CN102703479A - 6-ggpp合酶、8-倍半萜合酶、截短侧耳素高产菌株及菌株的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了6-GGPP合酶、8-倍半萜合酶、截短侧耳素高产菌株及菌株的应用，本发明通过筛选和诱变得到了2株截短侧耳素高产菌株，并提供了对截短侧耳素产量有重大影响的GGPP合成酶和倍半萜合成酶的基因序列，明确了菌种产截短侧耳素升高的原因，为进一步提高截短侧耳素的产量提供了新途径。这两种菌株生产截短侧耳素的能力均比现有技术中公开的菌种强，且通过对发酵条件的进一步选择和优化，使截短侧耳素的产量明显增加，符合工业化大生产的需要，降低成本。
Description
技术领域
本发明涉及截短侧耳素合成酶基因、生产截短侧耳素的菌株及其应用，具体涉及GGPP合成酶、倍半萜合成酶、截短侧耳素的高产菌株、截短侧耳素合成途径及应用，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
截短侧耳素是化学合成泰妙菌素（Tiamulin）的前体，分子式为C22H34O5，分子量为378.51，属二萜类化合物是高等真菌担子菌侧耳属Pleurotus mutilus或其它真菌的次级代谢产物，是一种天然的具有广泛抗菌活性的二萜类化合物。截短侧耳素的抗菌机理为抑制感受性细菌蛋白质的合成，即它作用于细菌体内的核糖体，主要表现为抑菌，高浓度时表现杀菌作用。截短侧耳素作为一种常用的兽用抗生素以及半合成前体物质，使用范围相当广泛。从最初的兽用抗生素，到现在结构改造成为人用抗生素，截短侧耳素类抗生素已经逐渐开始受到大量的重视。
然而从截短侧耳素发现到现在，关于截断侧耳素发酵条件的研究相对较少，而文献报道的产物产量仅为2.2mg / ml 左右，产量偏低，不适宜工业化生产。从工业化来看，虽然我国截短侧耳素的产能大，但菌株的效价水平较低，增加了生产的成本。因此迫切需要选育高产截短侧耳素的菌株，优化其发酵条件，以获得大量的截短侧耳素，适于工业化应用。
发明内容
本发明提供了两种对截短侧耳素的形成具有重要影响的6-GGPP合酶（即GGPP合酶、6-GGPP合酶、GGPP合成酶，下同）和8-倍半萜合酶（即倍半萜合成酶、倍半萜合酶、8-倍半萜合成酶，下同），具有这两种酶的菌种产截短侧耳素的效价水平较高。
本发明还提供了两种新的截短侧耳素高产菌株，这两种菌株生产发酵截短侧耳素的效价水平都较高，为截短侧耳素的生产提供了更好的选择。
本发明还提供了该两种高产菌株的应用——即用它们发酵生产截短侧耳素，该菌株效价高、降低了成本，适于工业化大生产。
本发明是通过以下措施实现的：
本发明通过筛选和诱变得到了两种截短侧耳素的高产菌株——斜盖伞属菌株。其中，一种为斜盖伞（Clitopilus prunulus）TM110518，其保藏编号为CGMCC NO.6093，保藏时间为2012年5月8日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。该TM110518菌株是从土壤中通过富集和划线分离的方法分离得到的，将所得菌种进行菌种鉴定，方法如下：
形态学特征：
固体培养特征：观察菌种在PDA平板上的生长情况及菌落形态。菌丝在PDA中培养3天后以菌种为圆心向四周延伸，菌丝呈白色，生长浓密。
细胞形态特征：菌丝纤细，宽度均在2.5-3 mm，有横隔，未发现锁状联合．菌丝培养至1个月未观察到孢子的形成．最长观察至3个月，观察不到子实体的形成。
液体培养特征：在无菌条件下，用接种环挑取一个菌落于液体培养基中，28℃，210rpm摇床培养，该菌在培养基中生长缓慢而均匀，培养基变得更加粘稠，达到最大浑浊度后，菌体会部分沉淀，菌体呈乳白色。
分子鉴定：
菌种送至北京微生物研究所鉴定其rDNA及rRNA，利用近似物种的rDNA序列设计引物并进行PCR扩增，测序结果在Genbank中进行比对．证实该新菌株是——斜盖伞（Clitopilus prunulus）。
TM110518菌种的ITS及28SrDNA（D1/D2）序列如下：
ITS序列
CCCGTAAACAGTAAGGACGTGAAGATCGGATCATTATTGATAACTTGGTCAAGCTGTTGC 60
TGGTCCTTCGGGGCATGTGCACGCTTGCCACCAAATTTAACCACCTGTGCACCTTTTGTA 120
GACTAGAAACGTTTCTCGAGGCAACTCGGATTGAGAATTGCTGCGCGAAAGCCAGCTGTT 180
CTTGTGTTTCTCAGTCTATGTTTTTACATACCCCGAATGAATGTATTAGAATGTATTGCT 240
