CN102703428A - 基于凝胶的多聚酶链式反应试剂保存方法及反应试剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于凝胶的多聚酶链反应试剂保存方法及反应试剂，是将一种或几种多聚酶链式反应液的组分包埋在凝胶内进行保存，其中凝胶的熔点低于用于多聚酶链反应扩增的聚合酶的灭活温度。另外本发明还包括可以常温保存和运输的反应试剂和试剂盒，采用本发明方法处理后的多聚酶链反应试剂，可常温贮存和运输，使用时无需特殊处理，直接使用即可。由于处理后的多聚酶链扩增反应试剂混合物呈固态状，可以很方便的进行航空运输，克服了此前反应试剂混合物呈液态较难利用航空方式进行长距离运输的难题。

Description

基于凝胶的多聚酶链式反应试剂保存方法及反应试剂

技术领域

本发明属于生化试剂组合物的保存方法技术领域，具体涉及一种基于凝胶的多聚酶链反应试剂保存方法及反应试剂。

背景技术

在过去的20年里，以多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）为代表的核酸扩增技术得到了迅猛的发展和应用。由于PCR技术方便快捷、可在短时间内大量扩增目标核酸片段，所以该技术在基因克隆与重组表达、生物物种鉴别与分类、物种起源与进化、流行病病原检测和法医鉴定等领域得到了广泛的应用。虽然PCR技术本身优势明显，但基于该技术的产品在大规模应用过程中却面临一些问题的困扰，其中最为突出的是产品需要低温冷冻保存和运输。作为核酸扩增技术的一种，PCR扩增需要由具有生物活性的酶的参与，而酶生物活性的长期保持需要低温冷冻条件，同时PCR反应所需的寡聚核苷酸引物、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）和反应缓冲液等均需在冷冻条件下贮存，并且反复冻融会使这些成份失效，所以基于PCR扩增技术的产品要求在低温冷冻条件进行运输和保存，这一方面增加了运输成本，另一方面也限制了这些产品在不具备低温保存条件的环境或地区的应用。

对于大规模生产、商品化的基于PCR扩增技术的产品，为了保证产品的一致性、稳定性和可靠性，也要求尽可能把各种反应试剂一次性添加和分装，并使产品在贮存和运输过程中具备尽可能长的保质期限。因此，发明一种能够方便有效保存PCR反应试剂混合物的方法具有重要的价值。发明专利“聚合酶链式反应混合物的保存方法（ZL 0011250.4）”公开了一种利用核酸真空浓缩仪在低温条件下干燥PCR反应试剂混合物来实现PCR反应试剂混合物长期保存的方法，但这种方法需要专门的核酸真空浓缩仪或真空冷冻干燥仪等复杂的设备，还需要消耗大量的能源，并不是一种十分经济的方法。发明专利“含高浓度甘油的PCR和RT-PCR全预混试剂（ZL 03117011.0）”公开了一种利用添加30-65%（v/v）甘油实现PCR试剂低温长期保存的方法，但该方法无法用于PCR试剂的常温长期保存。因此有必要提供一种能使PCR试剂在常温下长期保存的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于凝胶的多聚酶链反应试剂保存方法及反应试剂，以弥补现有技术的不足。

本发明的一个方面是提供一种在多聚酶链反应试剂中添加能形成凝胶的物质并形成凝胶从而使PCR反应试剂混合物在常温或室温长期保存的方法。

本发明的另一个方面是提供一种采用上述方法制作的PCR反应试剂，以及包含有该反应试剂的试剂盒。

本发明的基于凝胶的多聚酶链反应试剂保存方法，是将一种或几种多聚酶链反应液的组分包埋在凝胶内进行保存。

上述的凝胶，其熔点低于用于多聚酶链反应的聚合酶的灭活温度。

上述的凝胶，还包括有熔点高于用于多聚酶链反应的聚合酶的灭活温度的凝胶，这种高熔点的凝胶必须与熔点低于用于多聚酶链反应的聚合酶的灭活温度的凝胶同时添加，添加比例不高于熔点低于用于多聚酶链反应的聚合酶的灭活温度的凝胶质量的10%。

上述的多聚酶链反应液的组分为用于多聚酶链反应的聚合酶。

上述的多聚酶链反应液的组分还包括有引物、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）、多聚酶链反应聚合酶的反应缓冲液中的任一种或几种。

上述的用于多聚酶链反应的聚合酶为DNA聚合酶。

上述的DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。

本发明的保存方法，一种操作步骤如下：首先将可形成凝胶的物质添加到多聚酶链反应液的组分中，然后在低于多聚酶链反应的聚合酶的灭活温度下将凝胶熔解，最后冷却凝固凝胶进行保存。

