CN102781952A

CN102781952A - 编码rantes的核酸分子、包含其的组合物以及其使用方法

Info

Publication number: CN102781952A
Application number: CN2011800085822A
Authority: CN
Inventors: D·B·韦纳; J·D·博耶; M·库兹勒
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2010-02-08
Filing date: 2011-02-08
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2031-02-08
Also published as: EP2539354A4; WO2011097640A1; JP6125232B2; KR20120125283A; EP2539354A1; JP2013518599A; CA2788902A1; AU2011213559B2; CA2788902C; JP2016063835A; US9034313B2; US20130017224A1; EP2539354B1; KR101784177B1; AU2011213559A1; CN102781952B

Abstract

本发明公开了包含编码RANTES及其片段和变体的核苷酸序列的核酸分子。另外，提供了包含与编码免疫原的核酸序列相结合的编码RANTES及其片段和变体的核苷酸序列的核酸分子和组合物。还提供了包含编码RANTES及其片段和变体的核苷酸序列、具有或不具有编码免疫原的核酸序列的重组病毒载体，其为包含编码RANTES及其片段和变体的核苷酸序列的减活病原体。还公开了调节免疫反应和诱导对抗免疫原的免疫反应的方法。

Description

编码RANTES的核酸分子、包含其的组合物以及其使用方法

发明领域

本发明涉及编码RANTES的核酸分子。本发明涉及包含编码RANTES的核苷酸序列的疫苗，以及预防性和/或治疗性免疫个体以对抗免疫原的方法，还涉及包含编码RANTES的核苷酸序列的免疫治疗组合物，以及免疫治疗方法。

发明背景

本申请要求美国临时申请第61/302,324号的优先权，其以引用方式整体并入本文。

RANTES，其为活化时调节的、正常T细胞表达和分泌的(Regulated upon Activation,Normal T-cell Expressed,and Secreted)的缩写，是被分类为趋化细胞因子或趋化因子的8kDa蛋白质。RANTES被鉴定为在T细胞活化后的几天表达的基因。已发现在许多人类疾病中表达的ACC趋化因子，RANTES，在T淋巴细胞中被Kruppel样因子13(KLF13)所调节。

与趋化因子受体CCR3、CCR5和CCR1相互作用的RANTES对T细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞具有趋化性。其参与白细胞向炎性位点的募集。RANTES与由T细胞释放的细胞因子IL-2和IFN-γ的结合诱导某些天然杀伤(NK)细胞的增殖和活化。这样的细胞被称作CHAK(CC-趋化因子激活的杀伤)细胞。

以引用方式并入本文的美国申请第09/622,452号公开了使用编码RANTES的核酸分子作为免疫治疗剂和疫苗组分的组合物和方法。当用作免疫治疗剂时RANTES的表达改变了在表达其的个体内免疫系统的某些方面。类似地，当用作疫苗的一部分时RANTES的表达增强了对抗疫苗免疫原的免疫反应的某些方面。

免疫治疗是指调节人的免疫反应以赋予所期望的治疗作用。免疫治疗剂是指当施用于个体时调节个体的免疫系统足以最终减少与不期望的免疫反应相关的症状或足以通过增强所期望的免疫反应来最终减轻症状的那些组合物。在有些情况中，免疫治疗是疫苗接种规程的一部分，在所述疫苗接种规程中对个体施用所述疫苗，该疫苗使个体暴露于在此情况下个体为对抗其而产生免疫反应的免疫原，免疫治疗剂增强免疫反应和/或选择性增强对治疗或预防特定病况、感染或疾病而言所需的免疫反应的部分(例如细胞免疫(cellular arm)或体液免疫(humoral arm))。

疫苗规程可通过递送调节人免疫反应以诱导改善的免疫反应的试剂来改善。在对个体施用使个体暴露于个体对抗其产生免疫反应的免疫原的疫苗的一些接种规程中，提供增强免疫反应和/或选择性增强对治疗或预防特定病况、感染或疾病而言所需的免疫反应的部分(例如细胞免疫或体液免疫)的试剂。

疫苗对于免疫个体以对抗靶抗原例如变应原、病原体抗原或与参与人类疾病的细胞相关的抗原是有用的。与参与人类疾病的细胞相关的抗原包括癌相关的肿瘤抗原和与参与自身免疫病的细胞相关的抗原。

在设计这样的疫苗时，已认识到在接种疫苗个体的细胞中产生靶抗原的疫苗在诱导免疫系统的细胞免疫中是有效的。具体地，使用无毒性载体和DNA疫苗的减活疫苗、重组疫苗各自在接种疫苗的个体的细胞中导致抗原的产生，这导致对免疫系统的细胞免疫的诱导。另一方面，尽管死疫苗或灭活疫苗和仅包含蛋白质的亚单位疫苗可诱导有效的体液反应，但不诱导良好的细胞免疫反应。

细胞免疫反应对于提供对抗病原体感染的防护和对于提供用于治疗病原体感染、癌症或自身免疫疾病的有效的免疫介导的治疗通常是必须的。因此，在接种疫苗的个体的细胞中产生靶抗原的疫苗例如使用无毒性载体的减活疫苗、重组疫苗和DNA疫苗通常是优选的。

已研究了直接施用核酸序列来递送蛋白质或针对动物和人疾病来进行疫苗接种并且大量努力集中于核酸递送的有效和高效手段以便产生治疗/佐剂蛋白质和/或期望抗原的必要表达。

DNA疫苗具有许多优于较传统的基因递送和疫苗接种方法（例如减活病毒和重组蛋白质类疫苗）的优点。DNA疫苗安全、稳定、易于生产，并且在人类中良好耐受，其中临床前试验表明质粒整合迹象较少[Martin,T.等,Plasmid DNA malaria vaccine:the potential forgenomic integration after intramuscular injection.Hum Gene Ther,1999.10(5):第759-68页;Nichols,W.W.等,Potential DNA vaccine integrationinto host cell genome.Ann N Y Acad Sci,1995.772:第30-9页]。另外，由于疫苗的效力不受预先存在的抗体滴度对载体的影响，DNA疫苗非常适合于反复施用[Chattergoon,M.,J.Boyer,和D.B.Weiner,Genetic immunization:a new era in vaccines and immune therapeutics.FASEB J,1997.11(10):第753-63页]。然而，临床采用DNA疫苗的一个主要障碍是当转移到较大动物时平台(platform)免疫原性的降低[Liu,M.A.和J.B.Ulmer,Human clinical trials ofplasmid DNA vaccines.Adv Genet,2005.55:第25-40页]。DNA疫苗免疫原工程的最新技术进步，如密码子优化、RNA优化和免疫球蛋白前导序列的添加已改善了DNA疫苗的表达和免疫原性[Andre,S.,等,Increased immuneresponse elicited by DNA vaccination with a synthetic gp 120sequencewith optimized codon usage.J Virol,1998.72(2):第1497-503页;Deml,L.,等,Multiple effects of codon usage optimization on expression andimmunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the humanimmunodeficiency virus type 1Gag protein.J Virol,2001.75(22):第10991-1001页;Laddy,D.J.,等,Immunogenicity of novelconsensus-based DNA vaccines against avian influenza.Vaccine,2007.25(16):第2984-9页;Frelin,L.等,Codon optimization and mRNAamplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis Cvirus nonstructural 3/4A gene.Gene Ther,2004.11(6):第522-33页]，以及质粒递送系统中最近开发的技术，如电穿孔[Hirao,L.A.,等,Intradermal/subcutaneous immunization by electroporation improvesplasmid vaccine delivery and potency in pigs and rhesus macaques.Vaccine,2008.26(3):第440-8页;Luckay,A.等,Effect ofplasmid DNAvaccine design and in vivo electroporation on the resultingvaccine-specific immune responses in rhesus macaques.J Virol,2007.81(10):第5257-69页;Ahlen,G.,等,In vivo electroporation enhancesthe immunogenicity of hepatitis C virus nonstructural 3/4A DNA byincreased local DNA uptake,protein expression,inflammation,andinfiltration of CD3⁺T cells.J Immunol,2007.179(7):第4741-53页]。另外，研究已表明使用共有免疫原(consensus immunogen)与单独的天然抗原相比，能够增强细胞免疫反应的宽度[Yan,J.等,Enhancedcellular immune responses elicited by an engineered HIV-1subtype Bconsensus-based envelope DNA vaccine.Mol Ther,2007.15(2):第411-21页;Rolland,M.等,Reconstruction and function of ancestralcenter-of-tree human immunodeficiency virus type 1proteins.J Virol,2007.81(16):第8507-14页]。

用于递送核酸序列例如质粒DNA的一种方法是电穿孔(EP)技术。该技术已被用于人临床试验以递送抗癌症药物，例如争光霉素，和用于大量动物物种的许多临床前研究。

虽然疫苗对于预防性或治疗性地免疫个体以对抗病原体感染或人类疾病通常是有效的，但是仍存对具有改善的疫苗的需求。需要产生增强的免疫反应的组合物和方法。同样地，虽然一些免疫治疗剂对于调节患者内的免疫反应是有用的，但仍存在对具有改善的免疫治疗组合物和方法的需求。

发明概述

本发明涉及包含选自由以下组成的组的核苷酸序列的核酸分子：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、与SEQID NO:195%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:395%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:595%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:795%同源的核酸序列；包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:1的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:1的功能片段95%同源的核酸序列、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段95%同源的核酸序列、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段95%同源的核酸序列和与包含至少60个核苷酸的SEQ IDNO:7的功能片段95%同源的核酸序列。

本发明还涉及组合物，所述组合物包含多个一种或多种核酸分子，其包含选自由以下组成的组的一种或多种核酸序列：1)选自由下述序列组成的组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQID NO:7、与SEQ ID NO:195%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:395%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:595%同源的核酸序列、与SEQ IDNO:795%同源的核酸序列；包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:1的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段、与包含至少60个核苷酸的SEQ IDNO:1的功能片段95%同源的核酸序列、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段95%同源的核酸序列、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段95%同源的核酸序列和与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段95%同源的核酸序列；和b)编码一种或多种免疫原的一种或多种另外的核酸序列。

本发明另外涉及调节免疫反应的方法，所述方法包括向个体施用核酸分子或组合物的步骤，所述核酸分子包含选自由下述组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7、与SEQ ID NO:195%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:395%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:595%同源的核酸序列、与SEQ IDNO:795%同源的核酸序列；包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:1的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段、与包含至少60个核苷酸的SEQ IDNO:1的功能片段95%同源的核酸序列、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段95%同源的核酸序列、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段95%同源的核酸序列和与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段95%同源的核酸序列；所述组合物包含多个一种或多种核酸分子，其包含选自由以下组成的组的一种或多种核酸序列：1)选自由下述组成的组：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、与SEQ ID NO:195%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:395%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:595%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:795%同源的核酸序列；包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:1的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:1的功能片段95%同源的核酸序列、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段95%同源的核酸序列、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段95%同源的核酸序列和与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段95%同源的核酸序列；和b)编码一种或多种免疫原的一种或多种另外的核酸序列。

本发明进一步涉及包含选自由以下组成的组的核苷酸序列的重组病毒载体：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7、与SEQ ID NO:195%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:395%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:595%同源的核酸序列、与SEQ IDNO:795%同源的核酸序列；包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:1的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段、与包含至少60个核苷酸的SEQ IDNO:1的功能片段95%同源的核酸序列、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段95%同源的核酸序列、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段95%同源的核酸序列和与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段95%同源的核酸序列。

本发明还涉及调节个体内的免疫反应的方法，所述方法包括向所述个体施用重组病毒载体，所述重组病毒载体包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQID NO:7、与SEQ ID NO:195%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:395%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:595%同源的核酸序列、与SEQ IDNO:795%同源的核酸序列；包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:1的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段、与包含至少60个核苷酸的SEQ IDNO:1的功能片段95%同源的核酸序列、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段95%同源的核酸序列、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段95%同源的核酸序列和与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段95%同源的核酸序列。

本发明另外涉及包含选自由以下组成的组的核苷酸序列的减活病原体：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、与SEQ ID NO:195%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:395%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:595%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:795%同源的核酸序列；包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:1的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ IDNO:7的功能片段、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:1的功能片段95%同源的核酸序列、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段95%同源的核酸序列、与包含至少60个核苷酸的SEQ IDNO:5的功能片段95%同源的核酸序列和与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段95%同源的核酸序列。

本发明还涉及免疫个体以对抗病原体的方法，所述方法包括向所述个体施用减活病原体，所述减活病原体包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7、与SEQ ID NO:195%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:395%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:595%同源的核酸序列、与SEQ IDNO:795%同源的核酸序列；包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:1的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段、与包含至少60个核苷酸的SEQ IDNO:1的功能片段95%同源的核酸序列、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段95%同源的核酸序列、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段95%同源的核酸序列和与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段95%同源的核酸序列。

附图简述

图1a-1e示出表明在用EP进行DNA接种后强烈细胞免疫反应的诱导的数据。每次免疫后对SIVgag(白色带)、env(灰色带)和pol(黑色带)的总反应显示为叠加组平均反应±SEM。使用杜克事后检验(Tukey post hoc test)和邓尼特T3事后检验(Dunnett T3post hoc)来分别测定第三和第四次免疫的组之间的差异显著性。

