CN102755881B - 碱性橙ⅱ分子印迹固相萃取填料、固相萃取柱及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取填料，它是以碱性橙Ⅱ为模板分子、丙烯酰胺为功能单体、马来松香乙二醇丙烯酸酯为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂制成的分子印迹聚合物微粒。该固相萃取填料对碱性橙Ⅱ分子的立体结构具有“记忆”功能，能实现对碱性橙Ⅱ的特异性、选择性分离和富集，将其装填成固相萃取柱，可用于检测食品中含碱性橙Ⅱ样品提取溶液中碱性橙Ⅱ的选择性分离、纯化和富集，对含碱性橙Ⅱ的食品样品实现了高灵敏度、高选择性的检测，回收率稳定，相对标准偏差小，具有操作更为简单、快速、高效等特点。

Description

碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取填料、固相萃取柱及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及食品安全检测技术领域，尤其是一种碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取填料、固相萃取柱及其制备方法和应用。

背景技术

碱性橙Ⅱ（Basic OrangeⅡ），化学名为2，4-二胺基偶氮苯，俗名“王金黄”，化学分子式为C₁₂H₁₂N₄·HCl，分子量为248.5，由苯胺重氮化后，与间苯二胺偶合而制得，是一种偶氮类碱性工业染料。碱性橙为红褐色结晶性粉末或有绿色光泽的褐色块状晶体，主要用于皮革制品、纺织品及木制品的染色。据调查其具有高致癌、致畸变性等危害，中国、美国及欧盟等都禁止用作食品添加剂。

在食品残留检测中，样品前处理过程对分析结果的确准性、可靠性至关重要。固相萃取（Solid Phase Extraction，简称SPE）是近年发展起来的一种新型样品前处理技术，其结合了液固萃取和柱液相色谱技术的优点，主要用于样品的分离、纯化和富集，能更有效地将待测组分与样品基体或干扰物质分离，减少样品前处理步骤，具有使用有机溶剂量少，操作简单、快速、分离效率高等优势。SPE在食品残留分子的检测中已被广泛应用，成为食品样品分离纯化的重要技术。

常规固相萃取柱的装填材料主要有键合硅胶固相萃取材料、无机基质固相萃取材料和有机聚合物固相萃取材料，它们分离选择性不高。分子印迹固相萃取（MolecularlyImprinted Solid Phase Extraction，MISPE）利用分子印迹聚合物(Molecularly ImprintedPolymer，MIP)的特异选择性吸附机理制备SPE填料，由于MIP对模板分子具有特异选择性和亲合性，而且其受酸、碱、有机溶剂和加热等环境因素影响很小，可以克服食品样品体系复杂、预处理程序烦琐等不利因素，实现复杂食品样品基体中低浓度目标物的分离富集，提高SPE的净化效果及分析检测方法的灵敏度。

目前分子印迹技术所用交联剂（如乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸(TRIM)等）多为直链型分子，种类较单一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取填料及其制备方法，以方便实现对碱性橙Ⅱ进行特异性、选择性分离和富集。

本发明要解决的另一技术问题是提供一种碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取柱及其制备方法，以方便实现对食品中的碱性橙Ⅱ进行特异性吸附、选择性分离纯化和富集，并能结合高效液相色谱法实现食品中微量碱性橙Ⅱ的快速、高效的分离检测，利于在食品安全检测中的推广和应用。

本发明要解决的再一技术问题是提供一种碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取柱在选择性分离、纯化和富集食品样品中碱性橙Ⅱ方面的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取填料，以碱性橙Ⅱ为模板分子、丙烯酰胺为功能单体、马来松香乙二醇丙烯酸酯为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂制备。

碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取填料是由原料碱性橙Ⅱ、丙烯酰胺、马来松香乙二醇丙烯酸酯、偶氮二异丁腈按投料量比0.1～3mmol:2～60mmol:3～90mmol:0.1～1.2g制成的分子印迹聚合物微粒。

