CN102746220B - 吡啶生物碱、其制备方法及这些吡啶生物碱的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及如本说明书中所述的式(I)的新颖吡啶生物碱化合物，或其医药学上可接受的衍生物、其制备方法及包含所述化合物的组合物。本发明还提供吡啶化合物用于提高PPARγ活性、预防和/或治疗与胰岛素抗性相关的疾病或病症及预防和/或治疗代谢综合症或其并发症的用途。本发明还提供红曲菌发酵产物的提取物及其用于预防和/或治疗与胰岛素抗性相关的疾病或病症(诸如代谢综合症)的用途。

Description

吡啶生物碱、其制备方法及这些吡啶生物碱的用途
技术领域
本发明涉及新颖吡啶生物碱及其制备方法。本发明进一步涉及包含吡啶化合物的组合物，及吡啶化合物用于活化PPARγ及用于预防和/或治疗与胰岛素抗性相关的疾病或病症(诸如代谢综合症)的用途。本发明还涉及红曲菌发酵产物的提取物用于预防和/或治疗与胰岛素抗性相关的疾病或病症(诸如代谢综合症)的用途。
背景技术
红曲菌(Monascus spp.)在中国发酵食品中已有数千年的使用历史。除会产生一些色素外，经红曲菌发酵的红曲米还会产生具生物活性的代谢物，诸如γ-氨基丁酸(GABA)及聚酮化合物莫那可林K(monacolin K)，这两种物质分别被用作抗高血压药(参见过K.(Tsuii，K.)等人，1992，“两种日本酒曲对自发性高血压大鼠血压的影响(Effects of two kinds of Koji on blood pressure in spontaneously hypertensive rats.)”日本农艺化学会志(Nippon.Nogeikagaku Kaishi.)，66：1241-1246)及降低胆固醇的药物(参见恩多A.(Endo，A.)，1979，“由红曲菌种产生的一种新颖低血胆固醇剂莫那可林K(Monacolin K，a new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus species.)”抗生素杂志(J.Antbiot.)，32：852-854；恩多A.，1985，“作为抑制HMG-CoA还原酶的潜在降胆固醇剂的康派汀(ML-236B)和相关化合物(Compactin(ML-236B)and related compounds as potential cholesterol-lowering agents that inhibit HMG-CoA reductase.)”药物化学杂志(J.Med.Chem.)，28：401-405；及马汀诺科娃L.(Martinokova，L.)等人，1995，“由真菌红曲菌产生的聚酮颜料的生物活性(Biological activity of polyketide pigments produced by the fungus Monascus.)”应用细菌学杂志(J.Appl.Bacteriol.)，79：609-616)。
陈W-P.(Chen，W-P.)等人(“红曲米防止发展由高脂肪饮食诱发的肥胖、血脂异常和高胰岛素血症(Red mold rice prevents the development of obesity，dyslipidemia and hyperinsulinemia induced by high-fat diet.)”国际肥胖杂志(International Journal of Obesity)，2008，32：1694-1704)指出红曲米提取物可预防肥胖、血脂异常及高胰岛素血症。其结果显示经紫色红曲菌(Monascus purpureus)NTU568发酵的红曲米的水提取物及乙醇提取物可抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖(proliferation)以及3T3-L1前脂肪细胞分化为脂肪细胞。所述文献的结论为这些作用可能是由增加脂肪组织中脂肪分解活性及降低食物/能量摄取所导致。
还曾有报告指出红曲菌发酵产物具有抗糖尿病作用(参见史Y.(Shi，Y.)及潘T.，J.(Pan，T.，J.)2010，“经紫色红曲菌NTU 568发酵的产物对链脲佐菌素诱发的糖尿病大鼠的抗糖尿病作用(Anti-diabetic effects of Monascus purpureus NTU 568 fermentedproducts on streptozotocin-induced diabetic rats.)”农业和食品化学学报(J.Agric.FoodChem.)，58(13)：7634-7640)。然而，红曲发酵产物中具有抗糖尿病作用的化合物及其药理学机制尚未可知。
调节脂类代谢是治疗代谢综合症的策略之一。噻唑烷二酮(TZD)是20世纪80年代初研发的2型糖尿病治疗药物。关于TZD机制的研究显示，TZD通过活化PPARγ使胰岛素敏感性增强。活化PPARγ的特有效应之一是促进脂肪细胞分化。因此，促进脂肪细胞分化已成为一种筛选能够活化PPARγ及降低胰岛素抗性的药剂的通用方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种式(I)化合物，
或其医药学上可接受的衍生物，
其中R1为烷基，R2为烷基或烯基，且R3为烷基。
本发明的另一目的为提供一种组合物，其包含式(I)化合物或其医药学上可接受的衍生物及任选使用的医药学上可接受的载剂或赋形剂。
本发明的另一目的为提供一种制备式(I)化合物或其医药学上可接受的衍生物的方法。
本发明的另一目的为提供一种红曲米提取物。
本发明的另一目的为提供一种组合物，其包含本发明的红曲米提取物及任选使用的医药学上可接受的载剂或赋形剂。
本发明的另一目的为提供一种提高PPARγ活性的方法。
本发明的另一目的为提供一种预防和/或治疗个体与胰岛素抗性相关的疾病或病症的方法。
本发明的又一目的为提供一种预防和/或治疗代谢综合症或其并发症的方法。
在以下部分中详细描述本发明。可在以下【具体实施方式】及权利要求书中容易地发现本发明的其它特征、目的及优点。
附图说明
图1显示(A)红曲烟酸酯A、(B)红曲烟酸酯B、(C)红曲烟酸酯C及(D)红曲烟酸酯D的结构。
图2显示红曲烟酸酯A的主要(A)NOESY相关性及(B)HMBC相关性。
图3显示红曲烟酸酯B的主要(A)NOESY相关性及(B)HMBC相关性。
图4显示红曲烟酸酯C的主要(A)NOESY相关性及(B)HMBC相关性。
图5显示红曲烟酸酯D的主要(A)NOESY相关性及(B)HMBC相关性。
图6显示倒立显微镜观测下的DMI分化模型中结果。样品：(A)DMI对照物；(B)红曲烟酸酯A(5μg/ml)；(C)红曲烟酸酯B(5μg/ml)；(D)红曲烟酸酯C(5μg/ml)；及(E)红曲烟酸酯D(5μg/ml)。
图7显示红曲烟酸酯A-D在胰岛素模型(A)及DMI模型(B)中增加3T3-L1脂肪细胞的细胞溶质脂联素的表达。对照组：仅使用培养基Trog：200nM曲格列酮。最终样品浓度为5μg/mL。
图8显示在供给红曲米的乙醇提取物后于C57BL/6JNarl小鼠中脂肪细胞的大小分布。*表示测试组与HF/HS组存在显著差异(P＜0.05)。