本发明的保存方法，另一种操作步骤如下：首先将可形成凝胶的物质与水或含水的溶剂加热使之溶解配成浓缩的母液，然后将浓缩的母液加入到多聚酶链反应液的组分中，最后让温度下降使混合物由液态凝固为固态或半固态的凝胶进行保存。

上述的可形成凝胶的物质在多聚酶链反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为0.01%~30%。

上述的可形成凝胶的物质为能形成凝胶的多糖类物质和/或明胶类物质。

上述能形成凝胶的多糖类物质和/或明胶类物质为淀粉、糊精、凝结多糖（又称凝结胶、凝胶多糖、热凝胶、可得然胶、卡德兰）、结冷胶、黄原胶、槐豆胶、亚麻籽胶、魔芋胶、壳聚糖、琼脂、琼脂糖、低熔点琼脂糖、超低熔点琼脂糖、红藻胶、海藻酸（又称藻酸、褐藻酸、海藻素）、海藻酸盐（如海藻酸钠，又被称为海藻胶、褐藻胶或藻胶）、卡拉胶、果胶、低甲氧基果胶、明胶和阿拉伯胶中的任一种或几种。

上述的可以形成凝胶的物质为能形成凝胶的人工聚合物。

上述能形成凝胶的人工聚合物为甲基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺中的任一种或几种。

上述的凝结多糖在多聚酶链反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为0.2%~3%，优选为0.5%~2.5%。

上述的琼脂糖在多聚酶链反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为0.3%~3.5%，优选为0.5%~3%。

本发明还涉及一种可在常温下长期保存的多聚酶链反应试剂，该反应试剂是将除核酸模板外的一种或几种多聚酶链反应液的组分包埋在凝胶内制备的。

本发明还包括一种可以在常温保存和运输的多聚酶链反应试剂盒，该试剂盒包括有可在常温下长期保存的多聚酶链反应试剂，以及其它分子实验需要的组分。

采用本发明方法处理后的多聚酶链反应试剂，可常温贮存和运输，使用时无需特殊处理，直接使用即可。由于处理后的多聚酶链扩增反应试剂混合物呈固态状，可以很方便的进行航空运输，克服了此前反应试剂混合物呈液态较难利用航空方式进行长距离运输的难题。同时本发明的方法和试剂盒具有工艺简单、成本低廉的特点，采用本发明方法处理后的多聚酶链反应试剂混合物及试剂盒在便利的贮存条件下（常温或室温等温度条件）具有活性稳定持久的优点，这在大大降低多聚酶链反应试剂的贮运成本的同时，还为多聚酶链反应的实际操作带来极大的便利。该发明必将有力促进多聚酶链反应技术的在科研、医疗、检验和检疫等领域的运用和基于多聚酶链反应技术的诊断或检测试剂产品的大规模推广应用。

具体实施方式

在目前的分子实验、检测操作中，若是直接将PCR反应试剂（即多聚酶链反应液的组分）如引物、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）、DNA聚合酶、DNA聚合酶的反应缓冲液（不同类型的PCR反应需要不同的反应试剂）等的混合物保存在常温或者室温条件下，通常情况下1~2天后这些反应试剂混合物就失去了对目的核酸的扩增能力。研究发现，在常温或室温的条件下，PCR反应试剂混合物中最容易失去反应活性的是DNA聚合酶，而这些聚合酶丧失活性的主要原因是由于长时间保存或温度过高或温度变化导致聚合酶活性中心维持高级结构的氢键、离子键、二硫键等分子作用力受到破坏所致；在常温或室温条件下，多聚酶链反应液（即PCR反应试剂混合物）中的寡聚核苷酸引物、dNTP也会很快降解，无法参与基因扩增。申请人在长期的研究中发现，在PCR反应试剂混合物中添加0.01%~30%（W/V，即重量体积比）可以形成凝胶的物质，加热至合适的温度使凝胶分子熔解（或熔解），然后使反应试剂混合物温度下降，混合物可由液态变为固态（或半固态）的凝胶，聚合酶分子就会被凝胶分子形成的三维网状结构所固定，聚合酶分子的空间结构（三维结构或高级结构）得以长期维持，聚合酶的活性即可长期保持。而且凝胶也会将PCR反应试剂混合物中的引物、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）以及聚合酶反应缓冲液中的各种成分固定，使其包埋在凝胶分子形成的微孔内，彼此间形成物理性的隔断，同时也隔绝空气，从而使PCR反应试剂混合物的各种成分得以长期稳定保存。