GGGCCTTTGTGCCTTTAAATCAAATACAACTTTCAACAACGTGAATCATCGAATCTTTGA 300
ACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTCT 360
CAACTATACAAGTTTTTATTAACCTGTATGGCTTGGATCATGGGGTTTGCGGGCTTCCTG 420
AGTCGGCTATCCTTAAATGCATTAGCAGAGCTTTTGCCGCTAATCTATGGTGTGATAATT 480
ATCTACGCCATTGAGAAGTGACATGTTGAGGCTTCGCTTCTAATCGTCTTCACAGACAAC 540
ATTTGACAATCTGACCTCAAATCAGGTAGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAG 600
GCGGAGG 607
D1/D2序列
AGAAAATCAAAGGTATTCTACCTGATTTGAGGTCAGATTGTCAAATGTTGTCTGTGAAGA 60
CGATTAGAAGCGAAGCCTCAACATGTCACTTCTCAATGGCGTAGATAATTATCACACCAT 120
AGATTAGCGGCAAAAGCTCTGCTAATGCATTTAAGGATAGCCGACTCAGGAAGCCCGCAA 180
ACCCCATGATCCAAGCCATACAGGTTAATAAAAACTTGTATAGTTGAGAATTTAATGACA 240
CTCAAACAGGCATGCTCCTCGGAATACCAAGGAGCGCATTCATCGATGCGAGAGCCAAGA 300
GATCCGTTGTTGAAAGTTGTATTTGATTTAAAGGCACAAAGGCCCAGCAATACATTCTAA 360
TACATTCATTCGGGGTATGTAAAAACATAGACTGAGAAACACAAGAACAGCTGGCTTTCG 420
CGCAGCAATTCTCAATCCGAGTTGCCTCGAGAAACGTTTCTAGTCTACAAAAGGTGCACA 480
GGTGGTTAAATTTGGTGGCAAGCGTGCACATGCCCCCAAGGACCAGCAACAGCTTGACCA 540
AGTTTATTCAATAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGATTTTTA 600
ACTTCCAA 608
将菌种TM110518进行培养，测定其产截短侧耳素的效价：
1、所用培养基：
PDA培养基 (g/L)：土豆200，葡萄糖20，琼脂20，水余量，pH 6.5。
种子培养基(g/L)：葡萄糖50，酵母提取物15，MgSO4 0.5，Ca(NO3)2 0.05，KH2PO4 1，水余量，pH 6.5。
发酵基本培养基(g/L)：葡萄糖50，玉米浆粉20，MgSO4 0.4，CaCO3 1，豆油4，水余量，pH 6.5。
2、培养条件：
将菌株接种于PDA斜面活化，25℃培养7d，将活化的TM110518菌种接种到种子培养基中，25℃、200 r/min条件下振摇培养7d，得一级种子液，将一级种子液以10％的接种量转入种子培养基中，按相同条件培养3 d，得二级种子液，将二级种子液按10％的接种量转入发酵培养基中，25℃、200 r/min条件下振摇培养9 d，得发酵液，取发酵菌液10mL，加入10 mL甲醇混匀，25℃振荡提取24 h，4℃离心，上清液供HPLC 检测。
3、产物检测
检测仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪．固定相ODS C18反相柱(5ktm，4.6 lnrnX250 lnrn)，流动相为磷酸：甲醇=45：55，检测波长205 nm，流速：1 mL／min，进样量20 L(发酵产物在此条件下保留时间：17．314)．根据截短侧耳素标准曲线(Y=4.310856e-007X，R =0.9994)计算发酵液中产物含量为13mg/ml。
从初步检测可以看出，本发明筛选菌种产截短侧耳素的效价比现有技术中报道的要高的多，适于工业化大生产。
进一步的，发明人采用亚硝基胍和紫外线对菌种斜盖伞（Clitopilus prunulus）TM110518进行复合诱变获得菌种斜盖伞（Clitopilus prunulus）TM110519。该斜盖伞（Clitopilus prunulus）TM110519菌种也进行了保藏，保藏号为CGMCC NO.6094，保藏日期为2012年5月8日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。