图2a-2c示出DNA免疫后离体(ex-vivo)的增殖能力。将在第四次免疫后两周分离的新鲜PBMC用CFSE染色并用SIVgag(白条带)、env(灰色带)和pol(黑色带)肽活体外刺激5天以测定抗原特异性细胞的增殖能力。图2a中，示出了代表性动物的点图。总SIV增殖反应作为叠加组平均反应±SEM对于CD4⁺T细胞区室示于图2b且对于CD8⁺T细胞区室示于图2c中。通过进行配对曼-惠特尼检验(pair-wiseMann-Whitney test)，用邦费罗尼(Bonferroni)校正来测定各组之间的统计学差异，p值<0.017为显著。

图3a-3d示出免疫后SIVpol反应的多功能图谱。在第四次免疫后2周分离的PBMC在活体外用SIVpol肽库混合物(peptide pool mix)刺激5小时。对细胞染色以分析细胞内IFNγ、TNF α和IL-2的产生以及通过CD107a的脱粒。图3a示出对于细胞内细胞因子染色的代表性设门分析(gating analysis)。通过使用前向散射高度(FSC-H)和前向散射面积(FSC-A)来区分单态群体(singlet population)。随后我们通过FSC-A使用侧向散射面积(SSC-A)来分离淋巴细胞群体。活T细胞对于针对生存力、CD14、CD16和CD19的Pacific Blue清除设门(dumpgate)（包括鲜紫色染料(Violet Vivid Dye)）鉴定为阴性染色，而对于CD3为阳性染色。此后，在相对于IFNγ的CD8⁺和CD4⁺事件上连续设门事件证明下调。在该实施例中示出为鉴定CD8⁺T细胞的设门。第一CD3⁺CD8⁺T细胞通过阳性CD8染色和阴性CD4染色，以排除活化后可具有上调的CD8的任何CD4⁺T细胞来鉴定。CD28和CD95染色从分析中排除天然CD8⁺T细胞。然后对于在我们的小组：CD107a、IL-2、IFNγ和TNFα中四个功能中的每一个设门所得经历抗原的CD8⁺T细胞。图3a和3b中的条形图描述了15种功能组合中每一种的频率。图3b示出CD4⁺T细胞反应。图3c示出CD8⁺T细胞反应。圆饼图示出具有4种功能(紫色或黑灰色)、3种功能(黄色或淡灰)、2种功能(绿色或中等黑灰色)或1种功能(浅蓝或灰色)的SIVpol特异性CD4⁺T细胞的比例。叠加于圆饼图上的数字表示SIVpol反应的总频率。图3d涉及IFNγ⁺单功能CD8⁺T细胞的记忆表型。IFNγ⁺单功能(黑灰色)的点图通过CD95密度图叠加于CD28上以测定该群体的记忆表型。示出在DNA+12组中的来自代表性动物的染色。

图4a和4b示出多功能记忆T细胞群体的维持。在最后免疫(SIVmac251激发之日)后八个月分离的PBMC用SIVpol肽库混合物活体外刺激5小时。对细胞染色以在细胞内产生IFNγ、TNFα和IL-2以及通过CD107a脱粒。图4a和4b中的条形图描述了15种功能组合中每一种的频率。图4a示出CD4⁺T细胞反应。图4b示出CD8⁺T细胞反应。圆饼图示出具有4种功能(紫色或黑灰色)、3种功能(黄色或淡灰色)、2种功能(绿色或中等黑灰色)或1种功能(浅蓝色或灰色)的SIVpol特异性CD4⁺T细胞的比例。叠加于圆饼图上的数字表示SIVpol反应累频。

图5a-5d示出来自SIVmac251粘膜激发的数据。图5a示出在激发前、激发后第2周(峰)、第14周(设定点)和第35周(长期)时接种(或淡灰色)和未接种(●或黑灰色)的动物之间的病毒载量的比较。图5b示出通过组：天然(●或黑灰色)、DNA(●或灰色)、DNA+12(●或中等黑灰色)、DNA+RANTES(或淡灰色)的激发前、峰、设定点和长期病毒载量的比较。图5c示出曲线图下的面积。示出组平均值。图5d示出了在峰、设定点和长期感染期间的保护性I类等位基因、Mamu-B*03和Mamu-B*017(或淡灰色)和非对照等位基因(■或黑灰色)动物之间的病毒载量的比较。进行双尾T检验以测定对于图5a和5d的组之间的差异的显著性，并且在图5b中使用具有双尾邓尼特事后检验(Dunnett post hoc test)的ANOVA。

图6a-6e示出在SIVmac251粘膜激发后的CD4⁺T细胞损耗。示出在激发后外周CD4⁺T细胞计数的变化。CD4⁺T细胞计数的相对变化描述为基线计数的百分比，和对于天然(■)、DNA(▲)、DNA+12

和DNA+RANTES(

)组示出组平均±SEM。激发后个别CD4⁺T细胞损耗的时间过程。在各组中突出显示具有与保护相关的单体型的动物。除了在具有Mamu-B*017等位基因的DNA+12组中的4394之外全部具有Mamu-B*003等位基因。

图7a和7b示出免疫后CCR5⁺T细胞的诱导。在第三次免疫(即，用于诱导分子佐剂的最后一次免疫)后分离的冷冻保存的PBMC用SIVpol肽刺激，并通过由ICS动员的IFNγ、TNFα、IL-2或CD107a的产生来鉴定抗原特异性细胞。测定对于CD8⁺T细胞区室(数据示于图7a)和CD4⁺T细胞区室(数据示于图7b)的SIVpol特异性，CCR5⁺细胞的频率。在总CD8或CD4群体中数据显示为频率。IFNγ和TNFα结合到相同荧光基团上，以在该小组中适应另外的染色。

详细描述

提供编码人RANTES的核酸分子，其具有设计为在人细胞中产生高表达水平的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。由核苷酸序列编码的RANTES的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2中。核苷酸序列可以可操作地连接到在人细胞中表达所需的调控元件。可提供另外的元件和序列以进一步增强表达水平。包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:7的质粒、病毒载体或细胞可施用于个体并在个体的细胞中表达，以将功能RANTES蛋白质递送到个体。另外，可对用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7转化的宿主细胞进行培养以产生RANTES蛋白质。

当作为免疫治疗剂或疫苗的一部分递送时，编码RANTES及其功能片段的核酸分子调节免疫反应。因此，编码RANTES及其功能片段的核酸分子可作为免疫治疗剂和/或与疫苗组合或作为疫苗的组分递送，所述疫苗组分还包括编码需要免疫反应对抗的免疫原性靶标的核酸分子。

虽然不受科学理论束缚，但用于调节免疫反应的免疫治疗剂可包含核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:7。可用于激发对抗免疫原的增强的免疫反应的疫苗可包含下述中的一种或多种：1)包含SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7和编码靶标免疫原的核苷酸序列的核酸分子；2)包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的第一核酸分子和包含编码靶标免疫原的核苷酸序列的第二核酸分子。

可使用这样的核酸分子来进行免疫治疗和免疫方法。为了实现RANTES的高水平表达，可将免疫治疗剂和疫苗制备为具有可操作地连接到SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的调控元件。

将编码RANTES或其功能片段的核酸序列递送到个体来调节个体内的免疫反应。当作为免疫治疗剂递送时，编码RANTES或其功能片段的核酸序列调节个体内的免疫反应以缓解涉及免疫系统的各种疾病、病况和病症的症状或病因。当作为疫苗的组分与编码免疫原的核酸序列一起递送到个体时增强对抗免疫原的免疫反应。当编码RANTES或其功能片段的核酸分子施用于个体时，RANTES被细胞吸收并表达于细胞中，因此，将RANTES蛋白质递送到个体。就疫苗而言，也施用编码免疫原的核酸序列，其被细胞吸收和表达，由此产生免疫原性蛋白质。递送蛋白质编码序列的方法可包括递送多个单核酸分子或多个多种不同的核酸分子。蛋白质的编码序列可以是例如质粒的一部分、重组疫苗或减毒疫苗。

提供对个体进行预防性和/或治疗性免疫以对抗病原体或异常、疾病相关的细胞的组合物和方法。所述疫苗可以是诸如减活疫苗、重组疫苗或核酸或DNA疫苗的任何疫苗类型。通过递送编码免疫原和RANTES或其功能片段的核酸分子，可以调节由疫苗诱导的免疫反应。当经由可表达的核酸分子，例如作为质粒或者重组载体或减活病原体或细胞的一部分递送时RANTES是特别有用的。当在未感染或无疾病个体内为了诱导保护性免疫反应而预防性递送时，RANTES是特别有用的。编码RANTES的核酸分子可在不含细胞的组合物中递送。在一些实施方案中，可施用编码RANTES的核酸分子而无任何其它细胞因子。

使用标准技术和易于获得的原料可以制备编码RANTES蛋白质的核酸分子。

提供用于递送RANTES的组合物、使用所述组合物的方法，以及疫苗和免疫方法。所述组合物包含核酸分子，所述核酸分子包括可操作地连接到调控元件的编码RANTES或其功能片段的核苷酸序列。当为疫苗的一部分时，所述组合物包括可操作地连接到调控元件的编码免疫原的核苷酸序列。可将包含该组合物的可注射药物组合物施用于个体。

1.定义

本文使用的术语仅为了描述特定实施方案，并非旨在限定。如说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”除非上下文明确规定否则包括复数个指示物。

对于本文数值范围的引用，明确地包含具有相同精确度的介于其间的数。例如，对于6-9的范围，除了6和9之外，还包括数7和8，对于6.0-7.0的范围，明确地包括数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

a.佐剂

如本文使用的“佐剂”指添加到本文所述的DNA质粒疫苗以增强由下文所述DNA质粒和编码核酸序列编码的抗原的免疫原性的任何分子。

b.抗体

如本文使用的“抗体”指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE类抗体，或者其片段、片段或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd和单链抗体、双链体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。所述抗体可以是从哺乳动物的血清样品分离的抗体、多克隆抗体、亲和纯化的抗体或对期望的表位或由其衍生的序列显示足够的结合特异性的这些抗体的混合物。

c.编码序列

如本文使用的“编码序列”或“编码核酸”指包括编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列可进一步包含可操作的连接到调节元件的起始信号和终止信号，包括能够指导在施用所述核酸的个体或哺乳动物的细胞内表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。

d.互补

如本文使用的“互补(complement)”或“互补性(complementary)”指核酸能够在核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间形成沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或胡斯坦(Hoogsteen)碱基配对。

e.恒定电流

如本文使用的“恒定电流”指在将电脉冲传送到相同组织期间，由所述组织或界定所述组织的细胞所接受或经历的电流。电脉冲由本文所述的电穿孔设备传送。由于本文提供的电穿孔设备具有反馈元件，优选具有瞬时反馈，所以在电脉冲周期内该电流在所述组织内保持于恒定安培数。反馈元件可测量贯穿脉冲期间组织(或细胞)的电阻，并引起电穿孔设备改变其电能输出(例如，增加电压)因此贯穿电脉冲(大约几微秒)和从脉冲至脉冲在相同组织内的电流保持恒定。在一些实施方案中，反馈元件包括控制器。

f.电流反馈或反馈

“电流反馈”或“反馈”可交换使用，并且是指提供的电穿孔设备的主动响应，其包括测量电极之间的组织内的电流和相应地改变由EP设备传送的能量输出以便保持电流于恒定水平。该恒定水平由使用者在引发脉冲序列或电处理之前进行预设。反馈可伴随有电穿孔设备的电穿孔组件，例如控制器，因为其中的电路能够连续地监控电极之间的组织内的电流和比较监控的电流(或组织内的电流)与预设的电流并连续地使能量输出调节以保持监控的电流于预设水平。由于它是模拟闭环反馈，所以反馈回路可以是瞬间的。

g.分散电流

本文使用的“分散电流”指从本文所述的电穿孔设备的各种针电极阵列传送的电流模式，其中所述模式最小化，或优选消除在待电穿孔的组织的任何区域上的电穿孔相关的热应力的发生。

h.电穿孔

如本文可交换使用的“电穿孔”、“电透化”或“电动力增强”(“EP”)指使用横跨膜电场脉冲来诱导生物膜中的微观通路(孔)；它们的存在允许生物分子例如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水从细胞膜的一侧通过到另一侧。

i.反馈机制

如本文使用的“反馈机制”指通过软件或者硬件(或固件)进行的处理，该处理接受并将所需组织(能量脉冲传送之前、期间和/或之后)的阻抗与预定值，优选电流进行比较，并调节传送的能量脉冲以达到预定值。可通过模似闭环电路进行反馈机制。

j.功能片段

如本文使用的“功能片段”对于SEQ ID NO:1是指以下核酸分子：1)具有与小于全长SEQ ID NO:1的SEQ ID NO:1的一部分对应的核苷酸序列(即除其全长SEQ ID NO:1之外)的核酸分子，和2)编码具有RANTES活性(即当在人类中表达时，其作为当SEQ ID NO:1在人类中表达时产生的RANTES发挥作用)的多肽的核酸分子。功能片段的大小可以是90或以上、120或以上、150或以上、180或以上、210或以上或240或以上的长度。DNA片段可小于10个核苷酸、小于20、小于30、小于40、小于50、小于60、小于75、小于90、小于120、小于150、小于180、小于210或小于240。为了本文公开的目的，期望本文所述的大小也构成大小的范围例如DNA功能片段的大小可以是20-90、20-120、20-150、20-180、20-210、20-240、30-90、30-120、30-150、30-180、30-210、30-240、40-90、40-120、40-150、40-180、40-210、40-240、50-90、50-120、50-150、50-180、50-210、50-240、60-90、60-120、60-150、60-180、60-210、60-240、75-90、75-120、75-150、75-180、75-210、75-240、90-120、90-150、90-180、90-210、90-240、20-90、120-150、120-180、120-210、120-240、150-180、150-210、150-240、180-210、180-240和210-240的长度。

