CN102747012A

CN102747012A - 一株可以在人肠道中定植并繁殖的益生菌及其检测方法

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Publication number: CN102747012A
Application number: CN2012101509683A
Authority: CN
Inventors: 张佳超; 王丽凤; 高鹏飞
Original assignee: BEIJING HEMEI KESHENG BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: BEIJING HEMEI KESHENG BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2012-05-15
Filing date: 2012-05-15
Publication date: 2012-10-24

Abstract

一株可以定植于肠道中的益生菌，其特征在于所述益生菌（Lactobacillusplantarum P8）分离自由中国境内采集的酸马奶样本，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.5468，保藏日期为：2011年11月18日。益生菌Lactobacillus plantarum P8在肠道中的检测方法，其特征是包括下列步骤：（1）粪便样品中宏基因组DNA的提取；（2）L.plantarumP8的特异性片段的扩增；（3）琼脂糖凝胶电泳；（4）RT-PCR检测样品中L.plantarum P8的数量；（5）肠道中益生菌L.plantarum P8定植能力的检测。

Description

一株可以在人肠道中定植并繁殖的益生菌及其检测方法

技术领域

本发明涉及一株可以在人肠道中定植并繁殖的益生菌及其检测方法，应用该方法对益生菌进行检测，可准确、快速的完成肠道中益生菌的定性和定量研究。

背景技术

人类的肠道栖居着庞杂多样的微生物群落。这些微生物聚集在人类肠道内，其数量超过肠道的细胞，因此在人体肠道是一个多样性丰富动态平衡的生态系统。这个系统像是一个栖息地，一些微生物成员可以在此根深地固，一些却像是搭便车转瞬即逝。目前肠道菌群之间，及其与宿主的关系越来越引起人们的重视并成为研究热点。对其关系最常见的描述为共生（一个伙伴受益而其他的不受影响）而不是互惠（包括合作伙伴都一起受益），这对稳定这个可持续发展的肠道环境是十分关键的。研究发现，不同肠道微生物结构和组成影响着宿主的营养物质加工、能量平衡、免疫功能、胃肠道发育及其他多种重要的生理活动，进而直接影响人类健康。

在现代分子生物学技术的帮助下，肠道微生物的研究也深入到了基因和作用机制水平。人体肠道菌群可分为硬壁菌门，拟杆菌门，放线菌门，梭杆菌门，变形菌门，疣微菌门，蓝藻菌门。这些菌门的划分都基于对最全面和多样性16SrRNA测序的研究。在所有细菌的染色体基因组中，16S rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的rDNA序列，并具有高度的保守性和特异性。因此在生物进化的过程中16S rRNA变化级小，所以可以根据测定其序列追根溯源不同生物的亲缘关系。

益生菌（Probiotic），源于希腊语“对生命有益”，是定植于人体肠道内，能产生确切健康功效的活的有益微生物的总称，早在上个世纪初（1907年）著名细菌学家诺贝尔奖得主梅切尼科夫即提出益生菌可以延年益寿的假说。益生菌主要包括乳杆菌（Lactobacillus）和双歧杆菌（Bifidobacterium），其益生作用主要是通过直接或者间接的调整宿主肠道微生物的组成，激活宿主内源性微生物群或者免疫系统的活性来实现的。口服益生菌能够治愈或缓解多种胃肠道或与胃肠道相关的疾病，目前研究证实口服益生菌有助于缓解乳糖不耐症，预防或者治愈胃肠炎（gastroenteritis）、抗生素相关性腹泻（antibiotic-associateddiarrhea）、旅行性腹泻（traveler’sdiarrhea）、便秘（constipation）及肠道感染（intestinal infections），同时可抑制有害微生物在宿主肠道中定植，对肠易激综合征（irritable bowel syndrome,IBS）、炎症性肠炎（inflammatory bowel disease,IBD）及结肠癌（colon cancer）等肠道相关性疾病具有良好的预防和治疗作用。

