其如此。溶血磷脂通常在油加工期间通过如下方式产生：从磷脂裂解酰基(脂肪酸)链，留下单个酰基链、磷酸基团、任选地连接至甘油基部分的首基和游离醇。用于脱胶的酶，例如磷脂酶(尤其是磷脂酶A1和A2)和酰基转移酶可以在油中产生溶血磷脂。在其中方法包括使用产生溶血磷脂的酶进行酶法脱胶步骤的实施例中，水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶优选地在酶法脱胶步骤之前与油接触。
在一个实施例中，溶血磷脂酶可以在脱胶步骤期间与磷脂酶或酰基转移酶联合使用。溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)是可以水解溶血磷脂释放脂肪酸的酶。溶血磷脂酶的使用可以帮助减少脱胶步骤期间油中溶血磷脂的产生，例如保持油的溶血磷脂含量低于约0.2重量％。合适的溶血磷脂酶在例如Masuda et al.，Eur.J.Biochem.，202，783-787(1991)(Masuda等人，《欧洲生物化学杂志》，第202卷，第783-787页，1991年)、WO 98/31790、WO 01/27251和WO 2008/040465中有所公开。
磷脂酶C是另一个可用于脱胶的酶。磷脂酶C在甘油基和磷酸部分之间断裂磷脂，留下二酰基甘油和磷酸基(连接在首基(如果存在的话)上)。因此，与磷脂酶A1和A2相比，磷脂酶C不产生溶血磷脂。在其中方法包括使用不产生溶血磷脂的酶(例如磷脂酶C)进行酶法脱胶步骤的实施例中，水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶可以在酶法脱胶步骤之前或其期间与油接触。
在特定实施例中，按油的总重量计，油的溶血磷脂含量小于0.2重量％、小于0.15重量％、小于0.1重量％或小于0.05重量％。通常，溶血磷脂的浓度尽可能低是所期望的。
可存在于油中的溶血磷脂包括溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)、溶血磷酸酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰丝氨酸(LPS)和溶血磷脂酸(LPA)。油中LPC和LPE的含量尽可能低是特别优选的。在优选的实施例中，按油的总重量计，LPC和/或LPE的浓度小于0.2重量％、小于0.15重量％、小于0.1重量％或小于0.05重量％。
油的溶血磷脂含量可以使用标准方法，例如以上针对磷脂所述的方法，包括使用HPLC或TLC分析法测定。合适的方法在AOCS推荐准则Ja 7-86(2009年重新批准)“Phospholipids in Lecithin Concentrates byThin-Layer Chromatography(通过薄层色谱法测定卵磷脂浓缩物中的磷脂)”或Journal of Chromatography A，864(1999)179-182(《色谱法杂志A辑》，第864卷，1999年，第179-182页)中有所描述。
酶反应条件
通常，油可以与酶在约5℃至约100℃之间，更优选地在10℃至约90℃之间，更优选地在约15℃至约80℃之间，更优选地在约20℃至约75℃之间温育(或混合)。
脱镁叶绿素在高温下分解为焦脱镁叶绿素，这通常是不太优选的，因为一些叶绿素酶对焦脱镁叶绿素的活性比对脱镁叶绿素的活性低。此外，焦脱镁叶绿素的叶绿素酶降解产物焦脱镁叶绿酸的水溶性比脱镁叶绿酸低，因此之后更难于从油移除。酶反应速率在高温下增加，但有利于使脱镁叶绿素至焦脱镁叶绿素的转化保持为最小。
根据以上描述，在尤其优选的实施例中，油与酶在低于约80℃，优选地低于约70℃，优选地约68℃或更低，优选地约65℃或更低下温育，以减少向焦脱镁叶绿素转化的量。然而，为了保持良好的反应速率，优选的是在与酶温育期间保持油的温度高于50℃。因此，酶与油温育的优选温度范围包括约50℃至低于约70℃，约50℃至约65℃以及约55℃至约65℃。优选地，使酶与油在约57℃至约63℃，优选地约58℃至约62℃，例如约60℃下接触。
优选地，当酶与油混合时，油的温度可以处于所需的反应温度。在酶加入之前和/或期间，油可以加热和/或冷却至所需温度。因此，在一个实施例中，设想根据本发明的方法的其他步骤可以是冷却和/或加热油。
反应时间(即酶与油温育的时间段，优选伴以搅拌)可适当地使叶绿素和叶绿素衍生物的水解持续足够的时间，例如形成叶绿醇和脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿酸。例如，反应时间可以为至少约1分钟，更优选地至少约5分钟，更优选地至少约10分钟。在一些实施例中，反应时间可以在约15分钟至约6小时之间，优选地在约15分钟至约60分钟之间，优选地约30至约120分钟。在一些实施例中，反应时间可以为最多6小时。
优选地，在约pH 4.0和约pH 10.0之间，更优选地在约pH 5.0和约pH 10.0之间，更优选地在约pH 6.0和约pH 10.0之间，更优选地在约pH 5.0和约pH 7.0之间，更优选地在约pH 5.0和约pH 7.0之间，更优选地在约pH 6.5和约pH 7.0之间，例如在约pH 7.0(即中性pH)下实施该方法。在一个实施例中，优选地在约pH 5.5和pH 6.0之间实施该方法。在另一个实施例中，在约pH 6.0至pH 6.8之间，例如在约pH 6.3和pH 6.5之间，优选地约pH 6.4下实施该方法。
当与酶温育(或混合)时，油中的水含量可适当地在约0.5至约5重量％水之间，更优选地在约1至约3重量％之间，并且更优选地在约1.5和约2重量％之间。在具体的实施例中，水含量可以为(例如)0.7重量％至1.2重量％，例如约1重量％；或1.7重量％至2.2重量％，例如约2重量％。
当使用固定化酶时，固定化酶的水活度可适当地在约0.2至约0.98的范围内，优选地在约0.4至约0.9之间，更优选地在约0.6至约0.8之间。
油的分离
在使用根据本发明的酶进行酶处理步骤后，在一个实施例中处理后的液体(例如油)以适当的装置，例如离心分离器分离，从而得到加工油。在完成酶处理后，如有必要，加工油可以另外用水或有机或无机酸，例如乙酸、柠檬酸、磷酸、琥珀酸等等洗涤，或用盐溶液洗涤。
叶绿素和/或叶绿素衍生物移除
涉及酶处理的本发明方法通常会减少油中叶绿素和/或叶绿素衍生物的含量。例如，与处理前油中存在的叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素的浓度(按重量计)相比，该方法可以使叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素的浓度减少至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。在特定实施例中，按油的总重量计，处理后油中叶绿素和/或叶绿素衍生物的浓度可以小于100、小于50、小于30、小于10、小于5、小于1、小于0.5、小于0.1mg/kg、或小于0.02mg/kg。
进一步加工步骤
在典型的植物油加工方法中，把油萃取到己烷中，使粗制植物油脱胶，任选地经碱中和，漂白(使用例如粘土吸附，随后弃去粘土)，并且脱臭从而产生精制、漂白和脱臭的油或RBD油(参见图31)。脱胶步骤需要与否取决于磷含量和其他因素。本发明的方法可与基于己烷萃取和/或酶辅助油萃取的方法结合使用(参见Journal of Americal OilChemists’Society(2006)，83(11)，973-979(《美国油脂化学家协会杂志》，2006年，第83卷第11期，第973-979页))。通常，本发明的方法可以使用Bailey’s Industrial Oil and Fat Products(2005)，6th edition，Ed.byFereidoon Shahidi，John Wiley&Sons(《贝雷工业油脂产品》，2005年，第6版，Fereidoon Shahidi编辑，约翰威立父子出版公司)中所述的油加工步骤进行。
在本发明的实施例中，涉及使用能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶的酶促反应优选地在该方法的特定阶段进行。具体地讲，根据本发明，使酶在存在至少0.1重量％磷脂，以及优选地小于0.2重量％溶血磷脂的情况下与油接触。虽然在方法的不同阶段，油中磷脂和溶血磷脂的含量随着油的性质和来源不同而有所不同，通常优选的是在磷脂含量基本上下降前和溶血磷脂含量上升前的方法阶段使酶与油接触。
