CN102731622A - 特异性靶向人类胚胎干细胞的量子点－噬菌体复合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异性靶向人类胚胎干细胞的量子点－噬菌体复合物。该复合物，是量子点与携带外源多肽的噬菌体的复合物；所述外源多肽的氨基酸残基序列为序列表中序列1所示的氨基酸残基序列。本发明的特异性靶向人类胚胎干细胞的量子点－噬菌体复合物可以用于胚胎干细胞的标记和分选。

Description

特异性靶向人类胚胎干细胞的量子点-噬菌体复合物

技术领域

本发明涉及一种特异性靶向人类胚胎干细胞的量子点－噬菌体复合物。

背景技术

胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是研究胚胎早期发生、细胞增殖与分化及基因表达调控等发育生物学基础研究的良好细胞模型系统，是细胞治疗和组织工程的理想来源（Wobus AM，Boheler KR.Embryonic stem cells:prospects for developmentalbiology and cell therapy.Physiol Rev.2005，85:635-678；Vats A，Bielby RC，TolleyNS，Nerem R，Polak JM.Stem cells.Lancet.2005，366:592-602.），并可用于药物筛选（Pouton CW，Haynes JM.Embryonic stem cells as a source of models for drugdiscovery.Nat Rev Drug Discov.2007，6:605-616）。近年来一直是生物学研究的热点。

ES细胞的高度自我更新能力和分化全能性是它区别于其它细胞的重要特征。目前对Oct4、Nanog、Sox2等胞核内转录因子的大量研究揭示这些ES细胞特异性标志分子对维持ES细胞的自我更新和分化的全能性发挥着重要的作用（Nichols J，Zevnik B，Anastassiadis K，et al.Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryodepends on the POU transcription factor Oct4.Cell.1998，95(3):379-391；Avilion AA，Nicolis SK，Pevny LH，et al.Multipotent cell lineages in early mouse developmentdepend on SOX2 function.Genes Dev.2003，17(1):126-140）。ES细胞膜表面蛋白质则主要包括信号通路受体、黏附分子、转运蛋白和蛋白水解酶类（Nunomura K et al.CellSurface Labeling and Mass Spectrometry Reveal Diversity of Cell Surface Markers andSignaling Molecules Expressed in Undifferentiated Mouse Embryonic Stem Cells.Mol CellProteomics.2005，4:1968-1976.），LIF、TGFb、BMP、FGF-PI3K信号通路对ES细胞的自我更新起到重要作用（Rebecca Stewart，Miodrag Stojkovic and Majlinda Lako.Mechanisms of self-renewal in human embryonic stem cells.Eur J Cancer.2006，42:1257-1272）。这些研究斗表明ES细胞表面特异性标志分子可通过介导外源信号来调节ES细胞的增殖和分化行为。由于目前发现的ES细胞标志分子数量有限，而且与其他的成体干细胞或肿瘤细胞有共同的表达，因此更多更特异的ES细胞标志分子仍有待发现。采用有效的手段发现特异性的、新的细胞表面标志物对于研究干细胞保持自我更新和分化的信号通路、实现细胞增殖、定向诱导分化具有重要意义，并将有助于ES细胞的鉴定、分离纯化、质量控制，加快ES的基础研究和临床应用。

目前国际上对ES细胞表面特异性标志分子的研究现主要采用蛋白质组学技术进行（Adewumi，O.，et al.Characterization of human embryonic stem cell lines by theInternational Stem Cell Initiative.Nat Biotechnol.2007.25(7):803-816；Dai，B.and T.P.Rasmussen.Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stem cells fromdifferentiated cells.Stem Cells，2007.25(10):2567-2574；Shin，S.，et al.Wholegenome analysis of human neural stem cells derived from embryonic stem cells and stemand progenitor cells isolated from fetal tissue.Stem Cells.2007.25(5):1298-1306；3.Wang，D.and L.Gao.Proteomic analysis of neural differentiation of mouse embryonic stem cells.Proteomics.2005.5(17):4414-4426.）。由于ES细胞膜表面标志分子丰度低，其细胞免疫原性差，难于采用传统的单克隆抗体技术来获得特异抗体。蛋白组学采用二维电泳结合质谱技术虽可高通量筛选ES细胞标志分子，但其结果还需要进一步验证，其方法本身也较为费时费力和价格昂贵。2007年国际干细胞研究所对全球17个实验室的59株人ES细胞的基因表达研究表明这些细胞株之间存在差异（Adewumi，O.，et al.Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem CellInitiative.Nat Biotechnol.2007.25(7):803-816），很多研究均表明ES细胞具有群体异质性，不同的培养条件会有不同的特异性标志分子的异质表达，加之ES细胞膜蛋白的提取相对困难，丰度低及疏水性使得不易用质谱分析这些蛋白；这些因素使得目前发现的ES细胞表面标志分子数量及其功能研究较为有限。