具体实施方式
参考以下对本发明的各方面、实例及伴随相关描述的化学图式及表格的详细描述，可更容易地了解本发明。在揭示与描述本发明的化合物、组合物和/或方法之前，应了解，除非由权利要求书另外特别地指出，否则本发明不受限于特定制备方法、载剂或调配物或将本发明化合物调配成用于局部、经口或非经肠投予的产物或组合物的特定模式，这是由于所属领域的一般技术人员非常清楚这些事情是可以加以变化的。还应了解，本文所用的术语仅用于描述特定方面的目的而不意在用于限制本发明的范围。
定义
除非另外指出，否则如本发明所用的以下术语应解释为具有以下含义。
如本文所用的术语“烷基”及“烯基”包括直链及分支链。
“烷基”是指在概念上可通过从具有直链或分支碳链的非环烃化合物的结构中去除氢并且所述氢原子经另一原子或有机或无机取代基置换而由烷烃形成的烃基。在本发明的一些方面中，烷基为“C1至C10烷基”，诸如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、叔戊基、己基及其类似基团。本发明的许多方面包含“C1至C7烷基”，其包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基及庚基。
术语“烯基”在结构上类似于包含至少一个碳碳双键的烷基或残基。在一些方面中，烯基为“C2至C7烯基”，例如乙烯基、烯丙基、丙烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、4-庚烯基、5-庚烯基及6-庚烯基，以及直链及分支链的二烯及三烯。在其它方面中，烯基限于二个至四个碳原子。
如本文所用的术语“医药学上可接受的衍生物”表示从本发明化合物改性而来，但性质及功效与本发明化合物相同或更佳的化合物。医药学上可接受的衍生物优选为本发明化合物的医药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物或前药。
一种或多种本发明化合物可以盐形式存在。术语“盐”涵盖与有机阴离子及阳离子以及无机阴离子及阳离子形成的盐。此外，此术语包括由碱性基团与有机酸或无机酸的标准酸碱反应而形成的盐。所述酸包括盐酸、氢氟酸、三氟乙酸、硫酸、磷酸、乙酸、丁二酸、柠檬酸、乳酸、马来酸、富马酸、棕榈酸、胆酸、双羟萘酸、粘液酸、D-谷氨酸、D-樟脑酸、戊二酸、邻苯二甲酸、酒石酸、月桂酸、硬脂酸、水杨酸、甲烷磺酸、苯磺酸、山梨酸、苦味酸、苯甲酸及肉桂酸。
本发明的化合物还可以溶剂合物及水合物形式存在。因此，这些化合物可与例如水合水或一个、许多或任何分率的母液溶剂分子一起结晶。所述化合物的溶剂合物及水合物包括在本发明的范围内。
如本文所用的术语“个体”表示任何动物，优选为哺乳动物，且更优选为人类。个体的实例包括人类、非人类灵长类动物、啮齿动物、天竺鼠、兔、绵羊、猪、山羊、母牛、马、狗及猫。
术语如本文所提供的化合物的“有效量”意思是所述化合物的量足以提供对所需功能(诸如基因表达、蛋白质功能或诱导特定类型的反应)的所需调节。如下文所指出，精确的需要量将在个体之间有所变化，这取决于个体的疾病病况、身体状况、年龄、性别、物种及体重、组合物的特性及配方等。给药方案可经调整以诱导最佳治疗反应。举例来说，可每日投予若干分次剂量，或可依治疗情形的紧急程度按比例减少剂量。因此， 很难指定精确的“有效量”。然而，本发明领域的一般技术人员使用常规实验即可确定适当的有效量。
术语“预防”为本发明领域中所公认，且当用于描述病状时，其包括在个体的所述病状发作之前投予药剂，以相对于未接受所述药剂的个体，降低医学病状的出现率或减轻病状严重程度或延迟病状症状的发作。
如本文所用的术语“治疗”表示逆转、减轻或改善此术语所适用的病症或病状或所述病症或病状的一种或多种症状，或抑制其进展。
如本文所用的术语“载剂”或“赋形剂”是指自身并不为治疗剂，而是用作用于将治疗剂传递至个体的载剂和/或稀释剂和/或佐剂或媒剂，或添加至调配物中以改善调配物的处理或储存性质或者允许或有助于组合物的剂量单位形成适于经口投予的剂量单位(诸如胶囊或片剂)的任何物质。适合的载剂或赋形剂为制造医药调配物或食品领域的一般技术人员所熟知的。载剂或赋形剂可包括(例如但不限于)缓冲剂、稀释剂、崩解剂、粘合剂、粘着剂、湿润剂、聚合物、润滑剂、滑动剂、为遮蔽或抵消不良味道或气味而添加的物质、调味剂、染料、芳香剂及为改善组合物的外观而添加的物质。可接受的载剂或赋形剂包括柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、碳酸氢盐缓冲剂、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸及硫酸的钠盐及钙盐、碳酸镁、滑石、明胶、阿拉伯胶、海藻酸钠、果胶、糊精、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、蔗糖、淀粉、明胶、纤维素物质(诸如烷酸的纤维素酯及纤维素烷基酯)、低熔点蜡、可可脂、氨基酸、尿素、醇类、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如血清白蛋白)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二甲亚砜(DMSO)、氯化钠或其它盐、脂质体、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油或粉末、聚合物(诸如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇及聚乙二醇)及其它医药学上可接受的物质。载剂不应破坏治疗剂的药理学活性，且在以足以传递治疗量的药剂的剂量投予时应无毒性。
范围在本文中通常表述为“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表述此类范围时，一方面为包括一个特定值和/或至另一个特定值的范围。类似地，当值通过使用字“约”表述为近似值时，应了解特定值可形成另一方面。另外应了解，每一范围的各端点都有显著性，一端点与另一端点既有相关性，又彼此独立。
“任选使用的”或“任选地”意思是随后所述的事件或状况可能发生或可能不发生，且所述描述包括所述事件或状况发生的情况及其未发生的情况。举例来说，“任选地包含药剂”意思是所述药剂可能存在或可能不存在。
必须指出，除非上下文另外清楚规定，否则如本说明书及随附权利要求书中所用的单数形式“一”及“所述”包括多个所指标的物。因此，除非上下文另外需要，否则单 数术语应包括复数且复数术语应包括单数。
本发明的化合物
本发明涉及吡啶生物碱或其医药学上可接受的衍生物。本发明的吡啶生物碱具有下式(I)：
其中R1为烷基，R2为烷基或烯基，且R3为烷基。
在式(I)化合物的一些方面中，R1为C1-C10烷基，R2为C1-C6烷基或C2-C6烯基，且R3为C1-C6烷基。
在一个优选方面中，R1为戊基，R2为丙烯基，且R3为甲基。
在另一个优选方面中，R1为戊基，R2为丙烯基，且R3为乙基。