发明内容

本发明的目的是提供一株可以在人肠道中定植并繁殖的益生菌及其检测方法，以L.plantarum P8的全基因组序列中一段特异性片段为依据，设计了该菌株的特异性引物，使用该引物对目的菌株扩增和RT-PCR定量，可以快速准确的完成人体肠道中L.plantarum P8的定性定量研究。

本发明的技术方案是：一株可以定植于肠道中的益生菌，其特征在于所述益生菌（Lactobacillus plantarum P8）分离自由中国境内采集的酸马奶样本，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名：植物乳杆菌，保藏号：CGMCC No.5468，保藏日期为：2011年11月18日。

益生菌在肠道中的检测方法，其特征是包括下列步骤：

1、粪便样品中宏基因组DNA的提取：

采用液氮冻融—CTAB法：取1.0g粪便样品洗涤处理，将洗脱的菌体于1.5mL离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃水浴中融化（约5min），反复冻融3次，加0.1mL 10%SDS和10.0μL 10mg/mL蛋白酶K，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下12000g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中。上清液与等体积的氯仿于12000g离心10min（为了使沉淀、水相和有机相分层），吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经0.1倍体积的醋酸钠，1倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，然后70%乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用。

2．L.plantarum P8的特异性片段的扩增

扩增引物：

以L.plantarum P8的全基因组序列为依据，采用本实验室自主设计的引物前序列，

该引物序列及扩增片段的具体信息为：

ATCGGTTA

GGGCGTGCGCCGAGCGGAAATTATCAATGGCTTACGATGGTCAGTAGTAGCGGACGCATTAGGGTTGCCCGCGGAAAATCGTCAACGGGGAACTTATCCGTTAATTACGGAAATGGTCGCAAGTGACTTTTGGAAACAGCCAGCAGGGAGCTGGTCTGATGACACATCGATGAGTTTAGGATTGATTGAGAATTTGGTTAGCGGTGGTGATTATGATGATCTCAT

ATGCGCTTTGGAACGAACACGC

扩增体系：

反应体系50μL：10×PCR Buffer 5μL，25mmo1/L Mg²⁺1.0μL，2.5mmol/LdNTPs 4μL，5mmol/L上下游引物各2μL，DNA模板100ng左右，5U/μLTaq酶(Promega)0.5uL，dd H₂O补足至50μL。

扩增条件：

95℃变性5min；循环30次：95℃变性1min，62℃退火45s，72℃延伸1min，然后72℃延伸7min，4℃保存。

3.琼脂糖凝胶电泳

将PCR产物于1%琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20-30min，EB染色，紫外拍照，检测扩增效果。

4.RT-PCR检测样品中L.plantarum P8的数量

首先应用已知数量的L.casei Zhang通过RT-PCR扩增制作标准曲线，然后以标准曲线为依据，用上述特异性引物定量检测样品中L.caseiZhang的数量。

RT-PCR扩增体系：

反应体系20μL：10×PCR mix 10μL，10mmol/L上下游引物各0.4μL，DNA模板100ng左右，dd H₂O补足至20μL。

RT-PCR扩增条件：

95℃变性20s；循环40次：95℃变性5s，62℃退火30s，72℃延伸45s。

5.肠道中益生菌L.plantarum P8定植能力的检测

随机选取33名近三个月内无抗生素类药物摄入的志愿者（性别比例17：16），每日服用含益生菌Lactobacillus plantarum P8的片剂（活菌数>2x10¹⁰个/粒）3粒，连续服用28天，分别于0天，14天，28天以及停止服用菌片后一周（35天），两周（42天）和四周（56天）采集志愿者粪便样品。样品采集后迅速放入液氮中速冻，并在8小时内完成粪便样品宏基因组DNA的提取。而后应用Lactobacillus plantarumP8的特异性引物进行RT-PCR扩增，检测不同时间内各志愿者体内Lactobacillus plantarumP8的残留量，进而判断其定植能力。

