CN102766208A - 用于检测t-2和ht-2毒素的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能识别T-2和HT-2毒素的特异性单克隆抗体，所述的单克隆抗体是由杂交瘤细胞T-2所分泌的，该杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201189。本发明还公开了检测T-2和HT-2毒素的酶联免疫方法与试剂盒及其在T-2和HT-2毒素检测中的应用。与现有技术相比，本发明制备的单克隆抗体识别灵敏度高，抗体特异性好， IC₅₀值分别为1.46μg/L和26.26μg/L，本发明建立的酶联免疫方法及试剂盒检测精密度高、准确性好，样品处理方法简单，利于快速筛选。

Description

用于检测T-2和HT-2毒素的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒

技术领域

本发明属于检测分析和免疫学技术领域，具体涉及一种用于检测T-2和HT-2毒素的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒。

背景技术

T-2毒素和HT-2毒素是A类单端孢霉烯族毒素，由早熟禾镰刀菌(F.poae)和拟分枝孢镰刀菌(F.sporotrichioides)在湿冷的生长环境和潮湿的储存条件下产生，广泛存在于自然界，污染玉米、小麦、燕麦、黑麦等谷物，以玉米污染最为常见。T-2毒素和HT-2毒素能抑制DNA、RNA和蛋白质的合成，干扰生物体能量代谢，有致癌和致畸性，对人、畜危害极大，因此建立灵敏的粮食和饲料中的T-2和HT-2毒素检测方法十分重要。粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会(JACFA)规定的T-2和HT-2毒素的每日最大耐受摄入量(PMTDI)为60ngKg(JECFA，2001)，以色列规定谷物饲料中T-2毒素不得超过100μg/kg，欧洲国家规定T-2和HT-2在谷物中的最高残留限量(MRL)为20-300μg/Kg(FAO，2004)，我国规定猪配合饲料和禽配合饲料中T-2毒素的允许量为1mg/kg(GB 21693/2008)。

目前检测T-2和HT-2毒素的方法主要有薄层色谱法、气相、液相色谱法以及酶联免疫方法(ELISA)、试纸条等免疫学方法。薄层层析法检测的精度低(最低检出量为200ng)，气相、液相需要精密仪器和专业操作人员，不利于大面积推广与快速检测。ELISA方法具有灵敏、快速、特异性强、简便等优点，适合大量样本的筛检，近年来倍受关注。ELISA基于抗原抗体反应实现检测目的，抗体对毒素的特异性决定了方法的灵敏性、假阳性率、假阴性率，所以制备特异的单克隆抗体是此类方法的关键。现有用于制备T-2毒素抗体的完全抗原有两类，一类抗原合成方法是用连接臂丁二酸酐(HS)、戊二酸酐(HG)、O-羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)和T-2毒素C-3位置的羟基反应，C-3的羟基生成羧基，羧基和蛋白质的氨基连接，合成T-2-HS(HG、CMO)-BSA(GIgG)。Chu等(1985)合成抗原T-2HS-GIgG，得到两株细胞12C12和15H6，单克隆抗体可以检测T-2毒素和HT-2毒素，12C12和15H6针对T-2毒素的IC₅₀分别是133μg/mL和152μg/mL。1988年，日本学者Satoshi(1988)等用戊二酸酐代替琥珀酸酐，羊免疫球蛋白做连接蛋白，即合成抗原T-2HG-GIgG，获得细胞株7D4，抗体针对T-2毒素的IC₅₀是1ng/mL。我国T-2毒素的抗体研究较晚，90年代杨传和(1990)制备抗原T-2HS-GIgG，得到细胞株1D7，IC₅₀是180ng/mL。另一类抗原是用于检测T-2毒素的代谢物，Chu等(1987)在T-2的R8侧链水解，生成T-2tetraol、T-2tetraol四乙酸盐，再酶解T-2tetraol四乙酸盐生成T-2毒素的中间代谢物3-AcNEOS，最后合成完全抗原3-AcNEOS-HS-BSA，得到细胞株H159B1D5，所得抗体可识别T-2毒素及其代谢物(T-2、Ac-T-2、3-OH-T-2、DAS)，这种方法比较复杂，反应的步骤较多，特别是T-2tetraol的产率低于10%，副产物多，需要耗费大量T-2毒素，这些缺陷严重制约了这种方法的应用。杨传和(1990)的1D7抗体IC₅₀是180ng/mL，和T-2的限量标准比较其灵敏度比较低，样品检测时需要繁琐的萃取净化方法才能达到检测要求，需要较长的样品处理时间，不利于快速筛选。