适合使用根据本发明方法的酶的优选阶段在图31中示出。在特定实施例中，优选地使酶在脱胶步骤前与油接触。在另一个实施例中，酶可以在水化脱胶步骤期间与油接触。酶通常在脱胶完成前(例如在碱中和步骤前)与油接触。
在一些实施例中，酶可以在水化脱胶后与油接触(例如将酶加入水化脱胶油中)，前提条件是叶绿素和叶绿素衍生物的酶水解在全脱胶步骤之前，例如在加入酸和进行碱中和之前进行。这在图31中以虚线示出。因此，酶可以在油部分脱胶后加入，前提条件是仍然存在至少0.1重量％磷脂。然而，通常优选的是在尽可能高的磷脂含量下(例如优选地至少0.5重量％或1.0重量％磷脂)加入酶，并且在部分脱胶后使用酶通常不是最优选的。
在用酶处理后，进一步加工步骤可帮助移除叶绿素和/或叶绿素衍生物的酶法水解产物。例如，进一步加工步骤可移除脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸、焦脱镁叶绿酸和/或叶绿醇。
脱胶
炼油中的脱胶步骤的作用是通过加入水来分离磷脂。将脱胶沉淀的材料分离，并且进一步加工为卵磷脂的混合物。商业化卵磷脂，例如大豆卵磷脂和向日葵卵磷脂是半固态的或很粘的材料。它们由极性脂质(主要是磷脂例如磷脂酰胆碱)与三甘油酯的微量组分的混合物组成。如本文所用，术语“脱胶”意指通过从油中移除磷脂来精制油。在一些实施例中，脱胶可以包括将磷脂(例如卵磷脂和磷脂)转化为可水化磷脂的步骤。
本发明的方法可使用任何脱胶工序，尤其是在脱胶步骤前叶绿素或叶绿素衍生物水解酶与油接触的实施例。合适的脱胶方法包括水化脱胶、ALCON油脱胶(例如用于大豆)、safinco脱胶、“超级脱胶”、超滤脱胶、TOP脱胶、联合脱胶、干法脱胶和ENZYMAXTM脱胶。参见例如美国专利No.6,355,693、6,162,623、6,103,505、6,001,640、5,558,781、5,264,367、5,558,781、5,288,619、5,264,367、6,001,640、6,376,689、WO 0229022、WO 98118912等等。本发明方法包括的各种脱胶工序在Bockisch，M.(1998)，Fats and Oils Handbook，The extraction of VegetableOils(Chapter 5)，345-445，AOCS Press，Champaign，Illinois(Bockisch，M.，1998年，《油脂手册，植物油的提取》，第5章，第345-445页，伊利诺伊州香槟的AOCS出版社)中有所描述。
水化脱胶通常是指其中油与水(例如1至5重量％)温育以移除磷脂的步骤。通常水化脱胶可以在高温下，例如在50至90℃下进行。可以将油/水混合物搅拌例如5至60分钟，以将磷脂分离到水相中，随后从油中移除水相。
也可以进行酸法脱胶。例如，可以在60至70℃下使油与酸(例如0.1至0.5％的50％柠檬酸或苹果酸溶液)接触，混合，与1至5％的水接触，并且冷却至25至45℃。
可用于本发明方法的其他合适脱胶工序在WO 2006/008508中有所描述。在一个实施例中，方法包括使叶绿素或叶绿素衍生物水解酶与油接触，随后使用酰基转移酶进行酶法脱胶步骤，如WO 2006/008508中所述。适用于本方法的酰基转移酶在WO 2004/064537、WO 2004/064987和WO 2009/024736中也有所描述。可以使用任何具有酰基转移酶活性的酶(通常分类为E.C.2.3.1)，尤其是包含氨基酸序列基序GDSX的酶，其中X为以下氨基酸残基的一个或多个：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。在一个实施例中，酰基转移酶是具有Asn80Asp突变的突变型杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)，例如包含发生翻译后修饰之后的SEQ ID NO：23氨基酸序列的酰基转移酶(参见图32)，或与其具有至少80％序列同一性的酶。
在另一个实施例中，方法包括使用磷脂酶进行的脱胶步骤。可以使用具有例如磷脂酶A1(E.C.3.1.1.32)或磷脂酶A2(E.C.3.1.1.4)活性的任何酶，例如Lecitase
或胰磷脂酶A2(丹麦诺维信(Novozymes，Denmark))。在一个实施例中，该方法包括将叶绿素或叶绿素衍生物水解酶与油接触，随后使用磷脂酶进行酶法脱胶步骤，例如使用US5,264,367、EP 0622446、WO 00/32758或Clausen(2001)“Enzymatic oildegumming by a novel microbial phospholipase，”Eur.J.Lipid Sci.Technol.103：333-340(Clausen，2001年，“通过新型微生物磷脂酶进行酶法油脱胶”，《欧洲脂质科学和技术杂志》，第103卷，第333-340页)中所述的脱胶步骤。
在脱胶步骤与叶绿素或叶绿素衍生物水解步骤同时进行的实施例中，优选地脱胶方法不产生溶血磷脂。例如，在这些实施例中，脱胶步骤可以是水化脱胶步骤。在另一个此类实施例中，可以使用利用酶，例如磷脂酶C(IUB 3.1.4.1)进行的酶法脱胶步骤。可用于脱胶步骤的具有磷脂酶C活性的多肽在例如WO2008143679、WO2007092314、WO2007055735、WO2006009676和WO03089620中有所公开。适用于本发明的合适磷脂酶C为得自马萨诸塞州剑桥维莱尼姆公司(VereniumCorporation，Cambridge，MA)的
酸处理/碱中和
在一些实施例中，在水化脱胶后可以进行酸处理/碱中和步骤以进一步降低油中的磷脂含量。在另一个实施例中，可以进行包含酸处理/碱中和的单一脱胶步骤。此类方法通常称为全脱胶或碱炼。
已经发现，酸处理/碱中和步骤对于移除叶绿素的酶水解产物，例如脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸是特别有效的。因此，该步骤可在酶处理步骤后的任何阶段进行。例如，此步骤可包括加入酸例如磷酸，然后用碱例如氢氧化钠中和。在酸/碱中和处理后，将化合物例如脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸从油中萃取到水相中。
在此类方法中，油通常首先与0.05至0.5重量％的浓磷酸例如在50至90℃的温度下接触，并且混合以帮助沉淀磷脂。接触时间可以是例如10秒至30分钟。随后，例如在50至90℃的温度下加入碱的水溶液(例如1至20％的氢氧化钠水溶液)，然后温育并且混合10秒至30分钟。然后可将油加热至约90℃，并通过离心使含水皂相与油分离。
任选地，也可以使用例如氢氧化钠或水进行进一步洗涤步骤。
移除脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸
本发明的方法可以任选地涉及移除不含叶绿醇的叶绿素衍生物，例如脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸的步骤。由于本发明的酶对叶绿素或叶绿素衍生物的水解，此类产物可以存在于组合物中，或者可以作为污染物，或作为加工产物中的不需要组分天然存在。由于脱镁叶绿酸的分解，焦脱镁叶绿酸也可以存在于组合物中，脱镁叶绿酸本身可以由具有脱镁叶绿素酶活性的酶对脱镁叶绿素的活性来产生，或者脱镁叶绿酸可以在叶绿素酶对叶绿素作用后由脱植基叶绿素形成(参见图1)。用于油精制的加工条件，尤其是加热可以促进主要组分焦脱镁叶绿酸的形成，例如促进脱镁叶绿素转化为焦脱镁叶绿素，焦脱镁叶绿素随后水解为焦脱镁叶绿酸。
在一个实施例中，与酶处理之前和之后的任一含量或二者含量相比，本发明的方法减少了油中脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿酸的含量。在一些实施例中，在酶处理后脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿酸的浓度可以增加。通常，方法涉及移除脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿酸的步骤，使得此类产物的浓度低于酶处理后的浓度。优选地，将通过该酶促步骤产生的脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿酸从油中移除，使得这些产物在油中的最终含量低于酶处理前的含量。