“功能片段”对于多肽序列指由作为非全长SEQ ID NO:2，即除SEQ ID NO:2之外的功能片段核酸分子编码的多肽。多肽片段可以是30个或以上的氨基酸长度、35或以上、40或以上、45或以上、50或以上、55或以上、60或以上、65或以上、70或以上、75或以上、80或以上、85或以上或90或以上的长度。多肽片段可以小于10个氨基酸、小于15、小于20、小于25、小于30、小于35、小于40、小于45、小于50、小于55、小于60、小于65、小于70、小于75、小于80、小于85或小于90个氨基酸的长度。为了在本文公开的目的，期望本文所述的大小也构成大小的范围，例如蛋白质功能片段的大小可以是30-35、30-40、30-45、30-50、30-55、30-60、30-65、30-70、30-75、30-80、30-85、30-90、35-40、35-45、35-50、35-55、35-60、35-65、35-70、35-75、35-80、35-85、35-90、40-45、40-50、40-55、40-60、40-65、40-70、40-75、40-80、40-85、40-90、45-50、45-55、45-60、45-65、45-70、45-75、45-80、45-85、45-90、50-55、50-60、50-65、50-70、50-75、50-80、50-85、50-90、55-60、55-65、55-70、55-75、55-80、55-85、55-90、60-65、60-70、60-75、60-80、60-85、60-90、65-70、65-75、65-80、65-85、65-90、70-75、70-80、70-85、70-90、75-80、75-85、75-90、80-85、85-90和85-90的长度。

k.遗传构建体

如本文使用的术语“遗传构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列包括可操作地连接到调控元件的起始和终止信号，所述调控元件包括能够指导在施用核酸分子的个体的细胞中表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。如本文使用的术语“可表达形式”是指包含可操作地连接到编码蛋白质的编码序列的必要调控元件的基因构建体，从而当存在于个体的细胞中时，将表达编码序列。

l.同一

如在本文的两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中使用的“同一”或“同一性”指所述序列具有在特定区域内相同的特定百分比的残基。所述百分比可以通过下述来计算：优化比对两个序列、在特定区域比较两个序列、测定同一残基在两个序列中出现的位置的数量以产生匹配位置的数量，用匹配位置的数量除以特定区域中位置的总数，和将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。在两个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端以及比较的特定区域仅包括单序列的情况中，单序列残基被包含于计算的分母而非分子中。当比较DNA和RNA时，可将胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)视为相当。同一性可以人工或通过使用电脑序列算法例如BLAST或BLAST2.0来进行。

m.阻抗

当论述反馈机制时可以使用“阻抗”并且根据欧姆定律可以转换为电流值，因此，能够与预定电流比较。

n.免疫反应

如本文使用的“免疫反应”指宿主免疫系统，如哺乳动物的免疫系统响应于抗原例如流行性感冒血凝素共有抗原而活化。免疫反应可以是细胞或体液反应的形式，或两者。

o.核酸

如本文使用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”指共价连接到一起的至少两个核苷酸。单链的描述也定义了互补链的序列。因此，核酸还包括所述单链的互补链。出于相同的目的可以将核酸的许多变体作为给定的核酸来使用。因此，核酸还包括基本上同一的核酸及其互补链。单链提供在严格杂交条件下能够与靶标序列杂交的探针。因此，核酸还包括在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链或双链，或者可以包含双链和单链序列两者的一部分。核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂化物，其中核酸可包含脱氧核糖和核糖核苷酸的组合，和包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成法或通过重组法来获得。

p.可操作地连接

如本文使用的“可操作地连接”指基因的表达在空间连接的启动子的控制下。启动子可位于在其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子和基因之间的距离可以与在启动子从中衍生的基因中启动子和其控制的基因之间的距离大致相同。如本领域已知的那样，可以在不丧失启动子功能的情况下调节该距离的变化。

q.启动子

如本文使用的“启动子”指能够赋予、活化或增强核酸在细胞中的表达的合成或天然来源的分子。启动子可以包含一个或多个具体的转录调节序列以进一步增强其表达和/或改变空间表达和/或时序表达。启动子还可包含远端增强子或阻遏子元件，其可位于距转录起始位点多达几千个碱基对。启动子可源自于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可根据其中发生表达的细胞、组织或器官或者根据发生表达的发育阶段，或响应于外界刺激例如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂来调节基因组分的组成性，或差异性表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和CMV IE启动子。

r.严格杂交条件

如本文使用的“严格杂交条件”指使第一核酸序列(例如，探针)与第二核酸序列(例如，靶标)在例如核酸的复杂混合物中杂交的条件。严格条件是序列依赖的并且在不同的环境中将不同。严格条件对于特异性序列可选定为在规定的离子强度pH下低于热解链温度(T_m)约5-10℃。T_m可以是50%的与靶标互补的探针以平衡态杂交到靶标序列(因为靶标序列过量存在，在T_m处，平衡时50%的探针被占据)时的温度(在规定的离子强度、pH和核酸浓度下)。严格条件可以是在pH7.0至8.3时盐浓度小于约1.0M钠离子，例如约0.01-1.0M钠离子(或其它盐)浓度和温度对于短探针(例如，约10-50个核苷酸)为至少约30℃和对于长探针(例如，大于约50个核苷酸)为约60℃的条件。也可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来达到严格条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可以是背景杂交的至少2至10倍。示例性严格杂交条件包括以下：50%的甲酰胺、5×SSC和1%SDS，在42℃下孵育，或5×SSC、1%SDS，在65℃下孵育，在65℃下在0.2×SSC和0.1%SDS中洗涤。

s.基本上互补

如本文使用的“基本上互补”指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250或更多个核苷酸或在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90或更多个氨基酸的区域内，第一序列与第二序列的互补链具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的同一性，或者是指两种序列在严格杂交条件下杂交。

t.基本上同一

如本文使用的“基本上同一”指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250或更多个核苷酸或在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90或更多个氨基酸的区域内，第一和第二序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的同一性，或者对于核酸，如果第一序列基本上互补于第二序列的互补链。

u.变体

如本文使用的“变体”对于核酸是指(i)引用的核苷酸序列的一部分或片段；(ii)引用的核苷酸序列的互补链或其部分；(iii)基本上相同于引用的核酸的核酸或其互补链；或(iv)在严格条件下与引用的核酸杂交的核酸，其互补链，或与其基本上同一的序列。

“变体”对于肽或多肽是指通过插入、缺失或保守性置换氨基酸而使氨基酸序列不同，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。变体还可以是指具有基本上与引用的蛋白质同一的氨基酸序列的蛋白质，所述引用的蛋白质具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性置换，即用性质相似(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来替代氨基酸在本领域内作为典型地涉及的微小变化是公知的。如本领域内所理解的那样，可以通过考虑氨基酸的亲水性指标来部分地鉴定这些微小变化。Kyte等，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水性指标是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域内己知可取代亲水性指标相似的氨基酸而仍保留蛋白质功能。在一方面，取代具有±2的亲水性指标的氨基酸。氨基酸的亲水性还可用于揭示将导致蛋白质保留生物功能的置换。考虑到肽背景中的亲水性氨基酸，允许计算最大的肽的局部平均亲水性(local averagehydrophilicity)，全部以引用方式并入本文的美国专利4,554,101已报道了有用的措施以使抗原性和免疫原性良好关联。如本领域内所理解的那样，具有相似亲水性值的氨基酸的置换可导致肽保留生物活性，例如免疫原性。可用彼此的亲水性值在±2内的氨基酸进行置换。氨基酸的亲水性和亲水性值两者均受到氨基酸特殊侧链的影响。与所述观察一致，认识到与生物功能相容的氨基酸置换依赖于氨基酸，特别是这些氨基酸的侧链的相对相似性，正如疏水性、亲水性、电荷、大小及其它性质所揭示。

v.载体

如本文使用的“载体”指包含复制起点的核酸序列。所述载体可以是载体、噬菌体、细菌、人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制染色体外载体，并优选为DNA质粒。

2.RANTES

RANTES由SEQ ID NO:1所编码。所述序列可进一步包含一个或多个另外的氨基酸序列元件。例如由核酸序列编码的RANTES可进一步在其N末端包含IgE或IgG前导氨基酸序列。IgE前导氨基酸序列可以是SEQ ID NO:3。同样地，编码IgE或IgG前导序列的编码序列可以连接到编码免疫原的编码序列。

优化SEQ ID NO:1以便高水平表达。核酸序列可在5’非翻译区包含Kozak序列。核酸序列可进一步包含编码前导序列的核酸序列。N末端前导序列的编码序列为RANTES编码序列的5’端。N末端前导区可有助于分泌。N末端前导区可以是IgE前导区或IgG前导区。SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:1公开的一样是RANTES编码序列，进一步包含IgE编码序列；前导序列连接到RANTES蛋白质的N末端。核酸序列可在5’非翻译区包含Kozak序列。SEQ ID NO:5与SEQ IDNO:3公开的一样是IgE前导RANTES编码序列并在5’非翻译区进一步包含Kozak序列。

3.遗传构建体和质粒

本文提供的是可包含编码RANTES或其功能片段的核酸序列的遗传构建体。遗传构建体可作为包含编码RANTES或其功能片段的核酸的功能性染色体外分子存在于细胞中。包含编码RANTES或其功能片段的核酸的遗传构建体可以是含有着丝点、端粒(telomer)或质粒或粘粒的微型染色体。

遗传构建体还可以是重组病毒载体，包括重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘的基因组的一部分。遗传构建体可以是细胞内存活的减活细菌或重组细菌载体中遗传物质的一部分。

遗传构建体可包含用于RANTES或其功能片段的基因表达的调控元件。调控元件可以是启动子、增强子、起始密码子、终止密码子或多聚腺苷酸化信号。

组合物可以包含编码RANTES或其功能片段的第一核酸序列，并可以进一步包含一个或多个另外的编码一个或多个免疫原的核酸序列。第一和另外的核酸序列可存在于相同的核酸分子或不同的核酸分子上。第一和另外的核酸序列可受控于在在人细胞中起作用的调控元件。

核酸序列构成可以是载体的遗传构建体。载体能够以有效引起个体内免疫反应的量在个体的细胞内表达RANTES或其功能片段。载体可以是重组的。载体可包含编码RANTES或其功能片段的异质核酸。载体可以是质粒。所述载体可用于用编码RANTES或其功能片段的核酸转染细胞，在RANTES或其功能片段发生表达的条件下培养和保持转化的宿主细胞。

载体可包含编码RANTES或其功能片段的异质核酸并可进一步包含可以在RANTES或其功能片段编码序列上游的起始密码子，和可以在RANTES或其功能片段编码序列下游的终止密码子。起始和终止密码子可以与RANTES或其功能片段编码序列在框(frame)内。载体还可包含可操作地连接到RANTES或其功能片段编码序列的启动子。可操作地连接到RANTES或其功能片段编码序列的启动子可以是来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷性病毒(HIV)启动子例如牛免疫缺陷性病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼病毒启动子、禽类白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子例如CMV立即早期启动子、EB病毒(EBV)启动子或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子。启动子可还以是来自人类基因例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白的启动子。启动子还可以是组织特异性启动子，例如肌肉或皮肤特异性启动子，天然或合成的。该启动子的实例描述于美国专利申请公布第US20040175727号，其内容全部并入本文。

载体还可包含多聚腺苷酸化信号。其可以在RANTES或其功能片段编码序列的下游。多聚腺苷酸化信号可以是SV40多聚腺苷酸化信号、LTR多聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多聚腺苷酸化信号或人β-球蛋白多聚腺苷酸化信号。SV40多聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4载体(Invitrogen,SanDiego San Diego,CA)的多聚腺苷酸化信号。

载体还可在RANTES或其功能片段编码序列的上游包含增强子。增强子可以是DNA表达所必须的。增强子可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子例如来自CMV、HA、RSV或EBV之一。在美国专利第5,593,972号、第5,962,428号和WO94/016737中描述了多聚核苷酸功能增强，其各自的内容以引用的方式整体并入。

载体还可包含哺乳动物复制起点以便在细胞中使载体保持于染色体外并产生多个载体的拷贝。载体可以是来自Invitrogen(SanDiego,CA)的pVAX1、pCEP4或pREP4，其可包含EB病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区，其可产生高拷贝游离型复制而不整合。载体的主链可以是pAV0242。载体可以是复制缺陷性腺病毒型5(Ad5)载体。