在另一个优选方面中，R1为庚基，R2为丙烯基，且R3为甲基。
在另一个优选方面中，R1为戊基，R2为丙基，且R3为甲基。
在一个最优选方面中，式(I)化合物为4-((E)-2-乙酰基-4-氧代壬-1-烯基)-6-((E)-丙-1-烯基)烟酸甲酯(红曲烟酸酯(Monasnicotinate)A)、4-((E)-2-乙酰基-4-氧代壬-1-烯基)-6-((E)-丙-1-烯基)烟酸乙酯(红曲烟酸酯B)、4-((E)-2-乙酰基-4-氧代十一-1-烯基)-6-((E)-丙-1-烯基)烟酸甲酯(红曲烟酸酯C)或(E)-4-(2-乙酰基-4-氧代壬-1-烯基)-6-丙基烟酸甲酯(红曲烟酸酯D)。
本发明的化合物可通过任何已知的方法进一步转化为医药学上可接受的衍生物，诸如医药学上可接受的盐、溶剂合物或前药。
本发明的组合物
本发明还提供一种组合物，其包含本发明化合物或其医药学上可接受的衍生物。本发明的组合物可为食物组合物或医药组合物。所述组合物中的本发明的式(I)化合物可以红曲米的提取物或化合物形式提供。
本发明的医药组合物可通过本发明领域中已知的任何方法局部或全身投予，包括 (但不限于)通过肌肉内、皮内、静脉内、皮下、腹膜内、鼻内、经口、粘膜或外部途径投予。适当的投药途径、调配方法及投药时程可由本发明领域中的一般技术人员来决定。在本发明中，医药组合物可根据相应投药途径以多种方式调配，诸如液体溶液、悬浮液、乳液、糖浆、片剂、丸剂、胶囊、持续释放调配物、散剂、颗粒、安瓿、注射液、输注液、试剂盒、软膏、洗剂、擦剂、乳膏或其组合。在必要时，其可经灭菌或与任何医药学上可接受的载剂或赋形剂混合，其中有许多医药学上可接受的载剂或赋形剂已为一般技术人员所知，例如参见【具体实施方式】第13段。
本发明的制备方法
本发明提供制备式(I)化合物的方法：
或其医药学上可接受的衍生物，
其中R1为烷基，R2为烷基或烯基，且R3为烷基。
在一个优选方面中，本发明的方法包含以下步骤：
(a)以红曲菌属分离菌株将米发酵，获得红曲米；
(b)以甲醇或乙醇提取所述红曲米；
(c)以乙酸乙酯与H2O提取步骤(b)中获得的提取物，获得可溶于乙酸乙酯的部分；
(d)利用洗脱剂经由硅胶色谱柱洗脱所述可溶于乙酸乙酯的部分；及
(e)利用硅胶色谱柱和/或制备型薄层色谱法(TLC)纯化(d)的洗脱份，以获得所述化合物。
根据本发明的方法，分离菌株可为丛毛红曲菌(Monascus pilosus)、紫色红曲菌(Monascus purpureus)或粉红色红曲菌(Monascus ruber)，优选为丛毛红曲菌或紫色红曲菌，更优选为丛毛红曲菌BCRC 930117(DSM 22351)或紫色红曲菌M615 BCRC 930146(DSM 24162)。
根据本发明的方法，在步骤(b)之前，红曲米可经干燥。
根据本发明的方法，步骤(c)中乙酸乙酯与H2O的比率为约1∶1。
根据本发明的方法，步骤(d)包含将所述可溶于乙酸乙酯的部分装载至硅胶色谱柱中，且利用包含12∶1、10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1正己烷/乙酸乙酯、EA、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1EA/甲醇及甲醇的洗脱剂洗脱所述柱，产生32个洗脱份。步骤(e)中所用的洗脱份为洗脱份10、11或14。
根据本发明的一个优选方法，步骤(e)中的纯化方法是以2∶1正己烷/EtOAc为溶剂的TLC。
根据本发明的另一个优选方法，步骤(e)中的纯化方法为以8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1正己烷/EA及EA(各500ml)进行洗脱的硅胶柱色谱法，得到7种洗脱份(洗脱份14.1至14.7)，且通过制备型TLC(2∶1正己烷/EtOAc)纯化洗脱份14.3。
本发明提供制备红曲米提取物的方法。在一个优选方面中，所述方法包含以下步骤：
(a)用红曲菌属分离菌株使米发酵，获得红曲米；及
(b)用甲醇、乙醇或乙酸乙酯提取所述红曲米。
根据本发明的红曲米提取物制备方法，分离菌株可为丛毛红曲菌、紫色红曲菌或粉红色红曲菌，优选为丛毛红曲菌或紫色红曲菌，更优选为丛毛红曲菌BCRC 930117(DSM22351)或紫色红曲菌M615BCRC 930146(DSM 24162)。
根据本发明的红曲米提取物制备方法，在步骤(b)之前，红曲米可经干燥。
效用
本发明的治疗方法的一个方面为提高需要调节的个体的PPARγ活性，其包含向所述个体投予有效量的式(I)化合物：
或其医药学上可接受的衍生物，
(其中R1为烷基，R2为烷基或烯基，且R3为烷基)，
或红曲米提取物。
本发明的治疗方法的另一方面为预防和/或治疗个体与胰岛素抗性相关的疾病或病症，其包含向所述个体投予有效量的式(I)化合物或其医药学上可接受的衍生物或红曲米提取物。
在某些方面中，与胰岛素抗性相关的疾病或病症为代谢综合症或其并发症，诸如致动脉粥样硬化血脂异常、血压升高、胰岛素抗性或葡萄糖不耐性、2型糖尿病或心血管疾病。
根据本发明的方法，式(I)化合物或其医药学上可接受的衍生物可通过本发明领域中已知的任何方法局部或全身投予，包括(但不限于)通过肌肉内、皮内、静脉内、皮下、腹膜内、鼻内、经口、粘膜或外部途径投予。适当投药途径、调配方法及投药时程可由本发明领域中的一般技术人员来决定。
根据本发明的方法，式(I)化合物或其医药学上可接受的衍生物可与第二种可有效预防和/或治疗代谢综合症或其并发症的药剂共同投予，从而改善本发明化合物的治疗效果。本发明领域中已知有多种药剂可有效预防和/或治疗代谢综合症或其并发症。所述药剂的实例包括(但不限于)控制胆固醇含量及脂质的药物，诸如斯达汀(statin)、纤维酸酯或烟酸；控制高血压的药物，诸如利尿剂或血管收缩素转化酶(ACE)抑制剂；及控制高血糖的药物，诸如二甲双胍(metformin)、胰岛素、磺酰脲(sulfonylurea，SU)、双胍(biguanide)、α-葡萄糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮(TZD)及其类似药物。
提供以下实例来有助于所属领域的技术人员实施本发明。
实例
微生物
于2009年2月18日将丛毛红曲菌寄存在食品工业发展研究所(Food IndustryResearch and Development Institute，FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BioresourceCollection and Research Center，BCRC)(台湾新竹市食品路331号300(331 Shih-PinRoad，300，Hsinchu，Taiwan，R.O.C.))，且寄存编号为BCRC 930117。还根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2009年3月5日将其寄存于德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)(德国布伦瑞克市Mascheroder Weg lb，D38124(Mascheroder Weg lb，D38124，Braunschweig，Germany))，且寄存编号为DSM 22351。
