CN102703372B - 一种高效降解木质纤维素的菌株保藏培养液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种高效降解木质纤维素的菌株保藏培养液及其制备方法，属于生物技术领域。其特征在于每1L去离子水中含有下述物质：硫酸镁、硫酸铁、硝酸铵、谷氨酰胺、钼酸钠、氯化钴、碘化钾、磷酸二氢钾、酵母粉、葡萄糖、硫化甘醇酸钠、柠檬酸、淀粉、牛肉膏、天冬酰胺、桃胶。上述一种高效降解木质纤维素的菌株保藏培养液，培养液中添加了多种能够促进降解木质纤维素的菌株迅速、稳定生长的营养元素；其培养液制作方法简便，设备投资少，原料成本低廉，且能准确稳定高效的培养出适应性强的优良菌株，所得菌株降解木质纤维素的活性高于自然界中自然生长的菌株。

Description

一种高效降解木质纤维素的菌株保藏培养液及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效降解木质纤维素的菌株保藏培养液。

背景技术

木质纤维素资源是地球上最丰富和廉价的可再生资源，木质纤维素可以转化成三种主要的利用方式：运输燃料，热能或电能以及化学给料。纤维素生物质的利用将是未来人类解决粮食和能源问题的重要途径之一。长期以来国内外学者一直致力于寻找降解植物木质纤维素的最佳途径，研究一般集中于以下几个方面：理化处理，如热水处理、蒸气爆破、低温氨爆处理、稀酸处理、碱处理、湿氧法处理、有机溶剂处理、超临界水处理等，此外还有生物法处理如酶解和生物发酵。理化处理一般可以去掉50%的木质素并降低纤维素的结晶度，但这样用于工业化的成本太高而且容易产生二次污染。与理化方法处理相比，生物降解法对木质纤维素降解的专一性较强，需要的反应条件温和，且降解时产生的抑制物和污染物较少。此外，生物处理法不需要额外投入酸碱进行中和处理，减少了投入的成本和污染。

    目前，降解木质纤维素最为有效的方法就是采用微生物法，即利用木质纤维素分解菌来达到降解的目的。而自然界中存在大量可以分解木质纤维素的细菌、真菌和放线菌，这些微生物主要是由来自土壤和动物消化道的微生物菌群组成。微生物主要采用两种进攻方式来降解木质纤维素，一是由外部到内部；二是由内部向外部。在降解木质纤维素时细菌首先要吸附在纤维素表面，然后不断地从纤维素的表面向内部渗透生长。细菌生长产生压力，使其吸附的纤维素部位受到破坏。纤维膨胀后，很容易被分解。而真菌在降解的过程中，首先吸附于木质纤维素的端部，由端部向内部延伸，不断分泌一系列降解木质纤维素的酶，然后由内部开始不断向外降解木质纤维素。在降解木质纤维素时无论微生物采用何种方式来破坏木质纤维素结构，微生物所产生的木质纤维素降解酶在木质纤维素生物降解过程中始终起主要作用。在众多微生物中把具有降解纤维素能力的细菌、真菌和放线菌统称为纤维素降解微生物。这些微生物通常并不独立存在，而是与其他一些非木质纤维素降解微生物生活在一起，形成一个互惠互利的小生境，从而能更好地降解木质纤维素等有机物质。据不完全统计自20世纪60年代以来，国内外共报道了隶属于53个属的数千个产纤维素酶的菌株。其中，细菌主要有假单胞菌属，枯草杆菌、芽孢杆菌。纤维素降解细菌常见于腐殖质、堆肥和反刍动物的肠胃中；放线菌主要有小单胞菌属、诺卡氏菌属、高温放线菌属、链霉菌属、节杆菌；真菌主要有绿色木霉、黄白卧孔菌、球毛壳、粗皮侧耳、变色多孔菌、青霉、黑曲霉、米曲霉、曲霉、棘孢曲霉等菌株。筛选纤维素降解菌的方法主要有纤维素刚果红培养基、纤维素选择培养基、滤纸溃烂法和纤维素天青培养基等选择和分离的方法。还有在这些方法的基础上改进的方法如Smith的半固体纤维素天青试管法和《P-N》法等。Tearther 和Wood等认为染料同水解产生的多糖形成一个清晰可见有浓郁色泽的复合物，并且认为水解圈大小同酶活高低有一定的数量关系。Hendricks 等则进一步发展成为一个鉴别性培养基用于各种纤维素分解菌数目测定，取得了一定的进展。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种高效降解木质纤维素的菌株保藏培养液及其制备方法的技术方案，能高效稳定的培养出降解木质纤维素性能优良且适应性强的优良菌株。