采用上述评价菌种TM110518的方法对菌种TM110519的产截短侧耳素能力进行检测，HPLC检测发酵液中产物含量为17mg/ml。从此可以看出，诱变后的新菌种TM110519的产截短侧耳素的能力更高，截短侧耳素产量提高20%以上，更加适合工业化大生产。
菌种发酵产截短侧耳素与其内部的代谢途径有很重要的联系，发明人经分析，得斜盖伞（Clitopilus prunulus）属菌株的代谢途径如图1所示。从代谢途径中可以看出，6-GGPP合酶和8-倍半萜合酶是截短侧耳素产生的关键酶，他们的变化对截短侧耳素的产量有很重要的影响。发明人对这两种酶的基因进行了提取、分析，进一步的研究确定其对截短侧耳素的影响。
基因提取方法为：
按下列顺序在1.5ml离心管中加入下列反应物(体积为12.5ul)：
DEPC水 （8-x）μl
RNA酶抑制剂 (50U/ul，Invitrogen) 0.5μl
随机引物(50pM/ul，Invitrogen Co.) 2μl
RNA xμl（2ug）
注: 总RNA体积与DEPC水的总体积是8μl，其中RNA的量是2μg；
在65℃水浴处理5min；
室温放置10min，高速(高于5000g)离心5秒；
按下列顺序加在1.5ml离心管加入下列反应物(加入之后总体积为20ul)：
RNA酶抑制剂(50U/ul) 0.5μl
5×buffer(invitrogen) 4μl
dNTP MIX(10mM/each，宝生物工程（大连）有限公司) 2μl
DTT（二硫苏糖醇） 2μl
AMV(逆转录酶，200U/ul) 1μl
水浴40℃下反应1小时；
90℃处理5-10min；
冰浴5min；
高速(高于5000g)离心5秒。
序列与引物设计：序列参照Gene Bank 数据库中各目的基因的序列，引物由ABI公司的Primer Express Software v2.0设计，由invitrigen公司合成。
PCR反应体系（50μl）：
PCR扩增结束后，用BIORAD电泳仪进行琼脂糖凝胶电泳，TBE作为缓冲液，凝胶浓度为1.2%。在紫外灯下，用手术刀片将DNA片段切下，并尽量切碎，然后转入1.5mL离心管中；用QIAGEN胶回收试剂盒回收PCR产物。得到的DNA可以拿来与T载体连接，或放在－20℃保存。
目的基因与质粒T载体的连接一般采用下面的体系：
连接产物转化大肠杆菌
在1.5mL离心管内加入待转化的连接产物、大肠杆菌感受态细胞50μL，轻柔混匀，冰浴30min。42℃热激恰好90s，冰上冷却2~3min。加入700μL LB，于37℃，200rpm，恢复培养80min。离心弃去550μL培养基，混匀剩余的菌体和培养基均匀涂布在LB+Amp抗性平板上，37℃倒置培养14~16h。
从平板上分别挑取单菌落，用5mL Amp＋LB培养过夜；取20ul菌液后离心，弃上清；用余下的菌体作为模板进行PCR鉴定，阳性菌株在华大公司进行测序。
结果：测序结果显示，TM110518菌株的GGPP合成酶的基因序列如SEQ IDNO：1所示，倍半萜合成酶的基因序列如SEQ IDNO：3所示；TM110519菌株的GGPP合成酶的基因序列如SEQ IDNO：2所示，倍半萜合成酶的基因序列如SEQ IDNO：4所示。从测序结果的比对中可以发现有GGPP合成酶和倍半萜合成酶的基因在菌种TM110518和TM110519中有不同，明显看出TM110519菌株有基因突变。这些突变很可能就是导致二萜产物升高的原因。因此在以后的研究中，可以通过控制酶的基因加强菌种的发酵产率，也可以将基因导入宿主细胞用于产截短侧耳素。
6-GGPP合酶和8-倍半萜合酶的突变位点如下：
1、6-GGPP合酶（geranylgeranyl diphosphate synthase, type III）
175：T——A
576：T——G
830: T——C
908：T——C
950：T——C
2、8-倍半萜合酶（(2E,6E)-farnesyl diphosphate diphosphate-lyase）
43： G——A
294：C——T
586：C——T
为了使菌种适合工业化应用，发明人进一步的对菌种的发酵条件进行了进一步的选择和优化，得出以下工艺：
一种截短侧耳素的发酵生产方法，其特征是：以斜盖伞（Clitopilus prunulus）TM110518 CGMCC No.6093或斜盖伞（Clitopilus prunulus）TM110519 CGMCC No. 6094为菌种，经过发酵得截短侧耳素。
上述方法中，发酵培养的步骤为：将菌种以1%-15%的接种量接入发酵培养基中，在温度20-35℃、溶氧5%-100%、pH1-10的条件下，发酵3-20天。