实例7至10中所用的紫色红曲菌M615于2010年10月27日寄存于FIRDI的BCRC，且寄存编号为BCRC 930146。还根据布达佩斯条约，于2010年10月28日寄存于DSMZ， 且寄存编号为DSM 24162。
实例1.制备酵母材料
将丛毛红曲菌BCRC 930117及紫色红曲菌M615 BCRC 930146接种于马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar，PDA)(美国Difco公司)平板上且在30℃下培养7天。用6ml无菌水将孢子自PDA平板中洗出，且将1ml孢子悬浮液接种于250ml含有GSP培养基(其含有7％甘油、3％面粉、1.2％聚蛋白胨、3％大豆粉、0.1％硫酸镁及0.2％硝酸钠)的锥形瓶中并振荡，且在30℃、150rpm下培养3天，获得种曲菌液。
实例2.固态发酵
将75ml 0.2％酒石酸溶液添加至10个各自含有75g在来米(Zailai rice)的450ml宽口玻璃瓶中。在4℃下浸泡过夜。接着将米沥干并灭菌。将实例1中获得的种曲菌液分别接种7.5ml于各瓶中，置于25℃下培养14天(在培养第7天时，添加7.5ml GSP培养基至培养物中)，以获得红曲米。
实例3.从红曲米中提取及分离新颖化合物
干燥实例2的红曲米，且在室温下将5Kg经干燥的红曲米以95％EtOH(6L)提取3次。使乙醇浆提取物分配于EtOAc与H2O(1∶1)(10L)之间，得到可溶于EtOAc(76g)的部分。
将可溶于EtOAc的部分经硅胶(75g，70-230目)(德国默克公司(Merck))色谱分离，且以12∶1、10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1正己烷/乙酸乙酯、EA、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1EA/甲醇及甲醇(各1L)洗脱，产生32个洗脱份。洗脱份10通过制备型TLC(2∶1正己烷/EtOAc)来纯化，得到新颖化合物A(36.4mg)。洗脱份11通过制备型TLC(2∶1正己烷/EtOAc)来纯化，得到新颖化合物B(7.8mg)及C(39.2mg)。洗脱份14通过硅胶柱色谱法，以8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1正己烷/EA及EA(各500ml)洗脱来进一步纯化，得到7个洗脱份(洗脱份14.1至14.7)。通过制备型TLC(2∶1正己烷/EtOAc)从洗脱份14.3得到化合物D(3.5mg)。
实例4.新颖化合物的表征
将丛毛红曲菌BCRC 930117发酵的红曲米的EtOH提取物的可溶于EtOAc的部分进行充分的色谱纯化，得到四种新颖化合物-化合物A、B、C及D。新颖化合物的特征鉴定如下进行。
旋光度是在Jasco P-1020数字旋光仪上测量。紫外光谱是在Jasco UV-240分光光度计上于MeOH中获得，且IR光谱(KBr或纯)是在Perkin-Elmer系统2000FT-IR光谱仪上获得。使用CDCl3作为溶剂的1D(1H、13C、DEPT)及2D(COSY、NOESY、HSQC、 HMBC)NMR谱是在Varian Unity Plus 400(1H NMR为400MHz，13C NMR为100MHz)上记录。化学位移内部参考CDCl3中的溶剂信号(1H，δ7.26；13C，δ77.0)，以TMS为内部标准品。高分辨率ESI-MS谱是在Bruker Daltonics APEX II 30e光谱仪上获得。硅胶(70-230，230-400目)(默克公司)用于柱色谱法，且硅胶60F-254(默克公司)用于TLC及制备型TLC。
化合物A的特征
获得呈白色粉末状的新颖化合物A，且其特征如下：
-1H NMR(CDCl3，400MHz)：0.88(3H，t，J＝6.8Hz，CH3-22)，1.27(2H，m，CH2-21)，1.32(2H，m，CH2-20)，1.59(2H，m，CH2-19)，1.96(3H，dd，J＝7.0，1.8Hz，CH3-9)，2.51(3H，s，15-COCH3)，2.54(2H，d，J＝7.4Hz，CH2-18)，3.27(2H，s，CH2-16)，3.92(3H，s，OCH3-12)，6.54(1H，br d，J＝12.0Hz，H-7)，6.93(1H，m，H-10)，7.33(1H，s，H-5)，8.13(1H，s，H-13)，9.13(1H，s，H-2)；
-13C NMR(CDCl3，100MHz)：13.9(C-22)，18.6(C-9)，22.4(C-21)，23.4(C-19)，25.4(15-COCH3)，31.3(C-20)，40.6(C-16)，43.2(C-18)，52.3(C-12)，120.1(C-5)，121.1(C-3)，130.2(C-7)，135.4(C-8)，136.9(C-14)，140.9(C-13)，145.7(C-4)，151.83(C-2)，159.4(C-6)，165.5(C-10)，198.8(C-15)，208.7(C-17)；
-IR(纯)cm-1：1712，1668(C＝O)；
-UVλmax(MeOH)nm(logε)：253、280、330；
-ESI-MS m/z380[M+Na]+；
-HR-ESI-MS m/z380.1837[M+Na]+(C21H27NO4Na的计算值为380.1835)。
化合物B的特征
分离出呈黄色油状的新颖化合物B，且其特征如下：
-1H NMR(CDCl3，400MHz)：0.87(3H，t，J＝7.2Hz，CH3-23)，1.32，1.33，1.59(各2H，m，CH2-20～22)，1.39(3H，t，J＝7.2Hz，CH3-13)，1.95(3H，dd，J＝7.0，2.0Hz，CH3-9)，2.50(3H，s，16-COCH3)，2.54(2H，d，J＝7.4Hz，CH2-19)，3.27(2H，s，CH2-17)，4.36(2H，q，J＝7.2Hz，CH2-12)，6.54(1H，br d，J＝12.0Hz，H-7)，6.92(1H，m，H-8)，7.24(1H，s，H-5)，8.12(1H，s，H-14)，9.14(1H，s，H-2)；
-13C NMR(CDCl3，100MHz)：13.9(C-23)，14.2(C-13)，18.6(C-9)，22.4(C-21)，23.4(C-19)，25.4(15-COCH3)，31.3(C-21)，40.7(C-17)，43.2(C-19)，61.4(C-12)，120.1(C-5)，121.1(C-3)，130.1(C-7)，135.5(C-8)，136.9(C-15)，141.0(C-14)，145.7(C-4)，151.7(C-2)，159.4(C-6)，165.5(C-10)，198.8(C-16)，208.7(C-18)；
-IR(纯)cm-1：1716，1676(C＝O)；
