CN102792912B

CN102792912B - 一种判别棘头梅童鱼产地和生活史的方法

Info

Publication number: CN102792912B
Application number: CN201210330300.7A
Authority: CN
Inventors: 杨健; 刘洪波; 姜涛
Original assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2012-09-07
Filing date: 2012-09-07
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2032-09-07
Also published as: CN102792912A

Abstract

本发明涉及一种判别棘头梅童鱼产地和生活史的方法，特征是：取样本分类放于冰箱内保存待用；标本解冻后取左或右侧矢耳石用水清除耳石表面的有机质并自然晾干；先用热熔胶固定耳石，再用混合树脂调匀后包埋耳石，双面磨制耳石；用透反射光确认磨至核心后，经抛光、清洗、镀碳薄膜后方可用X射线电子探针微区分析仪进行耳石样品的定量线分析；以及分析时确定的各状态参数都保证了所取得的结果稳定性好，可重复性高、系统误差小，可判别性强，克服了目视、遗传学等方法无法判别的局限，亦可有效区别不同产地的棘头梅童鱼群体和其生活史阶段划分。该方法同样为了解其它洄游鱼类的生活史规律提供了便利。

Description

一种判别棘头梅童鱼产地和生活史的方法

技术领域

本发明涉及一种利用耳石微量元素判别棘头梅童鱼产地和生活史的方法，属于鱼类生态学领域。

背景技术

棘头梅童鱼是近海小型经济鱼类，主要分布于中西太平洋区的南海、东海和黄渤海，是我国、菲律宾、印尼、日本和朝鲜等国家沿海、河口水域重要的渔业资源和主要的经济鱼类之一。近年来由于过度捕捞和环境污染等因素的影响，棘头梅童鱼的年平均资源密度在大幅下降，资源开发率过高。其鱼卵仔鱼资源补充量已受到衰竭的威胁，而全人工育苗技术至今尚未成熟。近些年来由于价格不断攀升，棘头梅童鱼已经成为一种高经济价值的水产品。毫无疑问，准确了解棘头梅童鱼的资源动态及其与环境因子的关系，对揭示棘头梅童鱼生活史过程所需环境条件、生境规律，加强保护和优化全人工繁殖的环境技术等具有非常重要的意义。

迄今，通过渔获调查法对棘头梅童鱼的生境及活动规律已经有了认识。它的分布区一般在河口（如长江、飞云江、闽江、珠江），有在深浅水间洄游的现象。资源密度的变化存在季节性且随盐度增加而降低。产卵多在大潮水的几天里。卵的浮性及个体发育依赖海水的盐度等条件。然而，由于研究技术的限制，要确切而直观地把握棘头梅童鱼从孵化到幼鱼直至成鱼全生活史过程中的洄游、生境差异，群体组成规律，以及不同河口水域棘头梅童鱼种群特征及相关性等尚有很大的难度。

研究发现，由于不同水环境之间的元素成分会有很大的差异，鱼类从水环境中吸收的元素可以在硬组织如耳石中沉积并长期保存。因此，伴随着不同的生活和洄游履历，硬组织中元素的积累可留下栖息水环境中元素特征的

“指纹”。相应地如果能利用诸如元素衍射电子探针分析（EPMA）等较为先进的技术对这些“指纹”进行归纳总结，就有可能恢复、重现和掌握大量洄游性鱼类生态学、生理学等方面的信息及其时空变化过程。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的利用耳石微量元素判别棘头梅童鱼产地和洄游生活史的方法，通过将耳石分离、磨抛等前处理以及元素衍射电子探针分析操作等一系列步骤，测定棘头梅童鱼耳石中Sr、Ca元素的浓度值，并将这些浓度值归纳出不同生境的微量元素地理“指纹”特征，并利用这些特征来进行棘头梅童鱼产地和洄游生活史判别。锶含量/钙含量×10³的比值连续出现三次及以上大于7时可判定为高盐度生活阶段；比值在3～7之间时为半咸水生活阶段；比值在0～3之间时为低盐度或淡水生活阶段。该方法所取得的结果稳定性好，可重复性高、系统误差小，可判别性强，显示出了其快速的优势。

