CN102824352A - 一种双糖化合物在制备抗肿瘤药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了式1所示的双糖化合物在制备抗肿瘤的药物中的用途。本发明式1化合物结构与蔗糖相似，为简单双糖类化合物，但该化合物进入体内后，发挥出了较强的生物活性，能够有效抑制肿瘤生长，具有显著的抗肿瘤效果；该化合物不仅能够增强正常机体免疫力，还可以提高患癌机体的免疫力，可在进行化疗的同时，改善化疗患者的免疫功能，从而提高癌症患者的生活质量。式1

Description

一种双糖化合物在制备抗肿瘤药物中的用途

本申请是申请号：201110306878.4的专利申请的分案申请。原申请的申请号：201110306878.4，申请日：2011年10月11日，发明名称：一种双糖化合物的新用途。

技术领域

本发明涉及一种双糖化合物在制备抗肿瘤药物中的新用途。

背景技术

双糖，是由二分子单糖通过糖苷键形成，水解之后可形成两个单糖分子。天然存在的游离态和具有机能的糖类以哺乳类的乳糖、细菌和昆虫血液等的海藻糖、植物蔗糖为代表，他们作为各种生物体的能量来源，或作为生物体组成的物质原料。

常见的双糖有乳糖、麦芽糖、蔗糖，其中，蔗糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖形成，进入人体后，被分解为葡萄糖和果糖，从而为人体提供能量。

目前还发现另一个与蔗糖结构类似的双糖化合物，也是由一分子果糖、一分子葡萄糖缩合而成，即，β-吡喃果糖-（1→4）-β-吡喃葡萄糖（Fructopyrano-(1→4)-glucopyranose），其结构式如下：

式1。

它与蔗糖为同分异构体，区别点在于（1）糖苷键的连接位置不同；（2）果糖的存在形式不同，式1化合物为吡喃糖。

该化合物最先在狭叶红景天中发现，目前，仅有文献报道了该化合物的提取方法[Helmut Wiedenfeld,Monika Zych,Waldemar,et al.Newcompounds from Rhodiola kirilowii.Scientia Pharmaceutica.75,29-34(2007)]，还未见该双糖化合物药效作用的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供β-吡喃果糖-（1→4）-β-吡喃葡萄糖（Fructopyrano-(1→4)-glucopyranose）这一双糖化合物的新用途；本发明的另一目的是提供一种抗肿瘤、抗病毒和增强免疫的药物组合物。

本发明提供了式1所示的双糖化合物在制备抗肿瘤、抗病毒或增强免疫的药物中的用途，

式1。

进一步地，所述的药物是治疗肝癌或肉瘤的药物。

进一步地，所述的药物是抗甲型流感病毒的药物。

更进一步地，所述的药物是抗甲型H3N2流感病毒的药物。

进一步地，所述的药物是增强正常机体、患癌机体免疫功能的药物。

本发明还提供了一种抗肿瘤、抗病毒、增强免疫的药物组合物，它是由有效量的式1所示化合物为活性成分，加上药学上常用的辅料制备而成的制剂。

进一步地，所述的制剂为口服制剂。

其中，所述制剂为颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、片剂、口服液。

本发明式1化合物结构与蔗糖相似，为简单双糖类化合物，但该化合物进入体内后，发挥出了较强的生物活性，能够有效抑制肿瘤生长，具有显著的抗肿瘤效果；该化合物不仅能够增强正常机体免疫力，还可以提高患癌机体的免疫力，可在进行化疗的同时，改善化疗患者的免疫功能，从而提高癌症患者的生活质量；该化合物还能够有效抑制甲型H3N2流感病毒生长，具有明显的抗流感病毒作用。

附图说明

图1式1化合物的HPLC分析图谱

图2式1化合物、帕拉米韦抑制NA剂量——抑制率关系曲线

图3式1化合物、帕拉米韦抑制NA对数剂量——抑制率关系曲线

具体实施方式

实施例1 本发明式1化合物的制备方法

板蓝根药材粗粉10kg，50％乙醇浸泡1h，回流提取3次，每次1h。合并提取液，减压回收乙醇至无醇味，50℃真空干燥，粉碎，得粗提物干浸膏粉末1560g，得率为15.6%。取粗提物干浸膏粉末500g用95%乙醇回流提取3次，每次1小时，过滤，合并提取液，减压回收乙醇至无醇味，50℃真空干燥，粉碎，即得板蓝根干浸膏粉末168g，得率为5.2%。