-UVλmax(MeOH)nm(logε)：248、275、338；
-ESI-MS m/z394[M+Na]+；
-HR-ESI-MS m/z394.1994[M+Na]+(C22H29NO4Na的计算值为394.1998)。
化合物C的特征
分离出呈黄色油状的新颖化合物C，且其特征如下：
-1H NMR(CDCl3，400MHz)：0.87(3H，t，J＝7.2Hz，CH3-24)，1.26(8H，br s，CH2-20～23)，1.58(2H，m，CH2-19)，1.95(3H，dd，J＝7.0，2.0Hz，CH3-9)，2.50(3H，s，15-COCH3)，2.53(2H，t，J＝7.2Hz，CH2-18)，3.27(2H，s，CH2-16)，3.92(3H，s，OCH3-12)，6.54(1H，br d，J＝12.0Hz，H-7)，6.92(1H，m，H-8)，7.24(1H，s，H-5)，8.12(1H，s，H-13)，9.14(1H，s，H-2)；
-13C NMR(CDCl3，100MHz)：14.1(C-24)，18.7(C-9)，22.6(C-21)，23.8(C-19)，25.4(15-COCH3)，29.1(C-22)，31.6(C-20)，40.7(C-16)，43.3(C-18)，52.4(C-12)，120.2(C-5)，121.1(C-3)，130.2(C-7)，135.6(C-8)，137.0(C-14)，140.9(C-13)，145.8(C-4)，151.8(C-2)，159.4(C-6)，165.6(C-10)，198.8(C-15)，208.7(C-17)；
-IR(纯)cm-1：1724，1672(C＝O)；
-UV λmax(MeOH)nm(logε)：251、282、327；
-ESI-MS m/z 408[M+Na]+；
-HR-ESI-MS m/z408.2151[M+Na]+(C23H31NO4Na的计算值为408.2153)。
化合物D的特征
分离出呈黄色油状的新颖化合物D，且其特征如下：
-1H NMR(CDCl3，400MHz)：0.88(3H，t，J＝7.2Hz，CH3-22)，0.94(3H，t，J＝7.2Hz，CH3-9)，1.26(4H，m，CH2-20，21)，1.57(2H，m，CH2-19)，1.75(2H，sext，J＝7.2Hz，CH3-8)，2.51(3H，s，15-COCH3)，2.52(2H，t，J＝7.2Hz，CH2-18)，3.26(2H，s，CH2-16)，3.93(3H，s，OCH3-12)，7.23(1H，s，H-5)，8.13(1H，s，H-13)，9.16(1H，s，H-2)；
-13C NMR(CDCl3，100MHz)：13.7(C-9)，13.9(C-22)，22.4(C-21)，22.7(C-8)，23.4(C-19)，25.4(15-COCH3)，31.3(C-20)，39.8(C-7)，40.7(C-16)，43.2(C-18)，52.5(C-12)，121.5(C-3)，122.8(C-5)，137.2(C-14)，140.5(C-13)，146.2(C-4)，150.9(C-2)，165.3(C-10)，166.4(C-6)，198.8(C-15)，208.7(C-17)；
-IR(纯)cm-1：1716，1665(C＝O)；
-UVλmax(MeOH)nm(logε)：245、271、328；
-ESI-MS m/z382[M+Na]+；
-HR-ESI-MS m/z382.1994[M+Na]+(C21H29NO4Na的计算值382.1994)。
化合物A、B、C及D的结构说明
如HR-ESI-MS数据配合1H-NMR、13C-NMR及DEPT确定，化合物A分子式为C21H27NO4，其具有9个不饱和度。IR光谱显示存在多个羰基C＝O(1712、1668cm-1)，通过紫外光谱分析(λmax253、280及330nm)得知，所述羰基之一与吡啶共轭。13C-NMR说明式中所固有的9个不饱和度中的8个为一个共轭羰基、一个酮、一个酯羰基、一对双键及五个烯碳。因此，化合物A含有单个吡啶环。
1H-/13C-NMR谱指示有7个四级C原子、5个CH、5个CH2及4个甲基。在1H-NMR谱中，存在以下典型信号：δH 3.92(3H，s)处1个OMe基团；δH 2.51(3H，s)处1个乙酰基部分；δH 2.54(2H，d，J＝7.4Hz)及3.27(2H，s)处酮的α-亚甲基质子信号；δH 1.59(2H，m)处酮的1个β-亚甲基共振；δH 7.33(1H，s)及9.13(1H，s)处吡啶烯烃质子的两个信号；以及δH 6.54(1H，br d，J＝12.0Hz)及6.93(1H，m)处1个(E)-双键信号，这表示化合物A可能为具有共轭羰基酯基的吡啶环部分。根据13C-NMR及DEPT实验确定吡啶衍生物的碳，且存在3个C＝O官能基[δC 198.8(α，β-不饱和C＝O基团)；165.5(酯C＝O基团)及208.7(C＝O)]、1个C＝C键[δC 130.2、135.4]、1个乙烯基甲基碳[δC 18.6]、1个甲氧基[δC 52.3]、1个乙酰基甲基部分[δC 25.4]及3个脂肪族亚甲基C-原子[δC 20.0、31.0、34.6]的共振。化合物A的以上数据还与类似化合物的吡咯环部分相关。
化合物A的结构进一步由13C NMR、DEPT、COSY、NOESY(参见图2A)、HSQC及HMBC(参见图2B)实验证实。以上对化合物A的观测结果配合1H、1H-COSY及HMBC谱确定化合物A的吡啶骨架中存在部分3个取代基：片段1a(-CH3(CH2)4COCH2C(C＝CH)(COCH3)-，即(E)-2-乙酰基-4-氧代壬-1-烯基)、1b(-CH＝CHCH3-，即(E)-丙-1-烯基)及1c(-COOCH3-)。化合物A的整个骨架借助于HMBC谱来构建。因此，测得化合物A的结构为4-((E)-2-乙酰基-4-氧代壬-1-烯基)-6-((E)-丙-1-烯基)烟酸甲酯(参见图1A)，且被命名为红曲烟酸酯A。
除了吡啶部分处的取代不同外，化合物B至D的1H NMR谱均类似于化合物A红曲烟酸酯A。其结构进一步由13C NMR、DEPT、COSY、NOESY(参见图3A、4A及5A)、HSQC及HMBC(参见图3B、4B及5B)实验证实。因此，测得化合物B、C及D的结构为4-((E)-2-乙酰基-4-氧代壬-1-烯基)-6-((E)-丙-1-烯基)烟酸乙酯(参见图1B)、4-((E)-2-乙酰基-4-氧代十一-1-烯基)-6-((E)-丙-1-烯基)烟酸甲酯(参见图1C)、(E)-4-(2-乙酰基-4-氧代壬-1-烯基)-6-丙基烟酸甲酯(参见图1D)，且分别被命名为红曲烟酸酯B、C及D。
实例5.红曲烟酸酯A、B、C及D促进3T3-L1细胞中的脂肪细胞分化
3T3-L1前脂肪细胞的制备