噬菌体展示技术是一项简单、成熟的，能够将所需性质的多肽从具有大量变异体的集落中提取出来的高效筛选技术。自从Smith首次阐述该方法以来（Smith，G.P.Filamentous fusion phage:novel expression vectors that display clonedantigens on the virion surface.Science.1985.228(4705):1315-1317.），噬菌体展示技术已经发展成为了一种发现新特性多肽以及改变已有多肽性质的强大工具（15.Barry，M.A.，W.J.Dower，and S.A.Johnston.Toward cell-targeting gene therapyvectors:Selection of cell-binding peptides from random peptide-presenting phage libraries.Nature Medicine.1996.2(3):299-305；16.Paschke，M.Phage display systems and theirapplications.Applied Microbiology and Biotechnology.2006.70(1):2-11；17.Petty，N.K.，et al.Biotechnological exploitation of bacteriophage research.Trends in Biotechnology.2007.25(1):7-15.）。传统的筛选方法多采用纯化抗原或重组抗原进行固相筛选，而筛选未知分子却是许多研究工作所需要的，因此近年来使用噬菌体展示技术直接对细胞进行筛选发展非常迅速。采用细胞筛选不需要预先知道细胞表面相关分子信息，直接用细胞进行筛选可保留其膜表面分子的原初信息，并更为真实地模拟配体和受体间的结合状态。但由于细胞膜表面成分及其复杂，而所需要筛选的膜表面抗原往往又丰度低、免疫原性差，容易导致噬菌体的非特异结合，使得用细胞进行筛选难度较大。近年来发展的扣除筛选法，即用阴性细胞先行进行筛选，以去除非特异结合的噬菌体，再用阳性细胞进行多轮富集筛选即可较好地解决这类问题。

在噬菌体展示技术用于筛选干细胞表面特异性标志分子方面，已经有报道将噬菌体展示技术应用到对单一的成体干细胞进行筛选，获得了许多特异性的，功能性的多肽（Nowakowski，G.S.，et al.A specific heptapeptide from a phage display peptide libraryhomes to bone marrow and binds to primitive hematopoietic stem cells.Stem Cells.2004.22(6):1030-1038；19.Letchford，J.，et al.Isolation of C 15:A novel antibody generatedagainst mesenchymal stem cell-enriched adult human marrow.Journal of ImmunologicalMethods.2006.308(1-2):124-137；20.Morita，Y.，et al.Selection and properties for therecognition of P19embryonic carcinoma stem cells.Biotechnology Progress.2006.22(4):974-978），但将噬菌体库筛选技术应用到人类胚胎干细胞以及胚胎干细胞分化的研究中尚未见报道。

在干细胞及其它细胞生物学涉及细胞信号转导研究，膜蛋白配体受体研究，利用表面特殊标识分子进行定位、鉴定、分离筛选等方面的工作时，均需要借助相应的生物探针。其中基于特异性靶蛋白导向的荧光细胞影像分析是目前使用最为广泛的技术手段。

在荧光生物标记技术中日益广泛使用的材料“量子点（Quantum Dots，QDs）”，尤其是低毒、高效的新型量子点材料，可谓是荧光探针中的佼佼者（Wang,F.,et al.,Luminescent nanomaterials for biological labelling.Nanotechnology，2006.17:p.R1；Jamieson,T.,et al.,Biological applications of quantum dots.Biomaterials,2007.28(31):p.4717-4732.）。量子点是由数目极少的原子或分子组成的原子或原子团簇。主要由主族II~VI如CdSe、III~V如lnP、lnAs和GaSe副族化合物以及Si等元素组成,特别是II~VI和III~V副族化合物。由于光谱禁阻的影响,当这些半导体纳米晶体的直径小于其玻尔直径(一般小于10nm)时,这些小的半导体纳米晶体就会表现出量子特性（类似箱中运动的粒子）,当半导体纳米粒子的尺寸在5~10nm时,由于电子波函数的量子限制效应,半导体纳米粒子能带的有效带隙随粒子的半径减小而增加,导致吸收光谱和荧光光谱的蓝移,光谱性质主要取决于其半径大小而与组成无关（Bruchez,M.,et al.,Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels.Science,1998.281(5385):p.2013-2016；Mardyani,S.,et al.,Interfacing peptides,identified using phage-displayscreening,with quantum dots for the design of nanoprobes.Nanobiophotonics andBiomedical Applications II,2005.5705:p.217-224；Alivisatos,A.P.,Semiconductorclusters,nanocrystals,and quantum dots.Science,1996.271(5251):p.933-937.）。传统上这些材料多应用于平面显示器、光电子元件、量子点激光器等技术领域，直到1998年伯克利大学的Alivisatos（Bruchez Jr,M.,et al.,Semiconductor nanocrystals as fluorescentbiological labels.Science,1998.281(5385):p.2013-2016）的小组提出量子点可用在生物标记，这一发现开始了量子点在生物技术中应用的序幕。