在发酵培养时，所用的发酵培养基是：葡萄糖45-55g/L，玉米浆粉15-25 g/L，MgSO4 0.2-0.6 g/L，CaCO3 0.5-2 g/L，豆油3-5 g/L。
进一步的，发酵培养时保持发酵罐中湿度为30%-60%、转速为100-1000rpm发酵效果会更好。
上述方法中，为了保证菌种的数量满足发酵罐中的接种量，要将菌种进行斜面活化及种子培养，所用的斜面培养基为：土豆180-250 g/L，葡萄糖15-25g/L，琼脂15-25g/L，pH1-10；所用的种子培养基为：葡萄糖45-55 g/L，酵母提取物10-20 g/L，MgSO4 0.3-1.0 g/L，Ca(NO3)20.03-0.1 g/L，KH2PO4 0.5-2 g/L，pH1-10。
菌种斜面活化、种子培养的过程为：将菌种接种到斜面培养基上，在20-35℃培养5-10天，对菌种进行活化；将活化的菌种接种到种子培养基中，20-35℃、100-500 r/min下进行一级种子培养，振摇培养5-10天，得一级种子液，然后以5-15%的接种量将一级种子液在相同的种子培养基、相同条件下进行二级种子培养，培养3-5天，得二级种子液。
将所得的二级种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，所得的发酵液经甲醇浸提、分离得浸提液，浸提液经浓缩、结晶得截短侧耳素。
本发明通过筛选和诱变得到了2株截短侧耳素高产菌株，并提供了对截短侧耳素产量有重大影响的GGPP合成酶和倍半萜合成酶的基因序列，明确了菌种产截短侧耳素升高的原因，为进一步提高截短侧耳素的产量提供了新途径。这两种菌株生产截短侧耳素的能力均比现有技术中公开的菌种强，且通过对发酵条件的进一步选择和优化，使截短侧耳素的产量明显增加，符合工业化大生产的需要，降低成本。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述，应该明白的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限制。
本发明公开的6-GGPP合酶和8-倍半萜合酶在知道其碱基序列的基础上，除了上述发明内容中记载的方法提取并获得碱基序列外，完全可以采用现有技术中公开的技术人工合成6-GGPP合酶和8-倍半萜合酶，此技术已经非常成熟，在此不再赘述，下面重点列举菌种发酵的优选实施例。
实施例1
利用菌种斜盖伞（Clitopilus prunulus）TM110519 CGMCC NO. 6094生产截短侧耳素，工艺如下：
1、所用培养基
斜面培养基(g/L)：土豆200，葡萄糖20，琼脂20，水余量，pH1.0。
种子培养基(g/L)：葡萄糖50，酵母提取物15，MgSO4 0.5，Ca(NO3)20.05，KH2PO4 1，水余量，pH 1.0。
发酵基本培养基(g/L)：葡萄糖50，玉米浆粉20，MgSO4 0.4，CaCO3 1，豆油4，水余量，pH1.0。
2、方法
将菌种接种到斜面培养基上，在20℃培养10天，对菌种进行活化；将活化的菌种接种到种子培养基中，20℃、500 r/min下进行一级种子培养，振摇培养10天，然后以15%的接种量将一级种子液在相同的种子培养基、相同条件下进行二级种子培养，培养5天，得二级种子液。按5％接种量转入发酵培养基中，在20℃、1000 r/min、湿度30%、pH4、溶氧为5%的条件下振摇培养20d，得发酵液；将发酵液用甲醇浸提、离心分离得浸提液，浸提液经浓缩、结晶得截短侧耳素。发酵液通过HPLC方法进行检测，检测结果显示发酵液中截短侧耳素的生物效价为16mg/ml。
实施例2
以斜盖伞（Clitopilus prunulus）TM110518 CGMCC No. 6093为菌种，采用实施例1的培养基和方法发酵生产截短侧耳素。发酵液通过HPLC方法进行检测，检测结果显示发酵液中截短侧耳素的生物效价为11mg/ml。
实施例3
利用菌种斜盖伞（Clitopilus prunulus）TM110519 CGMCC NO. 6094生产截短侧耳素，工艺如下：
1、所用培养基
斜面培养基(g/L)：土豆180，葡萄糖25，琼脂15，水余量，pH7.0。
种子培养基(g/L)：葡萄糖45，酵母提取物20，MgSO4 0.3，Ca(NO3)2 0.1，KH2PO4 0.5，水余量，pH 5.0。
发酵基本培养基(g/L)：葡萄糖45，玉米浆粉25，MgSO4 0.2，CaCO3 2，豆油3，水余量，pH1.0。
2、方法
