CN102796731A - 一种油菜蜂花粉核酸提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种油菜蜂花粉核酸提取方法，该方法包括以下步骤：⑴配制溶剂；⑵油菜蜂花粉壁破碎处理：将油菜蜂花粉与步骤⑴所得的溶剂混合均匀并浸泡，得到花粉溶液；然后对花粉溶液进行匀质，即得花粉匀质液；⑶在花粉匀质液中加入SDS提取液，水浴后得到油菜蜂花粉细胞裂解液；⑷将油菜蜂花粉细胞裂解液冷却至室温，加入步骤⑴所得的溶剂抽提，然后离心得到上清液；⑸重复步骤⑷，直到水相和有机相中间无蛋白层；⑹水相中加入预冷的异丙醇，摇匀后放置或过夜，得到液相和沉淀物；沉淀物用乙醇洗涤，去乙醇自然风干，即得油菜蜂花粉核酸；然后用灭菌ddH2O溶解油菜蜂花粉核酸即可。本发明预处理成本低、操作简单快速且无有害物质残留。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物保健品、食品与制药及生物技术领域，尤其涉及一种油菜蜂花粉核酸提取方法。
背景技术
蜂花粉是蜜蜂采集蜜源植物的花粉加上蜜蜂自身的腺上分泌物、唾液形成的不规则扁圆形团状物。蜂花粉的营养成分十分丰富，不仅含有丰富的蛋白质、糖类、脂类、维生素、有机酸、矿物质、核酸，还有酶和其它生物活性物质，且具有低脂肪、高蛋白的特点，常被称为“微型营养库”和“完全营养素”，是21世纪新型的营养源和保健食品。
蜂花粉中核酸含量丰富，蒋滢等人的检测发现，100g油菜花粉中含有386.72mg核酸，且核酸具有独特的抗衰老作用。目前国内外学者认为多吃含核酸的食物可使细胞再生，预防衰老和各种慢性疾病的发生，美国、日本和我国已用核酸产品对免疫功能低下者和肿瘤病人进行治疗。补充核酸，DNA和RNA能刺激T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖及分泌速度，从而提高机体免疫功能。
油菜蜂花粉核酸的提取是核酸功能发挥和产业化的关键。目前，尚未见油菜蜂花粉核酸提取方面的专利报道。油菜蜂花粉核酸提取曾涉及苯酚法、三氯乙酸（TCA）或高氯酸法，龙淑珍用苯酚法对油菜蜂花粉核酸提取工艺进行研究并测定核酸的含量和纯度，其提取工艺操作繁琐。花粉中提取的核酸主要用于食品时，防止残留的有害物质对人体有害。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种预处理成本低、操作简单快速且无有害物质残留的油菜蜂花粉核酸提取方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种油菜蜂花粉核酸提取方法，包括以下步骤：
⑴配制溶剂：将SDS提取液与氯仿/异戊醇的混合液等体积混合，即得溶剂；其中氯仿/异戊醇的混合液中氯仿与异戊醇的体积比为24：1；
⑵油菜蜂花粉壁破碎处理：将油菜蜂花粉与所述步骤⑴所得的溶剂按照1：3~1：5的质量体积比混合均匀，并浸泡12~24h，得到花粉溶液；然后用匀浆机以20000~24000转/min的速度对所述花粉溶液进行匀质，匀质次数为2~3次，每次5~10min，即得花粉匀质液；
⑶将所述花粉匀质液转入离心管中，加入所述花粉匀质液体积5~10倍的所述SDS提取液，于60~65℃水浴1h~1h 30min，得到油菜蜂花粉细胞裂解液；
⑷将所述油菜蜂花粉细胞裂解液冷却至室温，加入所述步骤⑴所得的溶剂抽提8~10min，然后于0~4℃，以10000r/min的速率离心8~10min，得到上清液；
⑸所述上清液转入另一离心管，重复步骤⑷，直到水相和有机相中间无蛋白层；
⑹所述水相中加入其2/3体积按常规方法获得的预冷的异丙醇，摇匀后于-20℃放置2h~3h或者过夜，得到液相和沉淀物，弃去所述液相；所述沉淀物用质量浓度为75%的乙醇洗涤2~3次，去乙醇自然风干，即得油菜蜂花粉核酸，称取其干重；然后用灭菌ddH2O溶解所述油菜蜂花粉核酸，于0~4℃保存，或于-20℃下放置长期保存；所述油菜蜂花粉核酸与所述灭菌ddH2O的质量体积比为1：50~1：120。