取上述板蓝根干浸膏粉末以硅胶柱干柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇（100:0～1:1）梯度洗脱，根据薄层色谱检查，合并相同的斑点部分。收集二氯甲烷-甲醇1:1流分，减压干燥，即得式1化合物粗品734mg，得率为0.023%。

再取式1化合物粗品300mg上制备液相色谱分离纯化，HPLC制备条件为：Agilent XDB-C18色谱柱(9.4mm×250mm，5μm)；柱温30℃，流动相为甲醇-水（5:95）；体积流量8ml·min^-1。制备柱柱后分流，分流比1:5；蒸发光散射检测器检测，漂移管温度为115℃，雾化气体体积流量为3.0L·min^-1。根据检测器谱图接收目标成分（保留时间在1.5～2.5min），回收溶剂后，干燥，得式1化合物纯品236mg，得率为0.018%。

纯化后得到的得式1化合物为无色透明状粉末。ESI-MS显示m/z341[M-H]^-，相对分子质量为342。¹H-NMR(500MHz,D₂O)：5.45(1H,d,J=3.8Hz,H-1),3.40-4.30(13H,m);¹³C-NMR(100MHz,D₂O):92.5(d,C-1),74.3(d,C-2),72.9(d,C-3),81.7(d,C-4),76.8(d,C-5),60.4(t,C-6),104.0(s,C-1’),72.7(d,C-2’),71.4(d,C-3’),69.5(d,C-4’),62.7(t,C-5’),61.7(t,C-6’)。

NMR(δ=ppm;J[Hz]):C-1:91.91;5,03(1H,d,J=2,5);C-2:74.37;3,0-4,3(1H,m);C-3:73.00;3,0-4,3(1H,m);C-4:82.68;3,0-4,3(1H,m);C-5:77.08;3,0-4,3(1H,m);C-6:60.60;3,0-4,3(2H,m);C-1’:104.16;3,0-4,3(1H,m);C-2’:73.00;3,0-4,3(1H,m);C-3’:71.77;3,0-4,3(1H,m);C-4’:69.93;3,0-4,3(1H,m);C-5’:62.29;3,0-4,3(2H,m);C-6’:62.16;3,0-4,3(2H,m)。

式1化合物也可以参照文献方法制备，如Helmut Wiedenfeld,MonikaZych,Waldemar,et al.New compounds from Rhodiola kirilowii.ScientiaPharmaceutica.75,29-34(2007)。

本发明所用板蓝根为十字花科植物菘蓝lsatis indigotica Fort的干燥根。

对制备得到的式1化合物进行HPLC分析，表明其为单一色谱峰，峰纯度为99.2%（见图1）。HPLC分析条件如下：Agilent XDB-C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇-水（5:95）；体积流量0.8ml·min^-1；蒸发光散射检测器检测，蒸发温度115℃；雾化气体体积流量为3.0L·min^-1。

实施例2 本发明药物组合物的制备

取实施例1制备得到的式1化合物，与适量微晶纤维素混合均匀后，直接装胶囊，即得本发明药物组合物胶囊剂。

实施例3 本发明药物组合物的制备

取实施例1制备得到的式1化合物，与适量蔗糖、淀粉混合均匀后，以80%乙醇为粘合剂，制粒后，即得本发明药物组合物颗粒剂。

以下通过具体试验例证明式1化合物的有益效果。

试验例1 对正常机体的免疫调节实验

1 方法

1.1 动物模型制备

取40只小鼠，随机分成5组，每组10只。分别为正常对照组(生理盐水)、阳性对照组（左旋咪唑25mg·Kg^-1）、溶媒对照组（1%DMSO）和式1化合物（实施例1制备）低、中、高剂量组（50、100、200mg·Kg^-1），连续灌胃10d。