本发明是通过在PCR反应试剂混合物中添加可以形成凝胶的物质并使反应试剂混合物形成凝胶，将反应试剂的成分包埋在凝胶内部的微孔内，使诸成分被固定、形成物理性的隔断来实现PCR反应试剂混合物的常温长期保存的。当需要使用添加了凝胶的PCR反应试剂混合物时，可在其中加入核酸模板按照PCR程序进行温度循环，当加热到一定温度时凝胶完全熔化成液态，PCR反应即可顺利进行。在较便利的贮存条件下（如常温或室温）和一定的贮存期内，上述添加凝胶后的PCR反应试剂混合物进行PCR反应所得的结果与用新鲜配制的PCR反应混合物所得到的结果完全相同。

因不同类型的PCR所需的最适反应温度不同，所以不同类型的PCR反应试剂混合物需要添加不同种类、不同熔点的凝胶或其不同比例的混合物来实现基于凝胶固定的常温长期保存。实际使用中，应根据PCR所需要的最适温度选择在该温度下能够完全或部分熔解的凝胶以取得较佳保护及扩增效果；通常情况下，所选用的凝胶的熔点应低于用于多聚酶链反应的聚合酶的灭活温度，有时为了提高凝胶的强度，可以添加部分熔点高于用于多聚酶链反应的聚合酶的灭活温度的凝胶，但这种高熔点的凝胶必须与熔点低于用于多聚酶链反应的聚合酶的灭活温度的凝胶同时添加，且添加比例不高于熔点低于用于多聚酶链反应的聚合酶的灭活温度的凝胶的10%，如可利用“10%明胶+0.1%结冷胶”的方式提高明胶的强度，或可利用“2.0%琼脂糖+0.2%聚丙烯酰胺”的方式提高琼脂糖凝胶的强度（上述百分比表示凝胶在多聚酶链反应液的组分中的添加浓度，为质量体积百分比g/ml）。

上述凝胶是指溶液中的胶体粒子或高分子在一定条件下互相连接或自身分子吸水膨胀，形成空间网状结构，结构空隙中充满了作为分散介质的液体的一种特殊的分散体系。

通常选用的可以形成凝胶的物质的是指各种能形成凝胶的多糖类物质、明胶类物质，如淀粉、糊精、凝结多糖（又称凝结胶、凝胶多糖、热凝胶、可得然胶、卡德兰）、结冷胶、黄原胶、槐豆胶、亚麻籽胶、魔芋胶、壳聚糖、琼脂、琼脂糖、低熔点琼脂糖、红藻胶、海藻酸（又称藻酸、褐藻酸、海藻素）、海藻酸盐（如海藻酸钠，又被称为海藻胶、褐藻胶或藻胶；又如海藻酸等）、卡拉胶、果胶、低甲氧基果胶、明胶和阿拉伯胶等；也可选用其他能形成凝胶的物质，如甲基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺等。实际使用中，应以热可逆的凝胶为主，非热可逆的凝胶可少量添加以提高凝胶的熔点、增强凝胶的强度。

将PCR反应试剂混合物保存于常温或者室温，1~2天后这些反应试剂混合物对目的核酸的扩增能力就基本完全丧失了。实验结果表明，采用本发明的方法处理后的PCR反应试剂的混合物可以在常温或室温条件下存放2个月或以上而不会失去正常反应活性，在较低的温度条件下（如4℃或以下）存放6个月仍具有正常的反应活性。

以下通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：PCR反应试剂混合物添加凝胶后的保存效果分析

1.PCR反应试剂混合物添加不同浓度和不同种类凝胶进行保存

将除核酸模板以外的各种PCR反应试剂的混合物6048μL（包括PCR引物F和引物R各0.4μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，KCl 50mM，Tris/HCl(pH 9.0)10mM，MgCl₂ 1.5mM，1%Triton X-100，Taq DNA聚合酶630U）按每管432μL分装于14个1.5mL的离心管中，按表1第1列（共14行）所示的浓度和种类向每个1.5mL的离心管中加入可形成凝胶的物质并混匀，然后将1.5mL的离心管置于金属浴上，按照不同凝胶的溶解温度于50~65℃保温5分钟（低于Taq DNA聚合酶的灭活温度100℃），使凝胶充分溶解，再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于18个0.2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于4℃、20℃（常温）、37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。

2.PCR反应试剂混合物添加两种及两种以上凝胶进行保存

将除核酸模板以外的各种PCR反应试剂的混合物6048μL（包括PCR引物F和引物R各0.4μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，KCl 50mM，Tris/HCl(pH 9.0)10mM，MgCl₂1.5mM，1%Triton X-100，Taq DNA聚合酶630U）按每管432μL分装于14个1.5mL的离心管中，按表2第1列（共14行）所示的浓度和种类向每个1.5mL的离心管中加入凝胶并混匀，然后将1.5mL的离心管置于金属浴上，按照不同凝胶的溶解温度于50~63℃保温5分钟，使凝胶充分溶解，再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于18个0.2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于4℃、20℃和37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。