按照本发明提供的技术方案，一种判别棘头梅童鱼产地和生活史的方法，采用以下工艺步骤：

1、捕捞不同水域的棘头梅童鱼，立刻放入清洁的塑料自封袋中并在0～4℃保存，在此温度条件下尽快运回实验室保存；

2、野外采集并运回实验室保存的棘头梅童鱼完整个体样本转移于-18～-20℃冰箱内保存，待用；

3、棘头梅童鱼耳石样本前处理方法：

(1)、取出左或右侧矢耳石，经超纯水洗清除表面的有机质，清洗干净后，室温下晾干、干燥保存作为分析的材料待用；

(2)、用上海艾立热熔胶棒厂生产含重量百分含量的聚氨酯胶成分>25%的热熔胶将其较平滑的面固定在载玻片上，等热熔胶冷却10～15分钟变硬后先将耳石在500目水砂纸上进行粗磨，并随时在正置金相显微镜上用透反射光观察表面状况，待首次观察到轮纹时换用1200目水砂纸细磨2～5分钟使表面平滑，然后用酒精灯将热熔胶熔化后取出耳石；

(3)、将未磨过的光面耳石用双面胶将其固定在镶样模内，做好样本标签，将冷镶嵌用透明的环氧树脂和硬化剂（司特尔公司,哥本哈根,丹麦）按照5:1的比例调匀后，往每个镶样模内注入3～4ml混合树脂，将耳石包埋于其中。放入40℃～45℃的干燥箱中烘12小时～15小时至完全固化；

(4)、取出镶样模内包埋有耳石的固化树脂块，选用500目水砂纸对未磨过的光面耳石进行粗磨，待粘在耳石上的双面胶全部磨掉后换用1200目水砂纸进行精磨，期间随时在金相显微镜上观察表面状况，用透反射光确认磨至核心后，将树脂块洗净待用；

(5)、使用金刚石抛光液和MD抛光布以120～150rpm的转速在抛光机上（司特尔公司,哥本哈根,丹麦）抛光3～5分钟至耳石表面无刮痕为止。将所有抛光的树脂块放入超纯水（美国密理博公司，Milliprore-Simplicity个人型超纯水系统，出水电阻率18.2MΩ.cm）中进行超声清洗3～5分钟后自然晾干24小时。

4、棘头梅童鱼耳石样本微区分析

(1)、将耳石样本置于JEE-420型真空镀膜机（JEOL Ltd，Tokyo，Japan）中，在真空度达到≦2x10^-4Pa，电流达到35A～36A时，镀碳薄膜20～25秒；

(2)、从耳石核心顺着最长横轴向边缘用电子探针显微分析仪（日本电子公司,东京，日本，简称EPMA）进行耳石样本的定量线分析。在测Sr、Ca元素的浓度值之前先做机器状态校验和标准分析，利用碳酸钙（CaCO₃）、碳酸锶（SrCO₃）或钛酸锶（SrTiO₃）等作为检验定量测定结果的标准物质。EPMA分析时的加速电压参数为15KV，电子束电流为1.2×10^-8～2.0×10^-8A，速斑直径为5μm，每点驻留时间为15秒，每间隔10～15μm测量下一点；

(3)、由上述电子探针显微分析仪沿耳石样本矢状面所获各点定量线分析数据用Sr和Ca含量的比率值表示。每个测定点到耳石核心的距离被称为“耳石径”，统一使用锶含量/钙含量×10³的比值表示，简称Sr/C a比值。耳石不同区域Sr:Ca的含量比值数据用平均值±标准差。统计分析使用美国SAS公司的StatView 5.0软件。差异的显著水平判定用曼-惠特尼（Mann-Whitney）U测验进行。根据Sr:C a含量比值的显著性差异水平，区别棘头梅童鱼的产地和不同的生活史。