1.2 对小鼠免疫器官的影响

第10天给药后2h，将小鼠处死，称重，取脾脏、胸腺称重，计算脾(胸腺)指数，脾(胸腺)指数=脾(胸腺)重量(mg)／体重(g)。

1.3 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验

试验前一天给小鼠腹腔注射2%糖原水溶液1.0mL，使巨噬细胞从腹膜血管渗到腹腔。第10天给药后2h，每组小鼠均腹腔注射2%鸡红细胞液l ml。轻柔腹部。30min后脱颈椎处死小鼠。死亡后立即剖开腹腔，用滴管吸出腹腔液滴加在载玻片上，每片约0.2ml。将载玻片放入37℃温箱中孵育30min，生理盐水冲去附着的细胞，用瑞氏染液染色，水冲洗晾干。显微镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况，并计算吞噬百分率和吞噬指数。吞噬百分率＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数／巨噬细胞总数×100％；吞噬指数＝巨噬细胞吞噬鸡红细胞的总数／巨噬细胞总数。

1.4 血清溶血素形成的实验

取BALB／C小鼠60只，体重19～21g，雌性，分组和给药方法同2.1，给药3d后腹腔注射5%鸡红细胞0.5mL/只致敏。免疫7d，摘眼球取血并分离血清。按文献^[3]方法取稀释100倍血清l mL加5%鸡红细胞、10％补体0.5mL混匀，置37℃恒温水浴箱温浴30Min，取出放在冰水冷却，离心，取上清液，测A540，以半数溶血值HC₅₀(HC₅₀＝样品A值／半数溶血A值×样品稀释倍数)表示溶血素水平。

1.5 统计学分析

计量资料用以表示，采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析及组间两两比较。

2 结果

2.1 式1化合物对小鼠免疫器官的影响

阳性对照左旋咪唑与式1化合物100、200mg·Kg^-1组均能显著提高小鼠的胸腺指数和脾指数，与正常对照组比较P＜0.05或P＜0.01，结果见表1。

表1 式1化合物对小鼠免疫器官的影响

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

2.2 对小鼠巨噬细胞功能的影响

式1化合物100、200mg·Kg^-1组与阳性对照左旋咪唑均能显著提高小鼠的吞噬百分率及吞噬指数，与生理盐水组比较P＜0.01或P＜0.05，结果见表2。

表2 式1化合物对小鼠巨噬细胞功能的影响

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

2.3 对小鼠血清溶血素形成的影响

结果显示，左旋咪唑与式1化合物50、100、200mg·Kg^-1组均能明显促进小鼠溶血素抗体形成，与生理盐水组比较P＜0.05或P＜0.01，结果见表3。

表3 式1化合物对小鼠血清溶血素形成的影响

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

3、结论

由上述实验可知，式1化合物能够增加小鼠免疫器官重量，提高巨噬细胞吞噬功能及增加B细胞产生抗体的能力，表明，式1化合物对正常机体的能够提高非特异性免疫和体液免疫，具有增强免疫功能的作用。

试验例2 抗肿瘤及对患癌机体的免疫调节实验

1 材料

1.1 药物 式1化合物,无色透明状，纯度高于98%，分子量为342，由实施例1制备得到，临用前用生理盐水稀释；顺铂注射液(DDP)：云南个旧生物药业有限公司生产，批号110801。

1.2 试剂 RPMI1640培养基，购自Gibco公司；胎牛血清，天津灏洋生物制品科技责任有限公司生产；刀豆蛋白(ConA)和二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司产品；SDS和瑞氏染液为上海生工公司生产；小鼠IL-2 ELISA试剂盒、小鼠IL-6ELISA试剂盒、小鼠IL-12 ELISA试剂盒和小鼠TNF-α ELISA试剂盒购自晶美生物工程有限公司；丙酮、甲醇和可溶性淀粉等均为国产分析纯。

1.3 瘤株和动物 小鼠肝癌细胞H22和小鼠肉瘤细胞S180，由四川大学华西医学中心提供。健康昆明种小鼠，雌性，体重20±2g；由泸州医学院实验动物科提供，合格证号：川实动证第07-16号。

