CN102796045B - 吡唑啉衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种吡唑啉衍生物的制备方法及其作为Zn2+荧光探针的应用。该吡唑啉衍生物的结构式如式（I）所示。本发明涉及吡唑啉衍生物本身不发荧光，在EtOH/HEPES(20mM,pH=7.2,1:1,体积比)缓冲溶液中与Zn2+作用后，荧光增强40倍。其作为Zn2+荧光探针，具有非常好的选择性，其对Zn2+的荧光检测限为6.1×10-7M，而且该化合物可以用于PC12细胞内Zn2+荧光成像和定位检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种吡唑啉衍生物及其制备方法与其作为Zn2+荧光探针的应用。
背景技术
金属锌作为人体中第二大过渡金属元素，在人体中有着十分重要的地位。众多以锌离子为中心的酶以及与DNA相连接的蛋白质均在人体中起到了举足轻重的作用。尽管锌离子（Zn2+）在作用时与酶和蛋白质紧紧相连，但游离的Zn2+依然存在于众多人体组织，如大脑、肠道和视网膜中。因此，当今的化学研究及生物研究领域急需一种高效率检测Zn2+的手段。
目前，虽然有文献报道利用荧光技术检测Zn2+，但是以吡唑啉衍生物为主要结构单元的Zn2+离子探针尚不多见。在前期研究中，我们开发了一种吡唑啉衍生物作为Zn2+离子探针，可在乙腈和水中进行荧光检测，但是荧光增强仅仅4倍【Sensors&Actuators:B.Chemical.2011,159,148-153】。因此需要对结构进行修饰，改进其应用性能。尤其是应用于检测活细胞内Zn2+的探针亟待开发。
发明内容
本发明目的是提供一种吡唑啉衍生物及其制备方法，同时利用其作为Zn2+荧光探针具有非常高的选择性和灵敏度，并用于活细胞中检测锌离子的存在。
本发明所述的吡唑啉衍生物，结构式如式（I）所示：
式（I）。
上述的吡唑啉衍生物合成方法，由是由间甲基-邻羟基苯乙酮（1）与邻烯丙氧基苯甲醛（2）在乙醇/水中反应得到查耳酮衍生物（3）；将制得查耳酮与氨基硫脲在乙醇/水回流条件下，反应4±0.1小时，经柱层析纯化得到式（I）所示吡唑啉衍生物（4）。
上述合成路线反应式如下：
本发明所述吡唑啉衍生物作为活细胞内Zn2+荧光探针的应用。
其中：所述活细胞优选PC12细胞。
上述吡唑啉衍生物对Zna+具有非常高的选择性和灵敏度，其作为活细胞内Zn2+荧光探针可用于活细胞中检测锌离子的存在。
具体的，配制吡唑啉衍生物（4）的乙醇/HEPES缓冲液（20mM HEPES，pH=7.2，1:1，体积比）的溶液，分别定量加入微升级的NaNO3,Mg(NO3)2·6H2O,Al(NO3)3·9H2O,KNO3,Ca(NO3)2·4H2O,Cr(NO3)3·9H2O,50%(wt.)Mn(NO3)2(aq.),Fe(NO3)3·9H2O,Co(NO3)2·6H2O,Ni(NO3)2·6H2O,Cu(NO3)2·3H2O,Zn(NO3)2·6H2O,AgNO3,Cd(NO3)2·4H2O,Ba(NO3)2,HgCl2,Pb(NO3)2,CuCl2·2H2O,CuSO4·5H2O,Cu(Ac)2·H2O,NaCl,NaAc和Na2SO4小的水溶液。通过荧光分光光度法测试对不同金属离子的选择性、响应能力以及其它金属离子的干扰情况。
在不加入锌离子和加入锌离子的的活PC12细胞内分别加入吡唑啉衍生物（4）对照细胞染色荧光显微成像变化。
结果见图1～4。
本发明公开的吡唑啉衍生物本身荧光极弱，在EtOH/HEPES(20mM,pH 7.2,1:1,体积比)缓冲溶液中与Zn2+作用后，荧光增强40倍，作为Zn2+荧光探针，具有非常好的选择性，其对Zn2+的荧光检测限为6.1×10-7M，而且吡唑啉衍生物可以用于PC12细胞内Zn2+荧光成像和定位检测。
附图说明
图1：为10μM的化合物4空白缓冲溶液以及分别将100μM的不同金属离子加入10μM的化合物（4）的缓冲溶液的荧光光谱强度变化。(激发波长(λex)，394nm；激发狭缝宽度,10.0nm；发射波长(λem),476nm；发射狭缝宽度,5.0nm)。
图2：为10μM的化合物4在乙醇/HEPES缓冲溶液（20mM HEPES，pH=7.2，1:1，体积比）中用不同浓度的锌离子Zn2+(0-50×10-5M)滴定的荧光图谱，发射波长(λem),476nm；。
图3：为向EtOH/HEPES缓冲溶液中分别加入100μM的不同金属离子，进而向该溶液中再分别加入10μM的Zn2+的荧光强度变化柱状图。
图4：为活PC12细胞荧光显微成像图(a1-a3)加入10μM化合物4的PC12细胞在37℃培养0.5小时的图像；(a2)为(a1)的亮场成像图；(a3)为(a1)和(a2)的叠加图；(b1-d1)为分别加入10μM,25μM和50μM Zn2+的PC12细胞在培养基中37℃培养0.5小时，然后用化合物4同(a)相同条件处理后的图像；(b2-d2)分别为(b1-d1)的亮场成像图；(b3-d3)为(b1-d1)和(b2-d2)的叠加图。
具体实施方式
实施例1吡唑啉衍生物制备
将间甲基-邻羟基苯乙酮（1）（12g），邻烯丙氧基苯甲醛（2）（13g），氢氧化钠（48g），溶解于150ml乙醇，冰水浴反应8h，TLC判断反应结束后，加入稀盐酸溶液中和至pH=7，过滤得反应粗产物，用40ml乙醇重结晶，过滤抽干得查耳酮衍生物（3）（18.546g），橘红色晶体，产率78.8%。熔点166-167℃。
