CN102816229A - 两种头孢噻肟钠-牛血清白蛋白偶联物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及两种具有生理活性的头孢噻肟钠-牛血清白蛋白的偶联物，即偶联物Ⅰ和偶联物Ⅱ，头孢噻肟与牛血清白蛋白的偶联比范围为5～30∶1，其结构式如图所示，式中R是牛血清白蛋白，R1是
R2是-N＝C-(CH2)3-C＝N-。本发明的两种头孢噻肟钠-牛血清白蛋白偶联物，免疫原性强，对动物免疫后，通过间接ELISA法测得血清效价≥1：100,000。
Description
发明领域：
本发明涉及两种以牛血清白蛋白与头孢噻肟钠进行偶联的头孢噻肟钠-牛血清白蛋白偶联物及其制备方法。其属于免疫学检测技术领域。
背景技术：
头孢噻肟钠（Cefotaxime Sodium）为第三代头孢类抗生素，其抗菌谱广，对革兰阴性菌的作用更强，抗菌谱包括嗜血性流感杆菌、大肠杆菌、沙门杆菌克雷白产气杆菌属及奇异变形杆菌、奈瑟菌属、葡萄球菌、肺炎球菌、链球菌等。临床上主要用于各种敏感菌的感染，如呼吸道、五官、腹腔、胆道、脑膜炎、淋病、泌尿系统感染、败血症等。头孢噻肟钠是人类疾病治疗中最有效的药物之一，但随着养殖业的发展及动物养殖过程中病害的频发，越来越多的人受利益驱使将该药用于畜禽、水产等养殖过程中。农业部176号公告明文规定，未办理兽药、饲料添加剂审批手续的人用药品，不得直接用于饲料生产和饲养过程，在动物饲料中肆意添加和动物性食品中药物残留的存在一是容易引起耐药性，二是由于未做安全性试验，存在各种安全隐患。随着人民生活水平的提高及我过对外贸易的增加，抗生素的使用及动物学食品中残留的检测必将法制化、常规化。因此研究头孢类抗生素在动物性食品中的残留检测方法是非常必要的。
在抗生素残留的检测中，仪器法如高效液相色谱和质谱仪及液相质谱联用是最广泛的方法，这些方法准确、稳定、可靠，可以作为标准方法。但仪器法价格昂贵，费时较长，且造成有机溶剂污染，需要大量仪器设备和专业技术人员，所以难以用于现场现场操作。酶联免疫检测法（ELISA）提供了一种极好的初步筛选手段。该法具有快速、准确、简易、不需专业人员操作等优点，这使得ELISA成为一种理想的，可以用日常常规扫描的检测方法。
本发明是针对酶联免疫检测法的建立核心是需要高效价的抗体，而高效价的抗体的获得是需要免疫原性强的抗原免疫动物而产生的，但大多数抗生素包括头孢类抗生素，都是小分子化合物，不具有免疫原性，称之为半抗原，所以，本发明则是针对如何把半抗原----头孢噻肟钠设计合成为能引发动物免疫系统产生高效价抗体的完全免疫原而设计的。
发明内容：
本发明的头孢噻肟钠-牛血清白蛋白是以共价键方式与牛血清白蛋白连接的头孢噻肟钠偶联物，头孢噻肟钠与牛血清白蛋白的偶联比范围为5～30∶1。
本发明的技术方案如下：
两种头孢噻肟钠-牛血清白蛋白偶联物，即偶联物Ⅰ和偶联物Ⅱ，具有如下结构：
式中R是牛血清白蛋白，R1是 
R2是-N＝C-(CH2)3-C＝N-，
所述的头孢噻肟钠-牛血清白蛋白，紫外特征吸收光谱显示出如下物化特征：偶联物Ⅰ：213.0nm，275.5nm；偶联物Ⅱ：264.0nm。
所述的头孢噻肟钠-牛血清白蛋白偶联物Ⅰ或偶联物Ⅱ的制备方法是由如下步骤完成：
（1）偶联物Ⅰ：按头孢噻肟钠：1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基-碳化二亚胺（EDC）：牛血清白蛋白为1：2～8：1～10的质量比进行反应；
偶联物Ⅱ：按头孢噻肟钠：牛血清白蛋白为1：1～10的质量比进行反应，头孢噻肟钠：25%的戊二醛为2～5mg：1～3μl。