例如，与脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿酸移除步骤前，即酶处理之前或之后，油中存在的脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿酸浓度(按重量计)相比，该方法可减少脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿酸的浓度至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。在特定实施例中，按组合物(例如植物油)的总重量计，移除步骤后油中脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿酸的浓度可以低于100、低于50、低于30、低于10、低于5、低于1、低于0.5、低于0.1mg/kg、或低于0.02mg/kg。
本发明方法的优点是，反应产物例如脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿酸可以通过例如酸处理/碱中和步骤简单、轻松地从油中移除。因此，在优选的实施例中，叶绿素和叶绿素衍生物可以基本上从油中移除，而无需进一步加工步骤，例如粘土和/或二氧化硅处理和脱臭(如图31中所示的虚线框表示的)。
粘土处理
方法不包括粘土处理步骤是特别优选的。避免使用粘土是有利的，原因前已述及，尤其是降低成本，减少因粘土粘附造成的油损失以及增加有效化合物例如类胡萝卜素和生育酚的保留。
在一些实施例中，方法可以在无粘土处理步骤和无脱臭步骤下进行，与涉及粘土处理的方法相比，可使精制油中此类有效化合物浓度的增加。
二氧化硅处理
虽然不一定是必要的，但在一些实施例中，方法可以包括优选地在酶处理之后的二氧化硅处理步骤。例如，方法可以包括使用本领域已知的无吸附剂或含少量吸附剂的二氧化硅精制装置和方法，例如使用TriSyl二氧化硅精制方法(马里兰州哥伦比亚的格雷斯戴维森公司(Grace Davison，Columbia，MD))或SORBSIL RTM二氧化硅(伊利诺伊州乔利埃特的英力士二氧化硅公司(INEOS Silicas，Joliet，IL))。
二氧化硅处理步骤可用于移除油中的任何残余脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和/或焦脱镁叶绿酸或其他极性组分。例如，在一些实施例中，二氧化硅处理步骤可以用作酸处理/碱中和(全脱胶或碱精制)步骤的替代步骤。
在一个实施例中，方法包括两阶段二氧化硅处理，例如包括由移除二氧化硅的分离步骤例如过滤步骤分开的两个二氧化硅处理步骤。二氧化硅处理可以在高温下，例如在高于约30℃，更优选地约50至150℃，约70至110℃，约80至100℃或约85至95℃，最优选地约90℃下进行。
脱臭
在一些实施例中，方法可以包括脱臭步骤，通常作为方法的最终精制步骤。在一个实施例中，脱臭是指油的蒸汽蒸馏，脱臭通常移除挥发性气味和风味化合物、生育酚、甾醇、甾烷醇、类胡萝卜素以及其他营养物质。通常，油在低压(例如0.1至1kPa)下加热至220至260℃以排除气体。将蒸汽(例如1-3重量％)吹入油中例如15至120分钟以移除挥发性化合物。可以收集含水馏出液。
在另一个实施例中，脱臭可以使用惰性气体(例如氮气)代替蒸汽进行。因此，脱臭步骤可以包括气泡精制或惰性气体(例如氮气)鼓泡，例如A.V.Tsiadi et al.in“Nitrogen bubble refining of sunflower oil inshallow pools”，Journal of the American Oil Chemists′Society(2001)，Volume 78(4)，pages 381-385(A.V.Tsiadi等人，“在浅水池中对向日葵油进行氮气气泡精制”，《美国油脂化学家协会杂志》，2001年，第78卷第4期，第381-385页)中所描述。可以收集通过油的气相并且任选地使其冷凝，和/或可将其中的挥发性化合物萃取到水相中。
在一些实施例中，本发明方法进行时无需粘土处理，但包括脱臭步骤。有用的化合物(例如类胡萝卜素、甾醇、甾烷醇和生育酚)可以至少部分地从油中萃取到馏出液(例如含水或含氮馏出液)中，所述馏出液得自脱臭步骤。该馏出液提供了化合物例如类胡萝卜素和生育酚的宝贵来源，而所述化合物在包括粘土处理的方法中可因夹带而至少部分地损耗。
漂白期间的生育酚损耗取决于漂白条件和所使用的粘土类型，但有报道称这种漂白步骤可造成20-40％的生育酚损失(K.Boki，M，Kubo，T.Wada，and T.Tamura，ibid.，69，323(1992)(K.Boki、M，Kubo、T.Wada和T.Tamura，同上，第69卷，第323页，1992年))。有报道称在大豆油加工期间，漂白步骤中损耗13％生育酚(S.Ramamurthi，A.R.McCurdy，and R.T.Tyler，in S.S.Koseoglu，K.C.Rhee，and R.F.Wilson，eds.，Proc.World Conf.Oilseed Edible Oils Process，vol.1，AOCS Press，Champaign，Illinois，1998，pp.130-134(S.Ramamurthi、A.R.McCurdy和R.T.Tyler，S.S.Koseoglu、K.C.Rhee和R.F.Wilson编辑，《世界含油种子与食用油加工会议论文集》，第1卷，伊利诺伊州香槟AOCS出版社，1998年，第130-134页))。
类胡萝卜素可能在粘土处理和非粘土处理油的脱臭步骤中从油中移除。通常，有颜色的类胡萝卜素的移除受到控制，以便产生具有在指定范围的值内的预定颜色的油。可以通过更改脱臭步骤而改变精制油中类胡萝卜素和其他挥发性化合物的含量。例如，希望在油中保持较高浓度类胡萝卜素的实施例中，脱臭步骤可以在较低温度(例如使用200℃或更低的蒸汽)下进行。在此类实施例中，避免粘土处理步骤是特别优选的，由于这将在精制油中产生较高浓度类胡萝卜素。
进一步酶处理
在另一方面，本发明的方法还包括使用脂质酰基转移酶、磷脂酶、蛋白酶、磷酸酶、植酸酶、木聚糖酶、淀粉酶(例如α-淀粉酶)、葡聚糖酶、聚半乳糖醛酸酶、半乳糖脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和其他植物细胞壁降解酶，以及混合酶制品和细胞裂解液。在可供选择的方面，本发明的方法可以结合其他方法，例如酶法处理(如使用糖酶，包括纤维素酶、半纤维素酶和其他降解副活性)或化学方法(如己烷提取大豆油)实施。在一个实施例中，本发明的方法可以结合WO2006031699中定义的方法实施。
现在将结合以下非限制性实例进一步说明本发明。
实例1
来自普通小麦(小麦)的叶绿素酶在枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)
中的克隆和表达
将编码小麦叶绿素酶(chlorophyllase)(SEQ.ID No.2，下文称为小麦叶绿素酶(chlase))的核苷酸序列(SEQ ID No.3)在枯草芽孢杆菌中表达，其并带有枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)信号肽(参见图17)。为了在芽孢杆菌中的最佳表达，从金斯瑞公司(美国新泽西州皮斯卡塔韦的金斯瑞公司，08854(GenScript Corporation，Piscataway，NJ 08854，USA))订购了密码子优化的基因构建体(TRI_CHL)。
构建体TRI_CHL包含20个核苷酸，在小麦叶绿素酶编码区上游具有BssHII限制性位点以允许融合到aprE信号序列，该编码区下游具有PacI限制性位点，用于克隆至芽孢杆菌表达载体pBNppt。
将构建体TRI_CHL用BssHII和PacI消化，并且用T4DNA连接酶连接至BssHII和PacI消化的pBNppt。
将连接混合物转化进大肠杆菌(E.coli)TOP10细胞。通过DNA测序(丹麦里斯考的DNA技术公司(DNA Technology A/S，Risskov，Denmark))确认包含TRI_CHL基因的BssHII和Pac插入片段的序列，把正确质粒克隆之一命名为pBN-TRI_CHL(图18)。将pBN-TRI_CHL转化进枯草芽孢杆菌菌株BG 6002中，该菌株为AK 2200衍生菌株，如WO 2003/099843中所述。
选择一个新霉素抗性(neoR)转化子，并且用于表达小麦叶绿素酶。
实例2
来自莱茵衣藻(绿藻)的叶绿素酶在枯草芽孢杆菌中的克隆和表达