作为新型的荧光标记物，量子点的优点主要体现在以下几个方面：

1）QDs是无机半导体材料，体积小，适合生物体，细胞的标记。

2）单色性好、发光效率高、不易被光漂白；所得到的荧光图像清晰度好。

3）对激发光源要求低，普通特定波长的LED即可；激发光源波长范围较宽（紫外到蓝光范围均可）。

4）不同粒径的QDs，用同一波长光源均可激发，可同时呈现多色影像，能对多个不同标记物质同时进行成像分析。

自从Smith（Smith,G.P.,Filamentous fusion phage:novel expression vectors thatdisplay cloned antigens on the virion surface.Science,1985.228(4705):p.1315-7）首次阐述噬菌体展示技术以来，该方法已经发展成为了一种发现新特性多肽或抗体以及改变已知多肽性质的有效手段。其中，对于筛选得到的特异肽段需要进行相应的荧光标记，从而对筛选结果做出确认。比较普遍的做法是生物素化筛选得到的多肽片段，再用亲和素偶联荧光素探针进行标记。这样的方式存在下面几个问题：

1）筛选得到的肽段需要测序、量化合成，方可进行生物素标记。带来了观察、确认与细胞培养进程的滞后。

2）由于引入了生物素-亲和素体系，加上本身标记用荧光材料的理化性质，增加了标记反应的非特异性。带来了降低标记反应本底的麻烦。

3）标记用的荧光素都是一些常见的有机荧光染料，如CY3，CY5，FITC，罗丹明，等。分子量大，稳定性不高，伴有“光漂白”现象，一次标记反应完成后，无法进行连续、实时的观测。

4）如果需要进行多靶标同时标记，不但需要单独完成每一组“生物素-亲和素”标记，彻底洗脱后，再进行其它位点标记。而且，往往不同的荧光素可能需要使用不同波长和强度的激发光源，观测时，需要切换不同的光路通道，最后进行图层叠加才能得到同一细胞视野中多色标记的图像。增加了显微成像的操作难度。

5）荧光素标记材料本身的荧光强度所限，发射光半峰宽都较宽，最终荧光影响锐度较低。而且多色标记时发射光容易叠加，形成干扰杂色区域，不利于对目标位点进行准确分析。由于噬菌体稳定易保存，易扩增等的特点，已经有一些研究小组利用荧光标记噬菌体来检测细菌（Mosier-Boss,P.A.,et al.,Use of fluorescently labeled phage inthe detection and identification of bacterial species.Appl Spectrosc,2003.57(9):p.1138-44.），化学改造噬菌体来标记癌细胞（Li,K.,et al.,Chemical modification of M13bacteriophage and its application in cancer cell imaging.Bioconjug Chem,2010.21(7):p.1369-77.），利用噬菌体纳米材料复合物，如胶体金－噬菌体复合物来进行细菌的检测（Edgar,R.,et al.,High-sensitivity bacterial detection using biotin-tagged phage andquantum-dot nanocomplexes.Proc Natl Acad Sci U S A,2006.103(13):p.4841-5.），利用量子点标记噬菌体来检测细菌（Yim,P.B.,et al.,Quantitative characterization of quantumdot-labeled lambda phage for Escherichia coli detection.Biotechnol Bioeng,2009.104(6):p.1059-67.），但利用偶联的方法来获取胚胎干细胞特异性的噬菌体－量子点复合物，并用在干细胞检测中尚未见报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种特异性靶向人类胚胎干细胞的量子点－噬菌体复合物，是将量子点与携带特异性靶向人类胚胎干细胞的外源多肽的噬菌体偶联获得的复合物。

所述携带特异性靶向人类胚胎干细胞的外源多肽的噬菌体为次要包膜蛋白pIII的N端连接有外源多肽的M13单链噬菌体。

所述特异性靶向人类胚胎干细胞的外源多肽的大小为12个氨基酸残基；

所述携带特异性靶向人类胚胎干细胞的外源多肽的噬菌体为通过Ph.D.-12噬菌体肽库筛选获得的含有特异性靶向人类胚胎干细胞的噬菌体克隆；所述筛选使用人类胚胎干细胞系X-01筛选；

所述筛选的方法包括：

1）负筛：将Ph.D.-12噬菌体肽库先加入到自由分化的人类胚胎干细胞系X-01细胞悬浮液中，晃动使噬菌体与自由分化的人类胚胎干细胞系X-01充分结合，然后离心获得含有未结合噬菌体的上清液，将上清液加入到P3辐照处理过的小鼠成纤维细胞PMEFsCF-1中，晃动使噬菌体与P3辐照处理过的小鼠成纤维细胞PMEFsCF-1充分结合，获得含未结合噬菌体的上清液；