可见，现有抗体的灵敏度和特异性都较差，不能完全满足T-2和HT-2毒素的检测要求。因此，制备出特异、灵敏的单克隆抗体，简化提取净化方法，更好地检测谷物和饲料中的T-2毒素和HT-2毒素具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种能识别T-2和HT-2毒素的单克隆抗体和检测T-2和HT-2毒素的酶联免疫方法与试剂盒。本发明还提供所述单克隆抗体在制备检测T-2和HT-2毒素的酶联免疫试剂盒中的应用以及酶联免疫方法和试剂盒在T-2和HT-2毒素检测中的应用。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种能同时识别T-2和HT-2毒素的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO：C201189的杂交瘤细胞T-2所分泌的。

所述的杂交瘤细胞T-2，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：C201189。

所述的单克隆抗体在制备检测T-2和HT-2毒素的酶联免疫试剂盒中的应用。

包含所述的单克隆抗体的试剂盒。

所述的试剂盒是检测T-2和HT-2毒素的酶联免疫试剂盒。

所述的试剂盒在T-2和HT-2毒素检测中的应用。

进一步，本发明提供了一种检测T-2和HT-2毒素的酶联免疫方法，其步骤如下：

(1)将T-2毒素与戊二酸酐(HG)反应后的产物(T-2HG)与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原(T-2HG-BSA)；

(2)将T-2毒素与丁二酸酐(HS)反应后的产物(T-2HS)与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原(T-2HS-OVA)；

(3)利用步骤(1)的免疫原制备得到保藏号为CCTCC NO：C201189的杂交瘤细胞T-2；

(4)用保藏号为CCTCC NO：C201189的杂交瘤细胞T-2制备单克隆抗体；

(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体(如酶标板)；

(6)将待测样品用体积百分比为50%的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液提取、滤纸过滤、样品稀释液稀释得到待测物；

(7)对步骤(6)的待测物进行检测；

其中，

样品稀释液的组分及配比为：NaCl 8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，加双蒸水至1000mL。

所述的酶联免疫方法在T-2和HT-2毒素检测中的应用。

本发明的有益效果是：

(1)本发明制备的单克隆抗体能够识别T-2毒素和HT-2毒素2种单端孢霉烯族毒素，IC₅₀值分别为1.46μg/L和26.26μg/L，识别灵敏度高，抗体特异性好；

(2)本发明建立的酶联免疫方法及试剂盒可用于检测谷物、饲料中的T-2和HT-2毒素，检测灵敏度、精密度高、准确性好；

(3)合成步骤少，样品处理方法简单，利于快速筛选。

附图说明

图1为本发明的技术路线图。

图2为本发明的单克隆抗体与T-2毒素标准品的间接竞争ELISA反应曲线，X轴为T-2毒素标准溶液浓度对数值，Y轴为T-2毒素标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B₀)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。

实施例1免疫原和包被原的制备

半抗原的合成：10mg的T-2毒素溶于0.4ml吡啶中，加入210mg的HG(或HS)，蒸汽浴下搅拌反应4h。反应结束后氮气吹干溶剂，将反应物重新溶解在5ml的氯仿中，并用5ml水洗4遍，然后再将其氮气吹干，产物即T-2HG(或T-2HS)。将产物转移到0.2ml DMF，加入10倍摩尔浓度的碳二亚胺(DCC)与5倍摩尔浓度的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌1h，氮气吹干。