2 方法

2.1 对小鼠移植性肿瘤生长的作用

将H22、S180瘤株复苏，每只小鼠腹腔注射0.5ml体内传代，无菌条件下抽取传第三代后接种7天的H22、S180瘤源小鼠的腹水(黄色清亮液体)，离心后弃去上清液，无菌生理盐水调至细胞浓度为1×10⁷·ml^-1，每只小鼠右腋部皮下接种0.2ml。接种次日将荷瘤小鼠随机分为式1化合物低、中、高剂量组（50、100、200mg·Kg^-1）、生理盐水组（NS）、溶媒对照组（1%DMSO）和阳性对照组（DDP：1mg·Kg^-1）。DDP腹腔注射给药，其余均为灌胃给药，每日1次，连续给药10天。每日观察肿瘤生长情况，按荷瘤小鼠造模评价标准判断造模是否成功。末次给药24小时后颈椎脱臼处死小鼠，剥取瘤块、胸腺和脾脏并称重，按下列公式计算抑瘤率、胸腺指数和脾指数。

肿瘤抑制率(%)=[对照组平均瘤重(C)-实验组平均瘤重(T)]/对照组平均瘤重(C)×100%

胸腺(脾)指数=胸腺（脾）重量(mg)/体重(g)×10。

2.2 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

按照2.1制备荷瘤小鼠、分组和给药，末次给药当日每只小鼠腹腔注射2%可溶性淀粉1ml，24h后每只小鼠再腹腔注射5%鸡红细胞悬液1ml，4h后颈椎脱臼处死小鼠，仰位固定于鼠板，腹腔注射生理盐水2ml,轻揉1分钟，吸出腹腔洗液备用。将腹腔洗液0.5ml滴于载玻片上37℃温箱孵育30分钟，晾干，1:1丙酮-甲醇固定5分钟，瑞氏染液染色1分钟，蒸馏水冲洗，晾干，油镜下计数200个巨噬细胞，计算巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数。吞噬百分率=吞噬红细胞的巨噬细胞数/200个巨噬细胞数×100%；吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞数/100个巨噬细胞数。

2.3 对ConA诱导的淋巴细胞转化反应的影响

按照2.1制备荷瘤小鼠、分组和给药。于末次给药24h后颈椎脱臼处死小鼠，泡入70%酒精5分钟，无菌取脾，放入含抗生素生理盐水的培养皿内。浸泡20分钟后将脾脏剪切成2-3mm²的小块，用毛玻片研磨碎，然后用200目不锈钢细胞筛过滤，离心后用含10%小牛血清的RPMI1640培养基将细胞调成浓度为3×10⁶/ml的细胞悬液。将脾细胞悬液分两孔加入96孔培养板，每孔90μl，一孔加入0.1mg·ml^-1 ConA 10μl（终浓度为10μg·ml^-1）为实验组，一孔加入10μl培养液作为对照。培养48h后每孔加入CCK-8继续培养1h，酶标仪450nm波长下检测各孔吸光度A值，按下列公式计算增值指数（SI）。增殖指数(PI)=实验组OD值／对照组OD值×100%；

2.4 Elisa法测定细胞因子

按照2.1制备荷瘤小鼠、分组和给药，连续给药10d，末次给药24h后摘眼球取血，收集血液，放置4小时后离心，取血清放于-20℃备用。临用前平衡至室温，按照Elisa试剂盒说明书步骤进行操作，测定细胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α的水平。

2.5 统计学处理

数据处理结果均以（

）表示，采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析及组间两两比较。

3 结果

3.1 对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用

结果见表4和表5。

表4 式1化合物对S180荷瘤小鼠瘤重的影响(n=10)

注：与生理盐水组比较，a：P＜0.05，b：P＜0.01

表5 式1化合物对H22荷瘤小鼠瘤重的影响(

n=10)

注：与生理盐水组比较，a：P＜0.05，b：P＜0.01

式1化合物100、200mg·Kg^-1组能显著抑制S180和H22肿瘤的生长，提高荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数，与生理盐水组比较，P＜0.01或P＜0.05。式1化合物各剂量组给药后动物体重均有不同程度的增加，与生理盐水组及溶媒对照组比较差异均无显著性。阳性对照DDP（1mg·kg^-1）明显抑制小鼠移植性肿瘤的生长，但动物体重、胸腺和脾指数明显降低。

3.2 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

结果见表6。

表6 式1化合物对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(

n=10)

注：与生理盐水组比较，a：P＜0.05，b：P＜0.01

灌胃给予式1化合物100、200mg·Kg^-110d后，能升高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数及吞噬百分率，与生理盐水及溶媒对照组比较，差异有显著性(P＜0.01)。阳性对照药DDP则明显降低小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数及吞噬率(P＜0.01)。

