CN102725408A - 猪肌抑素基因启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪肌抑素基因启动子及其应用。本发明提供的DNA片段，来源于猪，为如下1）-4）中任一所述的DNA分子：1）序列表的序列2所示的DNA分子；2）序列表的序列3所示的DNA分子；3）在严格条件下与1）或2）所述DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；4）与1）或2）中所述DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。本发明的实验证明，本发明提供的启动子，其可以驱动报告基因萤火虫荧光素酶的表达，也可以将启动子构建到报告载体后转染猪源以及人源培养细胞，通过报告基因测试，以准确定量的方法鉴定启动子的活性和效率。

Description

猪肌抑素基因启动子及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种猪肌抑素基因启动子及其应用。

背景技术

近十年来，转基因技术得到迅猛发展和广泛应用，尤其是基因打靶与体细胞克隆技术的结合，使得转基因动物的基因定点修饰成为现实。该技术的关键是使外源基因在转基因动物基因组上定点整合并且稳定表达，而外源基因的表达与其启动子的转录活性密切相关。因此，获得具有稳定表达活性的启动子将极大促进转基因动物研究。但目前应用于转基因动物的启动子种类和数量则非常有限，主要是来源于病毒的启动子，如巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)、猿猴空泡病毒40(simian virus 40,SV40)、单纯疱疹病毒(herpes s implex virus,HSV)等组成型启动子。它们可以在几乎所有种类真核生物细胞内调控外源基因表达，而且没有时空特异性。用上述启动子调控外源基因表达时，由于外源基因在不需要的细胞或不需要的发育阶段大量表达和积累，往往造成动物形态和生理功能异常，以致早衰或死亡。另外，由于它们属于异源基因，容易在转基因动物体内遭受免疫排斥和表观遗传修饰，导致外源基因表达的不稳定性。鉴于此，寻找来源于转基因动物自身的内源性启动子就成为解决该问题的突破口。而且，利用转基因动物内源性启动子的另外一个优势是通过基因打靶，可以实现外源基因的“原位”定点整合，由内源性启动子“原位”驱动，将外源基因的表达控制在一定的生理水平。因此，尽快开展此方面的研究，对于转基因动物的研究和生产具有重要的应用价值。

肌抑素基因最早于1997年由McPherron等人在小鼠中克隆。该基因属于TGF-β家族，是一种转化生长因子。基因敲除证明此基因的失活引起小鼠肌肉组织增生，体重增大；而且小鼠可以正常存活，也具有生育能力。随后在牛、羊等动物中发现，肌抑素基因的主要功能是负调控肌肉生长发育，而且肌抑素的失活并未导致上述动物的生理功能出现异常。因此，肌抑素是迄今为止证明表型效应明显、相对安全的转基因动物候选修饰基因。鉴于肌抑素基因序列和蛋白质序列在物种进化上的高度保守，人们有理由推测猪肌抑素基因也具有相似的功能，因而它正成为目前转基因猪研究的热点基因，潜力巨大。但现阶段研究多着眼于肌抑素基因的敲除以获得产肉率更高的转基因猪，关于猪肌抑素基因启动子的克隆、鉴定和活性分析的研究还是空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪肌抑素基因启动子及其应用。

本发明提供的DNA分子，来源于猪，为如下1）-4）中任一所述的DNA分子：

1）序列表的序列2所示的DNA分子；

2）序列表的序列3所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）所述DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；

4）与1）或2）中所述DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。

所述4）所示的DNA分子为序列表中序列1所示的DNA分子。

所述严格条件为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。

含有所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

所述重组载体为如下1）或2）：

1）为将所述DNA分子插入pGL3-basic的MluI和BglII位点间得到的重组载体；

2）为将所述DNA分子插入pEGFP-C1的AseI和NheI位点间得到的重组载体。

扩增所述DNA分子的引物对也是本发明保护的范围。

所述引物对为如下1）或2）：

1）所示的引物对中的一条引物的序列为序列5，另一条引物的序列为序列6；

2）所示的引物对中的一条引物的序列为序列7，另一条引物的序列为序列8。

所述DNA分子在使目的基因在离体动物细胞中的表达中的应用也是本发明保护的范围。

所述动物细胞为鼠源细胞或人源细胞。

所述鼠源细胞为小鼠成肌细胞；

所述人源细胞为人宫颈癌细胞。

所述小鼠成肌细胞为C2C12细胞；

所述人宫颈癌细胞为Hela细胞。

除非特别指出或是单独定义,本文所使用的科学和技术术语具有本发明所属领域技术人员共知的、无歧义的相同含义。另外,本文所述的材料、方法以及实施案例本意在于说明和阐述而非限制或限定。