将编码衣藻叶绿素酶(chloryphyllase)(SEQ.ID No.4，下文称为衣藻叶绿素酶(chlamy chlase))的核苷酸序列(SEQ ID No.5)在枯草芽孢杆菌中表达，其并带有枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)信号肽(参见图19和20)。为了在芽孢杆菌中的最佳表达，从金斯瑞公司(美国新泽西州皮斯卡塔韦的金斯瑞公司，08854(GenScript Corporation，Piscataway，NJ08854，USA))订购了密码子优化的基因构建体(CHL_CHL)。
构建体CHL_CHL包含20个核苷酸，在衣藻叶绿素酶编码区上游具有BssHII限制性位点以允许融合到aprE信号序列，该编码区下游具有PacI限制性位点，用于克隆至芽孢杆菌表达载体pBNppt。
将构建体CHL_CHL用BssHII和PacI消化，并且用T4 DNA连接酶连接至BssHII和PacI消化的pBNppt。
将连接混合物转化进大肠杆菌(E.coli)TOP10细胞。通过DNA测序(丹麦里斯考的DNA技术公司(DNA Technology A/S，Risskov，Denmark))确认包含CHL_CHL基因的BssHII和Pac插入片段的序列，把正确质粒克隆之一命名为pBN-CHL_CHL(图20)。将pBN-CHL_CHL转化进枯草芽孢杆菌菌株BG 6002中，该菌株为AK 2200衍生菌株，如WO 2003/099843中所述。
选择一个新霉素抗性(neoR)转化子，并且用于表达衣藻叶绿素酶。
实例3
在植物油中表面活性剂对叶绿素酶活性的影响
通过加入不同的表面活性剂(包括大豆卵磷脂)，在精制油菜籽油中测试具有SEQ ID NO：1序列的拟南芥叶绿素酶的活性。制备包含表1定义的组分的样品1至6：
表1
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||
| 精制油菜籽油 | g | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 大豆卵磷脂 | g | 0.2 | 0.2 | ||||
| 脱水山梨糖醇单油酸酯 | g | 0.2 | 0.2 | ||||
| 脱水山梨糖醇三油酸酯 | g | 0.2 | 0.2 | ||||
| 0.5mg/ml溶于丙酮的叶绿素 | μl | 250 | 250 | 250 | 250 | 250 | 250 |
| 溶于缓冲液*的叶绿素酶* | ml | 0 | 0.25 | 0 | 0.25 | 0 | 0.25 |
| 缓冲液* | ml | 0.3 | 0.05 | 0.3 | 0.05 | 0.3 | 0.05 |
| 水％ | ％ | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 | 3.00 |
*缓冲液：0.24％Triton X100、50mM KCL、100mM磷酸盐，pH＝7.0
将精制油菜籽油和表面活性剂在搅拌下加热至45℃。加入叶绿素、缓冲液和叶绿素酶。将样品在搅拌下温育180分钟，取出1ml样品，并且在3000rcf下离心3分钟。
用荧光光谱法(激发波长410nm，发射波长672nm)测定油相，根据校正曲线对叶绿素的量进行定量(表2)，该校正曲线通过测量加入已知浓度叶绿素的精制油菜籽油而绘制。
表2
| 样品 | ppm叶绿素 |
| 1 | 7.27 |
| 2 | 2.78 |
| 3 | 7.77 |
| 4 | 3.83 |
| 5 | 7.50 |
| 6 | 6.25 |
表2中的结果清晰地表明，不同的表面活性剂对叶绿素酶的活性具有很强的影响。卵磷脂对叶绿素酶活性具有很强的促进作用，因而对油中叶绿素的减少也有很强的促进作用。脱水山梨糖醇单油酸酯对叶绿素酶活性也具有促进作用，但是当脱水山梨糖醇三油酸酯加入油中时，叶绿素酶活性则非常温和。
从图21可以看出，与卵磷脂(样品1)组合时，叶绿素酶效率最高。与此相反，与脱水山梨糖醇三油酸酯(样品6)组合时，叶绿素酶活性低。还观察到，样品2的褐色比其他的样品更深。这可以用这样的事实解释：一些磷脂例如卵磷脂中的磷脂酸与镁高效络合，因此将叶绿素转化为脱镁叶绿素(无镁)。此结果表明，磷脂(例如存在于卵磷脂中的磷脂)促进叶绿素酶对叶绿素和叶绿素衍生物的水解。
实例4
在植物油中精制对叶绿素酶活性的影响
如实例3中所示，表面活性剂影响叶绿素酶对精制油的活性。在油精制方法的不同阶段，表面活性剂(尤其是卵磷脂)的量可以变化，从而影响叶绿素酶活性。
在以下实例中，根据表3中的配方，测试叶绿素酶在精制油以及精制油和粗制大豆油的组合中的活性：
表3
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | ||
| 精制油 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 精制油∶粗制大豆油1∶1 | g | 10 | 10 | 10 | 10 | ||||
| 叶绿素酶(拟南芥) | ml | 0 | 0 | 0.25 | 0.25 | 0 | 0 | 0.25 | 0.25 |
| 叶绿素 | ml | 0.2 | 0 | 0.2 | 0 | 0.2 | 0 | 0.2 | 0 |
| 额外的水 | ml | 0.3 | 0.3 | 0.05 | 0.05 | 0.3 | 0.3 | 0.05 | 0.05 |
| 水％ | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
将油加热至40℃。加入叶绿素、水和酶，将样品高剪切混合20秒，使之均质化，并且在40℃下温育，同时伴以磁力搅拌。90分钟后，将样品加热至97℃并保持10分钟，并且在1780rcf下离心3分钟。
目视评估样品，如图22中所示。据观察，精制油的叶绿素酶处理样品3与未加入叶绿素酶的样品1差别不大。假使酶已经水解了叶绿素的话，则反应产物脱植基叶绿素就理当在下层水相中呈现绿色。
在样品7(经叶绿素酶处理的精制油∶粗制大豆油1∶1混合物)中，可以非常清晰地看到绿色进入水相，并且水相与未加入叶绿素酶的样品5明显不同。
结果显示，叶绿素酶仅在包含粗制大豆油的油样品中具有水解叶绿素的活性。这表明，存在于粗制大豆油中的表面活性剂可促进叶绿素酶反应。粗制大豆油包含2-3％卵磷脂(主要是磷脂)形式的高含量表面活性剂。在精制油中，几乎不存在表面活性剂，因此未观察到叶绿素酶活性。
实例5
卵磷脂和酰基转移酶对油中叶绿素酶活性的影响
实例3和4表明表面活性剂如卵磷脂(其包含磷脂)对于叶绿素酶的活性很重要。卵磷脂以不同含量存在于一些粗制植物油中。它是粗制植物油如大豆油和油菜籽油的天然组分，但是在油精制过程期间，卵磷脂通常通过脱胶方法从油中移除。在脱胶步骤期间，卵磷脂可以通过酶促方法，使用酶例如磷脂酶移除。如果叶绿素酶活性取决于卵磷脂的存在，那么卵磷脂的酶法修饰将影响叶绿素酶活性。因此在存在最小量卵磷脂的情况下使用叶绿素酶，对于叶绿素的有效移除是很重要的。这可以受到如下因素影响：天然存在于特定油中的卵磷脂含量，精制方法期间施用叶绿素酶的时间点以及脱胶步骤的性质。
在以下实例中，粗制油在不存在和存在脂质酰基转移酶(得自丹尼斯克公司(Danisco A/S)的LysoMax
)时进行水化脱胶。LysoMax是具有Asn80Asp突变的杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)，其包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列(参见图32)。在溶血磷脂形成期间，已知该酶对磷脂具有较高活性。分离来自水化脱胶的分离胶相(卵磷脂或LysoMax
修饰卵磷脂)，并且以不同的量添加至精制油中，然后与3％水和叶绿素酶组合以研究卵磷脂量和卵磷脂类型的影响。
使用表4中示出的配方进行水化脱胶：
表4
*脂质酰基转移酶活性可以按照WO 2004/064987中所述方法测定。
将粗制油加热至55℃。加入水和酶，高剪切混合20秒，然后在磁力搅拌下温育。温育30分钟后，将样品加热至97℃并保持10分钟，并且在1780rcf下离心3分钟。分离两个实验的油相和胶相。将胶相在旋转蒸发仪上干燥。
在水化脱胶(WDG)方法中使用根据表5配方的油和干燥胶相测试小麦叶绿素酶(参见实例1)。将油和干燥胶在搅拌下加热至55℃。加入水和叶绿素酶。将样品在65℃下温育4小时。通过加热至97℃并保持10分钟使酶失活，然后在1780rcf下离心3分钟。
表5
分离油相，并且通过具有荧光检测的HPLC进行分析。根据相同量的油计算荧光信号RFU，结果在表6和图23至26中示出。
表6.