将菌种接种到斜面培养基上，在35℃培养5天，对菌种进行活化；将活化的菌种接种到种子培养基中，35℃、100 r/min下进行一级种子培养，振摇培养5天，然后以5%的接种量将一级种子液在相同的种子培养基、相同条件下进行二级种子培养，培养3天，得二级种子液。按1％接种量转入发酵培养基中，在35℃、500 r/min、湿度60%、pH1.0、溶氧为100%的条件下振摇培养10d，得发酵液；将发酵液用甲醇浸提、离心分离得浸提液，浸提液经浓缩、结晶得截短侧耳素。发酵液通过HPLC方法进行检测，检测结果显示发酵液中截短侧耳素的生物效价为10mg/ml。
实施例4
以斜盖伞（Clitopilus prunulus）TM110518 CGMCC No. 6093为菌种，采用实施例3的培养基和方法发酵生产截短侧耳素。发酵液通过HPLC方法进行检测，检测结果显示发酵液中截短侧耳素的生物效价为6mg/ml。
实施例5
利用菌种斜盖伞（Clitopilus prunulus）TM110519 CGMCC NO. 6094生产截短侧耳素，工艺如下：
1、所用培养基
斜面培养基(g/L)：土豆250，葡萄糖15，琼脂25，水余量，pH10.0。
种子培养基(g/L)：葡萄糖55，酵母提取物10，MgSO4 1.0，Ca(NO3)2 0.03，KH2PO4 2，水余量，pH 10.0。
发酵基本培养基(g/L)：葡萄糖55，玉米浆粉15，MgSO4 0.6，CaCO30.5，豆油5，水余量，pH10.0。
2、方法
将菌种接种到斜面培养基上，在25℃培养7天，对菌种进行活化；将活化的菌种接种到种子培养基中，25℃、700r/min下进行一级种子培养，振摇培养7天，然后以10%的接种量将一级种子液在相同的种子培养基、相同条件下进行二级种子培养，培养5天，得二级种子液。按15％接种量转入发酵培养基中，在25℃、100 r/min、湿度50%、pH10.0、溶氧为50%的条件下振摇培养7d，得发酵液；将发酵液用甲醇浸提、离心分离得浸提液，浸提液经浓缩、结晶得截短侧耳素。发酵液通过HPLC方法进行检测，检测结果显示发酵液中截短侧耳素的生物效价为9mg/ml。
实施例6
以斜盖伞（Clitopilus prunulus）TM110518 CGMCC No. 6093为菌种，采用实施例5的培养基和方法发酵生产截短侧耳素。发酵液通过HPLC方法进行检测，检测结果显示发酵液中截短侧耳素的生物效价为6mg/ml。
实施例7
利用菌种斜盖伞（Clitopilus prunulus）TM110519 CGMCC NO. 6094生产截短侧耳素，工艺如下：
1、所用培养基
斜面培养基(g/L)：土豆200，葡萄糖20，琼脂20，水余量，pH4.0。
种子培养基(g/L)：葡萄糖50，酵母提取物15，MgSO4 0.5，Ca(NO3)2 0.05，KH2PO4 1，水余量，pH 8.0。
发酵基本培养基(g/L)：葡萄糖50，玉米浆粉20，MgSO4 0.4，CaCO3 1，豆油4，水余量，pH7.0。
2、方法
将菌种接种到斜面培养基上，在25℃培养7天，对菌种进行活化；将活化的菌种接种到种子培养基中，25℃、300 r/min下进行一级种子培养，振摇培养5天，然后以10%的接种量将一级种子液在相同的种子培养基、相同条件下进行二级种子培养，培养3天，得二级种子液。按12％接种量转入发酵培养基中，在30℃、600 r/min、湿度40%、pH7.0、溶氧为90%的条件下振摇培养3d，得发酵液；将发酵液用甲醇浸提、离心分离得浸提液，浸提液经浓缩、结晶得截短侧耳素。发酵液通过HPLC方法进行检测，检测结果显示发酵液中截短侧耳素的生物效价为17mg/ml。
实施例8
以斜盖伞（Clitopilus prunulus）TM110518 CGMCC No.6093为菌种，采用实施例7的培养基和方法发酵生产截短侧耳素。发酵液通过HPLC方法进行检测，检测结果显示发酵液中截短侧耳素的生物效价为14mg/ml。
<110>山东胜利股份有限公司
<120> 6-GGPP合酶、8-倍半萜合酶、截短侧耳素高产菌株及菌株的应用
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<212>DNA
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GCTGATTATTCTACTCGCCACAGGTCTGCACTGGGGCTCCTGTCGAGATGATCACGCCTG 300
GCGGCGAGGTTCACTTCGTAGGATCGATGGTCCGTGAAAGCGTACGACTATCGAAACAGA 360
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ATGGCCAAATCCAAGCCAAATACCTCTGCAGTTCCAGCAGATGGCCATCCATCAGACGTA 60