本发明的实验证明，本发明提供的启动子，其可以驱动报告基因萤火虫荧光素酶的表达，也可以将启动子构建到报告载体后转染猪源以及人源培养细胞，通过报告基因测试，以准确定量的方法鉴定启动子的活性和效率，为在该启动子后引入外源基因、解决转基因猪外源基因表达不稳定性以及位置效应的不可预知性等问题，提供了可靠、有价值的基因资源。

附图说明

图1为猪肌抑素基因组织结构和启动子候选区域示意图

图2为猪肌抑素基因启动子扩增

图3为猪肌抑素基因启动子报告载体酶切验证

图4为猪肌抑素基因启动子克隆、突变与活性检测

图5为猪肌抑素基因启动子驱动绿色荧光蛋白表达的功能验证

图6为猪肌抑素基因启动子报告载体在人源培养细胞中的活性检测

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔等著,黄培堂等译，科学出版社，2002，分子克隆实验指南第三版所建议的条件。

实施例1、猪肌抑素基因启动子的克隆与验证

1、实验材料

表1实验材料

2、仪器设备

表2仪器设备

3、实验方法

1）猪基因组DNA提取

取仔猪的离体猪耳肌肉组织样0.1克，洗净，剪碎。

每个样品加300μl DNA抽提缓冲液（Tris-Hcl 10mM,EDTA 10mM,SDS 2%,NaCl 300mM,pH8.0）,8μl蛋白酶K（10mg/ml）,55℃消化6小时。

用苯酚抽提两次，10,000rpm离心10分钟取上清液，去掉蛋白质和下层苯酚。

再用氯仿/异戊醇苯酚抽提一次，10,000rpm离心10分钟取上清液。

在上清液中加30μl3M NaAC,600μl无水乙醇充分混匀，10,000rpm离心10分钟取沉淀。

沉淀用75%冷乙醇洗涤一次，离心5分种去乙醇取沉淀。

沉淀在4℃充分晾干，加三蒸水100μl，电泳检查定量，-20℃冻存可用于PCR扩增，得到猪基因组DNA。

2）猪肌抑素基因启动子片段的PCR扩增

以上述得到的基因组DNA为模板，带有预设酶切位点的特异引物（MSTN-F和MSTN-R）扩增猪肌抑素基因启动子序列，反应体系为：

表3反应体系

反应条件为：

反应结束后，以1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图2所示，M为1kb DNA分子量标准，长度大小依次为0.5kb，1kb，1.5kb，2kb，3kb，4kb，5kb，6kb，8kb，10kb，PCR扩增得到1.1kb片段。

将该PCR产物送至华大基因测序，测序引物为Glprimer2，结果为该PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，将该PCR产物的基因命名为MSTN。其中从5’末端第1031-1038位为5’端转录必需元件TATA盒(5’端TATA盒)，从5’末端第1056-1063为3’端转录必需元件TATA盒(3’端TATA盒)，从5’末端第991-996位为3’端转录必需元件CAAT盒。

也可人工合成序列1。

图1为猪肌抑素基因组织结构和启动子候选区域示意图，可以看出，猪肌抑素基因包含三个外显子和两个内含子，全长3789bp。外显子长度分别为373bp、374bp和381bp；内含子长度分别为1809bp和1980bp。紧靠外显子1上游的序列，含有真核生物转录必需元件TATA盒(2个)与CAAT盒(1个)，以及MEF(myocyte enhancer factor，肌肉细胞增强因子)结合序列等。

3）猪肌抑素基因启动子片段的克隆与鉴定

将上述2）得到的PCR产物经MluI和BglII酶切得到的片段与经过同样酶切得到的报告载体pGL3-basic片段以下述体系做连接：

表4连接体系

反应条件为：16℃，连接过夜。

按照标准方法将连接产物转化大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜，得到转化子。

以MSTN-F和MSTN-R引物对上述获得的转化子进行菌落PCR鉴定，能够得到1.1kb扩增产物的重组子即为阳性质粒；

将阳性质粒用MluI和BglII酶切，以pGL3-basic为对照，结果如图3所示。其中，泳道1,3为pGL3-basic，2,4为经MluI和BglII双酶切的pGL3-basic质粒；可以看出，pGL3-basic质粒无插入片段，故双酶切后该质粒电泳显示为单一条带，长度为4.8kb，与理论分析相符。泳道5,7,9为重组子，6,8,10分别为5、7、9的重组子经MluI和BglII双酶切的产物；可以看出，泳道6,8,10双酶切后电泳结果显示为1.1kb(右侧黑色箭头所示，亮度较弱)和4.8kb两条片段的为阳性质粒，与理论分析相符，说明泳道5,7,9为阳性质粒。