诱发3T3-L1前脂肪细胞分化的方法是根据胁(Waki)等人(2007，“小分子哈尔碱是PPARγ表达的抗糖尿病性细胞类型特异性调节剂(The small molecule harmine is anantidiabetic cell-type-specific regulator of PPARγexpression.)”细胞代谢(CellMetabolism)，5(5)：357-370)及黄(Huang)等人(2005，“作为用于治疗代谢综合症的过氧物酶体增殖物活化受体和相关核受体调节剂的草药或天然药物(Herbal or naturalmedicines as modulators of peroxisome proliferator-activated receptors and related nuclearreceptors for therapy of metabolic syndrome.)”基础和临床药学和毒理学(Basic andClinical Pharmacology and Toxicology)，96：3-14)所述的方法来制备。将前脂肪细胞培养于含有10％胎牛血清(FBS)的高葡萄糖DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)，西格玛(Sigma)D-7777)中，放在5％CO2培养箱中于37℃下培养。
在分化诱导实验之前，将细胞接种于96或24孔盘中(各孔中细胞浓度为约2×104个/平方厘米)。将培养盘培养约2天使细胞长满，接着再培养2天。根据不同实验，将培养基换成不同分化培养基。更换分化培养基的那天指定为第0天。
DMI分化模型
DMI分化模型中使用的分化培养基包含三合一分化诱导剂(three-in-onedifferentiation inducer，DMI)：地塞米松(dexamethasone)(西格玛D-4902，以乙醇回溶至0.25M作为储备溶液)、异丁基-甲基黄嘌呤(西格玛I-5879，以DMSO回溶至0.5M作为储备溶液)及胰岛素(西格玛I-6634，以0.01N HCl回溶至10mg/ml作为储备溶液)。地塞米松、异丁基-甲基黄嘌呤及胰岛素的最终浓度分别为0.25μM、0.5mM及5μg/ml。
分别将四种测试化合物红曲烟酸酯A、B、C及D以DMSO回溶至5mg/ml作为储备溶液。将1ml含有测试样品的分化培养基添加至24孔3T3-L1前脂肪细胞培养盘的各孔中(各孔中样品的最终浓度为5μg/ml)。对照组为仅含有分化培养基而无样品的培养物。放置在5％CO2培养箱中，于37℃下培养3天，接着将培养基替换为含有10％FBS的DMEM。继续培养至第9天或第10天，然后分析细胞中三酸甘油酯的量。另外在倒立显微镜下检查分化程度(油滴量)。
胰岛素分化模型
胰岛素分化模型中使用的分化培养基为含有10％FBS及10μg/ml胰岛素的DMEM。将分别含有四种测试化合物红曲烟酸酯A、B、C及D的分化培养基添加至24或96孔 3T3-L1前脂肪细胞培养盘的各孔中(各孔中测试化合物的最终浓度为2μg/ml)。对照组为仅含有分化培养基而无样品的培养物。放置在5％CO2培养箱中，于37℃下培养7天(在此期间，以含或无样品的分化培养基替换2次)，接着将培养基替换为含有10％FBS的DMEM。继续培养至第9天或第10天。在第9天或第10天以AdipoRed染色细胞，并分析三酸甘油酯的浓度。
(1)AdipoRed染色
以PBS清洗96孔盘，添加200μl PBS及5μl AdipoRed试剂(美国马里兰州沃克斯维尔市的龙泽-沃克斯维尔公司(Lonze Walkersville)，目录号PT-7009)至各孔中。均匀混合作用10至15分钟后，以设定在485nm激发波长及572nm发射波长下的光谱荧光计(无限(Infinite)M200)读取。将实验组的荧光数据除以对照组的荧光数据，换算为促分化的百分比。
(2)三酸甘油酯浓度的测量
以PBS清洗，然后以0.1ml 1％曲拉通(Triton)X 100洗出细胞。接着冷冻、解冻细胞，并离心(每5分钟10,000rpm)，收集上清液。使用三聚甘油(Triglycerol)测定试剂盒(欧迪诊断有限责任公司(Audit Diagnostics))分析0.05ml上清液的试样。
另以伯乐(Bio-Rad)Dc蛋白质测定试剂(伯乐公司(Bio-Rad))分析蛋白质的量。将三酸甘油酯浓度除以蛋白质浓度，计算出每微克蛋白质中三酸甘油酯的量(μg)。将实验组的三酸甘油酯的量除以对照组的三酸甘油酯的量，换算为样品的促分化率。
结果
图6(A)至(E)显示在倒立显微镜下所观测到的红曲烟酸酯A、B、C及D对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响(DMI分化模型)。较深颜色表明在分化脂肪细胞中存在丰富的三酸甘油酯小液滴。由结果可发现，经红曲烟酸酯A、B、C及D处理的培养物含有的三酸甘油酯小液滴比对照培养物多，这表示四种化合物均可显著地促进3T3-L1前脂肪细胞的分化。
测试化合物对3T3-L1分化的促进程度显示于表1中。
表1红曲烟酸酯A、B、C及D对3T3-L1分化的影响
a.样品浓度为5μg/ml。
b.样品浓度为2μg/ml。
由结果可发现，在DMI与胰岛素模型中，四种测试化合物红曲烟酸酯A、B、C及D均促进3T3-L1前脂肪细胞的分化。
实例6.测定NO产生及细胞存活率测定
将鼠类巨噬细胞细胞系RAW264.7(BCRC 60001＝ATCC TIB-71)培养于含有10％热灭活胎牛血清(FBS)的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM，基布克BRL生命技术公司(Gibco BRL Life Technologies))中，放置在5％CO2潮湿环境中于37℃下培养。24小时后，将培养基替换为含FBS的新鲜DMEM。接着在脂多糖(LPS，1μg/mL；西格玛公司(Sigma)，目录号L-2654)存在下，分别添加三种测试化合物红曲烟酸酯A、C及D(0、1、5、10及20μg/mL)，继续培养24小时。
离心，取上清液进行NO产生测量，以MTT(溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓盐)测定来测定细胞存活率。将上清液与等体积格里斯试剂(Griess reagent)(含1％氨苯磺酰胺(sulfanilamide)、0.1％N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐的2.5％磷酸溶液)混合，在室温下反应10分钟，测量540nm下的吸光度来测定亚硝酸盐浓度(参见摩斯曼T.(Mosman，T.)，1983，“细胞生长和存活率的快速比色测定：对增殖和细胞毒性测定的应用(Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application toproliferation and cytotoxicity assays.)”免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)，65：55-63)。MTT比色测定是由摩斯曼的比色测定修改而来(参见约翰逊M.(Johansson，M.)等人，2002，“来自子囊菌A111-95的生物学活性次级代谢产物(Biologically active secondarymetabolites from the ascomycete A111-95.)”抗生素杂志(J.Antibiot.)，55：104-106)。此测试是基于活细胞可将黄色可溶性盐MTT还原成紫蓝色不溶性甲臜的选择性能力。添加MTT(默克公司；溶于磷酸盐缓冲盐水中，5mg/mL)溶液至孔盘内(每100μl培养物10μl MTT)，37℃下培养4小时。接着添加DMSO，以550nm下的吸光度来确定所形成的有色甲臜代谢物的量。以对照(未经处理)细胞中所形成的甲臜的光学密度作为存活率100％。