3.3 对ConA诱导的淋巴细胞转化反应的影响

结果见表7。

表7 式1化合物对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化的影响(

n=9)

注：与生理盐水组比较，a：P＜0.05，b：P＜0.01

灌胃给予式1化合物100、200mg·Kg^-110d后，能促进荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化反应，与生理盐水组比较，P＜0.01。阳性对照药DDP则明显抑制荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化反应（P＜0.01）。

3.4 Elisa法测定细胞因子

结果见表8和表9。

表8 式1化合物对S180荷瘤小鼠血清中细胞因子水平的影响(n=9)

注：与生理盐水组比较，a：P＜0.05，b：P＜0.01

表9 式1化合物对S180荷瘤小鼠血清中细胞因子水平的影响(

n=9)

注：与生理盐水组比较，a：P＜0.05，b：P＜0.01

灌胃给予式1化合物100、200mg·Kg^-110d后，明显升高小鼠血清中IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α的水平，与生理盐水组比较，P＜0.01或P＜0.05。阳性对照药DDP则降低小鼠血清中IL-2和IL-12水平(P＜0.05)，而对IL-6和TNF-α水平无明显影响。

4、结论

体内抑瘤实验结果表明，式1化合物对小鼠S180、H22移植性肿瘤均有抑制作用，给药剂量200mg·Kg^-1时抑瘤率达40%以上，呈现出一定的剂量依赖性。与阳性对照DDP不同，式1化合物各剂量组能提高荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数，给药后动物体重均有不同程度的增加，状态良好，表明在本实验条件下式1化合物对正常机体影响较小，无明显毒副作用。

恶性肿瘤患者随着病程的发展和病情的恶化，往往伴有免疫功能的下降。这种免疫功能的降低在接受放化疗的患者更为明显，常影响疗效，甚至使治疗难以继续。本实验结果显示，式1化合物可促进在有丝分裂原ConA的作用下小鼠脾淋巴细胞的增殖，提高免疫活性细胞对特异性抗原应答的能力；式1化合物能提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬作用，提高非特异性细胞免疫功能；式1化合物能升高细胞因子IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α的水平，从而调节淋巴细胞的生长分化、激活巨噬细胞，在抗肿瘤免疫中起着重要的调节作用。

与目前常用的化疗药物不同的是，式1化合物在抑制肿瘤生长的同时，能提高荷瘤机体的特异性和非特异性免疫功能，防止化疗患者免疫功能降低，从而提高癌症患者的生活质量。

试验例3 抗病毒实验

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及传代

流感病毒（A/PR8/34），军事医科学院微生物传染病研究所，–70℃低温保存。

1.1.2 细胞培养

狗肾细胞（MDCK）由军事医学科学院微生物传染病研究所冻存；用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素和卡那霉素及含L-谷氨酸胺的Eagl，s MEM培养液（pH7.0～7.2），在37℃、5%CO₂的培养箱中培养，每周传代2次。

1.1.3 药物 利巴韦林粉为广东肇星湖生科技股份有限公司，批号：20071015；帕拉米韦由华南农业大学兽医药理实验室合成。

1.1.4 试剂和仪器

胎牛血清、牛血清蛋白，杭州四季青生物公司；四甲基噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、NP-40、MES（2-（N-吗啡啉）乙磺酸）、底物MUNANA，Sigma公司；分析纯CaCl₂、NaOH、乙醇为天津市大茂化学试剂厂；配套荧光测定96孔板，Cosmobrand公司；普通96孔细胞培养板，Biofil公司。主要仪器包括荧光酶标仪（ELX800-UV），酶标检测仪（ELX800-UV），美国Biotex公司。

1.2 方法

1.2.1 药物细胞毒性试验（MTT法）按下述文献中描述的方法测定。

Ehrhardt C,Hrincius E R,Korte V,et al.A polyphenol,rich plantextrant,CYSTUS052,exerts anti influenza virus activity in cellculture without toxic side effects or the tendency to induce viralresistance[J].Antiviral Res,2007,76(1):38-47.