本发明的效果是：Lactobacillus plantarum P8分离自由中国境内采集的酸马奶样本，是一株经过系统研究的益生菌。它有抗氧化和免疫调节特性，并已被用于发酵剂和乳制品的工业化生产。本发明以L.plantarum P8的全基因组序列中一段特异性片段为依据，设计了该菌株的特异性引物，使用该引物对目的菌株扩增和RT-PCR定量，可以快速准确的完成人体肠道中L.plantarum P8的定性定量研究。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。

附图说明

图1为粪便样品宏基因组DNA电泳图；

图2为5个样品中Lactobacillus plantarum P8的特异性扩增条带图；

图3为L.plantarum P8的RT-PCR扩增标准曲线图；

图4不同时期青年组、中年组和老年组粪便中Lactobacillus plantarum P8的含量曲线图。

具体实施方式

一株可以定植于肠道中的益生菌，所述益生菌（Lactobacillus plantarumP8）分离自由中国境内采集的酸马奶样本，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.5468，保藏日期为：2011年11月18日。

益生菌Lactobacillus plantarumP8在肠道中的检测方法，包括下列步骤：

1.粪便样品中宏基因组DNA的提取：

采用液氮冻融—CTAB法：取1.0g粪便样品洗涤处理，将洗脱的菌体于1.5mL离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃水浴中融化（约5min），反复冻融3次，加0.1mL 10%SDS和10.0μL 10mg/mL蛋白酶K，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下12000g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中。上清液与等体积的氯仿于12000g离心10min（为了使沉淀、水相和有机相分层），吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经0.1倍体积的醋酸钠，1倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，然后70%乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用。图1为粪便样品宏基因组DNA电泳图，图1中，1为样品1，2为样品2，M为λ-DNA/HindIII Markers。

2.Lactobacillus plantarum P8的特异性片段的扩增扩增引物：以L.plantarum P8的全基因组序列为依据，采用本实验室自主设计的引物前序列，

该引物序列及扩增片段的具体信息为：

ATCGGTTA

ATGCGCTTTGGAACGAACACGC

扩增体系：

扩增条件：

3.琼脂糖凝胶电泳

将PCR产物于1%琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20-30min，EB染色，紫外拍照，检测扩增效果。扩增效果见图2：

4.RT-PCR检测样品中L.plantarumP8的数量

首先应用已知数量的L.plantarumP8通过RT-PCR扩增制作标准曲线（参见图3），然后以标准曲线为依据，用上述特异性引物定量检测样品中L.plantarum P8的数量。

RT-PCR扩增体系：

RT-PCR扩增条件：

95℃变性20s；循环40次：95℃变性5s，62℃退火30s，72℃延伸35s。

样品中L.plantarum P8的定量结果见表1：

表15个样品中Lactobacillus plantarum P8的数量

5.肠道中益生菌L.plantarum P8定植能力的检测

本试验共征集33名健康志愿者（具体信息见表2），分为三组，青年组（Ygroup，11人，男性5人，女性6人），年龄25-29岁，平均年龄为26.2±1.2岁；中年组（M group，12人，男性6人，女性6人），年龄48-53岁，平均年龄为50.9±1.4；老年组（E group，10人，男性5人，女性5人），年龄71-80岁，平均年龄为75.1±3.3岁。男女比例为16:17。每个志愿者每天饭后咀食Lactobacillus plantarum P8片剂3粒，每粒含Lactobacillus plantarum P8活菌2×10¹⁰CFU，连续服用28天后停止服用。分别在第0天，14天，28天，以及停止服用后7天（连续35天）、14天（连续42天）、28天（连续56天）采集志愿者粪便。而后应用L.plantarum P8的特异性引物进行RT-PCR扩增，检测不同时间内各志愿者体内L.plantarum P8的残留量，进而判断其定植能力。

表2志愿者信息

应用RT-PCR技术定量研究不同时期各个志愿者粪便中Lactobacillusplantarum P8的数量，结果见图4。由于方法灵敏度所限，当粪便中Lactobacillus plantarum P8的含量小于3.2Log₁₀CFU/g时无法被检测到。

