CN102718809B - 山莓叶中一种二萜化合物、制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明所提供的一个新二萜化合物及其制备方法，该化合物的化学名称为：16α、17、18‑三羟基‑对映‑贝壳杉烷‑18‑O‑β‑D‑葡萄糖苷，其结构式为：

Description

山莓叶中一种二萜化合物、制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及山莓叶中一种二萜化合物、分离纯化制备方法及其在制备抗肿瘤药物方面的用途。

背景技术

山莓(Rubus corchorifolius L.f)属蔷薇科悬钩子属中一种落叶灌木。多生长于向阳山坡、溪边、山谷、荒地和灌丛中，海拔300m～1500m。除东北、内蒙古、青海、新疆、西藏外，全国均有分布。福建全省各地均有山莓分布，野生资源蕴藏量相当大。我国利用山莓的历史悠久，在古书《本草拾遗》、《本草纲目》、《名医别录》、《食疗本草》中就有山莓药用价值的详细记载，其药用已有上千年历史。山莓果、根及叶均可入药。

二萜化合物的抗肿瘤活性是十分显著的。L.Z.Li等(2010)从芫花中得到一个新的二萜化合物并研究得出其对人类早期的HL-60肿瘤细胞具有抑制作用，其IC50值为11.74μM。Li FS等(2010)从乳香中得到七个大环二萜类化合物，这七种化合物均对Bel-7402，Hela和SW-480肿瘤细胞有抑制作用。盘永才等(2006)从柳珊瑚中分离得到的三种二萜中，二萜T-7对肿瘤细胞KB，P388和L1210等显示出很强的抑制活性，ED50依次为2.80、0.31、0.22μg/mL；二萜T-8、T-9，也有很强的抗肿瘤活性；张敏等人(张敏，2007，药学学报；张敏，2011，HELVETICA CHIMICA ACTA)从山莓叶中分离得到了四个新的二萜化合物：3α,16α,17,19-对映-贝壳杉烷-四醇和2羰基-16α-羟基-对映-贝壳杉烷-17-β-D-葡糖苷。3β,1 6α,17,19-四羟基-対映贝壳杉-19-乙酸酯，3β,1 6α,17,19-四羟基-対映贝壳杉-19-乙酸酯-17-氧-β-D-葡萄糖苷。陈雪香等人(陈雪香，2010，HELVETICA CHIMICA ACTA)从山莓叶中分离鉴定出三个新化合物化合物：分别为9β,16α,17三羟基-对映贝壳杉-2酮(9β,16α,17-trihydroxy-ent-kaur-2-one)，16α,17，19三羟基-对映贝壳杉-2酮(16α,17,19-trihydroxyl-ent-kaur-2-one)，2β，3α，16α，17-四羟基-对映-贝壳杉醇(2β，3α，16α，17-tetrahydroxyl-ent-kauranol)，且均具有抗肿瘤的作用。

发明内容

本发明的目的是提供从山莓中分离出的一个二萜化合物，MTT肿瘤活性实验证明该化合物具有抗肿瘤作用。

本发明所提供的一个新二萜化合物是从山莓中经过反复硅胶柱层析、薄层层析和结晶的方法所得，化学名称分别为：16α、17、18-三羟基-对映-贝壳杉烷-18-O-β-D-葡萄糖苷。其结构式如下：

上述化合物由包括以下步骤的制备方法所得：

(1)称取粉碎的山莓叶，加入体积分数浓度60-80％的乙醇水溶液，料液重量体积比为1g：10ml，搅匀，先超声提取30min，然后于室温下浸提48h，过滤，滤渣再重复提取一次，合并滤液，浓缩冷冻干备用；

(2)将浸膏液用依次用石油醚，氯仿、乙酸乙酯、正丁醇反复多次萃取，将萃取液分别浓缩，冷冻干燥，分别得石油醚，氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物；

(3)将乙酸乙酯萃取物进行中压硅胶柱色谱分离，用石油醚和乙酸乙酯进行洗脱，再用乙酸乙酯与甲醇进行梯度洗脱，洗脱的流速为15mL/min，同时每管收集的流份量为20mL，收集洗脱液。

(4)将洗脱液进行压硅胶柱层析分离纯化，用氯仿与甲醇进行梯度洗脱，收集的样品点板合并样品，将样品进行结晶，得化合物和母液。

步骤(3)中，用石油醚和乙酸乙酯进行洗脱时，首先用石油醚洗脱，然后用石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱，石油醚和乙酸乙酯的重量配比为20:80。

用乙酸乙酯与甲醇进行梯度洗脱时，乙酸乙酯与甲醇的重量配比分别为100:0，40:1，10:l，0:1。

步骤(4)中，用氯仿与甲醇进行梯度洗脱时，氯仿和甲醇的重量配比分别为25:1，15:1，10:1，5:1。

实验证明，上述化合物对肝癌细胞具有直接的抑制作用，可以用于制备抗肿瘤药物。

附图说明

图1为二萜化合物对HepG2肝癌细胞生长的抑制作用对比试验结果图。

具体实施方式

从山莓中分离出的一种新化合物，化学名称分别为：16α、17、18-三羟基-对映-贝壳杉烷-18-O-β-D-葡萄糖苷，结构式为：

该化合物由以下方法分离所得：

(1)山莓叶乙醇粗提物的制备：称取粉碎的山莓叶3000.0g，加入10倍体积60-80％的乙醇，搅匀，先超声提取20-30min，然后于室温下浸提48h，过滤，滤渣再重复提取一次，合并滤液，浓缩冷冻干备用。