1.2.2 抗流感病毒药效 以空斑减少检测方法（Plaque Reduction Assay）用预防、治疗和直接作用三种试验，确认式1化合物对流感病毒的抑制作用。

①预防模式：MDCK细胞在96孔板长成单层后弃去旧液，加入不同浓度的药物，同时以利巴韦林为阳性对照药，于37℃培养2h后弃掉药液，用PBS洗2遍后加入100TCID₅₀流感病毒，并设病毒对照组和空白对照组，置于体积分数为5%的CO₂、37℃培养2h后弃掉病毒液，加入细胞维持液，37℃培养72h。

②治疗模式：MDCK细胞长成单层后弃去培养板旧液，接入100TCID₅₀流感病毒，置于体积分数为5%的CO₂、37℃培养箱感染2h后弃掉病毒液，用PBS洗2遍，加入稀释好的不同浓度的药物，同时以利巴韦林为阳性对照药，并设病毒对照组和空白对照组，于体积分数为5%的CO₂、37℃培养2h，弃掉药液，加入细胞维持液，于体积分数为5%的CO₂、37℃培养72h。

③直接作用模式：将各种不同浓度药物和100TCID₅₀流感病毒等量混合后马上加入到细胞，同时以利巴韦林为阳性对照药，并设病毒对照组和空白对照组，体积分数为5%的CO₂、37℃培养2h后弃掉液体，用PBS洗2遍，加入细胞维持液，体积分数为5%的CO₂、37℃培养72h。

72h后，弃去细胞表面的琼脂，然后以福尔马林缓冲结晶紫溶液（0.1%）固定和染色并计算空斑形成单位（PFU/ml），用Reed-Muench法计算半数抑制浓度（IC₅₀），药效以选择指数SI表示，SI=TC₅₀／IC₅₀。

1.2.3 流感病毒神经氨酸酶的制备

神经氨酸酶(NA)原液的制备：在长满MDCK细胞的培养瓶中加入含一定量流感病毒的培养上清液(含血清白蛋白1.2mg/ml，胰酶5μg/ml，无牛血清，其余同细胞培养液)待细胞完全病变后取上清液1000r/min离心10min，以除去细胞碎片，取上清液加入NP-40(终浓度为0.1%)灭活，0.22μm滤器滤过后分装，作为NA的原酶液，置﹣70℃冻存备用。

1.2.4 式1化合物对NA的抑制作用

采用了底物荧光检测法(FL-MU-NANA method)进行试验设计与检测。具体酶促反应与检测的过程如下：在96孔荧光酶标板每孔中加入10μl的NA，再加入20μl的不同浓度药物混匀，作用1h后加入MUNANA 40μl(20μmol/L)，加入30μlMES(33mmol/L)缓冲液，使每孔总体积为100μl，放入37℃恒温箱孵育30min后加入终止液(0.1mmol/L甘氨酸，以25%乙醇配制，1%NaOH调pH10.7)200μl终止反应。此外，设空白对照(MES)，以帕拉米韦为阳性药物对照，酶活性对照(NA+MUNANA，反应终止后再加入同样体积样品溶液)，背景对照(药物+MUNANA，缓冲液补足至相同体积)。用荧光酶标仪检测NA的活性，设定参数：EX=355nm，EM=460nm，required值为20%，gain值为20。根据荧光值的大小，计算各样品的抑制率

并按Bliss法计算式1化合物对NA的半数抑制浓度(IC₅₀)。

1.2.5 血凝抑制实验

加入pH9.0硼酸盐缓冲液于清洁干燥96孔V型微量板中，每孔25μl；再加入25μl 1:10血清于清洁干燥96孔V型微量板第一孔，依次2倍倍比稀释，充分混匀，最后一孔弃掉25μl。再于每孔中加入4单位血凝素25μl，充分混匀，加盖置室温1h；最后取抗凝豚鼠血后，用0.9%生理盐水洗涤3次，用无菌生理盐水配制成0.75%红细胞悬液。于96孔板中加入系列稀释的样品50μl，并设置药物对照组及生理盐水对照，置4℃，45min后，加入50μl/孔的0.75%豚鼠红细胞悬液，摇匀后，4℃放置30～60min，观察结果。