由图4可以得知当服用Lactobacillus plantarum P814天后，老年志愿者粪便中该菌株含量最高，平均达到8.47±0.17Log₁₀CFU/g(即10^8.47CFU/克)，青年志愿者次之，平均达到8.29±0.13Log₁₀CFU/g，而中年组志愿者粪便中该菌株含量最低，仅为7.98±0.17Log₁₀CFU/g。当服用到第28天时Lactobacillusplantarum P8在各组志愿者粪便中存留量基本相同，平均水平达到8.48±0.19Log₁₀CFU/g(即10^8.48CFU/克)。

当停止口服给予Lactobacillus plantarum P87天时，志愿者粪便中活菌数量平均水平下降到6.95±0.14Log₁₀CFU/g。到第14天时，志愿者粪便中活菌数量平均水平下降到6.32±0.25Log₁₀CFU/g，但是此时出现组别差异，老年志愿者粪便中存留的活菌数（6.78±0.11Log₁₀CFU/g）＞青年志愿者（6.43±0.07Log₁₀CFU/g）＞中年志愿者（6.13±0.176Log₁₀CFU/g）。而当停止给予Lactobacillus plantarum P828天时，该菌株在各组志愿者粪便中的存留量基本不再发生改变，平均水平甚至有所增加（6.44±0.28Log₁₀CFU/g），这说明该菌株已经在肠道内定植，成为志愿者肠道内的正常栖居菌群。

Claims

1.一株可以定植于肠道中的益生菌，其特征在于所述益生菌（Lactobacillusplantarum P8）分离自由中国境内采集的酸马奶样本，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.5468，保藏日期为：2011年11月18日。

2.可以定植于肠道益生菌在肠道中的检测方法，其特征是包括下列步骤：

（1）粪便样品中宏基因组DNA的提取

（2）L.plantarum P8的特异性片段的扩增

扩增引物：以L.plantarum P8的全基因组序列为依据，引物前序列及扩增片段的具体信息为：

ATCGGTTA

ATGCGCTTTGGAACGAACACGC

扩增体系：反应体系50μL：10×PCR Buffer 5μL，25mmo1/L Mg²⁺1.0μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，5mmol/L上下游引物各2μL，DNA模板100ng左右，5U/μL Taq酶(Promega)0.5uL，dd H₂O补足至50μL；

扩增条件：95℃变性5min；循环30次：95℃变性1min，62℃退火45s，72℃延伸1min，然后72℃延伸7min，4℃保存。

（3）琼脂糖凝胶电泳：将PCR产物于1%琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20-30min，EB染色，紫外拍照，检测扩增效果；

（4）RT-PCR检测样品中L.plantarum P8的数量：

首先应用已知数量的L.casei Zhang通过RT-PCR扩增制作标准曲线，然后以标准曲线为依据，用上述特异性引物定量检测样品中L.casei Zhang的数量；

RT-PCR扩增体系：反应体系20μL：10×PCR mix 10μL，10mmol/L上下游引物各0.4μL，DNA模板100ng左右，dd H₂O补足至20μL。

RT-PCR扩增条件：95℃变性20s；循环40次：95℃变性5s，62℃退火30s，72℃延伸45s。

（5）肠道中益生菌L.plantarum P8定植能力的检测

随机选取33名近三个月内无抗生素类药物摄入的志愿者（性别比例17∶16），每日服用含益生菌Lactobacillus plantarum P8的片剂（活菌数>2x10¹⁰个/粒）3粒，连续服用28天，分别于0天，14天，28天以及停止服用菌片后一周即第35天，两周即第42天和四周即第56天采集志愿者粪便样品；样品采集后迅速放入液氮中速冻，并在8小时内完成粪便样品宏基因组DNA的提取；而后应用Lactobacillus plantarum P8的特异性引物进行RT-PCR扩增，检测不同时间内各志愿者体内Lactobacillus plantarum P8的残留量，进而判断其定植能力。