免疫原的合成：将半抗原T-2HG转入0.2ml的DMF中，将反应液逐滴滴加到25mg BSA(10ml 0.1mol/L磷酸盐)溶液中，磁力搅拌24h，将反应液装入透析袋中，于磷酸盐缓冲液(PBS)中透析3天，每12h更换一次透析液。离心，取上清，冷冻备用。

包被原的合成：将半抗原T-2HS转入0.2ml的DMF中，将反应液逐滴滴加到25mg OVA(10ml 0.1mol/L磷酸盐)溶液中，磁力搅拌24h，将反应液装入透析袋中，于PBS缓冲液中透析3天，每12h更换一次透析液。离心，取上清，冷冻备用。

实施例2单克隆抗体的制备

2.1小鼠免疫

参照薛庆善《体外培养的原理与技术》科学出版社2001年版中的方法：以实施例1制备的T-2HG-BSA偶联物为免疫原，免疫Balb/c雌性小鼠。首次免疫时用弗氏完全佐剂乳化的抗原注射于小鼠的颈背部皮下，以后每隔15d(首免与二免间隔21d)用弗氏不完全佐剂乳化的抗原进行加强免疫。免疫三次以后，第8天尾静脉采血，37℃凝固0.5h，4℃静置过夜，4000r/min离心5min分离血清。间接ELISA法检测抗体效价，间接竞争ELISA方法检测血清对药物的特异性。免疫合格的小鼠(效价高、灵敏度好)停止免疫以备融合。

2.2细胞融合与筛选

在融合前3天(最好与上次免疫相隔3周以上)给免疫合格的小鼠腹腔注射含100μg免疫原的蛋白溶液(不加佐剂)，强化免疫。融合前1天取未免疫的Balb/c鼠一只制备饲养细胞。根据骨髓瘤细胞的计数结果，取3～5×10⁷个骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合(比例为1:10～5:10)。1500r/min离心5min，将离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上，控干水滴。轻轻地敲击管底，使管底细胞成糊状，将其放置于37℃水浴中，将吸有0.8mL预温至37℃的50%聚乙二醇(PEG，购自Amersco)的lmL刻度吸管插入到管底，60sec内缓缓加PEG到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，加完后静置90sec，将离心管插到离心管架上。移走水浴杯，用吸管吸取10mL预温至37℃的RPMI–1640基础培养液沿管壁缓缓加到融合细胞上，边加边轻轻晃动离心管，第1分钟逐滴加入1mL(3sec/滴)，第2分钟再加2mL，最后加完剩下的7mL(5min内加完)。加完第一个10mL后，接着沿管壁补加RPMI-1640培养基至50mL，加完后拧紧盖，缓慢颠倒几次，混匀。1500r/min离心5min，弃去上清，用含有饲养细胞的72mL HAT完全培养基轻轻将融合细胞搅拌重悬。将融合细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，2滴/孔。一次融合可接种5块96孔细胞培养板，置于37℃5%CO₂培养箱中培养。从融合当天算起为0d，前面3d尽量不要动细胞板，保持培养箱内环境稳定。第3d每孔补加1滴HAT完全培养基并观察集落生长情况；第5d每孔吸出l/2培养上清(100μL)，再加入1滴HT完全培养基；以后每隔3d同上法吸去1/2培养上清，换入HT完全培养基。根据细胞的生长情况，当细胞生长至占孔底面积1/4左右即可取细胞培养上清，以实施例1制备的T-2HS-OVA偶联物为包被原，利用ELISA方法筛选出分泌抗T-2毒素的阳性细胞孔。对筛选出来的阳性细胞孔利用有限稀释法连续3次克隆化，最终建立一株稳定分泌抗T-2毒素抗体的杂交瘤细胞株，对该杂交瘤细胞株进行染色体计数平均值为99.5条，高于亲本细胞的染色体数目(SP2/0骨髓瘤细胞的染色体平均数为58条，脾细胞染色体为40条)，说明融合细胞的确是SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的杂交产物。申请人将该杂交瘤细胞株命名为T-2，并于2011年9月8日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO：C201189。