分子印迹聚合物微粒的平均粒径为180～250μm。

碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取填料的制备方法，以碱性橙Ⅱ为模板分子、丙烯酰胺为功能单体、马来松香乙二醇丙烯酸酯为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂，按投料量比0.1～3mmol:2～60mmol:3～90mmol:0.1～1.2g发生聚合反应，再洗脱除去模板分子碱性橙Ⅱ得到分子印迹聚合物微粒。

该制备方法包括以下步骤：

<1>将0.1～3mmol碱性橙Ⅱ用适量无水乙醇溶解，加入2～60mmol丙烯酰胺单体、3～90mmol交联剂马来松香乙二醇丙烯酸酯、0.1～1.2g偶氮二异丁腈、2～10mL大豆油、10～40mL乙酸乙酯，超声20min，形成均匀有机相溶液A；溶液B为质量浓度0.10%的十二烷基硫酸钠水溶液；取溶液B100～600mL置于三颈烧瓶中，将溶液A倒入溶液B中，加装搅拌器、冷凝管和温度计，室温下恒速210～250r/min搅拌20min；程序升温加热聚合，温度控制在75～95℃，反应3～5h，生成分子印迹聚合物；

<2>抽滤步骤<1>的反应体系分离得到聚合物微粒，再将聚合物微粒置于滤纸筒中，以冰乙酸-无水乙醇溶液为洗脱剂，分别按体积比80/20、50/50、20/80、0/100的比例进行梯度洗脱，索氏提取除去碱性橙Ⅱ后，最后用蒸馏水洗去残留溶剂，室温下自然风干得到分子印迹聚合物微粒。

程序升温加热聚合是75℃1h；接上分水器，85℃，待有机溶剂分馏完毕；95℃1h。

使用上述碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取填料制成的固相萃取柱。

上述固相萃取柱的制备方法，将碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取填料填充于SPE空管内，空管两端分别装上聚乙烯筛板，该萃取柱的体积为1～20mL，如：1mL、3mL、6mL、12mL、和20mL等，本发明优选6mL的固相萃取小柱。

上述固相萃取柱在选择性分离、富集和纯化食品中碱性橙Ⅱ残留样品中的应用。

上述应用包括以下步骤：

<1>固相萃取柱装填好后，依次用1～3个柱体积的甲醇活化，再用1～3个柱体积的体积分数为45%的乙醇平衡；

<2>取样品提取液注入固相萃取柱；

<3>用0.5～1个柱体积的体积分数为20%的乙醇清洗；

<4>最后用1个柱体积的无水乙醇洗脱，即得洗脱液，经0.45μm有机滤膜过滤后进行HPLC分析。

发明人利用改性松香交联剂（马来松香乙二醇丙烯酸酯），设计制成了一种含三环菲骨架的碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取填料，主要是将碱性橙Ⅱ、丙烯酰胺、改性松香交联剂和引发剂发生聚合反应，再洗脱除去模板分子碱性橙Ⅱ得到分子印迹聚合物微粒，作为固相萃取填料。改性松香交联剂是高分子聚合物合成中的一种新型交联剂，在功能性高分子的合成上具有以下特点：分子量较大，可以制成孔径较大的印迹聚合物，利于模板分子的识别与分离；具有刚性三环菲骨架，所合成的聚合物的机械强度好，不宜破碎，热稳定性高；原料天然易得，价格低廉，无毒环保。因此，所得印迹聚合物微粒是一种具有固定孔穴大小、形状和确定功能基排列的高分子交联聚合物，对碱性橙Ⅱ分子的立体结构具有“记忆”功能，能实现对碱性橙Ⅱ的特异性、选择性分离和富集。该填料装填成固相萃取柱，可用于检测食品中碱性橙Ⅱ样品提取溶液中碱性橙Ⅱ的选择性分离、纯化和富集，对含碱性橙Ⅱ的食品样品实现了高灵敏度、高选择性的检测，回收率稳定，相对标准偏差小，更具有操作更为简单、快速、高效等特点。