(2)山莓活性成分液液萃取分离纯化：将浸膏液用依次用石油醚，氯仿、乙酸乙酯、正丁醇反复多次萃取，将萃取液分别浓缩，冷冻干燥。分别得石油醚，氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物。

(3)乙酸乙酯萃取物柱层析的分离纯化：先用中压柱层析分离，洗脱剂选用石油醚与乙酸乙酯(石油醚：乙酸乙酯＝100:0-0:80)，乙酸乙酯与甲醇(乙酸乙酯:甲醇＝100:0-0:1)进行梯度洗脱，洗脱的流速为10-15mL/min，每管收集的流份量为20mL。经TLC检测，采用硫酸香草醛显色，合并相同组份，分别得Fr.A，Fr.B，Fr.C，Fr.D,Fr.E,Fr.F,Fr.G,Fr.H,Fr.I,Fr.J,Fr.K,Fr.LFr.M共13个组分。

(4)组份Fr.J进行低压硅胶柱层析分离纯化，用氯仿与甲醇进行梯度洗脱(氯仿：甲醇＝25:1-5:1)，每20ml收集一瓶，收集的样品点板合并样品，分别为Fr.1,Fr.2,Fr.3,Fr.4,Fr.5,Fr.6,Fr.7,Fr.8,Fr.9,Fr.10,Fr.11Fr.12,Fr.13,Fr.14,Fr.15,Fr.16,Fr.17,Fr.18共18个组份。再选择Fr.13进行结晶，得化合物和母液。

本发明二萜化合物结构测定：

1、化合物的理化与光谱数据：

1.1理化数据

白色针状晶体，M.p.209～210℃，旋光度：-0.050(温度：23.9℃，波长：589.3nm下测得)。用二氯甲烷:甲醇＝20:1，石油醚:乙酸乙酷＝3:5，环己烷：丙酮＝3：1不同溶剂系统上行展开，1％香草醛硫酸溶液显为单一紫色斑点。在二氯甲烷:甲醇＝20:1系统中Rf＝0.50，石油醚:乙酸乙酷＝3:5系统中Rf＝0.49，环己烷：丙酮＝3：1系统中Rf＝0.1。

1.2光谱数据

(1)¹H-NMR(氘代甲醇，600MHz)

4.18(1H，d，J＝7.8Hz)，4.07(1H，d，J＝9.6Hz)，3.86(1H，dd，J＝2.4,11.4Hz)，3.69(2H，m)，3.58(1H，d，J＝11.4Hz)，3.34(1H，m)，3.32(1H，m)，3.27(1H，m)，3.25(1H，m)，3.17(1H，t，J＝8Hz)，2.01(1H，br.s)，1.92(1H，d，J＝11.4Hz)，1.88(1H，m)，1.83(1H，m),1.3-1.7(13H，m),1.065(3H，s),1.02(1H，m)，1.001(3H，s),0.92(2H，m)，0.79(1H，m)。

(2)¹³C-NMR(氘代甲醇，DEPT)

18.9q，19.3t，19.4t，21.8t，27.2t，28.4q，37.4t，38.1t，39.1s，40.5s，41.7t，43.7t，45.8s，46.4d，53.9t，58.3d，58.5d，62.7t，66.9t，71.7d，73.9t，75.2d，77.7d，78.2d，82.9s，105.1d。

2.2.2.3APCI-MS：483.7(M-H)466.7，448.7，304.7，286.8。

2、解析过程

APCI-MS给出准分子离子峰483.7(M-H)，说明该化合物分子量为484。¹³C-NMR结合DEPT共给出26个碳信号，其中甲基2个、亚甲基12个、次甲基8个、季碳4个，因此连碳质子数为38个。根据化学位移，得知分子中含有一分子六碳糖(62.7t，71.7d，75.2d，77.7d，78.2d，105.1d)，且与已知糖化学位移比较，推出该糖为β-D葡萄糖，¹H-NMR中δ4.18(1H，d，J＝7.8Hz)予以佐证。扣除糖部分，苷元含20个碳原子，其中有3个连氧饱和碳原子(66.9t，73.9t，82.9s)，至此可以推出分子式为C₂₆H₄₄O₈，Ω＝5，为一四环二萜苷元。仔细分析比较化合物一与从该植物中发现的多个‘对映-贝壳杉烷型二萜’碳化学位移数据，二者化学位移分布规律基本一致，如从该植物中已经发现报道的(3α,16α)-3,16,17,18-tetrahydroxy-ent-kaurane，化学结构如下：