2）正筛：将步骤1）获得的上清液转入人类胚胎干细胞系X-01悬浮液中，晃动使噬菌体与人类胚胎干细胞系X-01充分结合，收集人类胚胎干细胞系X-01，然后用含终质量百分浓度为3%的BSA和终质量百分浓度为0.1%的Tween-20的pH7.4的PBS洗涤细胞，然后用含0.1M glycine-HCl，终质量百分浓度为0.1%的BSA，pH 2.2的溶液洗脱，获得含有特异性靶向人类胚胎干细胞的噬菌体。

所述外源多肽的氨基酸残基序列为序列表中序列1所示的氨基酸残基序列。

所述量子点为激发波长为580nm,ZnS壳包被CdSe核，并用羧基修饰的量子点；所述量子点与携带特异性靶向人类胚胎干细胞的外源多肽的噬菌体之间的偶联是通过羧基与外源多肽的NH₂连接。

本发明还提供的特异性靶向人类胚胎干细胞的肽段，其氨基酸残基序列为序列表中序列1所示的氨基酸残基序列。

上述特异性靶向人类胚胎干细胞的肽段的编码核苷酸片段。

所述编码核苷酸片段的序列为序列表中序列2所示的核苷酸序列。

本发明通过对噬菌体库的筛选，获得携带特异性靶向胚胎干细胞的肽段的噬菌体，实验证明，该肽段可以与胚胎干细胞特异性结合，将该携带特异性靶向胚胎干细胞的肽段的噬菌体与量子点进行偶联，获得特异性靶向胚胎干细胞的噬菌体和量子点的复合物，本发明的肽段或其编码基因以及特异性靶向人类胚胎干细胞的量子点与噬菌体的复合物可以用于胚胎干细胞的识别，标记，分选和药物靶向中的应用。

附图说明

图1为筛选与制备方法总览

图2为人类胚胎干细胞的培养及AP（碱性磷酸酶）鉴定

图3为噬菌体克隆（可展示本发明特异性靶向人类胚胎干细胞的氨基酸肽段的噬菌体）的ELISA检测结果

图4为噬菌体克隆（可展示本发明特异性靶向人类胚胎干细胞的氨基酸肽段的噬菌体）的免疫荧光检测检测结果。

图5为量子点的选择和偶联示意图。

图6为噬菌体－量子点复合物电镜检测，黑色小点为量子点。

图7为噬菌体－量子点复合物标记胚胎干细胞的荧光检测结果图，图中a为序列1所示多肽的标记胚胎干细胞的荧光检测，b为噬菌体－量子点复合物标记胚胎干细胞的荧光检测，c为FITC标记的噬菌体，d为量子点标记M13噬菌体（对照）。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、特异性靶向人类胚胎干细胞的氨基酸序列的筛选

特异性靶向人类胚胎干细胞的氨基酸肽段的筛选流程图如图1所示，为了除去非特异性的多肽,本实验用自由分化的人类胚胎干细胞作为负筛材料,除去那些非特异性的噬菌体多肽,然后再用未分化的胚胎干细胞作为正筛材料,得到能与其特异性结合的多肽。具体步骤如下所述：

1、细胞的培养和准备

正向筛选细胞悬浮液的制备：人类胚胎干细胞系X-01（中国科学院干细胞库(StemCell Bank,ChineseAcademy ofSciences)赠送）培养于P3辐照处理过的小鼠成纤维细胞(PMEFsCF-1)（简称CF-1细胞，上海斯丹赛生物技术有限公司，货号0303-200）上。

培养用培养基为含体积百分含量为79%DMEM(Hyclone,Logan,新西兰),体积百分含量1%的非必需氨基酸(nonessential amino acid，Gibco BRL,USA美国),1mM L-谷氨酰胺(Gibco BRL，美国),4ng/L bFGF(Invitrogen,广州)，0.1mM b-mercaptoethanol(Amresco,Solon,Ohio美国),和体积百分含量为20%血清替代物(KSR)(Gibco BRL，美国)的培养基，培养时间为14天（复苏后第一代），传代后培养8天。AP（碱性磷酸酶）检测采用Alkaline Phosphatase Detection Kit(milipore,German德国)。

AP（碱性磷酸酶）检测的结果如图2所示，两个孔均为胚胎干细胞克隆，红色的显示结果表明胚胎干细胞AP结果为阳性，干细胞生长状况正常，图2中，ES为复苏后第7天的胚胎干细胞，平铺细胞为滋养层CF-1细胞，聚团克隆为胚胎干细胞，由形态学可以看出，胚胎干细胞克隆紧凑生长，有清晰的边缘，生长情况正常。dES为分化后的人类胚胎干细胞，细胞为铺散状态，失去清晰边缘。