核磁共振氢谱测定：1H NMR(300MHz,CDCl3):2.34(s,3H,CH3),4.67(dt,2H,J=5.4,1.5Hz,CH2 in allyloxy moiety),5.36(dd,1H,JABcis=9,JBC=1.5Hz,=CHH),5.50(dd,1H,JACtrans=19,JBC=1.5Hz,=CHH),6.10-6.23(m,1H,=CH-),6.93(d,1H,J=8.4Hz,ArH),6.95(t,1H,J=8.7Hz,ArH),7.31(d,1H,J=8.4Hz,ArH),7.38(t,1H,J=8.4Hz,ArH),7.65(d,1H,J=8.4Hz,ArH),7.69(s,1H,ArH),7.87(d,1H,Jtrans=15.6Hz,=CH-,conjugated vinyl),8.19(d,1H,Jtrans=15.6Hz,=CH-,conjugated vinyl),12.75(s,1H,OH)。
实施例2吡唑啉衍生物（4）制备
将化合物3（5.882g）,氨基硫脲（2.73g），氢氧化钠（2.4g），溶于70ml乙醇，加热回流保持4h，TLC判断反应结束后，用稀盐酸中和反应混合物至pH=7，过滤得粗产品，用300ml乙醇重结晶得产物吡唑啉衍生物（4），白色固体，产率52%，熔点233-234℃。
红外光谱测定：IR(KBr),υ:3436.6,3326.8,1600.4,1481.1,1337.7,1250.9,816.8,746.7cm-1。
核磁共振氢谱测定：1H NMR(300MHz,CDCl3):2.27(s,3H,CH3),3.25(dd,1H,J=18,3.6Hz,CHH in pyrazoline moiety),3.90(dd,1H,J=18,11.4Hz,CHH in pyrazoline moiety),4.57(d,2H,J=5.4Hz,CH2 in allyloxy moiety),5.23(d,1H,JABcis=10.5Hz,=CH),5.37(d,1H,JACtrans=17.1,=CHH),5.93-6.06(m,1H,=CH-),6.24(dd,1H,J=11.4,3.6Hz,CH in pyrazoline moiety),6.26-6.60(m,2H,NH2),6.88-6.96(m,3H,Ar-H),7.00(s,1H,Ar-H),7.09-7.26(m,3H,Ar-H),9.53(s,1H,OH)。
核磁共振碳谱测定：13C NMR(75MHz,CDCl3):175.7,159.2,155.0,154.5,133.2,132.4,128.7,128.5,128.4,128.1,126.4,120.3,117.2,116.3,114.0,111.8,68.6,58.5,41.8,19.9。
高分辨质谱测定：HRESIMS calcd for[M+H]+C20H22N3O2S:368.1433,found:368.1424。
实施例1～2的反应路线如下式所示：
实施例3荧光分光光度法测试
用微量注射器分别向盛有10mL配制好的吡唑啉衍生物（4）乙醇/HEPES缓冲溶液（20mMHEPES，pH=7.2，1:1，体积比）的溶液中加入10当量Na+,Mg2+,Al3+,K+,Ca2+,Cr3+,Mn2+,Fe3+,Co2+,Ni2+,Zn2+,Ag+,Cd2+,Ba2+,Pb2+,Hg2+和Cu2+离子水溶液，分别进行荧光分光光度法测试。
结果如图1，显示吡唑啉衍生物（4）对Zn2+具有非常好的选择性，加入锌离子前后对照显示荧光增强40倍，具有较强荧光增强效应。
实施例4细胞内荧光成像测试
在37℃、湿润的空气和5%二氧化碳存在下，在含有10%小牛血清（HyClone）的DMEM培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium,Gibco）中培养PC12细胞。
进行荧光成像前，将PC12细胞（5×104mL-1）接种到24孔板，Zn2+摄入的实验在相同培养基加入10μM，25μM或50μM硝酸铜约0.5小时后进行。在进行染色实验前，细胞用PBS缓冲液洗涤两次，然后将细胞培养板中在10μM的化合物4的存在下培养0.5小时。细胞用PBS缓冲液洗涤两次后，在相差显微镜下观察成像结果。
37℃下，加入10μM的化合物4的PC12细胞在培养基中培养0.5小时后观察不到荧光。用10μM Zn2+预处理PC12细胞，然后加入10μM化合物4在37℃继续培养0.5小时，在细胞质中可以观察到明显的荧光，表明化合物4进入细胞并可检测细胞内Zn2+。
当用25μM或50μM Cu2+预处理PC12细胞，用化合物4在相同条件下培养后，荧光显著增强，提示吡唑啉衍生物（4）可以作为活细胞内Zn2+荧光探针用来检测细胞内Zn2+浓度变化情况。结果见图4。
Claims (4)
1.一种吡唑啉衍生物，结构式如式（I）所示：
2.权利要求1所述吡唑啉衍生物的合成方法，是由间-甲基-邻羟基苯乙酮（1）与邻-烯丙氧基苯甲醛（2）在乙醇/水中反应得到查耳酮衍生物（3）；将制得查耳酮衍生物（3）与氨基硫脲在乙醇/水回流条件下，反应4±0.1小时，经柱层析纯化得到式（I）所示吡唑啉衍生物（4）；反应式如下：
3.权利要求1所述吡唑啉衍生物在制备活细胞内Zn2+荧光探针中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述活细胞为PC12细胞。
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