3.PCR反应试剂混合物的保存和有效性检验

保存于4℃装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满2个月、4个月和6个月时进行抽样检验，保存于20℃的装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满1个月、2个月和3个月时进行抽样检验，保存于37℃的装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满10天、20天和30天时进行抽样检验。检验方法如下：

1）依据上述9个贮存时间段，共需进行9批次、每批次56个的PCR反应试剂混合物的有效性检测，每次检测的时候需将变性后的对虾白班综合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）的核酸（30ng/μL）56μL等量分装于56个装有混合有凝胶的PCR反应试剂混合物的0.2mL的离心管中。同时，按照本实施例步骤1中的试剂比例配制新鲜的PCR反应液24μL，添加变性后的WSSV核酸（30ng/μL）1μL，作为阳性对照。

2）将上述离心管于放入PCR仪中进行PCR反应：95℃保温5min，1个循环；95℃保温30sec，63℃保温30sec，72℃保温1min，共35个循环；72℃保温5min，1个循环。PCR反应终止后，将上述部分阳性对照、对照和添加凝胶的反应体系扩增后的产物进行电泳检测，结果显示：阳性对照有目的条带出现，实验设置的对照组（PCR反应试剂的混合物中不添加任何凝胶直接在4°C、20℃和37°C条件下保存）均无扩增产物，添加不同浓度、不同种类凝胶的PCR反应试剂混合物的保存效果的检测结果见表1和表2。

添加不同浓度、不同种类凝胶的PCR反应试剂混合物保存后的检测结果（见表1和2）表明：保存时间为1个月、2个月时，在4℃和20℃条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性；保存时间为10天和20天时，在37℃条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性。

表1.不同浓度、不同种类凝胶对PCR反应试剂混合物的保护效果

注：1.表的第1列示PCR反应试剂混合物中添加凝胶的种类和浓度。

2.表中“对照”为不添加任何凝胶的PCR反应试剂混合物。

3.表中“+”号表示PCR反应试剂混合物经过扩增电泳检测有目的条带出现（即该样本保存后仍有良好扩增活性），“-”表示PCR反应试剂混合物经过扩增电泳检测没有目的条带出现（即该样本保存后不具有扩增活性）。

表2.两种以上凝胶对PCR反应试剂混合物的保护效果

注：1.表的第1列示PCR反应试剂混合物中添加凝胶的种类和浓度。

2.表中“对照”为不添加任何凝胶的PCR反应试剂混合物。

3.表中“+”号表示PCR反应试剂混合物经过扩增电泳检测有目的条带出现（即该样本保存后仍有良好扩增活性），“-”表示PCR反应试剂混合物经过扩增电泳检测没有目的条带出现（即该样本保存后不具有扩增活性）。

实施例2：PCR反应试剂混合物添加预混凝胶后的保存效果分析

1.PCR反应试剂混合物添加不同浓度和不同种类的预混凝胶进行保存

首先按表3第1列（共14行）所示的浓度和种类配制2倍于表中浓度的预混凝胶；将除被测样品核酸以外的各种PCR反应试剂的混合物3024μL（包括PCR引物F和引物R各0.4μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，KCl50mM，Tris/HCl(pH 9.0)10mM，MgCl₂1.5mM，1%Triton X-100，Taq DNA聚合酶630U）按每管216μL分装于14个1.5mL的离心管中；将2倍于表中浓度的预混凝胶置于凝胶的熔点温度下熔解凝胶，按表3第1列所示的浓度和种类向上述每个1.5mL的离心管（共14个）中加入216μL熔解的凝胶并混匀，然后将1.5mL的离心管置于金属浴上，按照不同凝胶的熔解温度于50~63℃保温5分钟，使凝胶充分分散于溶液中，再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于18个0.2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于4℃、20℃（常温）和37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。

2.PCR反应试剂混合物添加两种及两种以上预混凝胶进行保存

首先按表4第1列（共14行）所示的浓度和种类配制2倍于表中浓度的预混凝胶；将除被测样品核酸以外的各种PCR反应试剂的混合物3024μL（包括PCR引物F和引物R各0.4μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，KCl50mM，Tris/HCl（pH 9.0）10mM，MgCl₂1.5mM，1%Triton X-100，Taq DNA聚合酶630U）按每管216μL分装于14个1.5mL的离心管中；将上述2倍于表中浓度的预混凝胶置于凝胶的熔点温度下熔解凝胶，按表4第1列所示的浓度和种类向上述每个1.5mL的离心管（共14个）中加入216μL熔解的凝胶并混匀，然后将1.5mL的离心管置于金属浴上，按照不同凝胶的熔解温度于50~65℃保温5分钟，使凝胶充分分散于溶液中，再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于18个0.2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于4℃、20℃和37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。