本发明与已有技术相比具有以下优点：

洄游性鱼类在不同的生活史阶段栖息环境可能截然不同，而准确了解这些鱼类生活史过程中的生境变化非常困难，因为不管是传统的捕捞调查法，还是现在的生物遥测(biotelemetry)法均无法解决“多种类泛用”、“非负荷”、“全生活史监测”这三大难题。本发明选用江苏省长江口相同采样地不同年份和广东省珠江口产棘头梅童鱼耳石作为判别对象，经一系列标准化的前处理方法，获得清晰的磨至核心的耳石树脂块再镀上碳薄膜后，即可运用大型精密分析仪器电子探针显微分析仪（简称EPMA），利用碳酸钙、碳酸锶或钛酸锶作为定量分析的标准样品，完成标准分析之后，即可精确地测定耳石中目标元素Sr和Ca的浓度，根据Sr:Ca含量比值的显著性差异水平，可较为快速地区分不同阶段和不同水域棘头梅童鱼的洄游规律和生活史特征。该方法所取得的结果稳定性好，可重复性高、系统误差小，可判别性强，不仅克服了捕捞调查法、生物遥测法等方法无法判别的局限，而且具有快速检测、精确判定的优势，可有效区别不同产地和不同生活史的棘头梅童鱼。

附图说明

图1为本发明珠江口十五涌水域棘头梅童鱼耳石样本沿耳石矢状面从核心(0μm)到边缘定量线分析记录到的Sr:C a含量比率变化。

图2为本发明2010年夏季长江口崇明水域棘头梅童鱼耳石样本沿耳石矢状面从核心(0μm)到边缘定量线分析记录到的Sr:Ca含量比率变化。

图3为本发明2010年春季长江口崇明水域棘头梅童鱼耳石样本沿耳石矢状面从核心(0μm)到边缘定量线分析记录到的Sr:Ca含量比率变化。

具体实施方式：

下面本发明将结合实施例作进一步描述：

实施例一：一种判别棘头梅童鱼产地和生活史的方法，采用以下工艺步骤：

(1)、2011年11月采自珠江口十五涌水域棘头梅童鱼的样本先放入清洁的塑料自封袋中并在0～4℃保存并尽快运回实验室；

(2)、取体长规格接近的样本分类放于-20℃冰箱内保存随用。解冻后取体长大于13厘米样本的右侧矢耳石，超纯水洗清除耳石表面的有机质并自然晾干24小时后作为分析的材料待用；

(3)、用上海艾立热熔胶棒厂产热熔胶将其较平滑的面固定在载玻片上，等热熔胶冷却10分钟变硬后先将耳石在500目水砂纸上进行粗磨，并随时在C2030B正置金相显微镜(上海精密仪器仪表有限公司)上用透反射光观察表面状况，待首次观察到轮纹时换用1200目水砂纸细磨2分钟使表面平滑，然后用酒精灯将热熔胶熔化后取出耳石；

(4)、将未磨过的光面耳石用双面胶将其固定在镶样模(25mm直径)内，做好样本标签，将将冷镶嵌用透明的环氧树脂和硬化剂（司特尔公司,哥本哈根,丹麦）按照5:1的比例调匀后，往每个镶样模内注入3ml混合树脂，将耳石包埋于其中。放入45℃的干燥箱中烘12小时至完全固化；

(5)、取出镶样模内包埋有耳石的固化树脂块，选用500目水砂纸对未磨过的光面耳石进行粗磨，待粘在耳石上的双面胶全部磨掉后换用1200目水砂纸进行精磨，期间随时在金相显微镜上观察表面状况，用透反射光确认磨至核心后，将树脂块洗净待用；

(6)、使用金刚石抛光液和MD抛光布以150rpm的转速在RotoPol-35型（司特尔公司,哥本哈根,丹麦）抛光机上抛光3分钟至耳石表面无刮痕为止。将所有抛光的树脂块放入超纯水（美国密理博公司，Milliprore-Simplicity个人型超纯水系统，出水电阻率18.2MΩ.cm）中进行超声清洗5分钟后自然晾干24小时；

(7)、将耳石样本置于JEE-420型真空镀膜机（JEOL Ltd，Tokyo，Japan）中，在真空度达到≦2x10^-4Pa，电流达到35A时，镀碳薄膜20秒；