在使用噬菌体展示肽库筛选之前，胚胎干细胞用0.5mg/ml的胰蛋白酶迅速消化，用磷酸缓冲液（PBS，pH7.4）洗两次，然后悬浮于封闭液中(含终质量百分含量为3%FBS于pH7.4的PBS中)，得到的细胞悬浮液用于做正向筛选。

负向筛选细胞悬浮液的制备：负向筛选使用自有分化的胚胎干细胞X-01和P3辐照处理过的小鼠成纤维细胞PMEFsCF-1。这两种细胞悬浮液的制备方法如下所述：

将上述培养胚胎干细胞X-01形成克隆的核心挑除，留存周围胚胎干细胞，用胎牛血清培养基（培养基成分为由体积百分含量为10％胎牛血清（Gibco BRL，美国）和体积百分含量为90%DMEM(Hyclone,Logan,新西兰)组成的培养基），连续培养20天直至细胞失去胚胎干细胞特征，用于做负向筛选的分化后胚胎干细胞，将分化后胚胎干细胞也用0.5mg/ml的胰蛋白酶迅速消化并悬浮于封闭液中。

小鼠成纤维细胞(PMEFsCF-1)用胎牛血清培养基（培养基成分为由体积百分含量为10％胎牛血清（Gibco BRL，美国）和体积百分含量为90%DMEM(Hyclone,Logan,新西兰)组成的培养基）培养后，用0.5mg/ml的胰蛋白酶迅速消化并悬浮于封闭液中。

2、噬菌体肽库筛选

本实施例所用的噬菌体库是Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒中的Ph.D.-12噬菌体展示肽库，该试剂盒购自NEW ENGLAND BIO-LABS,美国，该试剂盒中Ph.D.-12噬菌体展示肽库使用的噬菌体载体为M13单链噬菌体，肽库表达的随机肽均在噬菌体次要包膜蛋白pIII的N端。M13噬菌体是丝状噬菌体，是一种温和型噬菌体，不裂解宿主菌，成熟的噬菌体可分泌到培养基中，通过离心收集培养上清，再向其中加入沉淀剂即可将上清中大量噬菌体粒子沉淀下来，从而富集得到含外源基因产物的重组噬菌体。采用负筛/正筛的方法来进行筛选，具体包括下述步骤：

1）负筛：接近1.56×10¹¹的噬菌体（Ph.D.-12噬菌体肽库，NEW ENGLANDBIO-LABS,美国）被加入到1ml的悬浮的上述用作负向筛选的分化的人类胚胎干细胞悬浮液中，在室温中轻微晃动1小时，3000rpm离心3分钟。上清液中含有没有结合分化细胞的噬菌体，将上清液转入P3辐照处理过的小鼠成纤维细胞PMEFsCF-1悬浮液中，室温轻微晃动1小时，3000rpm离心3分钟，收集上清液。

2）正筛：将步骤1）获得的上清转入步骤1制备的人类胚胎干细胞系X-01悬浮液中，室温轻微晃动1.5小时，弃上清，所获细胞与噬菌体的混合物用洗脱液1(含终质量百分浓度为3%的BSA和终质量百分浓度为0.1%的Tween-20的pH7.4的PBS)洗5次。接下来用1.6ml洗脱液2(含0.1M glycine-HCl，终质量百分浓度为0.1%的BSA，pH 2.2的溶液)洗脱与细胞结合的噬菌体，然后加入0.3ml中和液（pH 9.1，1M Tris-HCl溶液），目标噬菌体即在液体中。

3）将上述所获噬菌体于宿主细菌大肠杆菌ER2738(Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒中提供)中扩增后并进行滴定计数。通过2轮与上述步骤1）和步骤2）同样的筛选，计算每一轮的噬菌体得率。

噬菌体得率（Phage yield rate）=筛选后噬菌体量/加入噬菌体量

表1.两轮筛选后噬菌体的得率

3、噬菌体克隆的挑选和测序

上述二轮筛选后，将10μl得到的噬菌体感染200μl于LB培养基中生长至对数生长期初期的E.coli ER2738宿主菌5分钟，然后将该混合物加入到约50°C的顶层琼脂中，混匀后铺到LB/IPTG/X-gal平板(LB培养基，15g/L琼脂，灭菌后温度低于70摄氏度时加入1ml IPTG/X-gal，Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒提供)上，于37°C过夜培养。挑选单个噬菌斑扩增后获得含有肽段的噬菌体单克隆。使用PEG/NaCl溶液（含终质量百分浓度为20%polyethylene glycol-8000和2.5M NaCl的溶液)。使用DNA抽提液（含10Mm Tris-HCL(PH 8.0)，1Mm EDTA和4M NaI的溶液)抽提噬菌体DNA后测序。测序表明，其中一个噬菌体单克隆展示的肽段的序列为序列表中序列1，其编码序列为序列表中序列2。