3.PCR反应试剂混合物的保存和有效性检验

保存于4℃装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满2个月、4个月和6个月时进行抽样检验，保存于20℃的装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满1个月、2个月和3个月时进行抽样检验，保存于37℃的装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满10天、20天和30天时进行抽样检验。检验方法如下：

1）依据上述9个贮存时间段，共需进行9批次、每批次56个的PCR反应试剂混合物的有效性检测，每次检测的时候需将变性后的对虾白班综合征病毒（WSSV）的核酸（30ng/μL）56μL等量分装于56个装有混合有凝胶的PCR反应试剂混合物的0.2mL的离心管中。同时，按照本实施例步骤1中的试剂比例配制新鲜的PCR反应液24μL，添加变性后的WSSV核酸（30ng/μL）1μL，作为阳性对照。

2）将上述离心管于放入PCR仪中进行PCR反应：95℃保温5min，1个循环；95℃保温30sec，63℃保温30sec，72℃保温1min，共35个循环；72℃保温5min，1个循环。PCR反应终止后，将上述部分阳性对照、对照和添加凝胶的反应体系扩增后的产物进行电泳检测，结果显示：阳性对照有目的条带出现，实验设置的对照组（PCR反应试剂的混合物中不添加任何凝胶直接在4°C、20℃和37°C条件下保存）均无扩增产物，添加不同浓度、不同种类凝胶的PCR反应试剂混合物的保存效果的检测结果见表3和表4。

添加不同浓度、不同种类凝胶的PCR反应试剂混合物的保存后的检测结果（见表3和4）表明：保存时间为1个月、2个月时，在4℃和20℃条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性；保存时间为10天时，在37℃条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性。该结果与向PCR反应混合物中直接添加凝胶物质后反应混合物反应活性保持时间的结果基本一致。表3.不同

浓度、不同种类预混凝胶对PCR反应试剂混合物的保护效果

注：1.表的第1列示PCR反应试剂混合物中添加凝胶的种类和浓度。

2.表中“对照”为不添加任何凝胶的PCR反应试剂混合物。

3.表中“+”号表示PCR反应试剂混合物经过扩增电泳检测有目的条带出现（即该样本保存后仍有良好扩增活性），“-”表示PCR反应试剂混合物经过扩增电泳检测没有目的条带出现（即该样本保存后不具有扩增活性）。

表4.两种以上预混凝胶对PCR反应试剂混合物的保护效果

注：1.表的第1列示PCR反应试剂混合物中添加凝胶的种类和浓度。

2.表中“对照”为不添加任何凝胶的PCR反应试剂混合物。

3.表中“+”号表示PCR反应试剂混合物经过扩增电泳检测有目的条带出现（即该样本保存后仍有良好扩增活性），“-”表示PCR反应试剂混合物经过扩增电泳检测没有目的条带出现（即该样本保存后不具有扩增活性）。

实施例3凝胶固定化Taq DNA聚合酶长期保存后对PCR扩增效果的影响

1.添加不同浓度和不同种类凝胶对Taq DNA聚合酶进行固定化并储藏

按表5第1列（共14行）所示的浓度和种类向14个装有100μL Taq DNA聚合酶（2U/μL）的1.5mL的离心管中加入可形成凝胶的物质并混匀，然后将上述1.5mL的离心管置于金属浴上，按照不同凝胶的溶解温度于50~63℃保温5分钟，使凝胶充分溶解，再将每个1.5mL离心管中含有Taq DNA聚合酶的混合物按4μL的量分装于18个0.2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于4℃、20℃（常温）和37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。

2.添加两种及两种以上凝胶对Taq DNA聚合酶固定化并储藏

按表6第1列（共14行）所示的浓度和种类向14个装有100μL Taq DNA聚合酶（4U/μL）的1.5mL的离心管中加入相应的可形成凝胶的物质并混匀，然后将1.5mL的离心管置于金属浴上，按照不同凝胶的溶解温度于50~65℃保温5分钟，使凝胶充分溶解，再将每个1.5mL离心管中含有Taq DNA聚合酶的混合物按4μL的量分装于18个0.2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的0.2mL的离心管分别置于4℃、20℃（常温）和37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个装有混合物的0.2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0.2mL的离心管作为重复）。

3.凝胶固定化TaqDNA聚合酶长期储藏后对PCR扩增效果的影响检验

保存于4℃装有固定化Taq DNA聚合酶的0.2mL的离心管分别在贮存期满2个月、4个月和6个月时进行抽样检验，保存于20℃的装有固定化Taq DNA聚合酶的0.2mL的离心管分别在贮存期满1个月、2个月和3个月时进行抽样检验，保存于37℃的装有固定化Taq DNA聚合酶的0.2mL的离心管分别在贮存期满10天、20天和30天时进行抽样检验。检验方法如下：