所述步骤⑴或⑶中的SDS提取液是指将100ml浓度为0.5mol/L且pH值为8.0的EDTA、100ml浓度为5mol/L 的NaCl溶液和50ml质量浓度为10%的SDS混合均匀后加双蒸水定容至500ml所得的溶液。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明原料易得，因此，预处理成本低。
2、本发明工艺简单，并且在SDS配制中不添加Tris-HCl，因此，有效避免了Tris等有毒试剂的残留。
3、经对本发明所提取的油菜蜂花粉核酸进行检测，可以发现所得核酸纯度高：
⑴微量分光光度计检测：
取2μl本发明所提取的油菜蜂花粉核酸提取液，用Thermo Scientific NanoDrop 2000C微量分光光度计检测其纯度和含量，发现在260nm及280nm吸光度（A）的比值（A260/A280），A260/A280=1.90~2.00之间（比值A260/A280可作为核酸纯度的指标，A260/A280=1.80~2.00之间，意指高纯度的核酸），说明所得核酸纯度较高。
⑵琼脂糖凝胶电泳检测：
取4μl本发明所提取的油菜蜂花粉核酸提取液在1%的琼脂糖凝胶电泳上检测，UVP凝胶成像系统观察电泳检测结果如图1所示：说明本发明能够从油菜蜂花粉中提取得到核酸。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明从油菜蜂花粉中所提核酸电泳检测图。其中：1为液氮研磨2×CTAB法；2~4为本发明方法；M为lDNA/HINDⅢ。
具体实施方式
实施例1 一种油菜蜂花粉核酸提取方法，包括以下步骤：
⑴配制溶剂：将75ml SDS提取液与75ml氯仿/异戊醇的混合液等体积混合，即得溶剂；其中氯仿/异戊醇的混合液中氯仿与异戊醇的体积比为24：1。
⑵油菜蜂花粉壁破碎处理：将50g油菜蜂花粉与150ml步骤⑴所得的溶剂混合均匀，并浸泡12h，得到花粉溶液；然后用匀浆机以20000转/min的速度对花粉溶液进行匀质，匀质次数为3次，每次8min，即得花粉匀质液。
⑶将花粉匀质液转入离心管中，加入花粉匀质液体积5倍的SDS提取液，于60℃水浴1h 30min，得到油菜蜂花粉细胞裂解液。
⑷将油菜蜂花粉细胞裂解液冷却至室温，加入步骤⑴所得的溶剂抽提10min，然后于4℃，以10000r/min的速率离心10min，得到上清液。
⑸上清液转入另一离心管，重复步骤⑷，直到水相和有机相中间无蛋白层。
⑹水相中加入其2/3体积按常规方法获得的预冷的异丙醇，摇匀后于-20℃放置2h~3h或者过夜，得到液相和沉淀物，弃去液相；沉淀物用质量浓度为75%的乙醇洗涤2~3次，去乙醇自然风干，即得油菜蜂花粉核酸，称取其干重为0.2109g；然后用灭菌ddH2O溶解油菜蜂花粉核酸，于4℃保存，或于-20℃下放置长期保存；油菜蜂花粉核酸与灭菌ddH2O的质量体积比（g/ml）为1：50。
实施例2 一种油菜蜂花粉核酸提取方法，包括以下步骤：
⑴配制溶剂：将100ml SDS提取液与100ml氯仿/异戊醇的混合液等体积混合，即得溶剂；其中氯仿/异戊醇的混合液中氯仿与异戊醇的体积比为24：1。
⑵油菜蜂花粉壁破碎处理：将50g油菜蜂花粉与200ml步骤⑴所得的溶剂混合均匀，并浸泡18h，得到花粉溶液；然后用匀浆机以24000转/min的速度对花粉溶液进行匀质，匀质次数为2次，每次10min，即得花粉匀质液。
⑶将花粉匀质液转入离心管中，加入花粉匀质液体积10倍的SDS提取液，于65℃水浴1h，得到油菜蜂花粉细胞裂解液。
⑷将油菜蜂花粉细胞裂解液冷却至室温，加入步骤⑴所得的溶剂抽提8min，然后于0℃，以10000r/min的速率离心8min，得到上清液。
⑸上清液转入另一离心管，重复步骤⑷，直到水相和有机相中间无蛋白层。
⑹水相中加入其2/3体积按常规方法获得的预冷的异丙醇，摇匀后于-20℃放置2h~3h或者过夜，得到液相和沉淀物，弃去液相；沉淀物用质量浓度为75%的乙醇洗涤2~3次，去乙醇自然风干，即得油菜蜂花粉核酸，称取其干重为0.2250g；然后用灭菌ddH2O溶解油菜蜂花粉核酸，于0℃保存，或于-20℃下放置长期保存；油菜蜂花粉核酸与灭菌ddH2O的质量体积比（g/ml）为1：120。