综合上述分析，该化合物同样为‘对映-贝壳杉烷型二萜’的β-D葡萄糖苷。

对于苷元羟基取代位置及糖成苷位置分析HSQC、HMBC图谱，有以下数据予以支撑：与碳δ66.9t直接相连的氢δ3.58(1H，d，J＝11.4Hz)HMBC中可见其与碳δ82.9s、46.4d远程相关，证明苷元16、17位含有羟基。与碳δ73.9t直接相连的氢δ4.07(1H，d，J＝9.6Hz)HMBC中可见其与碳δ28.4q、38.1t、39.1s、58.3d和105.1d远程相关；同时与碳δ28.4q直接相连的氢δ1.00(3H，s)HMBC中可见其与碳δ38.1t、39.1s、58.3d和73.9t远程相关，证明苷元18、19位分别为羟基和甲基，且羟基与葡萄糖脱水形成苷键。另外分析该化合物NOE谱，可见与碳δ18.9q直接相连的氢δ1.06(3H，s)与氢δ4.07(1H，d，J＝9.6Hz)有明显相关，说明该羟基应处于18位，与苷元20甲基处于同一侧、空间距离较近。

综上推理，化合物1命名为：16α、17、18-三羟基-对映-贝壳杉烷-18-O-β-D-葡萄糖苷，(16α)-16,17,18-trihydroxy-ent-kauran-18-O-β-D-glucoside。化学结构如下：

本发明中新二萜化合物抗肿瘤活性的测定：

1、实验材料

(1)药品：上述分离的化合物A、B、C。

(2)细胞：人肝癌细胞株HepG₂由广州泰禾生物医药公司提供。

(3)试剂：PRMI1640,胎牛血清，96孔板，胰酶，DMSO,MTT，5-FU,青霉素，链霉素。

2、方法

将肝癌HepG₂细胞培养于含10％胎牛血清、1x10⁵U/L青霉素、链霉素的RPMI1640培养液中，37℃，5％CO₂培养箱内常规传代培养。细胞以1x10⁴个/孔的浓度接种于96孔培养板，于含10％的胎牛血清的RPMI—1640培养液中培养24h，细胞贴壁后，实验组给药量为100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL，阴性对照组加等量RPMI(DMSO含量为1％),阳性对照组加入5-Fu的浓度为100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、1600μg/mL。空白对照组只加等量RPMI。药物作用24h后，于每孔中加入配制的5％MTT 20μL继续培养4h，弃上清，加入150μL DMSO，在混合振荡仪上振药约10min，使结晶物充分溶解后，于酶联检测仪上492nm波长测定各孔吸光值。

计算细胞毒性值(CT％)，CT％＝(1一OD处理/OD对照)×100％。

3、化合物1对人肝癌HepG2细胞体外增殖活性的影响

上述新二萜化合物对HepG2肝癌细胞生长的抑制作用对比试验结果见图1。

结果表明，所得的新二萜化合物16α、17、18-三羟基-对映-贝壳杉烷-18-O-β-D-葡萄糖苷在受试五个浓度(200、150、100、50、25μg/mL)下对HepG2肝癌细胞具有直接的抑制作用，其抑制作用与活性组分浓度呈正相关，抑制率分别为45.09％、36.45％、29.31％、19.18％、9.70％；而阳性对照药5-FU在此浓度下的抑制率分别为：69.98％、63.22％、59.55％、47.91％、35.89％。空白对照的1％的DMSO对HepG2肝癌细胞无直接的抑制作用。说明新二萜化合物对HepG2肝癌细胞有一定的抑制作用，但其抑制率比5-FU低。

Claims (4)

1.一种山莓叶中一种二萜化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)称取粉碎的山莓叶，加入体积分数浓度60-80％的乙醇水溶液，料液重量体积比为1g：10ml，搅匀，先超声提取30min，然后于室温下浸提48h，过滤，滤渣再重复提取一次，合并滤液，浓缩冷冻干备用；

(2)将浸膏液用依次用石油醚，氯仿、乙酸乙酯、正丁醇反复多次萃取，将萃取液分别浓缩，冷冻干燥，分别得石油醚，氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物；

(3)将乙酸乙酯萃取物进行中压硅胶柱色谱分离，用石油醚和乙酸乙酯进行洗脱，再用乙酸乙酯与甲醇进行梯度洗脱，洗脱的流速为15mL/min，同时每管收集的流份量为20mL，收集洗脱液；

(4)将洗脱液进行低压硅胶柱层析分离纯化，用氯仿与甲醇进行梯度洗脱，收集的样品点板合并样品，将样品进行结晶，得化合物和母液，

上述方法所得化合物的结构式为：

。

2.根据权利要求1所述的山莓叶中一种二萜化合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，用石油醚和乙酸乙酯进行洗脱时，首先用石油醚洗脱，然后用石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱，石油醚和乙酸乙酯的重量配比为20:80。

3.根据权利要求1所述的山莓叶中一种二萜化合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，用乙酸乙酯与甲醇进行梯度洗脱时，乙酸乙酯与甲醇的重量配比分别为100:0，40:1，10:l，0:1。

4.根据权利要求1所述的山莓叶中一种二萜化合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，用氯仿与甲醇进行梯度洗脱时，氯仿和甲醇的重量配比分别为25:1，15:1，10:1，5:1。