1）依据上述9个贮存时间段，共需进行9批次、每批次56个的固定化Taq DNA聚合酶的有效性检测，每次检测的时候需将除被测样品核酸、Taq DNA聚合酶以外的各种PCR反应试剂的混合物1120μL（包括PCR引物F和引物R各0.4μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，KCl 50mM，Tris/HCl(pH 9.0)10mM，MgCl₂1.5mM，1%Triton X-100）按每管20μL的量分装于每批次抽检的56个0.2mL的离心管中，再将变性后的WSSV的核酸（30ng/μL）56μL等量分装于上述每批次的56个装PCR反应试剂混合物的0.2mL的离心管中，然后按照不同凝胶的溶解温度于50~65℃保温5分钟，使凝胶充分溶解。同时，配制新鲜的PCR反应液24μL，添加变性后的WSSV核酸（30ng/μL）1μL，作为阳性对照。

2）将上述离心管于放入PCR仪中进行PCR反应：95℃保温5min，1个循环；95℃保温30sec，63℃保温30sec，72℃保温1min，共35个循环；72℃保温5min，1个循环。PCR反应终止后，将上述部分阳性对照、对照和添加凝胶的反应体系扩增后的产物进行电泳检测，结果显示：阳性对照有目的条带出现，实验设置的对照组（PCR反应试剂的混合物中不添加任何凝胶直接在4°C、20℃和37°C条件下保存）均无扩增产物，添加不同浓度、不同种类凝胶的PCR反应试剂混合物的保存效果的检测结果见表5和表6。

添加不同浓度、不同种类凝胶的PCR反应试剂混合物保存后的检测结果（见表5和6）表明：保存时间为1个月、2个月时，在4℃和20℃条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性；保存时间为10天时，在37℃条件下贮存的混合物大部分都具有正常的反应活性。

表5.不同浓度、不同种类凝胶对对Taq DNA聚合酶的保护效果

注：1.表的第1列示PCR反应试剂混合物中添加凝胶的种类和浓度。

2.表中“对照”为不添加任何凝胶的PCR反应试剂混合物。

3.表中“+”号表示PCR反应试剂混合物经过扩增电泳检测有目的条带出现（即该样本保存后仍有良好扩增活性），“-”表示PCR反应试剂混合物经过扩增电泳检测没有目的条带出现（即该样本保存后不具有扩增活性）。

表6.两种以上凝胶对Taq DNA聚合酶的保护效果

注：1.表的第1列示PCR反应试剂混合物中添加凝胶的种类和浓度。

2.表中“对照”为不添加任何凝胶的PCR反应试剂混合物。

3.表中“+”号表示PCR反应试剂混合物经过扩增电泳检测有目的条带出现（即该样本保存后仍有良好扩增活性），“-”表示PCR反应试剂混合物经过扩增电泳检测没有目的条带出现（即该样本保存后不具有扩增活性）。

实施例4、PCR反应试剂盒中反应试剂混合物添加凝胶后的保存效果分析

1.组装下列各组分到试剂盒的包装盒中：

（1）扩增检测管，内装PCR反应试剂混合物；

（2）阴性对照管，内装无白斑综合征病毒核酸的FTA膜片；

（3）阳性对照管，内装吸附了白斑综合征病毒核酸的FTA膜片；

上述FTA膜片为英国Whatman的FTA卡上样品区裁剪下来的大小3平方毫米大小的纸片。

2.PCR反应试剂混合物添加不同浓度和不同种类凝胶进行保存

将除被测样品核酸以外的各种PCR反应试剂的混合物6048μL（包括PCR引物F和引物R各0.4μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，KCl 50mM，Tris/HCl（pH 9.0）10mM，MgCl₂1.5mM，1%Triton X-100，Taq DNA聚合酶315U）按每管432μL分装于14个1.5mL的离心管中，按表7第1列（共14行）所示的浓度和种类向每个1.5mL的离心管中加入可形成凝胶的物质并混匀，然后将1.5mL的离心管置于金属浴上，按照不同凝胶的熔解温度于50~63℃保温5分钟，使凝胶充分熔解，再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于18个0.2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的0.2mL的离心管分装入试剂盒，将试剂盒分别置于4℃、20℃（常温）和37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个试剂盒，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个试剂盒作为重复）。