实施例3 一种油菜蜂花粉核酸提取方法，包括以下步骤：
⑴配制溶剂：将125ml SDS提取液与125ml氯仿/异戊醇的混合液等体积混合，即得溶剂；其中氯仿/异戊醇的混合液中氯仿与异戊醇的体积比为24：1。
⑵油菜蜂花粉壁破碎处理：将50g油菜蜂花粉与250ml步骤⑴所得的溶剂混合均匀，并浸泡24h，得到花粉溶液；然后用匀浆机以22000转/min的速度对花粉溶液进行匀质，匀质次数为2次，每次5min，即得花粉匀质液。
⑶将花粉匀质液转入离心管中，加入花粉匀质液体积8倍的SDS提取液，于63℃水浴1h15min，得到油菜蜂花粉细胞裂解液。
⑷将油菜蜂花粉细胞裂解液冷却至室温，加入步骤⑴所得的溶剂抽提9min，然后于2℃，以10000r/min的速率离心9min，得到上清液。
⑸上清液转入另一离心管，重复步骤⑷，直到水相和有机相中间无蛋白层。
⑹水相中加入其2/3体积按常规方法获得的预冷的异丙醇，摇匀后于-20℃放置2h~3h或者过夜，得到液相和沉淀物，弃去液相；沉淀物用质量浓度为75%的乙醇洗涤2~3次，去乙醇自然风干，即得油菜蜂花粉核酸，称取其干重为0.2130g；然后用灭菌ddH2O溶解油菜蜂花粉核酸，于2℃保存，或于-20℃下放置长期保存；油菜蜂花粉核酸与灭菌ddH2O的质量体积比（g/ml）为1：85。
上述实施例1~3中步骤⑴或⑶中的SDS提取液是指将100ml浓度为0.5mol/L且pH值为8.0的EDTA、100ml浓度为5mol/L 的NaCl溶液和50ml质量浓度为10%的SDS混合均匀后加双蒸水定容至500ml所得的溶液。
Claims (2)
1.一种油菜蜂花粉核酸提取方法，包括以下步骤：
⑴配制溶剂：将SDS提取液与氯仿/异戊醇的混合液等体积混合，即得溶剂；其中氯仿/异戊醇的混合液中氯仿与异戊醇的体积比为24：1；
⑵油菜蜂花粉壁破碎处理：将油菜蜂花粉与所述步骤⑴所得的溶剂按照1：3~1：5的质量体积比混合均匀，并浸泡12~24h，得到花粉溶液；然后用匀浆机以20000~24000转/min的速度对所述花粉溶液进行匀质，匀质次数为2~3次，每次5~10min，即得花粉匀质液；
⑶将所述花粉匀质液转入离心管中，加入所述花粉匀质液体积5~10倍的所述SDS提取液，于60~65℃水浴1h~1h 30min，得到油菜蜂花粉细胞裂解液；
⑷将所述油菜蜂花粉细胞裂解液冷却至室温，加入所述步骤⑴所得的溶剂抽提8~10min，然后于0~4℃，以10000r/min的速率离心8~10min，得到上清液；
⑸所述上清液转入另一离心管，重复步骤⑷，直到水相和有机相中间无蛋白层；
⑹所述水相中加入其2/3体积按常规方法获得的预冷的异丙醇，摇匀后于-20℃放置2h~3h或者过夜，得到液相和沉淀物，弃去所述液相；所述沉淀物用质量浓度为75%的乙醇洗涤2~3次，去乙醇自然风干，即得油菜蜂花粉核酸，称取其干重；然后用灭菌ddH2O溶解所述油菜蜂花粉核酸，于0~4℃保存，或于-20℃下放置长期保存；所述油菜蜂花粉核酸与所述灭菌ddH2O的质量体积比为1：50~1：120。
2.如权利要求1所述的一种油菜蜂花粉核酸提取方法，其特征在于：所述步骤⑴或⑶中的SDS提取液是指将100ml浓度为0.5mol/L且pH值为8.0的EDTA、100ml浓度为5mol/L 的NaCl溶液和50ml质量浓度为10%的SDS混合均匀后加双蒸水定容至500ml所得的溶液。
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| 张坚，刘凤云: "油菜蜂花粉核酸提取工艺的比较研究", 《蜜蜂杂志》 * |
| 郝功元 等: "银杏花粉不同破壁方法的比较分析", 《银杏花粉不同破壁方法的比较分析》 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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