(8)、从耳石核心顺着最长横轴向边缘用电子探针显微分析仪JXA-8100型（日本电子公司,东京，日本）进行耳石样本的定量线分析。在测Sr、Ca元素的浓度值之前先做机器状态校验和标准分析，利用碳酸钙（CaCO₃）和钛酸锶（SrTiO₃）作为检验定量测定结果的标准物质。EPMA分析时的加速电压参数为15KV，电子束电流范围为2.0×10^-8A，速斑直径为5μm，每点驻留时间为15秒，每间隔10μm测量下一点；

将上述电子探针显微分析仪沿耳石标本矢状面所获各点定量线分析数据整理成图1、表1和表3，标本号为GZCL1、GZCL4、GZCL5和GZCL6。由图1可知珠江口水域棘头梅童鱼耳石绝大部分Sr:Ca×10³的比值在3-7之间窄幅波动，核心区没有出现骤降现象，生活史阶段划分不明显；表1显示耳石核心(0μm)到边缘定量线分析Sr:Ca含量比率的平均值，虽然个体之间的洄游方式略有差异，即平均值有高有低，但并未出现长江崇明口水域棘头梅童鱼耳石两阶段锶(Sr):钙(Ca)×10³值的现象；表3的曼-惠特尼U测验表面广州珠江口十五涌水域棘头梅童鱼耳石的锶(Sr):钙(Ca)×10³值与长江口崇明水域的差异水平极其显著。因此利用本发明所获得数据可以较客观地区别不同产地的棘头梅童鱼群体和其生活史阶段划分，判别效果良好。

实施例二：一种判别棘头梅童鱼产地和生活史的方法，采用以下工艺步骤：

(1)、2010年夏季采自长江口崇明水域棘头梅童鱼的样本先放入清洁的塑料自封袋中并在0～4℃保存并尽快运回实验室；

(2)～(8)同实施例一样本前处理及测试步骤，因耳石较大，每间隔15μm测量下一点。

将上述分析数据整理成图2、表2和表3，样本号为SCL1和SCL2。由图2可知长江口崇明水域夏季棘头梅童鱼耳石明显可分为2个阶段，即耳石核心部的Sr:Ca×10³比均很高，之后直到捕获，Sr:Ca×10³的比值绝大部分在3-7之间窄幅波动，在孵化阶段转向发育和生长阶段时，Sr:Ca×10³的比值出现骤降现象，群体的生活史阶段划分明显，个体之间的洄游方式大致相同；表2亦显示耳石核心(0μm)到边缘定量线分析Sr:Ca含量比率的值出现两阶段现象；表3的曼-惠特尼U测验表明夏季长江口崇明水域棘头梅童鱼耳石锶(Sr):钙(Ca)×10³值与广州珠江口十五涌水域的差异水平极其显著。同样证明了利用本发明所获得数据可以较客观地区别不同产地的棘头梅童鱼群体和其生活史阶段划分，判别效果良好。

实施例三：本发明一种判别棘头梅童鱼产地和生活史的方法，采用以下工艺步骤：

(1)、2010年春季采自长江口崇明水域棘头梅童鱼的样本先放入清洁的塑料自封袋中并在0～4℃保存并尽快运回实验室；

(2)～(8)同实施例二样本前处理及测试步骤。

将上述分析数据整理成图3、表2和表3，样本号为CL2、CL3、CL4和C L10。由图3可知长江口崇明水域春季棘头梅童鱼耳石明显可分为2个阶段，即耳石核心部的Sr:Ca×10³比均很高，之后直到捕获，Sr:Ca×10³的比值绝大部分在3-7之间窄幅波动，在孵化阶段转向发育和生长阶段时，Sr:Ca×10³的比值出现骤降现象，群体的生活史阶段划分明显，个体之间的洄游方式大致相同；表2亦显示耳石核心(0μm)到边缘定量线分析Sr:Ca含量比率的值出现两阶段现象；表3的曼-惠特尼U测验表明春季长江口崇明水域棘头梅童鱼耳石锶(Sr):钙(Ca)×10³值与广州珠江口十五涌水域的差异水平极其显著。同样证明了利用本发明所获得数据可以较客观地区别不同产地的棘头梅童鱼群体和其生活史阶段划分，判别效果良好。