4、全细胞ELISA检测

于96孔细胞培养板（Falcon,美国）中培养上述X-01细胞（X-01细胞）,x-01分化细胞（X-01分化）或cf-1细胞（P3辐照处理过的小鼠成纤维细胞(PMEFsCF-1)（CF-1）至70％铺满，培养基与步骤1中所述的培养基相同，每孔加入100μl多聚甲醛溶液（质量百分浓度为4％），室温（25°C）固定细胞15分钟。PBS溶液（pH7.4）洗板三次，向每孔中加入200μl封闭液（1%BSA-PBS-T，含终浓度为1%的BSA和终浓度为0.1%的Tween-20的pH7.4的PBS），于37°C封闭2小时。PBS溶液洗板三次，每孔中加入100μl用封闭液稀释的序列1所示的肽段（广州百奥泰公司合成，3’尾端（非作用末端）添加His标签，每孔添加2μmol），于室温下孵育90分钟。使用PBS-T溶液（含终浓度为0.1%的Tween-20的pH7.4的PBS）洗板三次，再用PBS溶液洗板三次。加入100μl封闭液1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记的鼠抗His抗体（Invitrogen，广州），于室温下孵育90分钟。使用PBS溶液（pH7.4）洗板三次后，再于每孔中加入100μl ELISA底物显色液（ELISA试剂盒提供，ELISA试剂盒购自碧云天生物技术研究所），并于暗处显色15分钟后用2mol/L的硫酸溶液终止。使用酶标仪在492nm波长下读溶液吸光度值，并用405nm波长的吸光度值作为背景值。结果如图3所示，LPH多肽（序列1所示）针对人类胚胎干细胞x-01具有较高的亲和力，而与分化细胞以及滋养层细胞的亲和力较低。试验结果表明LPH多肽（序列1所示）具有与人类胚胎干细胞x-01结合的特异性。

5、免疫荧光检测

24孔板(falcon,美国)培养人类胚胎干细胞x-01培养到60％铺满，弃培养上清,用PBS溶液（pH7.4）洗细胞一次。多聚甲醛溶液（质量百分浓度为4%）固定细胞10分钟,200μl/孔。吸去固定液,用PBS溶液（pH7.4）洗细胞3次。加入封闭液（含终浓度为1%的BSA和终浓度为0.1%的Tween-20的pH7.4的PBS）,于37℃下封闭2小时。PBS-T溶液洗三次。每孔加入200μl以封闭液稀释的序列1所示的肽段（广州百奥泰公司合成，尾端（非作用末端）添加His标签，每孔的添加量为2μmol）,室温（25℃）下孵育90分钟。孵育完成后,使用PBS-T溶液（含终浓度为0.1%的Tween-20的pH7.4的PBS）洗板三次,再用PBS溶液（pH7.4）洗板三次。于每孔加入200μl封闭液1:1000稀释的鼠抗His抗体(Anti-M13antibody，mouse,（Invitrogen，广州）,于室温（25℃）下孵育90分钟。PBS-T溶液（含终浓度为0.1%的Tween-20的pH7.4的）洗板三次,再用PBS溶液洗板三次。于每孔加入200μl使用封闭液1:200稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)兔抗鼠IgG抗体（Sigma,美国）,于暗处37℃下反应1小时。细胞核用hochest33258（Sigma,美国）复染，结果如图4所示。图中含有LPH多肽序列（序列1所示）与细胞反应，在细胞膜上显示为阳性绿色的小点，而作为对照(control)的随机多肽（序列为SLHSQPRSWTAY）未表现出特异性的阳性。试验结果进一步表明LPH多肽序列（序列1所示）具有与胚胎干细胞表面分子具有结合作用。

实施例2、特异性靶向人类胚胎干细胞的量子点－噬菌体复合物的制备

特异性靶向人类胚胎干细胞的量子点－噬菌体复合物的制备流程图如图1(b,c,d)所示，该方法包括筛选噬菌体库获得特异性靶向人类胚胎干细胞的噬菌体，然后将筛选得到的噬菌体与量子点偶联，利用离心洗涤步骤来洗掉非特异及偶联不完全的分子获取量子点－噬菌体探针。具体方法如下所述：