3.PCR反应试剂混合物添加两种及两种以上凝胶进行保存

将除被测样品核酸以外的各种PCR反应试剂的混合物6048μL（包括PCR引物F和引物R各0.4μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，KCl 50mM，Tris/HCl(pH 9.0)10mM，MgCl₂1.5mM，1%Triton X-100-100，Taq DNA聚合酶315U）按每管432μL分装于9个1.5mL的离心管中，按表8第1列（共14行）所示的浓度和种类向每个1.5mL的离心管中加入凝胶并混匀，然后将1.5mL的离心管置于金属浴上，按照不同凝胶的熔解温度于50~65℃保温5分钟，使凝胶充分熔解，再将每个1.5mL离心管中的混合物按24μL的量分装于18个0.2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的0.2mL的的离心管分装入试剂盒，将试剂盒分别置于4℃、20℃、37℃条件下保存（每个温度条件下保存6个试剂盒，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个试剂盒作为重复）。

4.试剂盒内PCR反应试剂混合物的保存和有效性检验

保存于4℃装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满2个月、4个月和6个月时进行抽样检验，保存于20℃的装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满1个月、2个月和3个月时进行抽样检验，保存于37℃的装有反应试剂混合物的0.2mL的离心管分别在贮存期满10天、20天和30天时进行抽样检验。检验方法如下：

1）依据上述9个贮存时间段，共需进行9批次、每批次56个的PCR反应试剂混合物的有效性检测，每次检测的时候需将变性后的对虾白斑综合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）的核酸（30ng/μL）56μL等量分装于56个装有混合有凝胶的PCR反应试剂混合物的0.2mL的离心管中。同时，按照本实施例步骤1中的试剂比例配制新鲜的PCR反应液24μL，添加变性后的WSSV核酸（30ng/μL）1μL，作为阳性对照。

2）将上述离心管于放入PCR仪中进行PCR反应：95℃保温5min，1个循环；95℃保温30sec，63℃保温30sec，72℃保温1min，共35个循环；72℃保温5min，1个循环。PCR反应终止后，将上述部分阳性对照、对照和添加凝胶的反应体系扩增后的产物进行电泳检测，结果显示：阳性对照有目的条带出现，实验设置的对照组（PCR反应试剂的混合物中不添加任何凝胶直接在4°C、20℃和37°C条件下保存）均无扩增产物，添加不同浓度、不同种类凝胶的PCR反应试剂混合物的保存效果的检测结果见表7和表8。

添加不同浓度、不同种类凝胶的PCR反应试剂混合物的保存效果的后检测结果（见表7和8）表明：保存时间为1个月、2个月时，在4℃和20℃条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性；保存时间为10天和20天时，在37℃条件下贮存的混合物大部分都具有正常的反应活性。

另外，针对阳性对照管中吸附了白斑综合征病毒核酸的FTA膜片进行检测，发现该FTA膜片吸附的病毒核酸也依然能够作为PCR反应的模板进行正常扩增；这与Whatman公司所称的该TFA卡片能够长期室温保存核酸相符合。

表7.不同浓度、不同种类凝胶对试剂盒内PCR反应试剂混合物的保护效果

注：1.表的第1列示PCR反应试剂混合物中添加凝胶的种类和浓度。

2.表中“对照”为不添加任何凝胶的PCR反应试剂混合物。

3.表中“+”号表示PCR反应试剂混合物经过扩增电泳检测有目的条带出现（即该样本保存后仍有良好扩增活性），“-”表示PCR反应试剂混合物经过扩增电泳检测没有目的条带出现（即该样本保存后不具有扩增活性）。

表8.两种以上凝胶对试剂盒内PCR反应试剂混合物的保护效果

注：1.表的第1列示PCR反应试剂混合物中添加凝胶的种类和浓度。

2.表中“对照”为不添加任何凝胶的PCR反应试剂混合物。

3.表中“+”号表示PCR反应试剂混合物经过扩增电泳检测有目的条带出现（即该样本保存后仍有良好扩增活性），“-”表示PCR反应试剂混合物经过扩增电泳检测没有目的条带出现（即该样本保存后不具有扩增活性）。

上述实施例中的PCR引物F和R为WSSV的特征引物（引物序列参见闫冬春，董双林，黄倢.PCR检测对虾白斑综合征病毒（WSSV）中假阴性的探讨[J].海洋与湖沼，2007，38（2）：146-149。），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