（2）溶液A的制备：将头孢噻肟钠溶于pH为7.4，浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液（PBS）中备用；
（3）溶液B的制备：将牛血清白蛋白溶于PBS中备用；
（4）溶液C1的制备：将EDC溶于PBS中备用；
溶液C2的制备：将25%的戊二醛用PBS以1：100的比例稀释备用。
（5）偶联物Ⅰ合成：将溶液A缓慢加入溶液B中置磁力搅拌器上慢速搅拌，然后将溶液C1逐滴加入上述反应液中，边加边搅拌，室温条件下避光反应4h后，再取溶液C1逐滴加入上述反应液中，室温避光搅拌反应24h；
偶联物Ⅱ合成：将溶液A缓慢加入溶液B中置磁力搅拌器上慢速搅拌，然后将溶液C2逐滴加入上述反应液中，边加边搅拌，室温条件下避光反应24h。
（6）将合成的偶联物Ⅰ和偶联物Ⅱ分别装入透析袋中，用PBS透析3d，每8h换液1次，得到头孢噻肟钠与牛血清白蛋白的偶联物Ⅰ或偶联物Ⅱ。
所述的头孢噻肟钠-牛血清白蛋白偶联物Ⅰ是：头孢噻肟钠的羧基与牛血清白蛋白的氨基进行结合；偶联物Ⅱ是：戊二醛一端先与头孢噻肟钠的氨基连接后另一端再与牛血清白蛋白的氨基进行结合。
所述的头孢噻肟钠-牛血清白蛋白偶联物Ⅰ或偶联物Ⅱ均可作为免疫原在制备头孢噻肟钠特异性抗体中进行应用。
本发明主要优点：
本发明头孢噻肟钠-牛血清白蛋白偶联物制备简单，免疫原性强，对动物免疫后，通过间接ELISA法测得血清效价≥1：100，000。
附图说明
图1：分子结构图，R是牛血清白蛋白，R1是 
图2：分子结构图，R是牛血清白蛋白，R2是-N＝C-(CH2)3-C＝N-，。
图3：紫外扫描图，1代表头孢噻肟钠-牛血清白蛋白偶联物，2代表头孢噻肟钠，3代表牛血清白蛋白。
图4：紫外扫描图，1代表头孢噻肟钠-牛血清白蛋白偶联物，2代表头孢噻肟钠，3代表牛血清白蛋白。
具体实施方式
本发明的实施例结合附图进一步描述如下：
实例1.偶联物Ⅰ的制备
（1）溶液A的制备：称取头孢噻肟钠124mg，用pH为7.4浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液（PBS）12ml溶解，备用；
（2）溶液B的制备：称取200mg牛血清白蛋白溶于10ml PBS中，备用；
（3）溶液C的制备：称取1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基-碳化二亚胺（EDC）300mg溶于15ml PBS中备用；
（4）将溶液A缓慢加入溶液B中置磁力搅拌器上慢速搅拌，然后将溶液C逐滴加入上述反应液中，边加边搅拌，室温条件下避光反应4h；
（5）再称取100mg EDC溶于5ml PBS中，逐滴加入上述反应液（4）中，室温避光搅拌反应24h；
（6）将合成的产物装入透析袋中，用PBS透析3d，每8h换液1次，得到头孢噻肟钠-牛血清白蛋白溶液，即偶联物Ⅰ，结构见附图1。
实例2.偶联物Ⅱ的制备
（1）溶液A的制备：称取头孢噻肟钠50mg溶于10ml PBS中，备用；
（2）溶液B的制备：称取100mg牛血清白蛋白溶于10ml PBS中，备用；
（3）溶液C的制备：取25%的戊二醛50μL溶于5ml PBS中，备用；
（4）将溶液A缓慢加入溶液B中置磁力搅拌器上慢速搅拌，然后将溶液C逐滴加入上述反应液中，边加边搅拌，室温条件下避光反应4h；
（5）将合成的产物装入透析袋中，用PBS透析3d，每8h换液1次，得到头孢噻肟钠-牛血清白蛋白溶液，即偶联物Ⅱ，结构见附图2。
实例3.紫外扫描鉴定