载体还可包含可良好地适应于在向其施用载体的人细胞中的基因表达的调节序列。RANTES或其功能片段编码序列允许宿主细胞中编码序列更有效地转录。载体可以是通过常规技术和易于获得的原料来产生蛋白质的表达载体或系统，包括Sambrook等，MolecularCloning A Laboratory Manual,Second Ed.,Cold Spring Harbor(1989)，其以引用的方式全部并入。

对于RANTES或其功能片段本文公开的遗传构建体和元件还可设计为具有编码除RANTES或其功能片段之外的免疫原的编码序列，由此该构建体将与编码RANTES或其功能片段的核酸序列一起提供诱导对抗免疫原的免疫反应的改善的疫苗。

4.药物组合物

本文提供的是根据本发明的药物组合物，其包含约1纳克至约10mg的DNA。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含来自下述1)之间和2)之间：1)至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克，或至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895.900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克，或至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10毫克或更多；2)高达且包括15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100，或高达且包括1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895.900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995、或1000，或高达且包括1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10毫克。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约5纳克至约10毫克的DNA。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约25纳克至约5毫克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约50纳克至约1毫克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约0.1至约500微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约1至约350微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约5至约250微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约10至约200微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约15至约150微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约20至约100微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约25至约75微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约30至约50微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约35至约40微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约100至约200微克DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约10微克至约100微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约20微克至约80微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约25微克至约60微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约30纳克至约50微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约35纳克至约45微克的DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物包含约0.1至约500毫克的DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物包含约1至约350微克的DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物包含约25至约250微克的DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物包含约100至约200微克的DNA。

根据本发明的药物组合物根据待使用的施用方式来配制。在药物组合物为可注射药物组合物的情况中，它们是无菌、无热原和无微粒的。优选使用等渗制剂(isotonic formulation)。通常，等渗压性添加剂可包含氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨醇和乳糖。在一些情况下，优选等渗溶液例如磷酸盐缓冲盐水。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，向制剂中添加血管收缩剂。

本文提供的是能够调节人类免疫反应的免疫治疗剂。免疫治疗剂可包含上述遗传构建体，所述遗传构建体包含SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或其功能片段。

本文提供的是能够在人类中产生对抗一种或多种免疫原的免疫反应的疫苗。所述疫苗可包含上述遗传构建体，所述遗传构建体包含与上述含有编码免疫原的核酸序列的遗传构建体组合的SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7或其功能片段。编码RANTES或其片段的遗传构建体可以在与包含编码免疫原的核酸序列相同或不同核酸分子上。

免疫治疗剂或疫苗可以是质粒DNA组合物。所述质粒DNA组合物可包含多种相同或不同质粒，所述质粒含有一种或多种遗传构建体。质粒DNA组合物可包含编码RANTES或其功能片段的核酸序列。当其为疫苗时，其可在相同或不同质粒上进一步包含编码免疫原的核酸序列。

可用于产生用作免疫治疗剂或疫苗的DNA质粒组合物的DNA疫苗技术公开于美国专利号5,593,972、5,739,118、5,817,637、5,830,876、5,962,428、5,981,505、5,580,859、5,703,055和5,676,594，其以引用的方式全部并入本文。DNA疫苗可进一步包含抑制其整合到染色体的元件或试剂。

也可产生包含上述遗传构建体的重组病毒载体。重组病毒载体还可包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或其功能片段，具有或不具有包含编码免疫原的核酸序列的遗传构建体。可将SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或其功能片段并入减毒疫苗，例如减毒活疫苗、灭活疫苗和使用重组载体递送外源基因的疫苗。减毒活疫苗、使用重组载体递送外源基因的那些、亚单位疫苗和糖蛋白疫苗的实例描述于美国专利号：4,510,245、4,797,368、4,722,848、4,790,987、4,920,209、5,017,487、5,077,044、5,110,587、5,112,749、5,174,993、5,223,424、5,225,336、5,240,703、5,242,829、5,294,441、5,294,548、5,310,668、5,387,744、5,389,368、5,424,065、5,451,499、5,453,364、5,462,734、5,470,734、5,474,935、5,482,713、5,591,439、5,643,579、5,650,309、5,698,202、5,955,088、6,034,298、6,042,836、6,156,319和6,589,529，其各自以引用的方式并入本文。

疫苗可进一步包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是诸如媒介物、佐剂、载体或稀释剂的功能分子。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包含表面活性剂，例如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant)，LPS类似物，包括单磷酰脂质A，胞壁酰肽，醌类似物，囊泡例如角鲨烯和角鲨烯，透明质酸，脂质，脂质体，钙离子，病毒蛋白质，聚阴离子，聚阳离子或纳米粒子，或其它已知转染促进剂。

转染促进剂为聚阴离子，聚阳离子，包括聚L谷氨酸(LGS)或脂质。转染促进剂为聚L谷氨酸，并更优选聚L谷氨酸以小于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可包含表面活性剂例如免疫刺激复合物(ISCOMS)，弗氏不完全佐剂，LPS类似物包含单磷酰脂质A，胞壁酰肽，醌类似物和囊泡例如角鲨烯和角鲨烯，并且也可将透明质酸与遗传构建体一同施用。在一些实施方案中，DNA质粒组合物还可包含转染促进剂例如脂质，脂质体，包括作为DNA-脂质体混合物的卵磷脂脂质体或本领域已知的其它脂质体(参见例如WO9324640)，钙离子，病毒蛋白质，聚阴离子，聚阳离子，或纳米粒子，或其它已知的转染促进剂。优选地，转染促进剂为聚阴离子，聚阳离子，包括聚L谷氨酸(LGS)，或脂质。疫苗中转染剂的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

药学上可接受的赋形剂可以是佐剂。佐剂可以是在任选的质粒中表达的其它基因或者是作为与上述质粒组合的蛋白质递送。佐剂可选自由下述组成的组：α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNF α、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关的上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86，包括具有缺失信号序列并任选的包含来自IgE信号肽的IL-15。佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。

可以是有用佐剂的其它基因包括编码下述的那些：MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、L-选择蛋白、p-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮细胞生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、CaspaseICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65、Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、失活NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。

质粒组合物可进一步包含如1994年4年1日提交的美国申请序列号021,579中所述的基因疫苗促进剂，其以引用的方式全部并入。

5.递送方法

本文提供递送药物制剂的方法，以便提供编码RANTES或其片段的遗传构建体，该遗传构建体具有或不具有包含编码期望免疫反应对抗的免疫原的序列的遗传构建体。可以提供递送药物制剂的方法以调节个体的免疫系统或诱导对抗特异性免疫原的治疗性和/或预防性免疫反应。

可以以美国专利第4,945,050号和第5,036,006号中所述的形式递送组合物，两者以引用的方式全部并入。

a.施用途经

可以通过不同的途径来施用组合物，包括口服、胃肠外、舌下、经皮、直肠、经粘膜、局部、经吸入、经口腔施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹内、皮下、肌内、鼻内、鞘内和关节内或其组合。可通过传统注射器、无针注射设备、“微粒轰击基因枪”或其它物理方法例如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”，或超声。

组合物的载体可以通过若干众所周知的技术来递送到哺乳动物，所述技术包括DNA注射(也称为DNA接种)、该DNA注射带有或没有活体内电穿孔、脂质体介导、纳米粒子促进、重组载体例如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘。

b.电穿孔

经由疫苗质粒的电穿孔的DNA施用可以使用电穿孔设备来实现，所述电穿孔设备可配置为向期望的哺乳动物组织递送有效地在细胞膜中引起可逆孔形成的能量脉冲，并且优选能量脉冲为类似于由使用者输入的预定电流的恒定电流。电穿孔设备可包含电穿孔组件和电极部件(electrode assembly)或处理部件(handle assembly)。电穿孔组件可包括和并入电穿孔设备的各种元件中的一个或多个，所述元件包括：整流器、电流波形产生器、阻抗测试器、波形测井、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储组件、电源和电源开关。可使用活体内电穿孔设备，例如系统(VGXPharmaceuticals,Blue Bell,PA)或Elgen电穿孔器(Genetronics,SanDiego,CA)来实现电穿孔以促进经由质粒的转染。

电穿孔组件可起电穿孔设备的一个元件的作用，并且其它元件是与电穿孔组件通信的单独元件(或组件)。电穿孔组件可起电穿孔设备的超过一个元件的作用，其仍可与从电穿孔组件分离的电穿孔设备的其它元件通信。作为电机或机械设备的一部分的电穿孔设备的元件可不局限于可起一种设备的作用的元件或与另外的设备通信的单独元件。电穿孔组件在期望的组织中能够传递产生恒定电流的能量脉冲，并且包括反馈机制。电极部件可包括具有多个空间排列的电极阵列，其中电极部件从电穿孔组件接收能量脉冲并通过电极将其传递到期望的组织。多个电极中的至少之一在能量脉冲的传递期间为中性(neutral)，并在期望的组织中测量阻抗和将阻抗传达到电穿孔组件。反馈机制可接收测量的阻抗并可调节由电穿孔组件传递的能量脉冲以保持恒定电流。

多个电极可以以分散模式传递能量脉冲。多个电极可以以通过在程序(programmed sequence)下的电极控制的分散模式传递能量脉冲，并且所述程序由使用者输入到电穿孔组件。所述程序可包含多个依次传递的脉冲，其中多个脉冲中的各脉冲由具有测量阻抗的一个中性电极的至少两个作用电极(active electrode)来传递，且其中多个脉冲中随后的脉冲由与具有测量阻抗的中性电极的至少两个作用电极不同的电极来传递。

反馈机制可通过或者硬件或者软件来进行。反馈机制可通过模拟闭环电路来进行。每50μs、20μs、10μs或1μs发生反馈，但优选实时或瞬时反馈(即，基本上由测定响应时间的可获得的技术测定的同时)。中性电极可测量期望组织中的阻抗并将阻抗传达到反馈机制，并且反馈机制应答于阻抗和调节能量脉冲以使恒定电流保持于类似预定电流的值。反馈机制在能量脉冲传送期间可连续地和瞬时地保持恒定电流。

可促进本发明的DNA疫苗递送的电穿孔设备和电穿孔方法的实例包括在Draghia-Akli等的美国专利第7,245,963号、Smith等提交的美国专利公布2005/0052630中所述的那些，其内容据此以引用的方式整体并入。可用于促进DNA疫苗递送的其它电穿孔设备和电穿孔方法包括提供于2007年10月17日提交的共同待决和共同拥有的美国专利申请序列第11/874072号中的那些，其根据35USC 119(e)要求2006年10月17日提交的美国临时申请序列号60/852,149和2007年10月10日提交的60/978,982的权益，其所有内容据此整体并入。

Draghia-Akli等的美国专利第7,245,963号描述了标准电极系统及其在用于促进生物分子导入体内或植物选定组织的细胞中的用途。标准电极系统可包含多个针电极；皮下针；提供从可编程恒定电流脉冲整流器向多个针电极的导电性连接的电插头；和电源。操作员可握住固定在承载结构上的多个针电极并牢固地将其插入到体内或植物的选定组织。然后生物分子经由皮下针递送到选定的组织。激活可编程恒定电流脉冲整流器并将恒定电流电脉冲施加到多个针电极。施加的恒定电流电脉冲促进生物分了导入到多个电极之间的细胞。美国专利第7,245,963号的全部内容据此以引用的方式整体并入。

由Smith等提交的美国专利公布2005/0052630描述可用于有效地促进生物分子导入体内或植物的选定组织的细胞的电穿孔设备。所述电穿孔设备包含由软件或固件规定其操作的电动设备(“EKD设备”)。EKD设备基于使用者控制和脉冲参数的输入在阵列的电极之间产生一系列可编程恒定电流脉冲模式，并允许存储和获得电流波形数据。电穿孔设备还包括具有针电极阵列的可更换的电极盘、注射针用中心注射通道和可移动导向盘。将美国专利公布2005/0052630的全部内容据此以引用的方式整体并入。

美国专利第7,245,963号和美国专利公布2005/0052630中所述的电极阵列和方法不仅可适合于深穿透到组织例如肌肉，而且可适合于深穿透到其它组织或器官。由于电极阵列的构造，注射针(用于递送所选生物分子)也完全插入到靶标器官，并在由电极所预描绘的区域，垂直于所述靶点进行注射。美国专利第7,245,963号和美国专利公开2005/005263中所述的电极优选为20mm长和21gauge。

另外，在一些实施方案中包括了并入的电穿孔设备及其用途，电穿孔设备有下述专利中所述的那些：1993年12月28日公布的美国专利5,273,525、2000年8月29日公布的美国专利6,110,161、2001年7月17日公布的6,261,281和2005年10月25日公布的6,958,060以及2005年9月6日公布的美国专利6,939,862。另外，涵盖主题的专利提供于2004年2月24日公布的美国专利6,697,669，其涉及使用多种设备中的任一种递送DNA，和2008年2月5日公布的美国专利7,328,064描绘了本文包括的注射DNA的方法。将上述专利以其整体引用的方式并入。

c.质粒的制备方法

本文提供的是包含本文所述SEQ ID NO:1的DNA质粒的制备方法。DNA质粒(在最后亚克隆步骤后进入哺乳动物表达质粒)可用于使用本领域内的已知方法在大型发酵罐中接种细胞培养物。