1、细胞的培养和准备

人类胚胎干细胞系X-01从中国科学院干细胞库(Stem Cell Bank,Chinese Academyof Sciences)获取（公众可通过合法的方法向中国科学院干细胞库申请获取）。于P3辐照处理过的小鼠成纤维细胞(PMEFsCF-1)（上海斯丹赛生物技术有限公司，货号0303-200）上经无血清培养，培养基含体积百分含量为79%DMEM(Hyclone,Logan,新西兰),体积百分含量1%，非必需氨基酸(nonessential amino acid，Gibco BRL,USA美国),1mM L-谷氨酰胺(Gibco BRL，美国),4ng/L bFGF(Invitrogen,广州)，0.1mMb-mercaptoethanol(Amresco,Solon,Ohio美国),和体积百分含量为20%血清替代物(KSR)(Gibco BRL，美国)的培养基。

2、特异噬菌体的扩增和滴定

用10μl实施例1筛选获得的含有序列表中序列1所示特异性肽段的噬菌体感染宿主细菌大肠杆菌ER2738(噬菌体肽库试剂盒中提供)中扩增。LB培养基中生长4.5小时，使用1／6体积PEG/Nacl溶液（含终质量百分浓度为20%的polyethyleneglycol-8000和2.5M NaCl的溶液)沉淀噬菌体。12000rpm离心即可获得大量的噬菌体。将稀释后的噬菌体加入到约50℃的顶层琼脂中,混匀后铺到LB/IPTG/X-gal平板上,于37°C过夜培养。对蓝斑计数，取数量>1.5x10¹²噬菌体备用。

3）水溶性量子点的选择：

选择水相转移后激发波长为320~460nm，可见光区发射，表面带有羧基（-COOH）的CdSe/ZnS核壳结构，量子点(Evident Technologies,Troy，NY)作为荧光标记材料。

4）量子点与特异性靶向人类胚胎干细胞的噬菌体的偶联

异性靶向人类胚胎干细胞的噬菌体（实施例1筛选），激发波长为580nm,ZnS壳包被CdSe核，并用羟基修饰的量子点,利用二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺（EDC）偶联。反应在常温下硼酸缓冲液（0.005mol/L的巯基乙醇的0.05mol/L硼酸盐，pH8.8）中进行，加入0.1mg/mL量子点，1.75×10¹²噬菌体，1mg二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺（EDC），偶联两个小时,并在4°C中过夜,反应得到的偶联产物即为本发明特异性靶向人类胚胎干细胞的量子点-噬菌体复合物，以添加M13噬菌体（NEW ENGLANDBIO-LABS,美国）替代上述特异性靶向人类胚胎干细胞的噬菌体作为对照。将获得的复合物用PBS清洗并保存在PBS溶液中。偶联后的量子点噬菌体复合物的结构示意图如图5所示，量子点表面的COOH基团与噬菌体携带的外源肽段上的NH₂基团偶联。复合物的电镜结果如图6所示，a为偶联反应示意图，b-c图中黑色的小点为量子点，d图为作为对照的量子点－M13噬菌体复合物。结果表明，噬菌体与复合物偶联在了一起。

5）量子点与特异性靶向人类胚胎干细胞的多肽的偶联

异性靶向人类胚胎干细胞的多肽（实施例1筛选测序（序列1），广州百奥泰公司合成），激发波长为580nm,ZnS壳包被CdSe核，并用羟基修饰的量子点,利用二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺（EDC）偶联。反应在常温下硼酸缓冲液（0.005mol/L的巯基乙醇的0.05mol/L硼酸盐，pH8.8）中进行，加入0.1mg/mL量子点，1mg多肽，1mg二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺（EDC），偶联两个小时,并在4°C中过夜，得到量子点－多肽偶联产物。

6）荧光检测

将上述的人类胚胎干细胞X-01铺在双凹玻璃片（上海生工，上海）的凹槽内,用步骤1所述的培养基培养12小时细胞贴壁后,PBS洗3次。终质量百分浓度为4%的多聚甲醛溶液（固定液）固定细胞15钟,200μl/孔。吸去固定液,用PBS溶液（pH7.4）洗细胞3次。加入封闭液（1%BSA-PBS-T）,于37°C下封闭1小时，PBS-T溶液（含终浓度为0.1%的Tween-20的pH7.4的PBS）洗三次。进行如下几组实验：

1）量子点-噬菌体复合物组：在上述培养的细胞中加入展示序列表中序列1的氨基酸片段的特异性靶向人类胚胎干细胞的量子点－噬菌体复合物10μl/孔（1.5×10¹⁰CFU），稀释于200μl 1%BSA-PBS溶液（含终浓度为1%的BSApH7.4的PBS）中,于37°C 1小时，PBS-T溶液（含终浓度为0.1%的Tween-20的pH7.4的PBS）洗三次。然后镜检。