2.3腹水单抗制备与鉴定

在接种前7天取Balb/c小鼠数只，每只小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂进行预处理。用RPMI-1640基础培养基悬浮细胞并将细胞数调至1×10⁶个/mL，每只小鼠腹腔接种0.5ml。待小鼠腹部明显膨大，精神变差，濒死不动时采集腹水，纯化获得单克隆抗体。以单克隆抗体亚型鉴定试纸条确定单克隆抗体为IgG1亚型，kappa轻链。

实施例3间接竞争ELISA检测方法的建立

3.1试剂配制

碳酸盐缓冲液(pH9.6)：准确称取Na₂CO₃1.59g、NaHCO₃2.93g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。

洗涤液(pH7.4)：准确称取NaCl 8.00g，KH₂PO₄0.20g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.90g，KCl 0.20g，少量超纯水溶解，加入Tween 200.50mL，定容至1000mL。

磷酸盐缓冲液(pH7.4)：准确称取NaCl 8.00g，KH₂PO₄0.20g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.90g，KCl0.20g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。

封闭液：准确称取卵清蛋白10.00g，加入磷酸盐缓冲液1000mL，搅拌混匀直至蛋白完全溶解。

底物混合液：准确吸取底物B液(购自武汉市飞远科技有限公司)10mL，加入100μL底物A液(购自武汉市飞远科技有限公司)，混匀，现配现用。

终止液：准确量取浓硫酸100mL，缓慢滴加到800mL超纯水中。

3.2方阵滴定法

采用方阵滴定法初步选择包被原浓度和抗体稀释度。使用碳酸盐缓冲液将T-2HS-OVA包被原倍比稀释成64、32、16、8μg/mL，从第一至第4列依次纵向加入96孔酶标板，4℃过夜；洗涤3次，拍干，加入封闭液250μL，37℃封闭2h；洗涤3次，拍干，单克隆抗体使用磷酸盐缓冲液倍比稀释成1:10000、1:20000、1:30000、1:40000、1:50000、1:60000、1:70000，从第一至第八行依次横向加入96孔酶标板，37℃孵育30min；洗涤3次，拍干，各孔加入用磷酸盐缓冲液1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(简称二抗，以下所指二抗均为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，购自武汉飞羿生物技术有限公司)100μL，37℃孵育30min；洗涤4次，拍干，各孔加入底物混合液100μL，避光显色15min；加入终止液50μL；用自动酶标仪在450nm波长处测定光密度值(OD值)。方阵滴定结果见表1，初步选择几个OD值接近2.0，且相邻两孔OD值有较大变化的包被浓度及对应的抗体稀释度组合。结果表明，可选择以下包被原浓度和抗体稀释度组合：(8，20000)、(16，40000)、(32，70000)

表1单克隆抗体方阵滴定

3.2最佳包被浓度的选择

以T-2毒素为竞争物，设置为0、0.25、1、2、4、8μg/L为浓度梯度，分别以3.1方阵滴定法选择的包被浓度及对应的抗体稀释度组合进行间接竞争ELISA。以竞争物浓度的对数值作为横坐标、B/B0(以无药物抑制时的OD值为B0，相应浓度药物抑制时的OD值为B值)作为纵坐标绘制抑制曲线。结果见表2，以“0”孔OD值和IC₅₀值作为判定指标，确定最佳包被原浓度。由结果可知，最佳包被浓度为32μg/mL，抗体稀释度初步确定为1:70000。

表2最佳包被浓度优化

包被原浓度(μg/mL)	抗体稀释倍数(1：X)	0孔OD值	IC50(μg/L)
				8	20000	1.391	10.72
16	40000	1.771	8.99
				32	70000	2.107	1.55

3.2最佳抗体稀释度的选择

以最佳包被浓度包被酶标板，将抗体以1:70000为基础浓度等差设计4个稀释梯度，其0孔与IC₅₀值见表3。随着抗体稀释度的减少，IC₅₀值发生不同的变化，综合零孔OD值和IC₅₀值最终选定1:60000为最佳抗体稀释度。