具体实施方式

实施例1

一、碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取小柱的制备

（1）具有三环菲骨架的含碱性橙Ⅱ分子印迹聚合物微粒的制备

称取0.2mmol碱性橙Ⅱ，加入适量无水乙醇使其恰好溶解，再加入4mmol丙烯酰胺单体、6mmol交联剂马来松香乙二醇丙烯酸酯、0.25g偶氮二异丁腈、2mL大豆油、10mL乙酸乙酯，超声20min，形成均匀有机相溶液A；溶液B为质量浓度0.10%的十二烷基硫酸钠水溶液；取溶液B100mL置于三颈烧瓶中，将溶液A倒入溶液B中，加装搅拌器、冷凝管和温度计，室温下恒速（210r/min）搅拌20min；加热，使反应体系缓慢升温至75℃，反应1h；接上分水器，缓慢升温至85℃，待有机溶剂分馏完毕；再缓慢升温至95℃，加热1h。

（2）聚合物中碱性橙Ⅱ的洗脱

抽滤步骤<1>的反应体系分离得到聚合物微粒，再将聚合物微粒置于滤纸筒中，以冰乙酸-无水乙醇溶液为洗脱剂，分别按体积比80/20、50/50、20/80、0/100的比例进行梯度洗脱，索氏提取除去碱性橙Ⅱ后，最后用蒸馏水洗去残留溶剂，室温下自然风干得到碱性橙Ⅱ分子印迹聚合物微粒（平均粒径为180～250μm）。

（3）碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取小柱的制备

称取0.30g的上述碱性橙Ⅱ分子印迹聚合物微粒填充于SPE空管内装柱，装填高度约为1cm，萃取柱的体积为6mL，填料的顶端和底端分别装有聚乙烯筛板；采用乙醇为装柱匀浆液将匀浆液装入聚乙烯固相萃取柱，盖紧筛板。

二、碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取小柱应用于腊肠中碱性橙Ⅱ残留样品的提取液的选择性分离、富集和纯化

<1>固相萃取柱装填好后，依次用10mL甲醇活化，再用10mL体积分数45%的乙醇平衡。

<2>取市售腊肠粉碎，准确称取2g于100mL具塞锥形瓶中，加入一定浓度的碱性橙Ⅱ乙醇溶液，混匀，放置自然挥干；加入10mL正己烷，超声1～2min，弃去正己烷层，冷风吹干；准确加入20mL无水乙醇超声提取20min，静置冷却后，精密量取上清液10mL于100mL茄形瓶中，45℃下减压旋转蒸干，准确加入10mL体积分数为45%的乙醇，超声1~2min，10000r/min离心10min，精密量取上清液2mL，缓慢注入固相萃取柱。

<3>用体积分数为20%的乙醇清洗（2.0mL×2次）。

<4>最后用无水乙醇洗脱（2.0mL×3次），即得洗脱液，经0.45μm有机滤膜过滤后进行HPLC分析。

结果：固相萃取小柱对腊肠中的碱性橙Ⅱ具有专一选择性的富集和纯化能力，对腊肠样品中加标回收率为79.0％，相对标准偏差为0.15％。

实施例2

一、碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取小柱的制备

（1）具有三环菲骨架的含碱性橙Ⅱ分子印迹聚合物微粒的制备

称取1mmol碱性橙Ⅱ，加入适量无水乙醇使其恰好溶解，再加入20mmol丙烯酰胺单体、30mmol交联剂马来松香乙二醇丙烯酸酯、0.5g偶氮二异丁腈、5mL大豆油、20mL乙酸乙酯，超声20min，形成均匀有机相溶液A；溶液B为质量浓度0.10%的十二烷基硫酸钠水溶液；取溶液B300mL置于三颈烧瓶中，将溶液A倒入溶液B中，加装搅拌器、冷凝管和温度计，室温下恒速（230r/min）搅拌20min；加热，使反应体系缓慢升温至75℃，反应1h；接上分水器，缓慢升温至85℃，待有机溶剂分馏完毕；再缓慢升温至95℃，加热1h。