2）FITC组：FITC组在上述培养的细胞中加入10⁹个携带特异性肽段序列的噬菌体（实施例1筛选），稀释于200μl 1%BSA-PBS溶液（含终浓度为1%的BSApH7.4的PBS）中,于37°C 1小时，PBS-T溶液（含终浓度为0.1%的Tween-20的pH7.4的PBS）洗三次。于每孔加入200μl封闭液1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记的鼠抗M13抗体(Anti-M13antibody，mouse,（Invitrogen，广州）,于室温（25℃）下孵育90分钟。PBS-T溶液（含终浓度为0.1%的Tween-20的pH7.4的PBS）洗板三次,再用PBS溶液洗板三次。于每孔加入200μl使用封闭液1:200稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)兔抗鼠IgG抗体（Sigma,美国）,于暗处37℃下反应1小时。加入hochest33258溶液（5ug/ml）复染,，20min。PBS溶液（pH7.4）洗三次，加入200μl/孔PBS溶液，然后镜检。

3）多肽组：按照1）的方法，用量子点标记多肽（序列1，步骤5）中制备）代替展示序列表中序列1的氨基酸片段的特异性靶向人类胚胎干细胞的量子点－噬菌体复合物作为对照1。

4）对照组：按照1）的方法，用量子点标记M13噬菌体代替展示序列表中序列1的氨基酸片段的特异性靶向人类胚胎干细胞的量子点－噬菌体复合物作为对照2。

结果如图7所示，量子点标记的多肽（图7中a）和量子点－噬菌体复合物（图7中b）可以很好的标记胚胎干细胞，并比较FITC标记的干细胞（图7中c），量子点－噬菌体复合物标记的界限更为清晰；同时，作为对照的量子点标记M13噬菌体（图7中d）没有明显的阳性信号。

Claims (10)

1.一种特异性靶向人类胚胎干细胞的量子点－噬菌体复合物，是将量子点与携带特异性靶向人类胚胎干细胞的外源多肽的噬菌体偶联获得的复合物。

2.根据权利要求1所述的量子点－噬菌体复合物，其特征在于：所述携带特异性靶向人类胚胎干细胞的外源多肽的噬菌体为次要包膜蛋白pIII的N端连接有外源多肽的M13单链噬菌体。

3.根据权利要求1所述的量子点－噬菌体复合物，其特征在于：所述特异性靶向人类胚胎干细胞的外源多肽的大小为12个氨基酸残基；

和/或，所述携带特异性靶向人类胚胎干细胞的外源多肽的噬菌体为通过Ph.D.-12噬菌体肽库筛选获得的含有特异性靶向人类胚胎干细胞的噬菌体克隆；所述筛选使用人类胚胎干细胞系X-01筛选；

和/或，所述筛选的方法包括：

1）负筛：将Ph.D.-12噬菌体肽库先加入到自由分化的人类胚胎干细胞系X-01细胞悬浮液中，晃动使噬菌体与自由分化的人类胚胎干细胞系X-01充分结合，然后离心获得含有未结合噬菌体的上清液，将上清液加入到P3辐照处理过的小鼠成纤维细胞PMEFsCF-1中，晃动使噬菌体与P3辐照处理过的小鼠成纤维细胞PMEFsCF-1充分结合，获得含未结合噬菌体的上清液；

2）正筛：将步骤1）获得的上清液转入人类胚胎干细胞系X-01悬浮液中，晃动使噬菌体与人类胚胎干细胞系X-01充分结合，收集人类胚胎干细胞系X-01，然后用含终质量百分浓度为3%的BSA和终质量百分浓度为0.1%的Tween-20的pH7.4的PBS洗涤细胞，然后用含0.1M glycine-HCl，终质量百分浓度为0.1%的BSA，pH 2.2的溶液洗脱，获得含有特异性靶向人类胚胎干细胞的噬菌体。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的复合物，其特征在于：所述外源多肽的氨基酸残基序列为序列表中序列1所示的氨基酸残基序列。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的复合物，其特征在于：所述量子点为激发波长为580nm,ZnS壳包被CdSe核，并用羟基或羧基修饰的量子点；所述量子点与携带特异性靶向人类胚胎干细胞的外源多肽的噬菌体之间的偶联是通过羟基或羧基与外源多肽的NH₂连接。

6.一种特异性靶向人类胚胎干细胞的肽段，其氨基酸残基序列为序列表中序列1所示的氨基酸残基序列。

7.权利要求1所述特异性靶向人类胚胎干细胞的肽段的编码核苷酸片段。

8.根据权利要求2所述的编码序列，其特征在于：所述编码核苷酸片段的序列为序列表中序列2所示的核苷酸序列。

9.权利要求6所述的肽段或其编码基因在制备人类胚胎干细胞的识别和/或标记和/或分选和/或药物靶向的产品中的应用。

10.权利要求1-5中任意一项所述特异性靶向人类胚胎干细胞的量子点与噬菌体的复合物在制备用于胚胎干细胞的识别和/或标记和/或分选和/或药物靶向的产品中的应用。

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