虽然供本发明的EP设备使用的DNA质粒可使用已知设备和技术的组合来配制或制造，但优选使用许可的、2007年3月23日提交的共同待决的美国临时申请美国序列号60/939,792中所述的优化的质粒制造技术来制造它们。在一些实施例中，在这些研究中使用的DNA质粒可以以大于或等于10mg/mL的浓度来配制。制造技术还包括或并入各种设备和规程，这些设备和规程对本领域内的普通技术人员为常规已知的，除了美国序列号60/939792所述的那些之外，包括2007年7月3日公布的许可专利美国专利第7,238,522号中所述的那些。将上述引用的申请和专利、美国序列号60/939,792和美国专利第7,238,522号据此以其整体分别并入本文。

6.免疫原

本发明可用于免疫个体以对抗病原体例如病毒、原核生物和致病性真核生物例如单细胞致病生物和多细胞寄生虫。本发明特别用于免疫个体以对抗感染细胞和无荚膜的那些病原体例如病毒和原核生物例如淋病菌、李斯特菌属和志贺氏菌属。另外，本发明还用于免疫个体以对抗原生动物病原体，所述原生动物病原体包括它们为胞内病原体的生命周期阶段。表1提供可以制备根据本发明的疫苗的某些病毒科和属的列表。包含编码肽的DNA序列的DNA构建体用于疫苗，所述肽至少包含等同于或基本上类似于在病原体抗原例如表中所列的那些抗原上显示的表位的表位。另外，本发明还用于免疫个体以对抗其它病原体，包括原核和真核原生动物病原体以及多细胞寄生虫例如表2所示的那些。

表1-病毒

小核糖核酸病毒科

属：

鼻病毒：(医学)是普通感冒病例-50%的病因。

肠病毒(Etheroviruses):(医学)包括小儿麻痹症病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒和人类肠病毒例如甲型肝炎病毒。

口疮病毒(Apthoviruses)：(兽医)它们是口蹄疫病毒。

靶抗原：VP1、VP2、VP3、VP4、VPG

杯状病毒(Calcivirus)科

属：

病毒的诺瓦克(Norwalk)组：(医学)这些病毒为流行性胃肠炎重要的病原体。

外衣病毒(Togavirus)科

属：

甲病毒(Alphaviruses)：(医学和兽医)实例包括辛德比斯病毒(Sindbis virus)、罗斯河病毒(RossRiver virus)和委内瑞拉东西马脑炎病毒(Venezuelan Eastern Western Equine encephalitis)。

呼肠孤病毒(Revirus)：(医学)风疹病毒。

黄病毒(Flariviridae)科

实例包括：(医学)登革热、黄热病、日本脑炎、圣路易斯脑炎和蜱传脑炎病毒。西尼罗河病毒(Genbank NC001563、AF533540、AF404757、AF404756、AF404755、AF404754、AF404753、AF481864、M12294、AF317203、AF196835、AF260969、AF260968、AF260967、AF206518和AF202541)

代表性靶抗原：E NS5C

丙型肝炎病毒：(医学)这些病毒并不归入同一科，但认为是外衣病毒或黄病毒之一。与外衣病毒科最相似。

冠状病毒科：(医学和兽医)

传染性支气管炎病毒(禽)

猪传染性胃肠炎病毒(猪)

猪血球凝集脑脊髓炎病毒(猪)

猫传染性腹膜炎病毒(猫)

猫肠道冠状病毒(猫)

狗冠状病毒(狗)

SARS相关的冠状病毒

人呼吸道冠状病毒导致约40%的普通感冒病例。EX.224E、OC43Note冠状病毒可导致非A、B或C肝炎。

靶抗原：El-也称为M或基质蛋白质E2-也称为S或刺突蛋白-也称为BE或血凝素-elterose糖蛋白(在全部冠状病毒中不存在)N-核衣壳

棒状病毒科

属：

水泡性病毒、狂犬病病毒：(医学和兽医)狂犬病

靶抗原：G蛋白、N蛋白

纤丝病毒科：(医学)

出血热病毒例如马伯格和埃博拉病毒

副粘病毒科：

属：

副粘病毒：(医学和兽医)腮腺炎病毒、新城疫病毒(鸡中的重要病原体)

麻疹病毒：(医学和兽医)麻疹、犬热病

肺炎病毒：(医学和兽医)呼吸道合胞体病毒

正粘病毒科(医学)流感病毒

布尼亚病毒(Bunyavirus)科

属：

布尼亚病毒:(医学)加利福尼亚脑炎、拉·克罗斯病毒(La Crosse)

白蛉病毒(Phlebovirus)：(医学)里夫特裂谷热(Rift Valley Fever)

汉坦病毒：扑热吗拉(Puremala)为hemahagin热病毒(hemahaginfever virus)

奈恩病毒(Nairvirus)(兽医)奈洛比羊病(Nairobi sheep disease)

还有许多未命名的布尼亚病毒(bungaviruses)

砂粒病毒科(医学)LCM、拉沙热病毒(Lassa fever virus)

呼肠孤病毒科

属：

呼肠孤病毒：潜在的人类病原体

轮状病毒：儿童急性胃肠炎

环状病毒：(医学和兽医)科罗拉多蜱热(Colorado Tick fever),

莱邦博病毒(Lebombo)(人)马器质性脑病、蓝舌病

逆转录病毒科

亚科：

Oncorivirinal：(兽医)(医学)猫白血病毒、HTLVI和HTLVII

慢病毒(Lentivirinal)：(医学和兽医)HIV、猫免疫缺陷性病毒、马感染、贫血病毒

Spumavirinal乳多泡病毒科

亚科：

多瘤病毒：(医学)BKU和JCU病毒

亚科：

乳头瘤病毒：(医学)许多病毒类型与癌症或乳突淋瘤的恶化发展相关。

腺病毒(医学)EX AD7、ARD.,O.B.-导致呼吸道疾病-某些腺病毒例如275导致肠炎细小病毒科(兽医)

猫细小病毒：引起猫肠炎

猫传染性粒细胞缺乏病毒(Feline panleucopeniavirus)

犬细小病毒

猪细小病毒

疱疹病毒科

亚科：

α疱疹病毒科

属：

单纯疱疹病毒(医学)

HSVI(Genbank X14112、NC001806)，

HSVII(NC001798)

水痘带状疱疹(Varicella zoster)：(医学兽医)

假性狂犬病

水痘带状疱疹

亚科：

β疱疹病毒科

属：

巨细胞病毒(医学)

HCMV

鼠巨细胞病毒

亚科

γ疱疹病毒科

属：

淋巴隐病毒(医学)

EBV-(伯基利淋巴瘤(Burkitt’slymphoma))

天花病毒科

亚科：

脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxviridae)(医学-兽医)属：

天花(痘疮)

痘疹(牛痘)

副痘病毒(Parapoxivirus)-兽医

禽痘病毒(Auipoxvirus)-兽医

山羊痘病毒(Capripoxvirus)

野兔痘病毒(Leporipoxvirus)

猪痘病毒(Suipoxvirus)

亚科：

Entemopoxviridue

嗜肝DNA病毒科

乙型肝炎病毒

未分类的丁型肝炎病毒

表2

细菌性病原体

致病性革兰阳性球菌包括：肺炎球菌、葡萄球菌和链球菌。

致病性革兰阴性球菌包括：脑膜炎球菌和淋球菌。

致病性肠道革兰杆菌包括：肠杆菌科；假单胞菌、正不动杆菌(acinetobacteria)和埃肯菌(eikenella)，类鼻疽；沙门氏菌；志贺氏菌病；嗜血杆菌；软下疳；普鲁斯病(brucellosis)；兔热病；耶尔森氏菌(巴斯德菌)；念珠状链杆菌和螺旋菌；单核细胞增生利斯特氏菌；红斑丹毒丝菌；白喉、霍乱、炭疽热；杜诺凡病(donovanosis)(性病性肉芽肿)；和卡里翁氏病(bartonellosis)。

致病性厌氧菌包括：破伤风；肉毒杆菌(botulism)；其它梭菌；结核病；及其它分枝杆菌。

致病性螺旋体病包括：梅毒；-密螺旋体病；雅司病(yaws)，品他病(pinta)和哈尔斯坦氏病(endemic syphilis)；和钩端螺旋体病。

由高级病原体细菌和致病真菌引起的其它的感染包括：放线菌病；奴卡氏菌病；隐球菌病；酿母病；达林氏病和球霉菌病；假丝酵母病、曲霉病和毛真菌病；孢子丝菌病；副球孢子菌病(paracoccidiodomycosis)、波氏霉菌病(petriellidiosis)、球拟酵母病(torulopsosis)、巴里格尔氏病(mycetoma)和着色真菌病(chromomycosis)；和皮肤真菌病。

立克次氏体感染包括立克次氏体属微生物(rickettsial)和立克次体病(rickettsioses)。

支原体和衣原体感染的实例包括：支原体肺炎(mycoplasmapneurnoniae)；性病性淋巴肉芽肿；鹦鹉热；和围产期衣原体感染。

致病性真核生物

致病性原生动物和蠕虫以及由此的感染包括：阿米巴病；疟疾；利什曼原虫病；嗜眠病；弓形体病；肺炎肺囊虫(pneumocystis carinii)；巴贝虫病；慢性痢疾；旋毛虫病；丝虫病；血吸虫病；线虫；蛭(trematodes)或吸虫(flukes)；绦虫(cestode)(带虫(tapeworm))感染。

本发明的另一方面提供赋予对抗特征为过度增殖性疾病的过度增殖细胞的保护性免疫反应的方法，和提供治疗患有过度增殖性疾病的个体的方法。过度增殖性疾病的实例包括所有形式的癌症和牛皮癣。

已发现含有编码免疫原性“过度增殖细胞”相关蛋白质的核苷酸序列的遗传构建体导入个体细胞导致接种的个体细胞中产生那些蛋白质。为了免疫以对抗过度增殖性疾病，向个体施用包含编码与过度增殖性疾病相关的蛋白质的核苷酸序列的遗传构建体。

为了使过度增殖性相关的蛋白质成为有效的免疫原性靶标，其必须为与正常细胞相比在过度增殖性细胞中专一性产生或处于更高水平的蛋白质。靶抗原包括此类蛋白质、其片段和肽；其至少包含在该蛋白质上发现的表位。在一些情况下，过度增殖性相关的蛋白质为编码蛋白质的基因突变体的产物。突变基因编码除了具有导致在正常蛋白质上未发现的稍有不同的氨基酸序列以外，几乎等同于正常蛋白质的蛋白质。该靶蛋白包括由致癌基因例如myb、myc、fyn和易位基因bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk和EGRF编码的蛋白质的那些。除了致癌基因产物作为靶抗原之外，用于抗癌治疗和预防性方案的靶蛋白包括通过B细胞淋巴瘤制备的抗体的可变区和T细胞淋巴瘤的T细胞受体的可变区，其在一些实施方案中也用作自身免疫病的靶抗原。可以使用其它肿瘤相关的蛋白质作为靶蛋白例如在肿瘤细胞中以高水平存在的蛋白质，包括由单克隆抗体17-IA识别的蛋白质和叶酸结合蛋白或PSA。

虽然本发明可用于免疫个体以对抗若干癌症形式中的一种或多种，但本发明特别地用于预防性免疫倾向于发展特定癌症或具有癌症并因此易于复发的个体。遗传学和工艺学以及流行病学中的发展允许测定个体中癌症发展的概率和风险评估。利用遗传筛查和/或家族健康史，可以预测特定个体具有的发展为若干类型癌症中任何一种的概率。

类似地，具有已发展的癌症的和已治疗以除去癌症的或以其它形式处于缓解中的那些个体特别易于复发和再发。作为治疗方案的一部分，可免疫该个体以对抗已诊断为具有它们的癌症以便对抗再发。因此，一旦已知个体已具有一种类型的癌症并处于复发的风险，则可以对其进行免疫以使其免疫系统准备对抗任何将来出现的癌症。

本发明提供治疗患有过度增殖性疾病的个体的方法。在此类方法中，遗传构建体的导入用作免疫治疗剂，指导和促进个体免疫系统以对抗产生靶蛋白的过度增殖性细胞。

在治疗或预防癌症时，没有细胞的实施方案是特别有用的。

本发明提供通过赋予广基型保护性免疫反应以对抗与自身免疫力相关的靶标（包括细胞受体和产生自导抗体(self-directed antibodies)的细胞来）治疗患有自身免疫病和紊乱的个体的方法。

T细胞介导的自身免疫病包括类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、舍格伦综合征(Sjogren's syndrome)、肉状瘤病、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、自身免疫甲状腺炎、反应性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮症、多肌炎、皮肤肌炎、牛皮癣、脉管炎、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、克罗恩氏疾病(Crohn's disease)和溃疡性结肠炎。这些疾病中的每一种的特征在于结合到内源性抗原的T细胞受体和引发与自身免疫病相关的炎性级联。针对T细胞可变区的接种将引起免疫反应包括CTL以消除那些T细胞。