CATGACAATCCAAACCCCATCATAACCCATCAAAATTGCCAGAAAAAAGTCGAAATTCAG 120
TTCACCATGTGCAACCCTCCATTTTACACCAGCGCCGAGGACGTCACAAATAGCTATAAT 180
GCCAAGGAGGAAGGGGCTTTCGGGGTAGGCCGCCTTGAACCACCTAATTGTGTATCGGGT 240
GCTGATTATTCTACTCGCCACAGGTCTGCACTGGGGCTCCTGTCGAGATGATCACGCCTG 300
GCGGCGAGGTTCACTTCGTAGGATCGATGGTCCGTGAAAGCGTACGACTATCGAAACAGA 360
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CAGGCGTTGGGCAGTGGGTTGGTCCCTGGACGATTATCGTCTACCTGACGTACGTTTACC 720
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CCTACCTCAAGCACCTTCATCATCCCCGCCCAAATCTTCGACCACCCTAGTCATTCGGGC 1020
TTCCACGGATACCTGGTCACGGAATGCGCGCCGCAAACGCGCCAGGGACAGCACCCTGCC 1080
AATTTCGTCCCATTCGGCACATATGGTACCAGATAAGGACACAGCCATGATATGTTCCAT 1140
AAGGGTGGAAGACATTGA 1158
<210>3
<211>753
<212>DNA
<213>斜盖伞（Clitopilus prunulus）TM110518 CGMCC NO.6093
<400>3
ATGAAAACCACCGGAATCCTCACGAGTTTGCTGTCGACTCCGATCGTCCGCACCCCCAGG 60
TCGCTCTCTGAGATCGCGATCCTTGTTGACCATCCATTGGCGCAGAAGGTCTGCGCACTC 120
CAGCCAACGATTCTGCCTGGCCAGCATTTCAGGAGTAACACCGTACTTGTCCGCACGGTC 180
GGCATGTGCACCGCGAAGTAAGAGAAGGTTGATTACTTCATAATTTCCGTTTGCCGCTGC 240
AAAATGTAATGGTGTGGAGCCCGAAGTACCAACAATGGGTGCTGAAGAGTCCCTATTCTT 300
GTCGTTGGAATAACGCCGCGGCAGCCTGTCCGGATACTATGAGTGACTCAGAAAGAGTGC 360
AAGTTCGTTCTACTCACCTTGGCGCATTCACATCCGCACCGTGATCAATCAACAATTTCA 420
CAACCTGCACGTTACCCCCAGCAGCAGCAGCGTGTAGAGGCAGAACGCCATCAAGTACGG 480
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CTGAACTCCGAAGGGGCACAGGCATTGATATGTAGTTTGCCCACTCAAGGTTGGGCTGTT 720
AAATTTTTGTCACCGATATCTGGTGCCGGTTGA 753
<210>4
<211>753
<212>DNA
<213>斜盖伞（Clitopilus prunulus）TM110519 CGMCC NO. 6094
<400>4
ATGAAAACCACCGGAATCCTCACGAGTTTGCTGTCGACTCCGGTCGTCCGCACCCCCAGG 60
TCGCTCTCTGAGATCGCGATCCTTGTTGACCATCCATTGGCGCAGAAGGTCTGCGCACTC 120
CAGCCAACGATTCTGCCTGGCCAGCATTTCAGGAGTAACACCGTACTTGTCCGCACGGTC 180
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CAACCTGCACGTTACCCCCAGCAGCAGCAGCGTGTAGAGGCAGAACGCCATCAAGTACGG 480
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<211>607
<212>DNA
<213>斜盖伞（Clitopilus prunulus）TM110518 CGMCC NO.6093
<400>5
CCCGTAAACAGTAAGGACGTGAAGATCGGATCATTATTGATAACTTGGTCAAGCTGTTGC 60