评估红曲烟酸酯A、C及D对LPS诱发的NO产生的抑制作用。红曲烟酸酯A的IC50为5.72μg/mL(16.0μM)，红曲烟酸酯D的IC50为9.4μg/mL(24.8μM)。红曲烟酸酯A及D显示对NO产生的抑制作用比作为阳性对照的槲皮素(quercetin)(IC50为 26.4μM)强。根据现有技术文献报导，槲皮素对LPS刺激的巨噬细胞RAW264.7的NO产生具有抑制作用(IC50为26.8μM)(参见莫泰T.(Motai，T.)及田家S.(Kitanaka，S.)，2005，“来自阜康阿魏的倍半萜烯色酮和其一氧化氮产生抑制作用(Sesquiterpenechromones from Ferula fukanensis and their nitric oxide production inhibitory effects.)”天然产物杂志(J.Nat.Prod.)，68：1732-1735)。在LPS处理24小时的期间，红曲烟酸酯A(1-10μg/mL)及D(1-20μg/mL)未显示任何显著的细胞毒性。红曲烟酸酯C在10μg/mL下具有显著的细胞毒性。
实例7.红曲米提取物促进3T3-L1前脂肪细胞的分化
根据实例1及2中所述的方法使用丛毛红曲菌BCRC 930117(DSM 22351)及紫色红曲菌M615BCRC 930146(DSM 24162)来制备红曲米。
有机溶剂提取物的制备：添加1g的固态发酵红曲米至50ml血清瓶中，并添加25ml有机溶剂(甲醇、乙醇或乙酸乙酯)。在室温下低速旋转，进行过夜提取。用滤纸过滤所提取的液体，并使用真空抽气干燥机去除所述过滤液体中的溶剂，得到BCRC 930117发酵米及BCRC 930146发酵米的干燥甲醇、乙醇及乙酸乙酯提取物。
水提取物的制备：添加5g的固态发酵红曲米至500ml血清瓶中，并添加250ml去离子水。在100℃下加热60分钟。用滤纸过滤所提取的液体，并使用冷冻干燥机去除所述过滤液体中的溶剂，得到BCRC 930117发酵米及BCRC 930146发酵米的干燥水提取物。
将上述干燥水提取物溶于去离子水中，干燥的甲醇、乙醇及乙酸乙酯提取物溶于二甲亚砜(DMSO)中，配成2mg/ml或5mg/ml的储备样品。
3T3-L1前脂肪细胞分化测定根据实例5进行。结果显示于表2及3中。
表2BCRC 930117发酵米及BCRC 930146发酵米的甲醇及水提取物对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响
表3BCRC 930146发酵米的甲醇、乙醇及乙酸乙酯提取物对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响
ND：未测试。
表2及3的结果证明，在DMI模型与胰岛素模型中，BCRC 930117发酵红曲米及BCRC 930146发酵红曲米的甲醇提取物可显著地促进3T3-L1前脂肪细胞分化。BCRC930146发酵红曲米的乙醇及乙酸乙酯提取物还可显著地促进3T3-L1前脂肪细胞分化。
实例8.红曲烟酸酯A、B、C及D促进3T3-L1脂肪细胞中的PPARγ表达，并提升脂联素浓度
如实例5中所述，用红曲烟酸酯A、B、C及D(实例3中制备)处理3T3-L1细胞。提取分化3T3-L1细胞的细胞核蛋白及细胞质蛋白，使用商业试剂盒分析细胞核PPARγ及细胞质脂联素含量。
(1)细胞核蛋白及细胞质蛋白提取
在9-cm培养盘(petri dish)上培养3T3-L1细胞，并使其分化。培养9天后以PBS洗涤。添加1ml缓冲剂A工作溶液(昂飞( )核提取试剂盒，帕诺米克公司(帕诺米克)；根据说明书新鲜配制)至培养盘中，冰浴、振荡10分钟。将培养盘上的细胞刮下，转移至1.5ml离心管，以14,000rpm离心3分钟。收集上清液(即细胞质部分)以供进一步分析。添加0.5ml缓冲剂B工作溶液(昂飞( )核提取试剂盒，帕诺米克公司；根据说明书新鲜配制)至离心管中，将沉淀细胞团再悬浮，于冰浴下振荡2小时。接着将离心管以14,000rpm离心5分钟。收集上清液(即细胞核部分)以供进一步分析。
(2)细胞核PPARγELISA
使用转录因子PPARγELISA试剂盒(帕诺米克公司)，根据说明书，分析细胞核部分中的细胞核PPARγ。
(3)细胞质脂联素(AdipoQ)ELISA
使用昆替凯恩(Quantikine)小鼠脂联素免疫测定(研究开发系统公司(R&Dsystems))，根据说明书，分析细胞质部分中的细胞质脂联素。
结果显示，红曲烟酸酯A、B、C及D可增加3T3-L1细胞中细胞核PPARγ的表达(参见表4)及细胞质脂联素的浓度(参见图7(A)及(B))。
表4红曲烟酸酯A、B、C及D对3T3-L1的PPARγ表达的影响
对照组：仅使用培养基。最终样品浓度为5μg/mL，曲格列酮为200nM。
实例9.红曲烟酸酯A、B、C及D以及红曲米提取物具有PPARs结合活性
根据实例3制备红曲烟酸酯A、B、C及D，根据实例7制备BCRC 930146发酵米的乙醇及乙酸乙酯提取物。使用竞争结合测定试剂盒(兰萨筛选TR-FRET PPARγ结合测定(LanthaScreen TR-FRET PPARγBinding Assay)及英杰PPARα竞争结合测定(Invitrogen PPARαCompetitive Binding Assay))，根据各自说明书，分析红曲烟酸酯A、 B、C及D以及BCRC 930146发酵米的乙醇及乙酸乙酯提取物对PPARγ及PPARα的结合活性。以曲格列酮(Troglitazone)及花生四烯酸分别作为PPARγ及PPARα配体的参考物。
表5显示，红曲烟酸酯A、B、C及D以及BCRC 930146发酵米的乙醇及乙酸乙酯提取物具有PPARγ结合活性，BCRC 930146发酵米的乙醇及乙酸乙酯提取物具有PPARα结合活性。
表5BCRC 930146发酵米的乙醇及乙酸乙酯提取物以及红曲烟酸酯A、B、C及D的
PPARs结合活性
ND：未测试。
实例10.红曲米提取物对高脂肪/高蔗糖饮食诱发肥胖及高血糖小鼠的作用红曲米乙醇提取物的制备
红曲米根据实例1及2中所述的方法使用紫色红曲菌M615BCRC 930146(DSM24162)来制备。将2.4Kg BCRC 930146发酵米置于10L不锈钢容器中，添加3L 95％乙醇溶液至所述容器中。在室温下静置提取72小时，并以滤纸过滤。使用真空抽气干燥机去除过滤液体中的溶剂，得到0.64L浓缩液。添加0.16L 2.5％甲基纤维素至浓缩液中，并将混合物冷冻干燥，得到110g干燥的提取物。将此用于动物测试。