在RA中，若干参与疾病的特异性T细胞受体的可变区(TCR)已被表征。这些TCR包括V.β.-3、V.β.-14、20V.β.-17和Va-17。因此，用编码这些蛋白质的至少一种的DNA构建体接种将引起将靶向参与RA的T细胞的免疫反应。参见，Howell,M.D等，1991Proc.Nat.Acad.Sci.USA 88:10921-10925;Piliard,X等，1991Science 253:325-329;Williams,W.V等，1992J Clin.Invest.90:326-333；其各自以引用的方式并入本文。在MS中，若干参与疾病的TCR的特异性可变区已被表征。这些TCR包括VfP和Va-10。因此，用编码这些蛋白质的至少一种的DNA构建体接种将引起将靶向参与MS的T细胞的免疫反应。参见：Wucherpfennig,K.W等，1990Science 248:1016-1019；Oksenberg,J.R等,1990Nature 345:344-346；其各自以引用的方式并入本文。

在硬皮症中，若干参与疾病的TCR的特异性可变区已被表征。这些TCR包括V.β.-6、V.β.-8、V.β.-14和Va-16、Va-3C、Va-7、Va-14、Va-15、Va-16、Va-28和Va-12。因此，用编码这些蛋白质的至少一种的DNA构建体接种将引起将靶向参与硬皮症的T细胞的免疫反应。

为了治疗患有T细胞介导的自身免疫病的患者，特别是TCR可变区还没有表征的那些，可以进行滑膜活检。可以采用现存的T细胞样品和使用标准技术来鉴定那些TCR的可变区。使用该信息可以制备基因疫苗。

B细胞介导的自身免疫病包括狼疮(SLE)、格雷夫症(Grave'sdisease)、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫血小板缺乏、哮喘、冷球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化和恶性贫血。这些疾病的每一种的特征在于结合到内源性抗原的抗体和引发与自身免疫病相关的炎性级联。针对抗体的可变区的接种将引起免疫反应包括CTL以消除产生抗体的那些B细胞。

为了治疗患有B细胞介导的自身免疫病的患者，必须鉴定参与自身免疫活性的抗体的可变区。可以进行活组织检查和可以采用现存于炎症位点的抗体样品。那些抗体的可变区可使用标准技术来鉴定。使用该信息可制备基因疫苗。

就SLE而言，认为一种抗原是DNA。因此，在待免疫以对抗SLE的患者中，可针对抗DNA抗体筛选它们的血清，并可以制备包括编码血清中发现的该抗DNA抗体的可变区的DNA构建体的疫苗。

TCR和抗体两者的可变区中的共同结构特征是众所周知的。编码特定TCR或抗体的DNA序列通常可按照众所周知的方法例如Kabat等于1987年Sequence of Proteins of Immunological Interest U.S.Department of Health and Human Services,Bethesda Md所述的那些方法找到，该文献以引用的方式并入本文。另外，对于克隆来自抗体的功能可变区的一般方法可见于Chaudhary,V..K等，1990Proc.Natl.Acad Sci.USA 87:1066，其以引用的方式并入本文。

除了使用免疫调节蛋白编码序列的可表达形式以改善基因疫苗以外，本发明还涉及使用重组载体以递送编码抗原的外源基因的改善的减毒活疫苗和改善的疫苗。减毒活疫苗和使用重组载体以递送外源抗原的那些的实例描述于美国专利号：4,722,848、5,017,487、5,077,044、5,110,587、5,112,749、5,174,993、5,223,424、5,225,336、5,240,703、5,242,829、5,294,441、5,294,548、5,310,668、5,387,744、5,389,368、5,424,065、5,451,499、5,453,364、5,462,734、5,470,734和5,482,713中，其各自以引用的方式并入本文。提供基因构建体，其包括编码IL-28或其功能片段的核苷酸序列，其中核苷酸序列可操作地连接到可在疫苗中作用以影响表达的调节序列。将基因构建体掺入减毒活疫苗和重组疫苗以产生根据本发明的改善的疫苗。

本发明提供免疫个体的改善方法，其包括作为包括DNA疫苗、减毒活疫苗和重组疫苗的疫苗组合物的一部分递送基因构建体到个体细胞的步骤。基因构建体包含编码IL-28或功能片段并且可操作地连接到可在疫苗中作用以影响表达的调节序列的核苷酸序列。改善的疫苗导致增强的细胞免疫反应。

实施例

实施例1

在以下实施例中进一步说明本发明。应理解本实施例虽然表明本发明的优选实施方案，但是仅以说明的方式给出。从以上论述和本实施例，本领域技术人员可以确定本发明的必要特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可对本发明做出各种变化和修改以使其适应于各种用途和条件。因此，从以上描述，除本文所示和所述的那些之外的本发明的各种修改对本领域内的技术人员而言将是显而易见的。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。

引言

评价表达SIVgag、env和pol的共同SIVmac质粒构建体的优化电穿孔(EP)诱导的细胞免疫反应，并将其与和表达质粒的恒河猴IL-12的EP结合的共同SIVmac质粒构建体的优化电穿孔(EP)诱导的细胞免疫反应进行比较，或RANTES可改变细胞免疫反应的大小和质量。T细胞免疫反应的深入改善如通过ELISpot来测量，观察多功能流分析，离体增殖以及表位宽度。还进行了这些接种方法对未匹配的、SIVmac251直肠内激发中的病毒载量的影响的评价。发现单独的DNA接种影响本研究中的病毒激发并防止CD4T细胞损耗。质粒IL-12和RANTES的共同递送导致病毒复制控制的增强。因此，同时操纵质粒疫苗盒(cassette)的递送和设计似乎对于与HIV模型系统相关的高频细胞免疫反应的产生是重要的。

材料和方法

动物。根据美国实验室动物管理认可协会(American Associationfor Accreditation of Laboratory Animal Care)的标准，将源于中国的恒河猴(Macaca mulatta)圈养于BIOQUAL,Inc.(Rockville,MD)。在任何试验之前使动物隔离适应至少30天。

免疫。用1.5mg SIVgag、SIVenv和SIVpol中的每一种在0、8、12和24周免疫六只一组的恒河猴(DNA)。将在各免疫的时间点的DNA通过活体内EP递送到四头肌中的单个位点。用1.5mg的SIVgag、SIVenv、SIVpol 和恒河猴IL-12(DNA+12)或RANTES(DNA+RANTES)中的每一种在0、8和12周免疫六只恒河猴一组的另外两组。在DNA+12和DNA+RANTES组中从第4次免疫(24周)中排除质粒佐剂。用灭菌注射水作为阴性对照(Naive)免疫六只恒河猴。使用恒定电流设备(VGX Pharmaceuticals,the Woodlands,TX)进行全部EP步骤。EP条件为0.5Amp、3次脉冲、52毫秒脉冲长度，脉冲间隔1秒。

血液采集。研究期间每两周给动物抽血。将10ml血液采集于EDTA管。通过标准聚蔗糖-海帕克(hypaque)离心并重悬于完全培养基(RPMI 1640，具有2mM L-谷氨酰胺，补充有10%热失活胎牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素和55μMβ-巯基乙醇。)中来分离外周血单个核细胞(PBMC)。用ACK裂解缓冲液(Cambrex BioScience,East Rutherford,NJ)来裂解RBC。

质粒和质粒产物。本研究中使用的质粒对于SIVgag(pSIVgag)、SIVpol(pSIVpol)或SIVenv(pSIVenv)表达修饰的共有抗原。为了改善表达，包含有效的IgE前导序列。另外，通过除去N连接的糖基化位缩短SIVenv V1和V2区域以及截断胞质尾以预防外膜再循环(envelope recycling)。对于SIV pol，引入3个突变以使蛋白酶、逆转录酶和RNAseH失活。所得优化的SIV DNA免疫原为密码子和RNA优化的、合成的，并克隆到pVAX1表达载体以产生SIVgag(pSIVgag)、SIVenv(pSIVenv)和SIVpol(pSIVpol)优化的表达构建体。然后以10L规模制备这些质粒构建体(VGXI,Inc.,the Woodlands,TX)，并进行配制以用于此处所述的研究。将纯化的质粒DNA配制于在水中具有0.25%丁呱卡因的0.15M的柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)。

肽。通过NIH，NIAID，AIDS部门的AIDS研究和参考试剂计划(AIDS Research and Reference Reagent Program)获得试剂：SIVmac239gag Peptides(#6204)、SIVmac 239env Peptides(#6883)和SIVmac239pol Peptides(#6443)。

PBMC的羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)共轭和流式细胞分析。在如前所述在第四次免疫后两周分离的新鲜PBMC上进行CFSE。

酶联免疫印迹分析(ELISpot)。使用猴IFN ELISpotkit(Mabtech,Cincinnati,OH)，如前面所述进行ELISpot。对于前两次免疫的输入细胞数为2×10⁵个细胞。对于第三和第四次免疫时间点，由于过量的斑点数使输入细胞数降低至1×10⁵个细胞。调整来自一式三份的孔中斑点的平均数以反映每10⁶个PBMC的斑点数。从根据用于刺激的各SIV肽库形成的斑点的值中减去根据单独培养基形成的斑点后计算SIV特异性反应。将为≥50SFU/10⁶PBMC和大于2×单独培养基反应的反应视为阳性，并然后增加净值。

SIVpol表位矩阵作图。如前面所述，使用矩阵格式(Matrix format)将SIVpol肽文库分为33个库，并用于刺激第四次免疫后分离的冷冻保存的PBMC。使用IFN ELISpot分析来评价反应宽度。基于识别的肽的总数来估计表位的最大数量。通过将阳性肽流(runs)（一系列两个或更多个连续阳性肽）的数量除以3并四舍五入至最接近的整数来计算表位的最小数。

胞内细胞因子染色。在如前述第四次免疫后2周和最后免疫之后8个月分离的新鲜PBMC上进行多功能T细胞分析。扣除背景后报告数据。将阳性反应定义为大于0.05%。

将冷冻保存的PBMC快速解冻并在刺激后在37℃的完全培养基中过夜静置。在抗原特异性CD8T细胞上测量CCR5(BD Biosciences,)表达的各功能以及全部功能反应。将IFN和TNFα抗体两者放在Alexa Fluor 700上以调节该小组中另外的染色。扣除背景后报告数据并显示为总CD8群体的百分比显示。

SIVmac251激发。在第四次免疫后8个月用25猴感染剂量(MID)的SIVmac251通过直肠内途径激发动物。由Ronald Desrosiers制备并由Advanced BioSciences Laboratories,Inc(ABL,Inc.)(Kensington,MD)提供病毒原液并由BIOQUAL,Inc.(Rockville,MD)滴定。

针对血浆病毒载量的定量基于核酸序列的扩增(NASBA)的分析。如前面所述，由ABL Inc.通过定量NASBA分析SIVgag来测定血浆病毒载量。

MHCI类基因型分型使用前述Sanger测序和焦磷酸测序方法的组合来进行基于全面序列的MHC-I基因型分型。简而言之，使用MagNA Pure LC RNA分离试剂盒(Roche Applied Sciences,Indianapolis,IN)从PBMC分离总细胞RNA。使用SuperscriptIII第一链合成系统(Invitrogen,Carlsbad,CA)由RNA产生cDNA，并用作使用Phusion高保真聚合酶(New England BioLabs,Ipswich,MA)和MHC-I特异引物的PCR扩增的模板。使用MinElute凝胶回收试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)来凝胶纯化PCR产物。对于Sanger测序，使用带有TOP10化学感受态大肠杆菌的Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)将这些产物克隆到细菌中。每只动物有96-192个转化的细菌菌落在LB+50μg/ml卡那霉素中过夜生长；随后使用Perfectprep质粒96Vac Bind试剂盒(5PRIME,Gaithersburg,MD)分离质粒DNA。使用序列特异性PCR引物利用DYEnamic ET终止剂循环测序试剂盒(GE Healthcare,Piscataway,NJ)来进行覆盖由MHC-I外显子2和3编码的高度可变肽-结合结构域的Sanger测序反应，并使用Applied Biosystems 3730xl Genetic Analyzer(AppliedBiosystems,Foster City,CA)分析。使用MHC-I外显子2中通用诊断190bp PCR扩增子的Roche/454-焦磷酸测序还基因型分型了5只动物的分组。该扩增子由cDNA扩增、凝胶纯化、定量、标准化和建库并在454测序中心(454Life Sciences,Branford,CT)或在伊利诺斯州大学的Urbana-Champaign高通量测序中心(Urbana，IL)的基因组测序仪FLX仪器上运行。利用CodonCode aligner(CodonCode Corporation,Deham,MA)和Lasergene 8(DNA Star,Madison,WI)进行序列分析。使用BLASTN将组装的重叠群与已知恒河猴MHC-I等位基因的内部数据库相比较。

统计。对于IFNγELISpot、T细胞增殖和细胞因子产生的比较，当适当使用SPSS17.0统计软件时进行双尾Mann-Whitney检验或借助于Tukey或DunnettT3事后检验的单向ANOVA。在统计分析之前对病毒载量进行对数转换以标准化数据。<0.05的P值被认为是显著的。

结果

研究设计。将24只源于中国的恒河猴分成四个免疫组(表3)。组1(DNA)接受编码SIVgag、SIVenv和SIVpol的优化质粒。组2(DNA+12)接受编码rhIL-12的质粒和组3(DNA+RANTES)除SIV质粒之外接受编码RANTES的质粒。组4(天然型)接受盐水注射。在第0、第8、第12和第24周时以1.5mg/构建体/免疫的剂量施用质粒。通过活体内EP后的肌肉注射来对猴进行免疫。