| 胶A | 胶B | Rel.RFU | Rel.RFU | Rel.RFU | Rel.RFU | |
| ％ | ％ | 油 | 脱镁叶绿酸 | 焦脱镁叶绿酸 | 脱镁叶绿素A | 焦脱镁叶绿素 |
| 0.2 | 0 | WDG no A | 12.5 | 1.6 | 1.8 | 1.8 |
| 0 | 0.2 | WDG no A | 6.7 | 1.0 | 7.6 | 2.5 |
| 0.5 | 0 | WDG no A | 12.1 | 1.5 | 1.7 | 1.8 |
| 0 | 0.5 | WDG no A | 6.1 | 1.0 | 8.0 | 2.6 |
| 1 | 0 | WDG no A | 11.5 | 1.8 | 1.3 | 1.8 |
| 0 | 1 | WDG no A | 5.5 | 1.0 | 8.5 | 2.7 |
| 2 | 0 | WDG no A | 11.0 | 1.7 | 1.3 | 1.7 |
| 0 | 2 | WDG no A | 3.7 | 1.0 | 10.0 | 2.7 |
| WDG油 | 0 | WDG no A | 11.0 | 1.5 | 2.9 | 2.3 |
| 粗制油 | 0 | 粗制油 | 10.5 | 1.3 | 0.6 | 0.9 |
WDG＝水化脱胶
为了进行比较，分析了未经叶绿素酶处理的粗制油菜籽油，得到以下结果：
表6的结果清晰地表明了卵磷脂和酶修饰卵磷脂对叶绿素酶活性的影响。叶绿素酶在粗制油样品中的活性明显比水化脱胶油(WDG)样品中的强。还观察到，向水化脱胶油中加入卵磷脂增加了叶绿素酶的活性，并且在加入0.2至2％的卵磷脂时存在对额外量的剂量效应。水化脱胶油包含约0.3％卵磷脂，这与叶绿素酶在未加入额外卵磷脂的水化脱胶油中具有一定活性的事实相符。如实例4中所示，叶绿素酶在精制菜籽油中的活性非常低，因此这个结果表明水化脱胶油中剩余的卵磷脂对叶绿素酶活性有明显影响。
向水化脱胶油中加入LysoMax
得自丹尼斯克公司(Danisco A/S)的脂质酰基转移酶)修饰卵磷脂对叶绿素酶活性具有很强的影响。即使低含量的酶修饰卵磷脂(0.2％)也对叶绿素酶的活性具有很强的负面影响，加入2％酶修饰卵磷脂，叶绿素酶活性几乎被完全阻断。
当溶血卵磷脂加入叶绿素酶的含水体系(包含表面活性剂TritonX100)中时，未观察到叶绿素酶活性降低(结果未示出)。该含水体系在物理特性方面与仅包含3％水的油体系明显不同。结果表明，溶血磷脂形成不同的介晶相，因此可防止底物(例如脱镁叶绿素)和酶(叶绿素酶)之间的相互作用。
实例6
水化脱胶油菜籽油过程中叶绿素酶和磷脂酶的作用
实例5中的结果表明，酶修饰卵磷脂对小麦叶绿素酶活性具有很强的影响。因此研究了叶绿素酶在与不同的磷脂酶/酰基转移酶组合时在水化脱胶过程中的功效。
在该实验中，测试了与LysoMax
(得自丹尼斯克公司(DaniscoA/S)的脂质酰基转移酶)、磷脂酶A1(PLA1，Lecitase
和磷脂酶C(PLC，
)组合的来自小麦(参见实例1)和衣藻(参见实例2)的叶绿素酶。
使用表7中所示的配方进行水化脱胶。
表7
将粗制油菜籽油加热至55℃。加入水和酶，将样品高剪切混合20秒，使之均质化，然后用磁力搅拌器搅拌。温育4小时后，将样品加热至97℃并保持10分钟，并且在1780rcf下离心3分钟。
用HPLC分析油相的叶绿素组分，结果在表8和图27中示出。
表8
表8的结果清晰地表明，在磷脂酶或酰基转移酶存在的情况下，叶绿素酶对脱镁叶绿素的活性发生了改变。为了进行比较，在不包含酶的对照样品中，粗制油菜籽油中的脱镁叶绿素A的相对荧光值为11.4RFU。
当叶绿素酶与酰基转移酶或PLA1组合时，与只包含叶绿素酶的对照相比脱镁叶绿素的量要高得多，但是当叶绿素酶与PLC组合时，脱镁叶绿素的含量几乎相当于只用叶绿素酶处理的对照油。实验表明，当与温育期间使磷脂生成溶血磷脂的酶联合使用时，叶绿素酶受到抑制。与此相反，当与使磷脂生成甘油二酯的PLC联合使用时，叶绿素酶保持了大部分初始活性。
实例7
全脱胶过程中的叶绿素酶
实例6显示，叶绿素酶可以在水化脱胶方法的油精制期间使用。根据油的类型和精制方法，可以使用不同类型的脱胶方法。作为水化脱胶方法的替代，植物油可以在全脱胶方法或中和方法中，不经过水化脱胶而进行精制。在以下实例中，叶绿素酶用于全脱胶/中和方法。在该实验中，也使用表9中所示的配方测试了与酰基转移酶组合的叶绿素酶：
表9
将粗制油菜籽油加热至55℃。加入30％磷酸，将样品高剪切混合10秒，使之均质化，然后在55℃下磁力搅拌。10分钟后，加入水、NaOH和酶，并且在55℃下温育，同时伴以磁力搅拌。4小时后，将样品加热至97℃并保持10分钟，并且在1780rcf下离心3分钟。
通过HPLC分析油相，结果在表10中示出：
表10
表10中的结果证实，在全油脱胶方法中叶绿素酶对脱镁叶绿素具有高活性。与酰基转移酶组合时，叶绿素酶活性显著降低。
实例8
使用叶绿素酶的、包括和不包括漂白步骤的油精制工序
在该实例中，将在大肠杆菌中表达的小麦叶绿素酶基因(称为TRI_CHL，参见实例1)用于粗制油菜籽油的油精制。该酶对油中的叶绿素、脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素具有活性。在第一步中，油用TRI_CHL处理，其中叶绿素、脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素分别水解为脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸。TRI_CHL处理后，将油在不使用漂白粘土情况下进一步精制，并将所述油与通过使用漂白粘土的传统油精制方法精制的同种油进行比较。
使用叶绿素酶并且不包括漂白步骤的油精制工序
水化脱胶：将175g粗制油菜籽油在搅拌期间加热至65℃，并用氮气覆盖。加入8.75单位(0,05单位/g)TRI_CHL以及6.125g(3.5％)水。将反应混合物高剪切混合20秒，使之均质化。将样品在65℃下温育同时伴以搅拌，并用氮气覆盖。反应4小时的时间后，将样品在3000rcf下离心5分钟，并且分离水化脱胶油。
全脱胶：通过加热至90℃并保持20分钟来干燥150克水化脱胶油。将油冷却至80℃，并且加入0.33％磷酸(30％水溶液)。将样品高剪切混合10秒，使之均质化，并在冷却至70℃时搅拌10分钟，然后加入1.28％4N NaOH。将样品在覆以氮气的情况下搅拌5分钟。将样品在3000rcf下离心5分钟。
NaOH洗涤：将油分离，并且加热至90℃。加入4％0.1N NaOH，并且搅拌样品5分钟。将油在3000rcf下离心5分钟。
水洗涤：将分离出的油相加热至50℃，用4％的水在搅拌下洗涤5分钟，并且在300rcf下离心5分钟。用4％的水将油相再洗涤一次。通过在真空下加热至100℃并保持20分钟来干燥分离了的油相。
脱臭：将油在240℃和0.5毫巴下通过汽提脱臭1小时。通过玻璃微纤维过滤膜(Whatman GF/C)过滤来精制油。
包括漂白步骤的油精制参考工序：
水化脱胶：将175g粗制油菜籽油在搅拌期间加热至65℃，并用氮气覆盖。加入6.125g(3.5％)水。将反应混合物高剪切混合20秒，使之均质化。将样品在65℃下温育同时伴以搅拌，并用氮气覆盖。反应4小时的时间后，将样品在3000rcf下离心5分钟，并且分离水化脱胶油。
全脱胶：通过加热至90℃并保持20分钟来干燥150克水化脱胶油。将油冷却至80℃，并且加入0.33％磷酸(30％水溶液)。将样品高剪切混合10秒，使之均质化，并在冷却至70℃时搅拌10分钟，然后加入1.28％4N NaOH。将样品在覆以氮气的情况下搅拌5分钟。将样品在3000rcf下离心5分钟。
漂白：将1％漂白粘土(Tonsil Optimum FF210)加入油中，在搅拌下90℃真空加热20分钟。将油冷却至80℃，并且在布氏漏斗上使用滤纸过滤。通过在真空下加热至100℃并保持20分钟来干燥分离了的油相。
脱臭：将油在240℃和0.5毫巴下通过汽提脱臭1小时。通过玻璃微纤维过滤膜(Whatman GF/C)过滤来精制油。
结果
将得自阿胡斯卡尔斯公司(AarhusKarlshamn)的粗制油菜籽油根据上述方法精制，所述精制(1)使用叶绿素酶、不包括漂白步骤的油精制工序或(2)包括漂白步骤的油精制参考工序。
油的颜色根据LoviBond使用Dr.Lange，LICO 200设备测量。结果在表11中示出：
表11