所述的一种高效降解木质纤维素的菌株保藏培养液，其特征在于每1L去离子水中含有下述物质：硫酸镁1.28-3.56g，硫酸铁0.19-1.87g，硝酸铵0.71-1.36g，谷氨酰胺1.37-2.56g，钼酸钠0.15-0.97g，氯化钴0.017-0.091g，碘化钾1.12-1.74g，磷酸二氢钾1.18-1.67g，酵母粉1.02-2.36g，葡萄糖4.00-9.00g，硫化甘醇酸钠0.12-0.34g，柠檬酸1.35-2.61g，淀粉3.00-7.00g，牛肉膏1.23-1.75g，天冬酰胺0.06-0.18g，桃胶3.00-8.00g。

所述的一种高效降解木质纤维素的菌株保藏培养液，其特征在于每1L去离子水中含有下述物质优选为：硫酸镁1.35-3.12g，硫酸铁0.23-1.57g，硝酸铵0.83-1.25g，谷氨酰胺1.42-2.19g，钼酸钠0.18-0.84g，氯化钴0.023-0.082g，碘化钾1.36-1.67g，磷酸二氢钾1.22-1.56g，酵母粉1.09-2.15g，葡萄糖4.50-8.32g，硫化甘醇酸钠0.18-0.31g，柠檬酸1.42-2.38g，淀粉3.25-6.27g，牛肉膏1.43-1.71g，天冬酰胺0.09-0.15g，桃胶4-6g。

所述的一种高效降解木质纤维素的菌株保藏培养液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）按权利要求1所述比例分别称取硫酸镁、硫酸铁、硝酸铵、谷氨酰胺、钼酸钠、氯化钴、碘化钾、磷酸二氢钾、酵母粉、葡萄糖、硫化甘醇酸钠、柠檬酸、淀粉、牛肉膏、天冬酰胺、桃胶，其中桃胶研磨成粉末，备用；

2）在灭菌后的干净容器中加入1L去离子水，加入步骤1）中的硫酸镁，硫酸铁，硝酸铵，谷氨酰胺，钼酸钠，氯化钴，碘化钾，磷酸二氢钾，葡萄糖，硫化甘醇酸钠，柠檬酸，天冬酰胺，搅拌至所有物质完全溶解，加热至28-35℃加入酵母粉、淀粉、牛肉膏、桃胶粉，充分混合后置于恒温培养箱中发酵保藏3-5天，即得菌株保藏培养液。

上述一种高效降解木质纤维素的菌株保藏培养液，培养液中添加了多种能够促进降解木质纤维素的菌株迅速、稳定生长的营养元素；其培养液制作方法简便，设备投资少，原料成本低廉，且能准确稳定高效的培养出适应性强的优良菌株，所得菌株降解木质纤维素的活性高于自然界中自然生长的菌株。