使用电穿孔的DNA质粒递送诱导强烈的、高度增殖性细胞免疫反应。首先，通过IFNγELISpot来评价各动物中细胞免疫反应的诱导。分析在各免疫后两周分离的PBMC的SIV特异性IFNγ产生。在第一次接种(分别为60±49和569±248SFU/10⁶PBMC)后与单独的DNA相比质粒rhIL-12的联合免疫导致ELISpot数的九倍增加。这种早期增强随着进一步的免疫而降低。在四次免疫中的每一次之后，观察到细胞反应的增强，最终在强烈的抗SIV IFNγELISpot中达到平均为16,000SFU/10⁶PBMC或1.6%的PBMC群体(图1a-1e)。DNA+RANTES组显示一贯低的ELISpot反应，尤其是在第三次免疫后当它们显著地低于DNA(p<0.001)和DNA+12(p=0.001)组。四次免疫后DNA+RANTES组具有9,217±2111SFU/10⁶PBMC的总IFNγ反应。

在第四次免疫后的SIVpol-特异性IFNγ反应的检验揭示三个组全部具有覆盖整个免疫原的大宽度反应(表4)。假定一个表位可潜在地出现在基于11个氨基酸的重叠的3个肽中，则表位数将大约为阳性库中出现的肽总数的三分之一。有意思的是，DNA+RANTES组尽管具有低于其它接种组的大小，但具有识别估计68±3.67个表位的最不同的反应。

然后，使用CFSE增殖分析来评价疫苗诱导的CD4⁺和CD8⁺T细胞反应的增殖能力(图2a)。DNA组具有高于DNA+12和DNA+RANTES组(分别为4.56±2.72%和1.73±0.76%和0.46±0.39%，图2b)的CD4⁺T细胞增殖反应。疫苗诱导的CD8⁺T细胞与CD4⁺T细胞区室相比具有更高的增殖能力。与CD4⁺T细胞反应一样，DNA组与DNA+12组中的18.7±5.02%和DNA+RANTES组中的17.9±5.33%相比，具有细胞增殖为41.3±9.2%的最高反应(图2c)。虽然DNA组具有更高的增殖反应，但差异在统计学上并不显著。

质粒rhIL-12的联合免疫通过抗原特异性CD4⁺T细胞提高细胞因子产量为测定疫苗诱导的反应的质量，评价SIVpol特异性CD4⁺T细胞产生IFNγ、IL-2、TNFα和CD107a(图3a)。使用布尔设门(Booleangating)评价个体细胞产生多重细胞因子，即，疫苗诱导的CD4⁺T细胞反应的多功能性的能力。用单独DNA的免疫导致0.52±0.29%的平均SIVpol反应(图3b)。将IL-12加入免疫导致CD4⁺T功能反应几乎两倍的增加(0.97±0.26%)。有意思的是，RANTES的添加并未诱导高于对照组的反应(分别为0.07±.03%和0.12±0.12%)。虽然在全部接种组中的大部分反应为单功能性的，但DNA+12组具有最大比例的能够具有两种或更多种功能的细胞，主要的双功能群体为产生IFNγ⁺TNFα⁺的细胞。

质粒rhIL-12的联合免疫有利于通过CD8⁺T细胞产生IFNγ在CD4⁺T细胞区室中已看出明显的表型差异，然后评价CD8⁺T细胞区室的表型。检验通过SIVpol特异性CD8⁺T细胞产生的细胞因子。功能反应的大小反映了在CD4⁺T细胞区室中所观察到的结果。DNA+12组具有最高反应，具有2.34±0.62%的CD8⁺T细胞产生至少一种功能(图3c)。DNA组具有略低的反应，具有1.69±0.63%，而DNA+RANTES组具有低四倍的反应，具有0.44±0.16%的CD8⁺T细胞反应。

除了具有最高大小的反应之外，与DNA组中的两只动物和DNA+RANTES组中的一只动物相比，在DNA+12组中的六只动物中有四只具有能够具有全部四种功能的细胞群体。尽管具有更大比例的能够具有全部四种功能的反应，但DNA+12组中的主要反应为IFNγ单功能群体。这可能表明IL-12作为分子佐剂的添加诱导高频末端分化的效应物类细胞，该细胞丧失产生除了IFNγ外的细胞因子的能力。然而，如通过CD28和CD95染色所定义的那样，这些细胞的记忆表型显示它们均分布于效应记忆T细胞和中心记忆T细胞区室(图3d)，从而支持了这些T细胞的功能性质。

疫苗诱导的反应的保持通过由EP递送的该质粒疫苗已观察到细胞免疫反应的显著诱导，进行实验以确定这些群体是否可以在免疫反应的记忆阶段中保持。将动物静养八个月并在对离体的SIVpol刺激的反应中检测细胞因子产生。在CD4⁺T细胞区室中，DNA和DNA+12组具有缩减至为免疫后的免疫反应大小的一半或更小水平的SIVpol反应(分别为0.15±0.11%和0.42±0.09%)(图4a)。一个例外是具有0.47±0.37%平均反应的RANTES组。然而，在组中的一只动物具有异常高的IFNγ反应，这说明大的记忆反应。如第四次免疫后所观察到的那样，IFNγ单功能细胞为全部组中的主要群体。

观察到在记忆CD8⁺T细胞区室中免疫反应的相同缩减(图4b)。虽然未检出四种功能细胞，但是全部三个组保持可检出的CD107a⁺IFNγ⁺TNFα反应以及在第四次免疫后观察到大IFNγ⁺单功能群体。这些数据表明具有或不具有分子佐剂的增强的DNA接种能够诱导长期的多功能记忆反应。

用质粒IL-12和RANTES的联合免疫导致在设定点病毒载量的显著下降接下来，进行实验以确定在免疫后保持8个月的这些疫苗特异性细胞反应在SIVmac251粘膜激发后是否能够影响病毒载量。用25猴感染剂量(MID)的SIVmac251通过直肠内途径来激发动物。两个月内每周及其后的每个月评价病毒载量直到激发后9个月。累计在一起，作为整体的接种动物(不论IL-12或RANTES)表现出相对于未接种的对照的显著更低的峰病毒血症(p=0.027)和更低的设定点(p=0.01)(图5a)。对于各组平均病毒载量的进一步检验揭示DNA+RANTES组中病毒复制控制随时间的增强(图5b)。在病毒血症的峰时，DNA和DNA+12组与天然组相比具有降低的病毒载量(分别为1.12和0.82log)。将RANTES加入免疫导致峰病毒血症显著地2.0log降低(p=0.016)。在设定点，与天然组相比DNA组平均仅显示0.62log的病毒载量降低。DNA+12和DNA+RANTES组与天然组相比具有显著的1.5(p=0.029)和2.2(p=0.003)log的在设定点病毒载量的降低。然而，在本研究的最后，当通过曲线下面积的分析测定，仅DNA+RANTES组具有病毒复制的显著降低(p=0.008)(图5c)。

之前的SIV激发研究已鉴定了与病毒复制的天然控制相关的若干MHC-I等位基因。为了评价宿主MHC-I遗传在本研究中的潜在贡献，反过来进行全部动物的基于全面序列的分型(表5)。事后分析揭示有四只表达保护性Mamu-B*003等位基因的动物、在DNA+RANTES组中有两只以及在DNA和DNA+12组中各有一只。我们在DNA+12组中也鉴定到Mamu-B*017动物。发现在DNA+RANTES组中另外的动物具有类似于Mamu-B*01702的新的I类等位基因。虽然在本研究最后在具有保护性单体型的动物中观察到显著低的病毒载量(p=0.033)(图5d)，但是在峰(p=0.968)和设定点(p=0.161)病毒载量没有统计学差异。因此，这些保护性等位基因在长期感染期间可有助于控制病毒复制，但是它们似乎并不与感染后早期观察到的疫苗对病毒复制控制的影响相关。

DNA接种预防SIVmac251粘膜激发后的CD4⁺T细胞损耗在接种组中的设定点处已观察到病毒复制水平的降低，通过另外的免疫参数来评价保护。为此，2个月的每两周及其后每四周监测CD4⁺T细胞计数。天然组在激发后的九个月内发生持续的CD4⁺T细胞损耗，与基准计数相比导致50%的损耗(图6a-6e)。相反，接种组没有显示CD4⁺T细胞计数的任何持续的降低。因此具有或不具有免疫佐剂的DNA接种防止用SIVmac251感染后九个月内的动物CD4⁺T细胞损耗。

在RANTES联合免疫后在外周血的抗原特异性CD8⁺T细胞上没有CCR5表达的增强。进行实验以确定与RANTES的联合免疫是否可影响能够被动员到感染位点并在激发后影响病毒复制的抗原特异性CD8⁺T细胞的水平。对于在第三次免疫后分离的冷冻保存的细胞上的CD107a、IL-2、IFNg和TNFa进行ICS。对于各功能首先测定SIVpol特异性反应以及测量那些细胞上的CCR5表达。在外周中的DNA+RANTES组(0.26±0.09%)与DNA和DNA+12组(分别为0.62±0.28%和0.33±0.14%)相比表达CCR5的抗原特异性CD8⁺T细胞的频率较低(图7a)。然而该差异并非统计学上显著(Kruskal-Wallis，p=0.056)。在CD4⁺T细胞区室中看到类似的趋向，DNA组具有SIVpol特异性CCR5⁺细胞的最高频率(0.27±0.09%)和DNA+RANTES在外周血中具有最低频率(0.13±0.04%)(图7b)。该数据支持RANTES调节或者CCR5在抗原特异性T细胞上的表达或者替换地动员这些到其它免疫位点。

讨论

此前在灵长类动物的探索性研究中已报道了EP和质粒IL-12显著增强HIV质粒抗原的免疫原性的能力。在小鼠研究中还观察到RANTES是非常有效的佐剂。本文所述的实验设计用于确定这些策略是否能够增强质粒SIV疫苗的免疫原性以及表征这些反应以求鉴定可能有助于病毒复制控制的细胞反应的任何亚群体。测试并检验共有SIV抗原以确定增强的反应是否能够影响未匹配的、粘膜SIVmac251病毒激发。

与先前的工作一致，EP能够显著地增强疫苗特异性IFNγ反应至非常高的水平。与早期研究相反，本研究中反应的大小超过3倍以上，这与加入本研究中使用的构建体的优化策略一致。然而，除了在本研究的早期之外，当将质粒IL-12用作佐剂时观察到ELISpot计数没有进一步的增强。这可能是由于使用的DNA剂量或DNA浓度更高；与探索性研究中的2mg/mL相比，以10mg/mL配制疫苗。以更高的剂量和浓度使用高度优化的DNA构建体似乎克服了当配制的疫苗以较低、更稀释的剂量递送时观察到的免疫原性差异。此类制剂可能对DNA平台具有重要影响。

虽然观察到显著的IFNγELISpot计数，但重要的是该参数单独不应当是确定疫苗候选物效力的唯一因素，这是因为许多研究已表明ELISpot反应不直接与病毒复制的控制相关联。为此，评价了已证实对有效HIV疫苗而言所需的许多参数。首先，得自最新Merck STEP的结果已表明宽免疫反应的诱导对于成功疫苗是重要的。平均而言，用Merck重组Ad5载体接种的受试者具有局限于三个至五个表位的反应宽度。在通过矩阵肽作图来评价对SIVpol抗原的反应时，对于大多数肽库观察前所未有的阳性反应，这表明在全部免疫组中的宽表位覆盖度。还有意思的是诱导绝大多数不同表位反应的DNA+RANTES疫苗具有最好的病毒复制控制。

长期非进展者中的研究已显示非进展者具有比进展者更多的功能性CD8⁺T细胞，这表明这些多功能群体可能在病毒控制中是重要的。在DNA和DNA+12两组中，对于CD4⁺和CD8⁺T细胞区室两者观察到多功能反应的诱导。然而令人感兴趣的观察结果甚少。首先，在CD4⁺T细胞区室中，DNA组中对SIVpol的反应率和反应大小低于DNA+12组。其次，在CD4⁺和CD8⁺T细胞区室两者中，DNA+12组具有高比例的由IFNγ单功能细胞组成的其反应。在T细胞记忆分化模型中，此类IFNγ单功能细胞被认为表示末端效应物。为了应对该可能性，通过CD28和CD95染色来检验这些单功能细胞的记忆表型。在这一情况下，发现这些反应由来自CD28⁺CD95⁺中心记忆群体以及CD28^-CD95⁺效应物群体两者的细胞组成。有可能CD28⁺CD95⁺细胞实际上不是单功能的，而且具有我们的多功能小组中未评价的某些其它功能。该假说在将来的研究中值得关注。

许多DNA引物/病毒载体增强研究已显示在SHIV89.6P激发模型中病毒载量降低的某些效力。然而该模型在预测疫苗效力中的实用性还有争议。因此评价了在更严格的、高剂量SIVmac251粘膜激发模型中的DNA疫苗诱导的免疫反应的效力。已报道使用该激发模型的其它研究对病毒复制有适度的影响。