经PCR、酶切均鉴定为阳性的质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列1插入pGL3-bai sc的MluI和BglII酶切位点间得到的质粒，将该质粒命名为pGL3-MSTN。实施例2、猪肌抑素基因启动子的功能鉴定

一、猪肌抑素基因启动子转录活性检测

A、猪肌抑素基因启动子报告系统突变载体的制备与验证

1、实验材料

表5实验材料

2、仪器设备

表6仪器设备

3、试验方法

1）突变载体构建本发明采用DpnI介导的点突变法。

突变PCR的反应体系如下：

表7反应体系

反应条件为：

具体如下：

以pGL3-MSTN为模板，以5’TATA盒删除突变上游引物和5’TATA盒删除突变下游引物作为引物，进行PCR扩增，得到5.9kbPCR产物1，经过测序，具有序列表中序列2所示的核苷酸（5’TATA盒缺失）；

以pGL3-MSTN为模板，以3’TATA盒删除突变上游引物和3’TATA盒删除突变下游引物作为引物，进行PCR扩增，得到5.9kbPCR产物2，经过测序，具有序列表中序列3所示的核苷酸（3’TATA盒）；

以pGL3-MSTN为模板，以三元件删除突变引物和MSTN-F作为引物，进行PCR扩增，得到981bpPCR产物3，经过酶切、连接、转化、鉴定、测序，具有序列表中序列4所示的核苷酸；

也可人工合成序列2或序列3。

用DpnI分别消化上述PCR产物（去除环化的模板pGL3-MSTN），体系如下：

表8反应体系

反应在37℃水浴，消化时间2小时。

消化结束后，分别取10μl消化产物按照标准步骤转化大肠杆菌感受态细胞DH5α（线性的消化产物两端有同源臂，在大肠杆菌中可以进行环化，这是经典突变方法的原理，由美国Stratagene公司开发），得到3种转化子：阳性质粒1、阳性质粒2、转化子3。

提取转化子1的质粒，送去测序，结果为该质粒中含有序列表中的序列2，该质粒为将序列表中的序列2插入pGL3-basic的MluI和BglII酶切位点间得到的质粒，命名为pGL3-TATA1；

提取转化子2的质粒，送去测序，结果为该质粒中含有序列表中的序列3，该质粒为将序列表中的序列3插入pGL3-basic的MluI和BglII酶切位点间得到的质粒，命名为pGL3-TATA2；

提取转化子3的质粒，送去测序，结果为该质粒中含有序列表中的序列4，该质粒为将序列表中的序列4插入pGL3-basic的MluI和BglII酶切位点间得到的质粒，命名为pGL3-3-boxes。

B、猪肌抑素基因启动子转录活性检测

1、实验材料

表9实验材料

2、仪器设备

表10实验材料

3、试验方法

1）、细胞转染

转染前一天,将4×10⁴C2C12细胞铺到24孔板中,隔夜生长后按照表中所列体系配制转染复合物,滴于24孔板中，补加400μl完全培养基，置于37℃,5%CO₂的条件下培养。在转染48h后收集细胞。按照Promega公司的DLR^MAssay试剂盒说明书进行荧光素酶活性测定。

转染体系如下：

表11转染体系

实验设置三个生物学重复，结果取平均值。

各个报告载体的酶活绝对值与相对比值如下表12所示：

表12各个报告载体的酶活绝对值与相对比值

各个报告载体的部分结构示意图和酶活相对比值作图如图4所示，从上述可以看出，TATA盒与CAAT盒是猪肌抑素基因转录的关键元件，三个元件的缺失可导致报告基因活性的丧失(与阴性对照pGL3-basic的酶活差异不显著)。分别缺失两个TATA盒发现它们均可有效驱动转录，证明这两个TATA盒是猪肌抑素基因转录起始的有效元件(突变型与野生型的酶活几乎一致)，但是二者无叠加效应。*，p<0.05,差异显著，说明序列2所示的DNA分子和序列3所示的DNA分子也为启动子。