HPLC/MS分析：
通过HPLC/MS分析在油精制中来自不同方法的油样品，并且相对于各组分的标准品进行定量，结果在表12中示出：
表12
表12中的结果在图29和30中以图形示出。
结果显示，在水化脱胶期间油中叶绿素酶对脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素具有活性。在叶绿素酶处理的油中移除了超过95％的脱镁叶绿素和超过70％的焦脱镁叶绿素。这些组分分别水解为叶绿醇和脱镁叶绿酸以及焦脱镁叶绿酸。据观察，水化脱胶方法后这两种组分在叶绿素酶处理油中的量增加。然而，这些组分的大部分在全脱胶方法中通过碱处理被洗掉。随后的NaOH和水洗涤对进一步移除降解产物只有很少的贡献。
材料
在实例3至8中，除非另外指明，通常使用以下材料：
油：得自阿胡斯卡尔斯公司(AarhusKarlshamn)的粗提油菜籽油
酶：
在大肠杆菌中表达并且纯化的小麦叶绿素酶，标记为CoRe-20(参见实例1)；
在芽孢杆菌中表达的衣藻叶绿素酶，标记为CoRe-31(参见实例2)；
脂质酰基转移酶，得自丹尼斯克公司(Danisco A/S)的LysoMax例如包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列
磷脂酶C，得自维莱尼姆公司(Verenium Corporation)的
磷脂酶A1，得自诺维信公司(Novozymes A/S)的Lecitase
乳化剂：
脱水山梨糖醇单油酸酯，得自丹尼斯克公司(Danisco A/S)的SMO
脱水山梨糖醇三油酸酯，得自丹尼斯克公司(Danisco A/S)的STO
HPLC分析
在实例3至7中，叶绿素衍生物通常通过根据以下方法的HPLC分析定量。使用通常根据“Determination of chlorophylls and carotenoids byhigh-performance liquid chromatography during olive lactic fermentation”，Journal of Chromatography，585，1991，259-266(“在橄榄乳酸发酵期间通过高效液相色谱测定叶绿素和类胡萝卜素”，《色谱杂志》，第585卷，1991年，第259-266页)中描述的方法进行HPLC分析。
通过连接到二极管阵列检测器的HPLC对脱镁叶绿素、脱镁叶绿酸、焦脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿酸进行测定。该方法采用的色谱柱填充有C18材料，叶绿素通过梯度洗脱分离。使用得自西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich)的叶绿素A和B标准品对峰进行归属，例如根据图28中示出的代表性HPLC色谱图(摘自Journal of Chromatography，585，1991，259-266(《色谱杂志》，第585卷，1991年，第259-266页))。
实例9
叶绿素酶在水化脱胶方法中的剂量
根据表13中的配方，在粗制油菜籽油的水化脱胶过程中测试不同剂量的小麦叶绿素酶。将油加热至65℃，加入水和酶。将样品用高剪切搅拌器混合20秒，并在磁力搅拌下温育。在1/2、1和2小时后取出样品进行分析，将样品加热至97℃并保持10分钟使酶失活。然后将样品在10000rcf下离心5分钟，通过HPLC/MS分析油中的叶绿素组分。
表13
HPLC结果在表14中示出：
四种叶绿素衍生物(叶绿素a和b以及脱镁叶绿素a和b)中的每一个均以一对差向异构体的方式存在，所述差向异构体由碳原子编号132(根据IUPAC系统编号)周围的H和COOCH3的立体结构决定。这些异构体以a/b和a′/′表示，其中上撇号(′)形式具有S-立体结构，没有上撇号的形式具有R-立体结构。
根据表14的结果，很明显油中的主要组分为脱镁叶绿素。脱镁叶绿素通常是油中的主要绿色成分，因为叶绿素很容易失去镁，转化为脱镁叶绿素。因为脱镁叶绿素是主要成分，所以在酶降解分析中选择重点研究该成分。
随酶剂量和反应时间而变化的叶绿素酶作用在图33中示出。初始(1/2小时)时，即使在低酶剂量下脱镁叶绿素的量也会大大减少，随着时间的推移，酶活性呈现平稳状态，但脱镁叶绿素的量在2小时的反应时间后仍在减少。
表14中的结果证实小麦叶绿素酶具有降解叶绿素、脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素的活性。然而，未加入酶的对照样品的结果揭示叶绿素a和b被热降解，最可能是因为叶绿素失去镁，转化为脱镁叶绿素。
还观察到，在对照样品中焦脱镁叶绿素的量随时间而增加，最可能是因为一些脱镁叶绿素转化为焦脱镁叶绿素。焦脱镁叶绿素的形成不是优选的，因为酶对该组分的活性远低于对脱镁叶绿素的活性。焦脱镁叶绿素水解生成的反应产物为焦脱镁叶绿酸，焦脱镁叶绿酸比脱镁叶绿酸更疏水，因此更难以从油中洗出。
实例10
pH和水浓度对叶绿素酶活性的影响
在该研究中，根据表15中的配方采用不同水剂量和不同pH调节，研究了全脱胶方法中的小麦叶绿素酶(TRI_CHL)。
表15
将油加热至55℃，并且加入柠檬酸。将样品高剪切混合20秒，然后用磁力搅拌器搅拌10分钟。加入NaOH、水和酶，高剪切混合20秒。将样品在磁力搅拌下温育4小时。在1/2、1和2小时后取出样品进行分析，将样品加热至97℃并保持10分钟使酶失活。然后将样品在10000rcf下离心5分钟，通过HPLC/MS分析油相。
pH和水％对叶绿素酶活性的影响在图34中示出。反应混合物中含2％水时，叶绿素酶活性随着pH的增加而增加，直到接近pH7。在含3.5％水时也观察到相同的趋势，但是在含5％水的实验中，酶活性增加直到pH6，但是在6和7之间，活性再次降低。
众所周知，叶绿素和脱镁叶绿素均以两种差向异构形式a和a”(R-异构体和S-异构体)存在，而叶绿素酶仅对a-异构体形式有活性。众所周知，两种形式之间存在平衡，并且重排取决于pH(图35)。
因此，预计酶活性取决于pH，因为高pH将促进a-异构体的形成。根据脱镁叶绿素a和a’差向异构体的HPLC分析，可计算不同pH下a-差向异构体的比率，如图36中所示。图36中的结果证实pH的增加将促进a-差向异构体的形成，这就可以解释高pH下酶活性增加的原因。活性增加的部分原因也可以用其他因素，如不同pH下的酶活性解释。
实例11
反应温度对叶绿素酶活性的影响
上述实验在55℃下进行，因为这是酶(例如LysoMax
的水化脱胶通常使用的温度。然而，已知小麦叶绿素酶(TRI_CHL)对热更稳定，并且在以下实验中，根据表16中的配方研究65、70和75℃下油中酶的活性。
表16
将油加热至设定值65、70或75℃。加入水和酶，并且将样品高剪切混合20秒，在设定温度下温育，同时伴以搅拌。在1/2、1和2小时后取出样品进行分析，将样品加热至97℃并保持10分钟使酶失活。然后将样品在10000rcf下离心5分钟，通过HPLC/MS分析油相。使用ANOVAStatgraphic软件对结果进行统计学评估。
温度对脱镁叶绿素含量的影响在图37中示出。该结果证实75℃下活性会降低，但是65和70℃下的酶活性没有任何明显差别。
结果表明，绿色色素的酶降解不仅限于脱镁叶绿素的降解，而且焦脱镁叶绿素也是重要的组分。一个局限性是，小麦叶绿素酶对焦脱镁叶绿素的活性远低于对脱镁叶绿素的活性，因此需要更多的酶和/或反应时间来水解该组分。另一个方面是脱镁叶绿素可转化为焦脱镁叶绿素，并且可以预计温度对该转化是有影响的。
温度对焦脱镁叶绿素含量的影响在图38中示出。结果清晰地表明，焦脱镁叶绿素的量在高温下温育的样品中较高。当然，这可以解释为酶的活性低，但是据显示酶在70℃下对脱镁叶绿素的活性至少与65℃下的活性相同。因此，结果表明高温下产生了更多的焦脱镁叶绿素。
考虑到部分叶绿素转化为脱镁叶绿素，并且脱镁叶绿素转化为焦脱镁叶绿素，还研究了温度对三种组分总和的影响(图39)。研究结果表明，酶对这三种组分的活性在65和70℃下处于同一水平，但是在75℃下酶活性较低。
实例12
叶绿素酶在油/水中发挥活性期间的混合条件
小麦叶绿素酶(TRI_CHL)在油中对叶绿素的酶促反应在两相油/水反应混合物中进行。因此可以推断，反应将取决于小水滴在水中的分布和粒度。为了对此进行详细研究，设置了具有和不具有高剪切混合的实验。还设置了其中酶和水在加入油之前混合的实验(表17)。在所有实验中，使用3.5％的水。
表17