在全部接种动物和对照动物之间观察到在保护CD4T细胞损耗中存在显著差异。对于研究的整个过程，防止了接种动物的CD4T细胞损耗，而与佐剂无关。此外，在激发后看到接种组之间在病毒复制控制中的差异。虽然DNA和DNA+12组两者相对于未接种的对照显示峰病毒血症大约1log的降低，但DNA+RANTES组与天然组相比显示显著的2.2log的峰病毒载量的降低。虽然DNA组在设定点不具有显著地病毒载量降低，但用IL-12和RANTES辅佐的组具有显著更低的病毒载量。在第35周，与天然对照相比，仅DNA+RANTES组显示持续的、显著的对病毒载量的影响。

对人和恒河猴的大量研究已表明某些MHC单体型与病毒的自然控制相关。虽然最先的研究已证实源于印度的恒河猴中的MHC-I/疾病相关性，但将源于中国的恒河猴用于SIV疫苗研究的增加已担当起对于在该研究群体中的相似研究的需求以补充迄今为止已完成的那些研究。为了应对该问题，在激发研究已开始后进行全部动物的全面I类基因型分型。事后分析揭示有四只动物表达与强烈预防SIV复制相关的Mamu-B*003等位基因；在DNA+RANTES组中有两只以及在DNA和DNA+12组中各一只。在DNA+12组中还鉴定了Mamu-B*017动物。有意思的是，激发后在从未显示可检出的血浆病毒RNA的DNA+RANTES动物中检测到潜在地保护性Mamu-B*017样新型等位基因。在研究最后在具有这些保护性等位基因的动物中观察到显著更低的病毒载量(p=0.035)，这与该I类等位基因的重要性相一致。然而，相比之下，在保护性单体型动物的峰(p=0.561)和设定点(p=0.056)的病毒载量没有统计学差异。因此在长期感染期间保护性单体型与病毒的控制相关，但在感染早期的病毒复制控制中也观察疫苗效果。另外，在接种组中激发后CD4⁺T细胞耗竭的缺乏在具有Mamu-B*003或Mamu-B*017等位基因的动物与接种的其它动物之间没有显著区别。概括起来，这些数据进一步表明DNA接种可有助于SIVmac251粘膜激发中的保护。

在DNA+RANTES组中观察到的增强病毒抑制的机理尚不清楚。从我们的分析可清楚的是，这并不是由于IFNγ反应的大小引起的。一种假说是免疫期间RANTES的存在会调节CCR5⁺CD8⁺T细胞的频率。如已针对CCR5⁺CD4⁺T细胞所报道的那样，这些细胞然后回归到感染位点，并能够靶向感染的CD4⁺T细胞并提供改善的结果。为了以初步方式应对该假说，在免疫后在外周血中测量表达CCR5的抗原特异性CD8⁺T细胞的频率。在外周血的DNA+RANTES组中观察到这些细胞的较低频率。该结果与在其它分析中观察到的抗原特异性细胞的较低频率一起可能反映与其它接种组相比的RANTES佐剂反应的差异性回归模式(differential homing pattern)(例如粘膜区室)。在任何事件中清楚的是，RANTES调节诱导的T细胞的免疫生物学方面，并且该调节似乎在病毒激发的情况中对宿主有益。需要进行将来的研究以进一步探索该重要领域。

虽然检验了许多免疫参数，但没有一种单一分析能够预测病毒激发的结果。在本研究中观察到的病毒复制的控制并与中和抗体的发展不相关，这是因为在免疫后没有检出任何一种。最近的研究已表明它细胞功能，例如细胞毒性可能是保护性免疫反应的较好指示物。然而由于缺少恒河猴特异性抗体，未对疫苗中穿孔素诱导的免疫反应进行评价。基于激发结果似乎清楚的是，IFNγELISpot反应虽然重要，但是从可能是病毒控制更佳指示物的其它功能中单独地分离。IL-12和RANTES诱导的反应的免疫表型的进一步研究将在确定本研究中所观察到的降低病毒复制的细胞机理中是重要的。

Merck STEP试验的最新结果强调了许多将来T细胞类疫苗候选物需要应对的问题，包括：预存疫苗载体血清学的顾虑、在Ad5平台上显著改善免疫反应的大小和宽度的要求，和在异种SIV粘膜激发模型中改善病毒控制。在这方面，本文提供的收集数据证实此处所述的组合的DNA疫苗方法能够诱导与SIV感染相关的强烈的免疫反应，同时规避由于预存血清学引起的问题。可能有意义的是将这些疫苗与载体方法结合以部分地绕过该血清学类问题。另外，这些反应的大小以及调节使用分子佐剂诱导的免疫反应的方向和表型的能力对于SIV模型中疫苗有关的关联性的研究而言是特别有用的工具。

表3：免疫程序表

表4：SIVpol表位作图

组	最小	最大
			DNA	56.33±14.76	171±43.11
DNA+12	43.67±12.47	128±37.58
			DNA+RANTES	68±3.67	188±14.12

最大数表示阳性肽的总数

最小数通过将阳性肽流（2个或更多个相邻肽）除以3并四舍五入至最近整数来计算。针对最小和最大表位估计值示出的组平均±S.E.M。

表5：MHC-I基因型分型

源于中国的恒河猴的全面MHC I类基因型通过基于Sanger和基于Roche/454焦磷酸测序的分型来测定。使用BLASTN将来自各动物的MHC I类序列与全部已知Mamu序列的内部数据库比较。焦磷酸测序提供明显更大的覆盖深度，但是由于评价的模板短使得高度类似的等位基因之间的模糊性增加。在各动物中与给定等位基因一致的读出序列的百分比为>5.0%(勃艮第(burgundy))。用与控制SIV复制相关的等位基因或单体型(Mamu-B*003和Mamu-B*017)观察的动物标识为绿色。一只动物(#4424)表达与Mamu-B*017高度相似的新型Mamu-B等位基因的，其也可能与SIV控制相关。与控制相关的其它等位基因，例如源于印度恒河猴等位基因Mamu-A*001、Mamu-B*008或Mamu-B*047在这群源于中国的恒河猴中未观察到。

实施例2

人RANTES(pCCL5ECRO-ECRO=IgE，密码子/RNA优化的)的合成与克隆

以下述方式设计、合成并克隆用于优化人CCL5(pHuCCL5ECRO)的348bp基因。使密码子选择(codon usage)适于产生高CAI值的人类基因的密码子偏倚性(未优化的：0.81；优化的：0.97)。对于设计和合成，将密码子选择为避免可能极高(>80%)或极低(<30%)GC含量的区域。在这方面，已确定野生型人CCL5基因以高频率使用稀有密码子并且GC含量是平均的(57%)，这可有助于少量的快速mRNA周转(turnover)。因此，略微增加GC含量(62%)以改善mRNA半衰期。在优化过程期间，避免以下顺式作用序列基序：内部TATA盒、chi位点和核糖体进入位点、富AT或富GC序列延伸、ARE、INS、CRS序列元件、重复序列和RNA二级结构、(隐蔽)剪接供体和受体位点以及支化点(branch point)。分析后，只鉴定出1个负向负顺式作用基序且将其除去。优化的人CCL5的基因合成通过Geneart,Inc.(德国)进行。由合成寡核苷酸来组装合成的高度密码子/RNA优化的人CCL5基因。引入Kozak序列(GCCACC)以增强翻译起始，引入IgE前导序列，和添加两个终止密码子以确保有效终止。使用EcoRI和XhoI限制性位点将片段克隆入pVAX1。通过VGX药剂(Pure YieldTMplasmidMidiprep,Promega)从转化的细菌中纯化质粒DNA，并通过UV光谱来测定浓度。通过测序来证实人CCL5(phumCCL5ECRO)的最终DNA序列，并发现为100%一致。

实施例3

所附序列表包括SEQ ID NO:1-8。SEQ ID NO:1为密码子/RNA优化的编码人RANTES的核酸序列。SEQ ID NO:2为由SEQ ID NO:1编码的人RANTES的氨基酸序列。SEQ ID NO:3为密码子/RAA优化的编码具有连接到人RANTESN末端的IgE前导序列的RANTES蛋白质的核酸序列。SEQ ID NO:4为具有连接到由SEQ ID NO:3编码的人RANTES的N末端的IgE前导序列的RANTES蛋白质。SEQ IDNO:5包括与SEQ ID NO:3所公开相同的密码子/RNA优化的编码具有连接到人RANTESN末端的IgE前导序列的RANTES蛋白质的核酸序列，但在构建体的5’非翻译区具有另外的Kozak序列。SEQ IDNO:6，其是与SEQ ID NO:4相同的序列，为具有连接到由SEQ IDNO:3编码的人RANTES的N末端的IgE前导序列的RANTES蛋白质。SEQ ID NO:7包括与SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5所公开相同的密码子/RNA优化的编码具有连接到人RANTES的N末端的IgE前导序列的RANTES蛋白质的核酸序列，但是在SEQ ID NO:5的构建体的5’非翻译区具有另外的Kozak序列以及在5’和3’端的限制酶位点，所述限制酶位点是有用的操作，包括在质粒中插入和克隆构建体。SEQ ID NO:8为与SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6相同的序列，是具有连接到由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5编码的人RANTES的N末端的IgE前导序列的RANTES蛋白质。

Claims

1.一种分离的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、与SEQ ID NO:195%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:395%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:595%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:795%同源的核酸序列；包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:1的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ IDNO:7的功能片段、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:1的功能片段95%同源的核酸序列、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段95%同源的核酸序列、与包含至少60个核苷酸的SEQ IDNO:5的功能片段95%同源的核酸序列和与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段95%同源的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其包含SEQ IDNO:1。

3.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其包含在编码序列的5’端含有连接到SEQ ID NO:1的IgE前导编码序列的核酸序列。

4.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其包含SEQ IDNO:3。

5.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其包含在编码序列的5’端含有连接到SEQ ID NO:1的IgE前导编码序列且在5’非翻译区进一步包含Kozak序列的核酸序列。

6.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其包含SEQ IDNO:5。

7.一种表达载体，其包含可操作地连接到在人细胞中作用的调控元件的权利要求1所述的核酸序列。

8.根据权利要求4所述的表达载体，其中所述表达载体为质粒。

9.一种组合物，其包含：

a)多个一种或多种核酸分子，其包含选自由以下组成的组的一种或多种核酸序列：

1)选自由下述组的组：由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、与SEQ ID NO:195%同源的核酸序列、与SEQID NO:395%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:595%同源的核酸序列、与SEQ ID NO:795%同源的核酸序列；包含至少60个核苷酸的SEQID NO:1的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段、包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:1的功能片段95%同源的核酸序列、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段95%同源的核酸序列、与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段95%同源的核酸序列和与包含至少60个核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段95%同源的核酸序列组成的组的核苷酸序列；和

b)编码一种或多种免疫原的一种或多种另外的核酸序列。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述b)的一种或多种另外的核酸序列在来自a)部分中所述的多个核酸分子中的多个一种或多种不同核酸分子上。

11.根据权利要求9所述的组合物，其中a)部分中所述的多个核酸分子包含SEQ ID NO:1。

12.根据权利要求9所述的组合物，其中a)部分中所述的多个核酸分子包含在编码序列的5’端含有连接到SEQ ID NO:1的IgE前导编码序列的核酸序列。

13.根据权利要求9所述的组合物，其中部分中所述的多个核酸分子包含含有SEQ ID NO:3的核酸序列。

14.根据权利要求9所述的组合物，其中a)部分中所述的多个核酸分子在编码序列的5’端包含连接到SEQ ID NO:1的IgE前导编码序列并在5’非翻译区进一步包含Kozak序列。

15.根据权利要求9所述的组合物，其中a)部分中所述的多个核酸分子包含SEQ ID NO:5。

16.根据权利要求9所述的组合物，其中a)和b)部分中所述的核酸序列各自可操作地连接到在人细胞中作用的调控元件。

17.根据权利要求9所述的组合物，其中a)和b)中所述的核酸序列是一种或多种表达载体的一部分。

18.根据权利要求17所述的组合物，其中一种或多种表达载体为质粒。

19.根据权利要求9所述的组合物，其中所述免疫原为病原体抗原、癌症相关的抗原或与参与自身免疫病的细胞相关的抗原。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述免疫原为病原体抗原。

21.一种调节免疫反应的方法，其包括向个体施用包含权利要求1所述的核酸序列的核酸分子的步骤。

22.一种诱导对抗免疫原的免疫反应的方法，其包括向个体施用权利要求9所述的组合物的步骤。

23.一种重组病毒载体，其包含权利要求1所述的核苷酸序列。

24.根据权利要求23所述的重组病毒载体，其进一步包含可操作地连接到调控元件的编码免疫原的核酸序列。

25.根据权利要求23所述的重组病毒载体，其中所述免疫原为病原体抗原、癌症相关的抗原或与参与自身免疫病的细胞相关的抗原。

26.根据权利要求25所述的重组病毒载体，其中所述免疫原为病原体抗原。

27.一种调节个体中的免疫反应的方法，其包括向所述个体施用权利要求26所述的重组病毒载体。

28.一种减活病原体，其包含权利要求1所述的核苷酸序列。

29.一种免疫个体以对抗病原体的方法，其包括向所述个体施用权利要求29所述的减活病原体。