二、猪肌抑素基因启动子驱动绿色荧光蛋白表达的功能验证

A、连接绿色荧光蛋白载体的制备与检测

1、实验材料

表13实验材料

2、仪器设备

表14仪器设备

3、实验方法

1）猪肌抑素基因启动子片段的PCR扩增

以pGL3-MSTN质粒DNA为模板，带有预设酶切位点的特异引物（启动子上游引物和启动子下游引物）扩增猪肌抑素基因启动子序列，反应体系为：

表15反应体系

反应条件为：

反应结束后，以1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，得到1122bp的PCR产物。

2）猪肌抑素基因启动子片段的克隆与鉴定

将经AseI和NheI酶切的上述1）得到的PCR产物与经过同样酶切得到的报告载体pEGFP-C1片段以下述体系做连接：

表16连接体系

反应条件为：16℃，连接过夜。

按照标准方法将连接产物转化大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜，得到转化子。

提取转化子的质粒，以启动子上游引物和启动子下游引物进行PCR扩增，得到1122bp的片段为阳性质粒。将阳性质粒用AseI和NheI酶切，得到1122bp片段，进一步证明为阳性质粒，经PCR、酶切均鉴定为阳性的质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列1插入pEGFP-C1的AseI和NheI酶切位点间得到的质粒，将该质粒命名为pMSTN-EGFP。

B、猪肌抑素基因启动子驱动绿色荧光蛋白表达的功能验证

1、实验材料

表17实验材料

2、仪器设备

表18仪器设备

3、试验方法

1）细胞转染

将上述构建好的pMSTN-EGFP报告载体转染（转染方法在试剂盒的说明书中有详细说明）小鼠成肌细胞C2C12，24小时后观察荧光，以pEGFP-C1为对照。

结果如图5所示，阳性对照质粒pEGFP-C1转染细胞后，可见大量绿色荧光蛋白表达；pMSTN-EGFP转染细胞后，也有部分细胞表达绿色荧光蛋白，但是其总亮度明显低于pEGFP-C1样品。这一方面说明所鉴定的MSTN启动子可以驱动报告基因绿色荧光蛋白的表达，另一方面也说明所鉴定MSTN启动子的活性确实低于组成型启动子CMV的效率，这与荧光素酶报告基因测试的结果是一致的，二者可以交互验证。由此可以认为，通过采用不同的报告基因系统，均检测到了所克隆片段的启动子活性，证明该片段确为猪肌抑素基因的启动子功能序列。

转染体系如下：

表19转染体系

三、猪肌抑素基因启动子报告载体在人源细胞的表达

1、实验材料

表20实验材料

2、仪器设备

表21仪器设备

3、试验方法

1）细胞转染

转染前一天,将4×10⁴个hela细胞铺到24孔板中,隔夜生长后按照表中所列体系分别配制转染复合物,滴于24孔板中，补加400μl完全培养基，置于37℃、5%CO₂的条件下培养。在转染48h后收集细胞。按照Promega公司的DLR^MAssay试剂盒说明书进行荧光素酶活性测定。

实验设置三个生物学重复，结果取平均值。

转染体系如下：

表22转染体系

荧光素酶活性检测结果如下表所示：

表23荧光素酶活性

将结果取平均值作图如图6所示。

可以看出，将猪肌抑素基因启动子报告载体pGL3-MSTN转染人宫颈癌Hela细胞，通过报告基因检测了猪肌抑素基因启动子在人源细胞的转录活性。结果显示，所克隆的启动子片段在人源细胞中具有很高的活性，证明所鉴定的猪肌抑素基因启动子在哺乳动物细胞中可有效表达。

Claims (10)

1.DNA分子，为如下1）-4）中任一所述的DNA分子：

1）序列表的序列2所示的DNA分子；

2）序列表的序列3所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）所述DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；

4）与1）或2）中所述DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。

2.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述4）所示的DNA分子为序列表中序列1所示的DNA分子。

3.含有权利要求1或2所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为如下1）或2）：

1）为将权利要求1或2中所述DNA分子插入pGL3-basic的多克隆位点得到的重组载体；

2）为将权利要求1或2中所述DNA分子插入pEGFP-C1的多克隆位点得到的重组载体。

5.扩增权利要求1或2所述DNA分子的引物对。

6.根据权利要求5所述的引物对，其特征在于：所述引物对为如下1）或2）：

1）所示的引物对中的一条引物的序列为序列5，另一条引物的序列为序列6；

2）所示的引物对中的一条引物的序列为序列7，另一条引物的序列为序列8。

7.权利要求1或2所述DNA分子在使目的基因在离体动物细胞中的表达中的应用。

8.根据权利要求7中所述的应用，其特征在于：所述动物细胞为鼠源细胞或人源细胞。

9.根据权利要求7或8中所述的应用，其特征在于：

所述鼠源细胞为小鼠成肌细胞；

所述人源细胞为人宫颈癌细胞。

10.根据权利要求7-9中任一所述的应用，其特征在于：

所述小鼠成肌细胞为C2C12细胞；

所述人宫颈癌细胞为Hela细胞。

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