动物测试
喂食雄性C57BL/6JNarl小鼠高脂肪/高蔗糖饲料(HF/HS)，以诱发肥胖症及高血糖症。四周后，HF/HS小鼠的非空腹血浆葡萄糖浓度高于正常小鼠(128.9±10.4mg/dL相对于154.1±16.1mg/dL，p＜103)。将HF/HS小鼠分成四组(一个对照组及三个测试组)。三个测试组的小鼠分别投予每千克体重277mg(低剂量)、每千克体重554mg(中等剂量)及每千克体重1108mg(高剂量)的红曲米乙醇提取物。HF/HS对照组的小鼠投予以实例1及2中所述的相同方法在BCRC 930146不存在下发酵的米及以实例7中所述的相同提取方法所制备的乙醇提取物。在第8周进行口服葡萄糖耐受性测试，在第10 周进行胰岛素耐受性测试。在第11周禁食后牺牲小鼠；收集血液以供血液学分析，将副睾脂肪组织固定、包埋和切片，以计算脂肪细胞的大小及数目。
结果
表6显示在第8周进行的口服葡萄糖耐受性测试的结果。结果显示三个测试组的30分钟及120分钟时的血浆葡萄糖浓度及AUC120min显著低于HF/HS对照组(p＜0.05)。
表6喂食BCRC 930146发酵米乙醇提取物对于葡萄糖耐受性的影响
结果以平均值±sd表示。 及*分别代表与正常组及HF/HS对照组间具有统计上显著差异(p＜0.05)。
表7显示在第10周进行的胰岛素耐受性测试的结果。结果显示中、高剂量组的15分钟及60分钟时的血浆葡萄糖浓度及AUC60min显著低于HF/HS对照组(p＜0.05)。
表7喂食BCRC 930146发酵米乙醇提取物对于胰岛素耐受性的影响
结果以平均值±sd表示。 及*分别代表与正常组及HF/HS对照组间具有统计上显著差异(p＜0.05)。
11周时血液学分析的结果显示于表8中。
结果以平均值±sd表示。 及*分别代表与正常组及HF/HS对照组间具有统计上显著差异(p＜0.05)。
结果显示(1)三个测试组的胰岛素浓度显著低于HF/HS对照组；(2)中剂量及高剂量均可显著地降低空腹血浆葡萄糖浓度；(3)低剂量组及高剂量组的血浆HDL浓度均显著高于HF/HS对照组；且(4)三个测试组的HDL/TC比率显著升高。
概括来说，红曲米乙醇提取物可改善葡萄糖不耐性以及胰岛素抗性，且可改善血脂质、升高HDL/TC比率。
图8显示副睾脂肪组织中脂肪细胞的大小分布。高剂量组中，直径为81-110μm的大脂肪细胞的数目显著低于对照组。中、高剂量组中的中脂肪细胞(直径为10-40μm)及小脂肪细胞(直径为10-40μm)的数目显著高于对照组。虽然对照组及三个测试组的脂肪细胞的总数并无显著差异，但高剂量组的大脂肪细胞较少，且中、小脂肪细胞较多。在本发明技术领域中已知，PPARγ促效剂对改善胰岛素抗性的作用之一是通过促进脂肪细胞分化来实现。本发明的结果证明，经由具有PPARγ结合活性的红曲烟酸酯A、B、C或D促进前脂肪细胞的分化，红曲米乙醇萃取物可增加胰岛素敏感性较佳的中、小脂肪细胞。
虽然已结合上述特定方面描述了本发明，但所属领域的一般技术人员应很容易了解到本发明的许多替代形式以及其修改及变化。所有这些替代形式、修改及变化均视为在本发明的范围内。

Claims (16)

1.一种化合物，其为4-((E)-2-乙酰基-4-氧代壬-1-烯基)-6-((E)-丙-1-烯基)烟酸甲酯、4-((E)-2-乙酰基-4-氧代壬-1-烯基)-6-((E)-丙-1-烯基)烟酸乙酯、4-((E)-2-乙酰基-4-氧代十一-1-烯基)-6-((E)-丙-1-烯基)烟酸甲酯或(E)-4-(2-乙酰基-4-氧代壬-1-烯基)-6-丙基烟酸甲酯，或其医药学上可接受的盐。
2.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的化合物或其医药学上可接受的盐及任选使用的医药学上可接受的载剂或赋形剂。
3.一种制备根据权利要求1所述的化合物的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)以红曲菌属分离菌株将米发酵，获得红曲米；
(b)以甲醇或乙醇提取所述红曲菌米；
(c)以乙酸乙酯与H2O提取步骤(b)中获得的提取物，获得可溶于乙酸乙酯的部分；
(d)利用洗脱剂经由硅胶色谱柱洗脱所述可溶于乙酸乙酯的部分；及
(e)利用硅胶色谱柱和/或制备型薄层色谱法纯化(d)的洗脱份，获得所述化合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述分离菌株为丛毛红曲菌或紫色红曲菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述分离菌株为丛毛红曲菌BCRC930117 DSM 22351或紫色红曲菌M615BCRC 930146DSM 24162。
6.一种红曲米提取物，其通过包含以下的方法来获得：
(a)以红曲菌属分离菌株将米发酵，获得红曲米；及
(b)用95％乙醇提取所述红曲米；
其中所述分离菌株为丛毛红曲菌BCRC 930117DSM 22351或紫色红曲菌。
7.根据权利要求6所述的红曲米提取物，其中所述分离菌株为紫色红曲菌M615BCRC 930146DSM 24162。
8.一种组合物，其包含根据权利要求6至7中任一权利要求所述的红曲米提取物及任选使用的医药学上可接受的载剂或赋形剂。
9.一种根据权利要求1所述的化合物或其医药学上可接受的盐、根据权利要求6至7中任一权利要求所述的红曲菌米提取物或根据权利要求2或8所述的组合物的用途，其用于制备在有需要的个体提高PPARγ活性的医药品。
10.一种根据权利要求1所述的化合物或其医药学上可接受的盐、根据权利要求6至7中任一权利要求所述的红曲菌米提取物或根据权利要求2或8所述的组合物的用途，其用于制备预防和/或治疗个体与胰岛素抗性相关的疾病或病症的医药品。
11.一种根据权利要求1所述的化合物或其医药学上可接受的盐、根据权利要求6至7中任一权利要求所述的红曲菌米提取物或根据权利要求2或8所述的组合物的用途，其用于制备预防和/或治疗个体的代谢综合症或其并发症的医药品。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述代谢综合症或其并发症选自由以下组成的群组：腹部肥胖、胰岛素抗性或葡萄糖不耐性、2型糖尿病及心血管疾病。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述心血管疾病为致动脉粥样硬化血脂异常或血压升高。
14.根据权利要求11所述的用途，其中所述医药品与第二种用于预防或治疗代谢综合症或其并发症的治疗剂并用。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述第二种治疗剂选自由以下组成的群组：斯达汀、纤维酸酯、烟酸；利尿剂、血管收缩素转化酶抑制剂；胰岛素、磺酰脲、双胍、α-葡萄糖苷酶抑制剂及噻唑烷二酮。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述双胍为二甲双胍。
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