表3最佳抗体稀释度优化

抗体稀释倍数(1：X)	0孔OD值	IC50值(μg/L)
			40000	2.288	2.01
50000	2.107	1.55
			60000	2.035	1.48
70000	1.499	2.75
			80000	1.257	1.94

3.3标准曲线的建立

将T-2毒素标准品配制成0、0.25、0.5、1、2、4、8μg/L 几个浓度梯度，按照上面确定的间接竞争ELISA方法测定，绘制标准曲线(见图2)。间接竞争ELISA检测方法的回归方程和相关指数为：y=-0.5326x+0.5791，R=0.995，IC50值为1.46±0.10(n=5)，线性范围为0.25～8μg/L。

3.4交叉反应实验

分别将T-2毒素及其代谢物标准品倍比稀释成浓度梯度进行间接竞争ELISA，计算IC₅₀值，得到交叉反应率，结果见表4。

表4单克隆抗体对单端孢霉烯族毒素的交叉反应率

竞争物	IC50(μg/L)	交叉反应率(%)
			T-2	1.46	100
HT-2	26.26	5.56
			T-2triol	>10000	<0.03
T-2tetraol	>10000	<0.03
			NEO	>10000	<0.03
DON	>10000	<0.03
			NIV	>10000	<0.03

实施例4：本发明ELISA检测试剂盒的组装

4.1试剂盒组成成分

(1)包被有包被原T-2HS-OVA的酶标板；

(2)T-2毒素标准品溶液7瓶，浓度分别为0、0.25、0.5、1、2、4、8μg/L；

(3)杂交瘤细胞T-2单克隆抗体工作液；

(4)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；

(5)浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl 80.00g，KH₂PO₄2.00g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.00g，KCl 2.00g，加双蒸水至1000mL；

(6)浓缩洗涤液：NaCl 80.00g，KH₂PO₄2.00g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.00g，KCl 2.00g，Tween205mL，加双蒸水至1000mL；

(7)底物混合液：准确吸取底物B液(购自武汉市飞远科技有限公司)10mL，加入100μL底物A液(购自武汉市飞远科技有限公司)，混匀，现配现用；

(9)终止液：2mol/L硫酸溶液。

4.2酶标板的制备

(1)包被：用碳酸盐缓冲液将T-2HS-OVA稀释成32μg/mL包被原溶液，准确吸取100μL包被原溶液于各酶标孔，水平放置于湿盒，4℃孵育12h。

(2)洗板：甩出酶标板内包被原溶液，拍干，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次。

(3)封闭：准确吸取250μL封闭液于各酶标孔，水平置于湿盒内，37℃培养箱孵育2h。

(4)洗板：甩出封闭液，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次。

(5)烘干：在吸水纸上拍干后；将酶标板于37℃培养箱中倒置烘干0.5h。

(6)封装：酶标板烘干后和干燥剂一起装入铝箔袋，用真空封装机封装。

实施例5：试剂盒在检测动物饲料中T-2毒素中的应用

5.1试剂配制

洗涤液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用双蒸水10倍稀释后使用。

样品稀释液配制：准确称取NaCl 8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g，KCl 0.2g于500mL烧杯中，加少量超纯水溶解，双蒸水定容至1000mL。

底物混合液配制：根据每次所需用量，取适量的底物A液与B液按1:100的比例混匀，现配现用。

5.2样品处理

提取：称取饲料2.0±0.02g于50mL聚四氟乙烯离心管中，加入二甲基甲酰胺:水(1:1)10mL，涡旋10min，静置1min。

净化：用滤纸过滤上清。准确吸取过滤后的上清10μL，加入PBS190μL，混匀后用于ELISA检测。

5.3ELISA测定程序

(1)取出试剂盒，平衡至室温，将足够标准品和样品所用数量的孔条插入微孔架。

(2)加T-2毒素标准品溶液或样品液50μL到各自微孔中；标准品和样品做两个平行实验，记录下标准品和样品的位置。加抗体液50μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育60min。