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<210>6
<211>608
<212>DNA
<213>斜盖伞（Clitopilus prunulus）TM110518 CGMCC NO.6093
<400>6
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ACTTCCAA 608
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成
<400>7
ATGGCCAACTACGACAACATCCTAG 25
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<400>8
TCACTTAGCTGCCTTGGCCAGCGA 24
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<400>9
ATGAAAACCACCGGAATCCTCAC 23
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<400>10
TCACTCAACCGGCACCAGATATC 23
Claims (10)
1.6-GGPP合酶，其特征是：其具有SEQ IDNO：1或SEQ IDNO：2所述的碱基序列。
2.8-倍半萜合酶，其特征是：其具有SEQ IDNO：3或SEQ IDNO：4所述的碱基序列。
3.截短侧耳素高产菌株，其特征是：所述菌株中含有表达6-GGPP合酶的SEQ ID NO：1所述的基因和表达8-倍半萜合酶的SEQ IDNO：3所述的基因；或者含有表达6-GGPP合酶的SEQ IDNO：2所述的基因和表达8-倍半萜合酶的SEQ IDNO：4所述的基因。
4.根据权利要求3所述的截短侧耳素高产菌株，其特征是：所述菌株为斜盖伞（Clitopilus prunulus）TM110518 CGMCC NO.6093或斜盖伞（Clitopilus prunulus）TM110519 CGMCC NO. 6094。
5.一种截短侧耳素的发酵生产方法，其特征是：以权利要求3或4所述的截短侧耳素高产菌株为菌种，经过发酵得截短侧耳素。
6.根据权利要求5所述的发酵生产方法，其特征是，发酵培养的步骤为：将菌种以1%-15%的接种量接入发酵培养基中，在温度20-35℃、pH1-10的条件下，发酵3-20天。
7.根据权利要求5所述的发酵生产方法，其特征是：发酵培养时，湿度为30-60%，溶氧为5-100%，转速为100-1000rpm。
8.根据权利要求5所述的发酵生产方法，其特征是：发酵培养基为：葡萄糖45-55g/L，玉米浆粉15-25 g/L，MgSO4 0.2-0.6 g/L，CaCO3 0.5-2 g/L，豆油3-5 g/L。
9.根据权利要求5所述的发酵生产方法，其特征是：在发酵培养前，先将菌种进行斜面活化和种子培养，过程为：
(1)将菌种接种到斜面培养基上，在20-35℃培养5-10天，对菌种进行活化；
(2)将活化的菌种接种到种子培养基中，20-35℃、100-500 r/min下进行一级种子培养，振摇培养5-10天，得一级种子液，然后以5-15%的接种量将一级种子液在相同的种子培养基、相同条件下进行二级种子培养，培养3-5天，得二级种子液。
10.根据权利要求9所述的发酵生产方法，其特征是：斜面培养基为：土豆180-250 g/L，葡萄糖15-25g/L，琼脂15-25g/L，pH1-10；种子培养基为：葡萄糖45-55 g/L，酵母提取物10-20 g/L，MgSO4 0.3-1.0 g/L，Ca(NO3)20.03-0.1 g/L，KH2PO4 0.5-2 g/L，pH1-10。
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| CN106868069A (zh) * | 2017-04-13 | 2017-06-20 | 常茂生物化学工程股份有限公司 | 一种提高截短侧耳素菌种发酵产量的方法 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102352317A (zh) * | 2011-10-13 | 2012-02-15 | 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 | 截短侧耳素产生菌的微量培养方法和其高产菌的高通量筛选方法 |
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