将油在磁力搅拌下加热至65℃。加入酶和水。根据表17高剪切混合处理样品，并且在磁力搅拌下温育。在1/2、1和2小时的反应时间后取出1ml样品。然后将样品在10000rcf下离心5分钟，通过HPLC/MS分析油相。
脱镁叶绿素含量的结果在图40中以图形示出，该结果显示在用或未用高剪切混合(Ultra Turrax)处理的样品中，脱镁叶绿素含量没有明显差别。这表明磁力搅拌器的不够强的混合已足以得到良好的酶反应。初始高剪切混合可在反应混合物中产生更细微的小水滴，但这并不能改善酶反应
实例13
水化脱胶过程中pH的作用
以上示出的实验(实例10)表明，叶绿素酶的活性以及脱镁叶绿素a’至脱镁叶绿素a的重排取决于pH。在以下实验中，水化脱胶方法在用NaOH或柠檬酸缓冲液调节pH和未调节pH的情况下进行。在一个实验中，还测定了与叶绿素酶组合时的酰基转移酶。将油加热至65℃，加入水、NaOH/缓冲液和酶。
用Ultra Turrax混合样品20秒，并且在65℃下温育，同时伴以磁力搅拌。在1/2、1、2和4小时的反应时间后取出样品。将样品加热至95℃并保持10分钟使酶失活，并且在10000rcf下离心5分钟，通过HPLC/MS分析油相。
表18
在图41中，示出了脱镁叶绿素(a+a’)的量随时间和不同pH条件的变化。据观察，加入NaOH使pH增加至大于7会增加酶对脱镁叶绿素的活性。这可以通过如下事实解释：脱镁叶绿素a’重排为脱镁叶绿素a取决于pH。
在图42中示出了a差向异构体的比率，显然在pH 5.12和5.4下，a-差向异构体的量很低，因为叶绿素酶仅对该差向异构体有活性，并且由于pH低，重排很慢。在pH 7.12和7.48下，a-差向异构体的量在整个方法期间几乎保持在平衡浓度(大约70％)。仅在4小时的反应时间后，a-差向异构体的相对量才变小，可能是因为此时脱镁叶绿素的总量非常低。
虽然酶对脱镁叶绿素具有活性是非常重要的，但是对于绿色色素来说，该方法可移除其他颜色组分(包括焦脱镁叶绿素)也很重要。图43示出了在不同pH下用小麦叶绿素酶处理的样品中焦脱镁叶绿素的量。可以推断，低pH对于焦脱镁叶绿素的移除具有促进作用。这可以解释为高pH下酶对焦脱镁叶绿素的活性低，或高pH催化焦脱镁叶绿素形成。
在图44中，焦脱镁叶绿素的量被从对照样品(其中未添加叶绿素酶)中焦脱镁叶绿素的量扣除。该坐标图表明，酶在不同pH下引起的焦脱镁叶绿素的变化几乎相同。因此可以推断，高pH可促进脱镁叶绿素形成焦脱镁叶绿素，这也解释了图44中的结果。
实例14
在油的水化脱胶过程中pH对叶绿素酶活性的影响。
以上报告的结果表明了pH对于酶活性和脱镁叶绿素a’重排为脱镁叶绿素a的影响。该方法中的高pH似乎也对脱镁叶绿素向焦脱镁叶绿素的转化具有影响。在该研究中，通过缩小适用于用小麦叶绿素酶(TRI_CHL)进行的水化脱胶试验的pH范围来进一步研究pH。该实验根据表19进行。
表19
将油加热至65℃，加入水、NaOH和酶。用Ultra Turrax混合样品20秒，并且在65℃下温育，同时伴以磁力搅拌。在1/2、1、2和4小时的反应时间后取出样品。将样品加热至95℃并保持10分钟使酶失活，并且在10000rcf下离心5分钟，通过HPLC/MS分析油相。
加入NaOH调节pH的效果对酶降解脱镁叶绿素的能力具有影响(参见图45)。在pH 4.5至pH 6下，酶活性似乎处于同一水平。还存在的趋势是，在1/2小时的反应时间后从pH 4.5至pH 6时，酶活性逐渐降低，但延长反应时间，则趋于平稳状态。在pH 6以上，脱镁叶绿素的含量明显下降，表明酶活性增加，反应的最适pH在pH 6.3至6.8之间。
pH对叶绿素酶活性的影响可以用如下事实解释：酶仅对脱镁叶绿素a差向异构体(R-异构体)有活性，对脱镁叶绿素a’差向异构体(S-异构体)没有活性。图46中的坐标图示出了pH对脱镁叶绿素a差向异构体相对量的影响。很显然pH从4.5提高至7将产生大量的a差向异构体，从约20％提高至70％a差向异构体，70％是平衡浓度。差向异构体a比率的变化可以用如下事实解释，低pH(高浓度H+)防碍重排向平衡移动。
小麦叶绿素酶对焦脱镁叶绿素的活性比对脱镁叶绿素的活性要低得多。因此在叶绿素酶与油的反应中，优化方法以产生尽可能少量的焦脱镁叶绿素也是重要的。在图47中示出了焦脱镁叶绿素的量随pH的变化。
结果清晰地显示了焦脱镁叶绿素随反应时间逐渐减少，但是还观察到高pH的样品含有较多的焦脱镁叶绿素。这可以解释为高pH可促进脱镁叶绿素向焦脱镁叶绿素转化。
在叶绿素组分酶促降解最适pH条件的选择中，重要的是，不仅要考虑酶动力学，还要考虑脱镁叶绿素的不同差向异构体以及脱镁叶绿素向焦脱镁叶绿素的转化。在图48中示出了叶绿素酶对脱镁叶绿素+焦脱镁叶绿素的量的影响随pH的变化。
图48中的结果证实pH 6.3至6.8是该方法的最佳范围。但是还观察到，在4小时的反应时间后，pH未对脱镁叶绿素+焦脱镁叶绿素的降解造成很强的影响。
在制备HPLC/MS的分析样品期间，离心样品并且分析油相。从而脱镁叶绿素水解的反应产物分布在油相和水相之间。脱镁叶绿酸在油相中的残余量随pH的变化在图49中示出。图49中的坐标图证实，pH提高时脱镁叶绿酸的量显著降低。这可以用以下事实解释：pH提高可将脱镁叶绿酸转化为其离子盐形式，而该形式更易溶于水。
实例15
在全脱胶方法中pH对叶绿素酶活性的影响
在上述实例中观察到，当使用小麦叶绿素酶(TRI_CHL)时，在水化脱胶方法中调节pH是有益的。在全脱胶方法中，总是在加工过程中加入酸和碱。在以下实验中，通过如下步骤研究全脱胶方法中pH对小麦叶绿素酶活性的影响：首先用柠檬酸处理油，然后根据表20加入不同量的NaOH。
表20
将油加热至65℃，并且加入柠檬酸。用Ultra Turrax混合样品20秒，并且在65℃下温育10分钟，同时伴以磁力搅拌。加入NaOH、水和酶，用Ultra Turrax混合样品20秒，然后在65℃下温育，同时伴以磁力搅拌。在1/2、1和2小时的反应时间后取出样品。将样品加热至95℃并保持10分钟使酶失活，并且在10000rcf下离心5分钟，通过HPLC/MS分析油相。
在该全脱胶实例中，观察到的趋势与水化脱胶方法中的相同。也就是说，当pH从4升高至6.6时，小麦叶绿素酶对脱镁叶绿素的活性更强，pH也关系到脱镁叶绿素的两种差向异构形式的量。以上涉及水化脱胶的实验使用与该全脱胶方法相同的酶剂量和油进行，因此比较了两种方法中2小时反应时间后的脱镁叶绿素降解结果随pH的变化，如图50所示。图50的坐标图表明，pH调节在全脱胶中的影响比水化脱胶中甚至更强。这可以解释为柠檬酸的加入可提高水相的离子强度，并且还影响磷脂的水化。
实例16
水含量和pH对油中叶绿素酶活性的影响
早期研究显示，小麦叶绿素酶(TRI_CHL)在油中需要至少1.5％的水，才能对脱镁叶绿素产生良好的活性。然而，在某些条件下使用更低含量的水是优选的。在以下实验中，水化脱胶方法使用1和2％的水，并且加入不同量的NaOH来进行，如表21所示。
表21
该方法根据实例14中提及的标准条件进行，在2和4小时后取出样品，用HPLC/MS进行分析。
pH和水含量对叶绿素酶处理的油中脱镁叶绿素的量的影响在图51和图52中示出。结果清晰地显示了小麦叶绿素酶在含1％水的方法中对脱镁叶绿素具有活性，与2％的水相比，在1％的水中该活性更佳。脱镁叶绿素在1％水中的活性更高不能解释为向焦脱镁叶绿素的高效转化(图52)，或解释为a’-差向异构体向a-差向异构体的重排(图53)。因此可以推断，在1％水中活性的改善可如此解释：极性脂质在1％水中的物理特性(介晶特性)与在2％的水中不同，从而可改变酶活性或底物可及性。
实例17
为油的叶绿素酶处理优化温度
研究显示，小麦叶绿素酶在高于70℃温度的油中是有活性的。在70℃下，酶具有最大活性，但是在该温度下脱镁叶绿素向焦脱镁叶绿素的转化显著增加。早期研究的结论是，65℃的反应温度优于70℃。在该研究中，通过在60和65℃下执行水化脱胶和酶反应方法进一步研究反应温度，酶剂量和pH调节根据表22a和22b中示出的实验进行变更。
表22a
| 2610-018- | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | |
| 粗制油菜籽no 8 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
| 水 | ml | 0.200 | 0.190 | 0.170 | 0.100 | 0.152 | 0.142 | 0.122 | 0.052 |