表1广州珠江口十五涌水域棘头梅童鱼耳石的锶(Sr):钙(Ca)×10³值

表2长江口崇明水域棘头梅童鱼耳石两阶段的锶(Sr):钙(Ca)×10³值

注:：每尾鱼耳石Sr∶Ca×10³数据右上角不同的大写字母表示不同阶段差异显著（P<0.05），不同的小写字母表示不同阶段差异极其显著（P<0.01）。“SCL”表示2010年夏季采样，“CL”表示2010年春季采样。表3广州珠江口十五涌水域棘头梅童鱼耳石的锶(Sr):钙(Ca)×10³值与长江口崇明水域棘头梅童鱼耳石锶(Sr):钙(Ca)×10³值的显著性差异水平（***表示均为极其显著，P<0.01）

Claims

1. 一种判别棘头梅童鱼产地和生活史的方法，其特征是：采用以下工艺步骤：

(1)、野外采集不同水域的棘头梅童鱼样本先放入清洁的塑料自封袋中，并在0～4℃保存，在此温度条件下尽快运回实验室保存；

（2）、野外采集并运回实验室保存的棘头梅童鱼，取体长规格接近的样本转移于-18～-20℃冰箱内保存，待用；

（3）、棘头梅童鱼耳石样本前处理方法：

(3-1)、取出样本左或右侧矢耳石解冻后，经超纯水清除表面的有机质，清洗干净后，室温下晾干、干燥保存作为分析的材料待用；

(3-2)、取含聚氨酯胶成分>25%的热熔胶将耳石平滑的面固定在载玻片上，等热熔胶冷却10～15分钟变硬后，先将耳石在500目水砂纸上进行粗磨，并随时在正置金相显微镜上用透反射光观察表面状况，待首次观察到轮纹时换用1200目水砂纸细磨2～5分钟使表面平滑，然后用酒精灯将热熔胶熔化后取出耳石；

(3-3)、将打磨过的光面耳石用双面胶将其固定在镶样模内，做好样本标签，将冷镶嵌用透明的环氧树脂和硬化剂以质量比为5:1的比例调匀后，往每个镶样模内注入3～4 ml混合树脂溶液，将耳石包埋于其中；放入40℃～45℃的干燥箱中烘12小时～15 小时至完全固化；

(3-4)、取出镶样模内包埋有耳石的固化树脂块，选用500目水砂纸对打磨过的光面耳石进行粗磨，待粘在耳石上的双面胶全部磨掉后换用1200目水砂纸进行精磨，期间随时在金相显微镜上观察表面状况，用透反射光确认磨至

核心后，将树脂块洗净待用；

(3-5)、使用金刚石抛光液和MD抛光布以120～150rpm的转速在抛光机上抛光3～5分钟至耳石表面无刮痕为止；将所有抛光的树脂块放入超纯水环境中进行超声清洗3～5分钟后，自然晾干24小时为耳石样本；

（4）、棘头梅童鱼耳石样本微区分析：

(4-1)、将耳石样本置于真空镀膜机中，在真空度达到≦2x10^-4Pa，电流达到35A～36A时，镀碳薄膜20～25秒；

(4-2)、从耳石样本核心顺着最长横轴向边缘用电子探针显微分析仪进行耳石样本的定量线EPMA分析；在测Sr、Ca元素的浓度值之前先做机器状态校验和标准分析，利用碳酸钙、碳酸锶或钛酸锶作为检验定量测定结果的标准物质；

(4-3)、由上述电子探针显微分析仪沿耳石样本矢状面所获各点定量线分析数据用Sr和Ca含量的比率值表示；每个测定点到耳石核心的距离被称为耳石径，统一使用锶含量/钙含量×10³的比值表示，简称Sr/Ca比值；耳石不同区域Sr: Ca的含量比值数据用平均值±标准差进行统计分析；差异的显著水平判定用曼-惠特尼U测验进行；根据Sr: Ca含量比值的显著性差异水平，区别棘头梅童鱼的产地和不同的生活史；

所述步骤（3）中镶样模直径为25mm；

所述步骤（3）中超纯水系统出水电阻率18.2MΩ.cm；

所述步骤（4）中EPMA分析时的加速电压参数为15KV，电子束电流为1.2×10^-8～2.0×10^-8A，速斑直径为5μm，每点驻留时间为15秒，每间隔10～15 μm测量下一点。