本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，其它的均为纯物质的重量百分含量。

具体实施方式

现结合本发明的实施例和培养效果试验，进一步说明本发明的有益效果。

实施例1

在2L灭菌后的干净容器中加入1L去离子水，再加入1.35g硫酸镁、0.25g硫酸铁、0.90g硝酸铵、1.60g谷氨酰胺、0.20g钼酸钠、0.033g氯化钴、1.40g碘化钾、1.25g磷酸二氢钾、4.50g葡萄糖、0.20g硫化甘醇酸钠、1.45g柠檬酸和0.09g天冬酰胺，搅拌至所有物质完全溶解，加热至28℃加入1.09g酵母粉、3.50g淀粉、1.45g牛肉膏和3.57g桃胶粉，充分混合后置于恒温培养箱中发酵保藏3天，即得菌株保藏培养液。

实施例2

在2L灭菌后的干净容器中加入1L去离子水，再加入3.12g硫酸镁、0.23g硫酸铁、0.95g硝酸铵、1.50g谷氨酰胺、0.30g钼酸钠、0.023g氯化钴、1.36g碘化钾、1.56g磷酸二氢钾、5.00g葡萄糖、0.22g硫化甘醇酸钠、1.55g柠檬酸和0.10g天冬酰胺，搅拌至所有物质完全溶解，加热至35℃加入2.15g酵母粉、3.55g淀粉、1.71g牛肉膏和3.67g桃胶粉，充分混合后置于恒温培养箱中发酵保藏5天，即得菌株保藏培养液。

实施例3

在2L灭菌后的干净容器中加入1L去离子水，再加入1.40g硫酸镁、1.57g硫酸铁、0.83g硝酸铵、1.80g谷氨酰胺、0.18g钼酸钠、0.082g氯化钴、1.45g碘化钾、1.22g磷酸二氢钾、8.32g葡萄糖、0.18g硫化甘醇酸钠、2.38g柠檬酸和0.11g天冬酰胺，搅拌至所有物质完全溶解，加热至29℃加入1.15g酵母粉、4.00g淀粉、1.43g牛肉膏和7.50g桃胶粉，充分混合后置于恒温培养箱中发酵保藏4天，即得菌株保藏培养液。

实施例4

在2L灭菌后的干净容器中加入1L去离子水，再加入1.45g硫酸镁、0.45g硫酸铁、1.25g硝酸铵、2.00g谷氨酰胺、0.84g钼酸钠、0.043g氯化钴、1.67g碘化钾、1.30g磷酸二氢钾、5.05g葡萄糖、0.31g硫化甘醇酸钠、1.42g柠檬酸和0.15g天冬酰胺，搅拌至所有物质完全溶解，加热至30℃加入1.25g酵母粉、4.50g淀粉、1.50g牛肉膏和4.05g桃胶粉，充分混合后置于恒温培养箱中发酵保藏3.5天，即得菌株保藏培养液。

实施例5

在2L灭菌后的干净容器中加入1L去离子水，再加入1.60g硫酸镁、1.00g硫酸铁、1.00g硝酸铵、1.42g谷氨酰胺、0.40g钼酸钠、0.053g氯化钴、1.50g碘化钾、1.35g磷酸二氢钾、6.00g葡萄糖、0.24g硫化甘醇酸钠、1.65g柠檬酸和0.12g天冬酰胺，搅拌至所有物质完全溶解，加热至32℃加入1.35g酵母粉、3.25g淀粉、1.55g牛肉膏和5.67g桃胶粉，充分混合后置于恒温培养箱中发酵保藏4.5天，即得菌株保藏培养液。

实施例6

在2L灭菌后的干净容器中加入1L去离子水，再加入2.18g硫酸镁、1.25g硫酸铁、1.15g硝酸铵、2.19g谷氨酰胺、0.55g钼酸钠、0.063g氯化钴、1.55g碘化钾、1.40g磷酸二氢钾、7.05g葡萄糖、0.28g硫化甘醇酸钠、1.85g柠檬酸和0.13g天冬酰胺，搅拌至所有物质完全溶解，加热至34℃加入1.45g酵母粉、6.27g淀粉、1.65g牛肉膏和3.07g桃胶粉，充分混合后置于恒温培养箱中发酵保藏3.8天，即得菌株保藏培养液。