| 1N NaOH | 0.050 | 0.050 | 0.050 | 0.050 | |||||
| TRI_CHL CoRe 70_11 | ml | 0.0100 | 0.0300 | 0.0100 | 0.0100 | 0.0300 | 0.0100 | ||
| U/g油 | 0.000 | 0.005 | 0.015 | 0.050 | 0.000 | 0.005 | 0.015 | 0.50 | |
| 水％ | 2.000 | 2.000 | 2.000 | 2.000 | 2.000 | 2.000 | 2.000 | 2.000 | |
| 温度 | ℃ | 65 | 65 | 65 | 65 | 65 | 65 | 65 | 65 |
表22b
| 2610-018- | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | |
| 粗制油菜籽no 8 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
| 水 | ml | 0.200 | 0.190 | 0.170 | 0.100 | 0.152 | 0.142 | 0.122 | 0.052 |
| 1N NaOH | 0.050 | 0.050 | 0.050 | 0.050 | |||||
| TRI_CHL CoRe 70_11 | ml | 0.0100 | 0.0300 | 0.0100 | 0.0100 | 0.0300 | 0.0100 | ||
| U/g油 | 0.000 | 0.005 | 0.015 | 0.050 | 0.000 | 0.005 | 0.015 | 0.50 | |
| 水％ | 2.000 | 2.000 | 2.000 | 2.000 | 2.000 | 2.000 | 2.000 | 2.000 | |
| 温度 | ℃ | 60 | 60 | 60 | 60 | 60 | 60 | 60 | 60 |
将油加热至65℃/60℃。加入NaOH、水和酶，用Ultra Turrax混合样品20秒，然后在磁力搅拌下温育。在2和4小时的反应时间后取出样品。将样品加热至95℃并保持10分钟使酶失活，并且在10000rcf下离心5分钟，通过HPLC/MS分析油相。结果在图54至56中以图形示出。
图54中的结果证实，叶绿素酶的活性与酶剂量相关，但即使0.005U/g酶的剂量也对脱镁叶绿素具有显著作用。还观察到60℃下的活性至少与65℃下的活性相同。方法中的pH调节似乎也对酶活性具有积极效果，最可能的解释是pH升高时差向异构体重排的变化(图56)。
还存在一些迹象显示焦脱镁叶绿素在60℃下的含量较低(图55)。这些结果共同表明，在水化脱胶方法中使用时，60℃是小麦叶绿素酶的优选反应温度。
结论
小麦叶绿素酶显示出对油体系中的三种主要叶绿素组分(叶绿素、脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素)具有活性。酶活性取决于多个方法参数，包括温度、pH、混合、水％和反应时间。
实验显示，pH 6.3至6.5是小麦叶绿素酶活性的最佳范围，因为酶仅对脱镁叶绿素a差向异构体有活性。在pH 6.3-6.5下，方法中可发生差向异构体a’向差向异构体a的重排。在更高pH下，观察到甚至更强的脱镁叶绿素a’向a的重排，但还观察到在pH高于6.5时，从脱镁叶绿素生成了更多的焦脱镁叶绿素。这不是优选的，因为小麦叶绿素酶对焦脱镁叶绿素的活性较低。
还发现，脱镁叶绿素向焦脱镁叶绿素的转化取决于温度。在70℃及以上的温度下，从脱镁叶绿素生成了明显更多的焦脱镁叶绿素，但这不是优选的。实验显示，小麦叶绿素酶的最适温度为60℃，该温度是酶的动力学与脱镁叶绿素向焦脱镁叶绿素转化之间最好的折衷温度。
在正常水化脱胶方法中，通常使用2％的水，并且实验显示小麦叶绿素酶在2％水中的活性非常强。已发现，酶在1％水中的活性甚至更强。在某些情况下，如果该方法产生的胶相粘度不至于高得无法恰当操作和抽吸的话，这种较低的水浓度可能是有利的。
上面说明书中提及的所有出版物以引用的方式并入本文。对本领域的技术人员将显而易见的是，可在不背离本发明的范围和精神的条件下对所描述的本发明方法和系统作出多种修改和变型。尽管本发明已结合特定的优选实施方案进行了说明，但应该理解受权利要求书保护的本发明不应该不当地受限于这些特定的实施方案。实际上，对生物化学和生物技术或相关领域的技术人员明显的用于执行本发明的所述模式的多种修改旨在处于如下权利要求书的范围内。
Claims (22)
1.精制植物油的方法，所述方法包括使所述油接触酶的步骤，所述酶能够水解叶绿素或叶绿素衍生物，其中所述酶在存在至少0.1重量％磷脂的情况下与所述油接触。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶在存在少于0.2重量％溶血磷脂的情况下与所述油接触。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述酶在所述油脱胶步骤之前或期间与所述油接触。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包括(a)使所述酶与所述油接触，然后，(b)使用磷脂酶或酰基转移酶使所述油脱胶。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包括使所述油与所述酶和磷脂酶C在单个步骤中接触。
6.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述酶在存在至少1重量％磷脂的情况下与所述油接触。
7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述酶在低于70℃的温度下与所述油接触。
8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述酶在存在1至5重量％水的情况下与所述油接触。
9.根据权利要求3至8中任一项所述的方法，其中所述脱胶步骤包括水化脱胶。
10.根据权利要求3至9中任一项所述的方法，其中所述脱胶步骤包括向所述油中加入酸，然后用碱中和。
11.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述方法不包括粘土处理的步骤。
12.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述方法还包括进行脱臭步骤以产生脱臭油和馏出液。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述方法与包括粘土处理步骤的方法相比在所述精制油和/或馏出液中产生的类胡萝卜素和/或生育酚水平提高。
14.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述酶包括叶绿素酶、脱镁叶绿素酶、焦脱镁叶绿素酶或脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶。
15.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述酶包含SEQ IDNO：1、2、4、6或8至15中的任一个中所定义的多肽序列，或其功能片段或变体。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述酶包含与SEQ ID NO：1、2、4、6或8至15中的任一个在至少50个氨基酸残基上具有至少75％序列同一性的多肽序列。
17.可通过前述任一项权利要求所定义的方法获得的精制植物油。
18.可通过权利要求12或权利要求13所定义的方法获得的馏出液。
19.权利要求11至16中的任一项所定义的方法用于提高通过油的脱臭获得的精制油和/或馏出液中的类胡萝卜素和/或生育酚水平的用途。
20.根据权利要求7所述的方法，其中所述酶在58℃至62℃的温度下与所述油接触。
21.根据权利要求8所述的方法，其中所述酶在存在约1重量％水的情况下与所述油接触。
22.根据权利要求1至16或20中任一项所述的方法，其中所述酶在pH 6.3至6.5下与所述油接触。
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