2 结果

2.1 药物细胞毒性

以MTT法测得板蓝根中式1化合物的半数有毒浓度（TC₅₀）为24.8mg/ml。

2.2 式1化合物抗流感病毒药效

结果见表10。

表10 板蓝根中式1化合物体外抑制流感病毒作用

本实验以空斑减少法用预防、治疗和直接作用三种试验，确认式1化合物对流感病毒的抑制作用，同时以利巴韦林为对照药物，结果显示（见表10），在预防、治疗和直接作用三种模式中，式1化合物对流感病毒均有一定程度的抑制作用，且直接作用模式（IC₅₀=9.2）最优，预防模式（IC₅₀=6.4）效果优于治疗模式（IC₅₀=5.6）；对照药物利巴韦林在治疗模式下对流感病毒有较好抑制作用（IC₅₀＝0.045），而在预防和直接作用模式下，利巴韦林对流感病毒均无抑制作用。

2.3 式1化合物抑制NA的结果

经测定式1化合物与阳性对照药帕拉米韦均表现出抑制NA的活性，量效曲线经统计学转换，其反应率与对数剂量之间呈良好的对称“S”形曲线（图2—图3），表明式1化合物与帕拉米韦体外抑制NA的作用趋势和规律相同。

经正规Bliss法计算式1化合物的半数抑制浓度(IC₅₀)为0.071mmol/ml，阳性对照药物帕拉米韦的IC₅₀为0.003nmol/ml(结果见表11)。

表11 式1化合物对甲型流感病毒NA活性的抑制作用

2.4 血凝抑制实验结果

式1化合物在体外细胞实验有效浓度下显示对流感病毒的血凝素有明显直接抑制作用（最低抑制浓度为4.25mg/ml）。药物对照，确认药物本身并没有对红血球有凝集作用；生理盐水对照，确认实验所用的流感病毒本身具有凝集红血球的能力。

3 结论

空斑减少实验结果显示，在预防、治疗和直接作用三种模式中，式1化合物对流感病毒均有一定程度的抑制作用，且直接作用模式（IC₅₀=9.2）最优，预防模式（IC₅₀=6.4）效果优于治疗模式（IC₅₀=5.6）；对照药物利巴韦林在治疗模式下对流感病毒有较好抑制作用（IC₅₀=0.045），而在预防和直接作用模式下，利巴韦林对流感病毒均无抑制作用。同时采用荧光酶标法检测式1化合物对流感病毒神经氨酸酶的抑制作用，IC₅₀为0.071mmol/ml。

流感病毒神经氨酸酶（NA）是影响流感病毒复制、感染和致病的关键酶，因此具有抑制NA活性的成分可以有效地控制流感症状和疾病的传播。目前底物荧光检测法(FL-MU-NANA method)是流感病毒神经氨酸酶(NA)活性体外检测方法之一，该检测法已发展为抗流感病毒药物(包括植物药)的筛选和活性评价的重要方法。本文采用底物荧光法成功检测了式1化合物体外抑制NA的生物活性，表明该成分具有抗流感病毒活性。

流感病毒的血凝素（HA）作为一种重要吸附宿主细胞受体的关键蛋白，与动物红细胞可产生红细胞凝集现象，若将药物与流感病毒（血凝素）预先作用后再加入红细胞，可观察是否产生凝集以判定其作用靶点。实验进一步发现式1化合物对甲型流感病毒的血凝素，具有明显的直接抑制作用。

综上所述，本发明式1化合物结构与蔗糖相似，为简单双糖类化合物，但该化合物进入体内后，发挥出了较强的生物活性，能够有效抑制肿瘤生长，具有显著的抗肿瘤效果；该化合物不仅能够增强正常机体免疫力，还可以提高患癌机体的免疫力，可在进行化疗的同时，改善化疗患者的免疫功能，从而提高癌症患者的生活质量；该化合物还能够有效抑制甲型H3N2流感病毒生长，具有明显的抗流感病毒作用。

Claims (6)

1.式1所示化合物在制备抗肿瘤的药物中的用途，

式1。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物是治疗肝癌或肉瘤的药物。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物是增强患癌机体免疫功能的药物。

4.一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于：它是由有效量的式1所示化合物为活性成分，加上药学上常用的辅料制备而成的制剂。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于：所述的制剂为口服制剂。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：所述制剂为颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、片剂、口服液。

Images