除了在实施例中列出的具体的凝胶外，分子生物学领域中的其它可形成凝胶的物质也可以选用。并且，也可以是三种或三种以上的凝胶混合使用。

由于PCR反应试剂中包含聚合酶等易丧失活性的成分，所以目前PCR反应试剂的保存和运输都是采用冰箱、冰袋或干冰等维持低温的条件下进行的，这不仅导致PCR扩增反应试剂的储运难度加大还增加了相关PCR扩增技术的使用成本；采用本发明方法处理的PCR扩增反应试剂后可实现常温（20℃）贮存3个月仍保持有正常的反应活性，这无疑为PCR扩增反应试剂的储运提供了很便捷的选择。同时本发明的方法具有工艺简单、成本低廉的特点，采用本发明方法处理后的PCR扩增反应试剂混合物在便利的贮存条件下（常温或室温等温度条件）具有活性稳定持久的优点，这在大大降低PCR扩增反应试剂贮运成本的同时，还为PCR扩增反应的实际操作带来极大的便利。该发明必将有力促进PCR扩增技术及产品在科研、医疗、检验和检疫等领域的运用。

本发明实施例中所用的试剂和材料来源如下：凝结多糖、结冷胶、黄原胶、槐豆胶、壳聚糖、琼脂、琼脂糖、红藻胶、海藻酸、海藻酸钠、海藻酸钙、卡拉胶、果胶、低甲氧基果胶、明胶、阿拉伯胶、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺等购自Sigma公司，魔芋胶购自汕头市捷成生物科技有限公司，Tris-HCl、KCl、MgSO₄、MgCl₂和Triton X-100-100购自上海生工生物工程技术服务有限公司，DNA聚合酶等购自Promega公司。也可以采用市售的其它同类产品来实现本发明。

Claims (19)

1.一种基于凝胶的多聚酶链反应试剂保存方法，其特征在于，是将一种或几种多聚酶链式反应液的组分包埋在凝胶内进行保存。

2.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于所述的凝胶，其熔点低于用于多聚酶链式反应的聚合酶的灭活温度。

3.如权利要求2所述的保存方法，其特征在于所述的凝胶，还包括有熔点高于多聚酶链式反应的聚合酶的灭活温度的凝胶，且添加比例不高于熔点低于用于聚酶链式反应的聚合酶的灭活温度的凝胶质量的10%。

4.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于所述的多聚酶链式反应液的组分为用于多聚酶链式反应的聚合酶。

5.如权利要求4所述的保存方法，其特征在于所述的多聚酶链式反应液的组分还包括有引物、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）、多聚酶链式反应聚合酶反应缓冲液中的任一种或几种。

6.如权利要求2-5任一项所述的保存方法，其特征在于所述的用于多聚酶链式反应的聚合酶为DNA聚合酶。

7.如权利要求6所述的保存方法，其特征在于所述的DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。

8.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于，操作步骤如下：首先将可形成凝胶的物质添加到多聚酶链式反应液的组分中，然后在低于多聚酶链反应的聚合酶的灭活温度下将凝胶熔解，最后冷却凝固凝胶进行保存。

9.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于操作步骤如下：首先将可形成凝胶的物质与含水的溶剂加热使之溶解配成浓缩的母液，然后将浓缩的母液加入到多聚酶链式反应液的组分中，最后让温度下降使混合物由液态凝固为固态或半固态的凝胶进行保存。

10.如权利要求8或9所述的保存方法，其特征在于所述的可形成凝胶的物质在多聚酶链式反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为0.01%~30%。

11.如权利要求8或9所述的保存方法，其特征在于所述的可形成凝胶的物质为能形成凝胶的多糖类物质和/或明胶类物质。

12.如权利要求11所述的保存方法，其特征在于所述的多糖类物质和/或明胶类物质为淀粉、糊精、凝结多糖、结冷胶、黄原胶、槐豆胶、亚麻籽胶、魔芋胶、壳聚糖、琼脂、琼脂糖、低熔点琼脂糖、超低熔点琼脂糖、红藻胶、海藻酸、海藻酸盐、卡拉胶、果胶、低甲氧基果胶、明胶、阿拉伯胶中的任一种或几种。 

13.如权利要求8或9所述的保存方法，其特征在于所述的可形成凝胶的物质为能形成凝胶的人工聚合物。

14.如权利要求13所述的保存方法，其特征在于所述的人工聚合物为甲基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺中的任一种或几种。

15.如权利要求12所述的保存方法，其特征在于所述的凝结多糖在多聚酶链式反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为0.2%~3%。

16.如权利要求12所述的保存方法，其特征在于所述的超低熔点琼脂糖在多聚酶链式反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为0.3%~3.5%。

17.一种多聚酶链反应试剂，其特征在于，所述的反应试剂是将除核酸模板外的一种或几种多聚酶链式反应液的组分包埋在凝胶内制备的。

18.如权利要求17所述的反应试剂，其特征在于所述的多聚酶链式反应液为多聚酶链反应聚合酶、引物、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）、多聚酶链反应聚合酶反应缓冲液中的任一种或几种。

19.一种多聚酶链反应试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含有权利要求17所述的多聚酶链反应试剂。