(3)甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取洗涤液250μL于各孔，静置30s左右，甩净洗涤液，在吸水纸上拍干。重复洗涤4次。

(4)加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育60min。

(5)甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取洗涤液250μL于各孔，静置30s左右，甩净洗涤液，在吸水纸上拍干。重复洗涤5次。

(6)加底物混合液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育15min。

(7)加终止液50μL至各孔；充分混合；30min内在450nm处测量吸光值。

5.4结果判定

将标准液或样品液吸光值的平均值除以“0”标准孔的吸光值再乘以100%，即为抑制率。在0.25~8μg/L范围内，以抑制率为纵坐标，标准液浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程。按照公式1计算样品的抑制率，将抑制率代入回归方程，计算出测定浓度，乘以稀释系数，即为样品中T-2毒素的残留浓度。

实施例6：本发明试剂盒的灵敏度、精密度、准确度

6.1本发明试剂盒的灵敏度

取20份空白样品，进行ELISA检测，测定OD值，计算空白样品OD值的平均值(x)。将x代入标准曲线上查出对应的浓度(C)，并计算标准差(SD)。根据公式Z＝C+3×SD计算Z值，得到饲料样品的最低检测限为12.38μg/kg。

6.2本发明试剂盒的精密度

将T-2毒素标准品稀释成0、0.25、0.5、1、2、4、8μg/L7个浓度，各浓度3个平行孔，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，将各标准品浓度对应的OD值代入其标准曲线方程求出ELISA检测的测定值，以标准品浓度测定值计算间接竞争ELISA标准曲线的板内板间变异系数，结果见表5。

表5本发明试剂盒的精密度

6.3本发明试剂盒的准确度

取空白饲料样品，按照毒素在各种组织中的最大残留限量分别进行添加实验，使组织中添加药物的浓度为50、100和200μg/kg，每个样品浓度设置5个平行样。然后进行样品处理，ELISA测定药物浓度，重复3批，计算回收率，回收率按下面公式计算，并计算批内和批间变异系数。

我国农业部要求兽药残留酶联免疫试剂盒的回收率范围在60%～120%之间，批内和批间变异系数分别小于25%和30%。本研究将T-2毒素添加到饲料样品中，其添加回收率及批内与批间变异系数测定结果见表6。药物回收率在95%～120%之间，批内和批间差异均小于15%。

表6饲料中T-2毒素添加回收率与变异系数

Claims (8)

1.一种能同时识别T-2和HT-2毒素的单克隆抗体，其特征在于，它是由保藏号为CCTCC NO：C201189的杂交瘤细胞T-2所分泌的。

2.权利要求1所述的杂交瘤细胞T-2，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：C201189。

3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测T-2和HT-2毒素的酶联免疫试剂盒中的应用。

4.包含权利要求1所述的单克隆抗体的试剂盒。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，该试剂盒是检测T-2和HT-2毒素的酶联免疫试剂盒。

6.权利要求4或5所述的试剂盒在T-2和HT-2毒素检测中的应用。

7.一种检测T-2和HT-2毒素的酶联免疫方法，其步骤如下：

（1）将T-2毒素与戊二酸酐反应后的产物与牛血清白蛋白偶联得到免疫原；

（2）将T-2毒素与丁二酸酐反应后的产物与卵清蛋白偶联得到包被原；

（3）利用步骤（1）的免疫原制备得到保藏号为CCTCC NO：C201189的杂交瘤细胞T-2；

（4）用保藏号为CCTCC NO：C201189的杂交瘤细胞T-2制备单克隆抗体；

（5）用步骤（2）的包被原包被固相载体；

（6）将待测样品用体积百分比为50% 的N,N-二甲基甲酰胺溶液提取、滤纸过滤、样品稀释液稀释得到待测物；

（7）对步骤（6）的待测物进行检测，

其中，

样品稀释液的组分及配比为：NaCl 8.0g， KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄ ^.12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，加双蒸水至1000mL。

8.权利要求7所述的酶联免疫方法在T-2和HT-2毒素检测中的应用。

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