（2）聚合物中碱性橙Ⅱ的洗脱

抽滤步骤<1>的反应体系分离得到聚合物微粒，再将聚合物微粒置于滤纸筒中，以冰乙酸-无水乙醇溶液为洗脱剂，分别按体积比80/20、50/50、20/80、0/100的比例进行梯度洗脱，索氏提取除去碱性橙Ⅱ后，最后用蒸馏水洗去残留溶剂，室温下自然风干得到碱性橙Ⅱ分子印迹聚合物微粒（平均粒径为180～250μm）。

（3）碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取小柱的制备

称取0.30g的上述碱性橙Ⅱ分子印迹聚合物微粒填充于SPE空管内装柱，装填高度约为1cm，萃取柱的体积为6mL，填料的顶端和底端分别装有聚乙烯筛板；采用乙醇为装柱匀浆液将匀浆液装入聚乙烯固相萃取柱，盖紧筛板。

二、碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取小柱应用于豆腐干中碱性橙Ⅱ残留样品的提取液的选择性分离、富集和纯化

<1>固相萃取柱装填好后，依次用15mL甲醇活化，再用15mL体积分数为45%的乙醇平衡。

<2>取市售豆腐干粉碎，准确称取2g于100mL具塞锥形瓶中，加入一定浓度的碱性橙Ⅱ乙醇溶液，混匀，放置自然挥干；加入10mL正己烷，超声1～2min，弃去正己烷层，冷风吹干；准确加入20mL无水乙醇超声提取20min，静置冷却后，精密量取上清液10mL于100mL茄形瓶中，45℃下减压旋转蒸干，准确加入10mL体积分数为45%的乙醇，超声1~2min，10000r/min离心10min，精密量取上清液2mL，缓慢注入固相萃取柱。

<3>用体积分数为20%的乙醇清洗（2.0mL×2次）。

<4>最后用无水乙醇洗脱（2.0mL×3次），即得洗脱液，经0.45μm有机滤膜过滤后进行HPLC分析。

结果：固相萃取小柱对豆腐干中的碱性橙Ⅱ具有专一选择性的富集和纯化能力，对豆腐干样品中加标回收率为78.5％，相对标准偏差为0.86％。

实施例3

一、碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取小柱的制备

（1）具有三环菲骨架的含碱性橙Ⅱ分子印迹聚合物微粒的制备

称取3mmol碱性橙Ⅱ，加入适量无水乙醇使其恰好溶解，再加入60mmol丙烯酰胺单体、90mmol交联剂马来松香乙二醇丙烯酸酯、1.2g偶氮二异丁腈、10mL大豆油、40mL乙酸乙酯，超声20min，形成均匀有机相溶液A；溶液B为质量浓度0.10%的十二烷基硫酸钠水溶液；取溶液B600mL置于三颈烧瓶中，将溶液A倒入溶液B中，加装搅拌器、冷凝管和温度计，室温下恒速（250r/min）搅拌20min；加热，使反应体系缓慢升温至75℃，反应1h；接上分水器，缓慢升温至85℃，待有机溶剂分馏完毕；再缓慢升温至95℃，加热1h。

（2）聚合物中碱性橙Ⅱ的洗脱

抽滤步骤<1>的反应体系分离得到聚合物微粒，再将聚合物微粒置于滤纸筒中，以冰乙酸-无水乙醇溶液为洗脱剂，分别按体积比80/20、50/50、20/80、0/100的比例进行梯度洗脱，索氏提取除去碱性橙Ⅱ后，最后用蒸馏水洗去残留溶剂，室温下自然风干得到碱性橙Ⅱ分子印迹聚合物微粒（平均粒径为180～250μm）。

