CN102816824A - 硝普钠在灵芝深层发酵灵芝酸中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开硝普钠在灵芝深层发酵灵芝酸中的应用，旨在提高深层发酵灵芝酸产量，硝普钠作为诱导剂在灵芝深层发酵液培养3～5天时加入以诱导灵芝深层发酵灵芝酸，本发明采用一氧化氮供体硝普钠晶体溶于水配制成硝普钠水溶液作为灵芝深层发酵灵芝酸的诱导剂，硝普钠通过在细胞中缓慢释放出一氧化氮，行使其促进次生代谢物灵芝酸合成的功能，实验研究结果表明，采用本发明在灵芝发酵液中加入适量的硝普钠可有效提高灵芝酸产量30～95%。

Description

硝普钠在灵芝深层发酵灵芝酸中的应用
技术领域
本发明涉及灵芝深层发酵技术，特别是硝普钠（SNP）在灵芝深层发酵次生代谢产物灵芝酸中的应用，提高深层发酵灵芝酸的产量。
背景技术
灵芝[Ganoderma lucidum (Fr.) Krast (Polyporaceae)]隶属于非褶菌目(无褶菌目，Aphyllophorales)灵芝科（Ganodermataceae）灵芝属(Ganoderma)，素有“仙草”、“灵丹妙药”之称，是一种食药兼用真菌，在中国、日本、韩国和台湾地区有着悠久的应用历史。现代生物学已证明灵芝子实体和菌丝体中含有多糖类、核苷类、氨基酸蛋白质类、三萜类、呋喃类、生物碱类、油脂类、甾醇类、有机锗、无机离子等活性物质，其中灵芝酸是存在于灵芝子实体、菌丝体、孢子粉的主要活性成分，具有抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、抗艾滋病病毒、防止动脉硬化和血栓形成、改善高血脂、提高人体免疫力、镇痛等广泛的药理作用，具有很高的药用价值。因此, 如何利用现代生物学技术提高灵芝多糖和灵芝酸产量一直是微生物学、园艺学和发酵工业的重要研究领域, 对医药业与农业的发展具有不可估量的价值。
目前，灵芝酸主要从灵芝子实体中提取。人工栽培灵芝子实体生产周期长，且生长条件和产品质量不易控制。采用深层发酵培养的方法来获得灵芝酸，具有生产周期大大地缩短、质量易控制、主要组分和野生灵芝基本一致，且发酵菌丝体中的多糖含量也高于子实体等特点。可见，深层发酵是获取灵芝酸的一种有效途径。然而，产量偏低的问题仍是限制灵芝深层液体发酵规模化生产的一个瓶颈。大量的研究表明，在培养基中添加一定浓度的真菌激发子、钙离子、铜离子、过氧化氢和茉莉酸等信号分子和植物激素均可一定程度提高灵芝酸含量。然而，动物和植物信号分子一氧化氮（NO）在食药用真菌内的生理生化功能目前国内外尚未展开。
发明内容
本发明的目的在于提供硝普钠在灵芝深层发酵次生代谢产物灵芝酸中的应用，硝普钠作为诱导剂诱导灵芝深层发酵灵芝酸，以提高灵芝酸的产量。
根据灵芝菌种的发酵特点和生理代谢特性经过广泛筛选和系统的条件试验，发现采用一氧化氮(NO)供体硝普钠(SNP)配制一定浓度的水溶液经过滤除菌后，在灵芝细胞生长的一定阶段加至深层发酵液，可以提高灵芝酸的产量。
硝普钠在灵芝深层发酵灵芝酸中的应用，其特征在于：硝普钠作为诱导剂诱导灵芝深层发酵灵芝酸，提高灵芝酸的产量。
硝普钠作为诱导剂诱导灵芝深层发酵灵芝酸的具体做法是，在灵芝深层发酵液培养3～5天时，向发酵液中加入浓度为50mmol/L的硝普钠水溶液，硝普钠水溶液与发酵液的体积比为0.2～1%，继续培养4～8天后，收获含灵芝酸的发酵产物。
本发明优选技术方案是，发酵液中加入占发酵液体积0.4%的浓度为50mmol/L硝普钠水溶液。
本发明的原理是一氧化氮诱导深层发酵培养的灵芝细胞氧化迸发，促进过氧化氢等活性氧的产生，进而诱导灵芝合成次生代谢物相关基因的表达。
本发明采用一氧化氮（NO）供体硝普钠晶体溶于水配制成硝普钠水溶液作为灵芝深层发酵次生代谢产物的的诱导剂，硝普钠通过在细胞中缓慢释放出NO，行使其促进次生代谢物合成的功能，研究结果表明，采用本发明在灵芝发酵液中加入适量的硝普钠可有效提高灵芝酸产量30～95%。
具体实施方式
硝普钠（SNP）在提高深层发酵灵芝酸产量中的应用，具体方法如下：
 1) 配制浓度为50mmol/L的硝普钠（Na2[Fe(CN)5NO]）水溶液；