以下通过试验说明上述培养液的有益效果。

表1  实施例1-6对不同降解木质纤维素的菌株第7d时的培养效果（红褐色圈直径/cm）

菌株

实施例1

实施例2

实施例3

实施例4

实施例5

实施例6

猴头菇

5.56±0.31a

5.69±0.15a

5.38±0.17a

5.54±0.23a

5.77±0.01a

5.39±0.17a

鸡腿菇

4.61±0.17a

4.72±0.21a

4.66±0.33a

4.65±0.46a

4.74±0.31a

4.68±0.37a

香菇

4.34±0.47a

4.49±0.28a

4.37±0.21a

4.48±0.11a

4.35±0.42a

4.56±0.34a

白灵菇

4.59±0.42a

4.64±0.38a

4.63±0.41a

4.72±0.24a

4.71±0.30a

4.63±0.25a

黑木耳

4.27±0.16a

4.38±0.44a

4.25±0.30a

4.31±0.13a

4.33±0.09a

4.26±0.17a

滑菇

3.86±0.29a

3.89±0.32a

3.84±0.31a

3.83±0.34a

3.89±0.27a

3.85±0.21a

高大环柄菇

4.22±0.14a

4.36±0.13a

4.23±0.17a

4.22±0.27a

4.31±0.21a

4.31±0.23a

从上表1可见，实施例1-6对不同降解木质纤维素的菌株均具有明显的促进生长作用，其中实施例2效果最佳。

Claims (3)

1.一种高效降解木质纤维素的菌株保藏培养液，其特征在于每1L去离子水中含有下述物质：硫酸镁1.28-3.56g，硫酸铁0.19-1.87g，硝酸铵0.71-1.36g，谷氨酰胺1.37-2.56g，钼酸钠0.15-0.97g，氯化钴0.017-0.091g，碘化钾1.12-1.74g，磷酸二氢钾1.18-1.67g，酵母粉1.02-2.36g，葡萄糖4.00-9.00g，硫化甘醇酸钠0.12-0.34g，柠檬酸1.35-2.61g，淀粉3.00-7.00g，牛肉膏1.23-1.75g，天冬酰胺0.06-0.18g，桃胶3.00-8.00g。

2.如权利要求1所述的一种高效降解木质纤维素的菌株保藏培养液，其特征在于每1L去离子水中含有下述物质优选为：硫酸镁1.35-3.12g，硫酸铁0.23-1.57g，硝酸铵0.83-1.25g，谷氨酰胺1.42-2.19g，钼酸钠0.18-0.84g，氯化钴0.023-0.082g，碘化钾1.36-1.67g，磷酸二氢钾1.22-1.56g，酵母粉1.09-2.15g，葡萄糖4.50-8.32g，硫化甘醇酸钠0.18-0.31g，柠檬酸1.42-2.38g，淀粉3.25-6.27g，牛肉膏1.43-1.71g，天冬酰胺0.09-0.15g，桃胶4-6g。

3.如权利要求1所述的一种高效降解木质纤维素的菌株保藏培养液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）按权利要求1中所述含量分别称取硫酸镁、硫酸铁、硝酸铵、谷氨酰胺、钼酸钠、氯化钴、碘化钾、磷酸二氢钾、酵母粉、葡萄糖、硫化甘醇酸钠、柠檬酸、淀粉、牛肉膏、天冬酰胺、桃胶，其中桃胶研磨成粉末，备用；

2）在灭菌后的干净容器中加入1L去离子水，加入步骤1）中的硫酸镁，硫酸铁，硝酸铵，谷氨酰胺，钼酸钠，氯化钴，碘化钾，磷酸二氢钾，葡萄糖，硫化甘醇酸钠，柠檬酸，天冬酰胺，搅拌至所有物质完全溶解，加热至28-35℃加入酵母粉、淀粉、牛肉膏、桃胶粉，充分混合后置于恒温培养箱中发酵保藏3-5天，即得菌株保藏培养液。