（3）碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取小柱的制备

称取0.50g的上述碱性橙Ⅱ分子印迹聚合物微粒填充于SPE空管内装柱，装填高度约为1.5cm，萃取柱的体积为6mL，填料的顶端和底端分别装有聚乙烯筛板；采用乙醇为装柱匀浆液将匀浆液装入聚乙烯固相萃取柱，盖紧筛板。

二、碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取小柱应用于海虾米中碱性橙Ⅱ残留样品的提取液的选择性分离、富集和纯化

<1>固相萃取柱装填好后，依次用20mL甲醇活化，再用20mL体积分数为45%的乙醇平衡。

<2>取市售海虾米粉碎，准确称取2g于100mL具塞锥形瓶中，加入一定浓度的碱性橙Ⅱ乙醇溶液，混匀，放置自然挥干；加入10mL正己烷，超声1～2min，弃去正己烷层，冷风吹干；准确加入20mL无水乙醇超声提取20min，静置冷却后，精密量取上清液10mL于100mL茄形瓶中，45℃下减压旋转蒸干，准确加入10mL体积分数为45%的乙醇，超声1~2min，10000r/min离心10min，精密量取上清液2mL，缓慢注入固相萃取柱。

<3>用体积分数为20%的乙醇清洗（2.0mL×2次）。

<4>最后用无水乙醇洗脱（2.0mL×3次），即得洗脱液，经0.45μm有机滤膜过滤后进行HPLC分析。

结果：固相萃取小柱对海虾米中的碱性橙Ⅱ具有专一选择性的富集和纯化能力，对海虾米样品中加标回收率为80.3％，相对标准偏差为1.2％。

Claims (4)

1.一种碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取填料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

<1>将0.1～3mmol碱性橙Ⅱ用适量无水乙醇溶解，加入2～60mmol丙烯酰胺单体、3～90mmol交联剂马来松香乙二醇丙烯酸酯、0.1～1.2g偶氮二异丁腈、2～10mL大豆油、10～40mL乙酸乙酯，超声20min，形成均匀有机相溶液A；溶液B为质量浓度0.10%的十二烷基硫酸钠水溶液；取溶液B100～600mL置于三颈烧瓶中，将溶液A倒入溶液B中，加装搅拌器、冷凝管和温度计，室温下恒速210～250r/min搅拌20min；程序升温加热聚合，温度控制在75～95℃，反应3～5h，生成分子印迹聚合物；

<2>抽滤步骤<1>的反应体系分离得到聚合物微粒，再将聚合物微粒置于滤纸筒中，以冰乙酸-无水乙醇溶液为洗脱剂，分别按体积比80/20、50/50、20/80、0/100的比例进行梯度洗脱，索氏提取除去碱性橙Ⅱ后，最后用蒸馏水洗去残留溶剂，室温下自然风干得到分子印迹聚合物微粒。

2.根据权利要求1所述碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取填料的制备方法，其特征在于：所述程序升温加热聚合是75℃1h；接上分水器，85℃，待有机溶剂分馏完毕；95℃1h。

3.使用权利要求1所得碱性橙Ⅱ分子印迹固相萃取填料制成的固相萃取柱在选择性分离、富集和纯化食品中碱性橙Ⅱ残留样品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于包括以下步骤：

<1>固相萃取柱装填好后，依次用1～3个柱体积的甲醇活化，再用1～3个柱体积的体积分数为45%的乙醇平衡；

<2>取样品提取液注入固相萃取柱；

<3>用0.5～1个柱体积的体积分数为20%的乙醇清洗；

<4>最后用1个柱体积的无水乙醇洗脱，即得洗脱液，经0.45μm有机滤膜过滤后进行HPLC分析。