2)取冰箱保存的灵芝[Ganoderma lucidum (Fr.) Krast (Polyporaceae)]母种菌丝体接入新鲜的马铃薯综合固体培养基斜面上，置于28℃培养箱中培养7天，将菌丝接入马铃薯综合液体培养基，于恒温摇床25～30℃，100～160rpm条件下培养2～5天，用分散器将菌丝球打碎即为灵芝种子液。
实施例一： 取灵芝种子液按5%接种量分别接入四个盛有95mL液体培养基(内含葡萄糖2.0克、蛋白胨1.0克、磷酸二氢钾0.1克、硫酸镁0.1克)的三角烧瓶中，于恒温摇床28℃、140rpm培养3天时，分别加入0、0.2、0.4、1.0mL浓度为50mmol/L的硝普钠水溶液，继续培养6天后，收获含灵芝酸的发酵产物（发酵液）。发酵液5000rpm离心10min，沉淀在-45℃真空冷冻干燥36h得灵芝菌丝体。四瓶中的灵芝菌丝体各称取0.100g，溶解于10mL无水乙醇中，超声波提取3次，每次1h，10000rpm离心10min，上清液于60℃下水浴蒸干；残余物用6mL蒸馏水浸提，再用8mL氯仿萃取，氯仿中的灵芝酸用4mL的5% NaHCO3萃取两次，每次4mL，合并萃取液；再用8mL酸化氯仿（pH 3.0～2.0）振摇萃取；在50℃蒸发氯仿，最后用 0.6mL 无水乙醇振摇溶解灵芝酸。灵芝酸经756MC紫外可见分光光度计在于245纳米吸收峰确定，分别得2.11毫克、2.74毫克、4.20毫克、2.87毫克灵芝酸。
实施例二： 取灵芝种子液按5%接种量分别接入四个盛有95mL液体培养基(内含葡萄糖2.0克、蛋白胨1.0克、磷酸二氢钾0.1克、硫酸镁0.1克)的三角烧瓶中，于恒温摇床28℃、140rpm培养5天时，分别加入0、0.2、0.4、1.0mL浓度为50mmol/L的硝普钠水溶液，继续培养4天后，收获含灵芝酸的发酵产物（发酵液）。发酵液5000rpm离心10min，沉淀在-45℃真空冷冻干燥36h得灵芝菌丝体。四瓶中的灵芝菌丝体各称取0.100g，溶解于10mL无水乙醇中，超声波提取3次，每次1h，10000rpm离心10min，上清液于60℃下水浴蒸干；残余物用6mL蒸馏水浸提，再用8mL氯仿萃取，氯仿中的灵芝酸用4mL的5% NaHCO3萃取两次，每次4mL，合并萃取液；再用8mL酸化氯仿（pH 3.0～2.0）振摇萃取；在50℃蒸发氯仿，最后用 0.6mL 无水乙醇振摇溶解灵芝酸。灵芝酸经756MC紫外可见分光光度计在于245纳米吸收峰确定，分别得2.35毫克、2.96毫克、4.38毫克、3.24毫克灵芝酸。
实施例三： 取灵芝种子液按5%接种量分别接入四个盛有95mL液体培养基(内含葡萄糖2.0克、蛋白胨1.0克、磷酸二氢钾0.1克、硫酸镁0.1克)的三角烧瓶中，于恒温摇床28℃、140rpm培养4天时，分别加入0、0.2、0.4、1.0mL浓度为50mmol/L的硝普钠水溶液，继续培养6天后，收获含灵芝酸的发酵产物（发酵液）。分别对四瓶中的发酵液进行5000rpm离心10min，沉淀在-45℃真空冷冻干燥36h得灵芝菌丝体。四瓶中的灵芝菌丝体各称取0.100g，溶解于10mL无水乙醇中，超声波提取3次，每次1h，10000rpm离心10min，上清液于60℃下水浴蒸干；残余物用6mL蒸馏水浸提，再用8mL氯仿萃取，氯仿中的灵芝酸用4mL的5% NaHCO3萃取两次，每次4mL，合并萃取液；再用8mL酸化氯仿（pH 3.0～2.0）振摇萃取；在50℃蒸发氯仿，最后用 0.6mL 无水乙醇振摇溶解灵芝酸。灵芝酸经756MC紫外可见分光光度计在于245纳米吸收峰确定，分别得1.98毫克、2.82毫克、3.69毫克、2.67毫克灵芝酸。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (3)

1.硝普钠在灵芝深层发酵灵芝酸中的应用，其特征在于：硝普钠作为诱导剂诱导灵芝深层发酵灵芝酸，提高灵芝酸的产量。
2.根据权利要求1所述硝普钠在灵芝深层发酵灵芝酸中的应用，其特征在于：硝普钠作为诱导剂诱导灵芝深层发酵灵芝酸的具体做法是，在灵芝深层发酵液培养3～5天时，向发酵液中加入浓度为50mmol/L的硝普钠水溶液，硝普钠水溶液与发酵液的体积比为0.2～1%，继续培养4～8天后，收获含灵芝酸的发酵产物。
3.根据权利要求2所述硝普钠在灵芝深层发酵灵芝酸中的应用，其特征在于：所述硝普钠水溶液与发酵液的体积比为0.4%。
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