分别将牛血清白蛋白、头孢噻肟钠-牛血清白蛋白偶联物Ⅰ、偶联物Ⅱ稀释至1mg/ml，头孢噻肟钠标准溶液0.1mg/ml，用PBS为空白，于200～400nm进行紫外扫描，测得偶联物I偶联比为5.8∶1，吸收峰为：213.0nm，275.5nm，见图附3；偶联物Ⅱ偶联比为24.1∶1，吸收峰264.0nm，见图附4。
实例4.抗体效价的测定
（1）抗体的制备
选择上述制备的偶联物Ⅰ，偶联物Ⅱ分别作为免疫原进行动物免疫制备抗体。
分别取2mg/ml的偶联物Ⅰ、偶联物Ⅱ1ml，加入等体积的弗氏完全佐剂（CFA），充分乳化后对BALB/C小白鼠进行腹腔注射，100ul/只；14d后进行第2次免疫，CFA换成弗氏不完全佐剂(IFA)，方法与剂量同首次免疫；7d后进行第3次免疫，将偶联物直接尾静脉注射，浓度和剂量不变；7d后进行第4次免疫，末次免疫5d后采血，分离血清，-20℃贮存备用。
（2）抗体效价的测定
用间接ELISA法测定抗血清效价，P/N≥2.1为阳性反应的最大稀释度为待测样品的效价，经测定，偶联物Ⅰ和偶联物Ⅱ免疫产生的抗体效价≥1：100,000。结果见表1：
表1.间接ELISA法测定结果
注：1、2号鼠为偶联物Ⅰ作为免疫原制备的抗体，3、4号鼠为偶联物Ⅱ作为免疫原制备的抗体
Claims (5)
1.两种头孢噻肟钠-牛血清白蛋白偶联物，其特征是：由头孢噻肟钠与牛血清白蛋白偶联比在5～30∶1构成偶联物Ⅰ或偶联物Ⅱ，其结构式如下：
式中R是牛血清白蛋白，R1是 R2是-N＝C-(CH3)3-C＝N-，
2.如权利要求1所述的头孢噻肟钠-牛血清白蛋白，紫外特征吸收光谱显示出如下物化特征：
偶联物Ⅰ：213.0nm，275.5nm；
偶联物Ⅱ：264.0nm。
3.如权利要求1中所述的头孢噻肟钠-牛血清白蛋白偶联物Ⅰ或偶联物Ⅱ的制备方法，其特征是：由如下步骤完成：
（1）偶联物Ⅰ：按头孢噻肟钠∶1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基-碳化二亚胺（EDC）∶牛血清白蛋白为1∶2～8∶1～10的质量比进行反应；
偶联物Ⅱ：按头孢噻肟钠∶牛血清白蛋白为1∶1～10的质量比进行反应，头孢噻肟钠∶25%的戊二醛为2～5mg∶1～3μl。
（2）溶液A的制备：将头孢噻肟钠溶于pH为7.4，浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液（PBS）中备用；
（3）溶液B的制备：将牛血清白蛋白溶于PBS中备用；
（4）溶液C1的制备：将EDC溶于PBS中备用；
溶液C2的制备∶将25%的戊二醛用PBS以1∶100的比例稀释备用。
（5）偶联物Ⅰ合成：将溶液A缓慢加入溶液B中置磁力搅拌器上慢速搅拌，然后将溶液C1逐滴加入上述反应液中，边加边搅拌，室温条件下避光反应4h后，再取溶液C1逐滴加入上述反应液中，室温避光搅拌反应24h；
偶联物Ⅱ合成：将溶液A缓慢加入溶液B中置磁力搅拌器上慢速搅拌，然后将溶液C2逐滴加入上述反应液中，边加边搅拌，室温条件下避光反应24h。
（6）将合成的偶联物Ⅰ和偶联物Ⅱ分别装入透析袋中，用PBS透析3d，每8h换液1次，得到头孢噻肟钠与牛血清白蛋白的偶联物Ⅰ或偶联物Ⅱ。
4.如权利要求1所述的头孢噻肟钠-牛血清白蛋白偶联物Ⅰ或偶联物Ⅱ，其特征是：偶联物 Ⅰ是：头孢噻肟钠的羧基与牛血清白蛋白的氨基进行结合；偶联物Ⅱ是：戊二醛一端先与头孢噻肟钠的氨基连接后另一端再与牛血清白蛋白的氨基进行结合。
5.如权利要求1中所述的头孢噻肟钠-牛血清白蛋白偶联物Ⅰ或偶联物Ⅱ，其特征是：偶联物Ⅰ或偶联物Ⅱ均可作为免疫原在制备头孢噻肟钠特异性抗体中进行应用。
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