CN102702565B - 一种吲哚乙酸分子印迹聚合物的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析化学领域，更具体涉及一种吲哚乙酸分子印迹聚合物的制备方法及其应用，适用于植物样品中生长素的富集和分析。该方法以IAA作为模板分子，加入功能单体、交联剂和引发剂得到预聚合溶液；60℃反应8h以上，脱除模板分子得到吲哚乙酸分子印迹聚合物。可将其用于SPME涂层。处理后的石英纤维插入预聚合溶液中，热引发聚合。反应完成后取出石英纤维，老化并重复涂渍，洗净模板分子，最后将纤维插入微萃取装置中用于后续萃取。此IAA-MISPME制备简单、厚度可控、选择性强、富集效果好，且能反复使用。此萃取头与液相色谱联用时，可实现对植物样品中2种生长素的高效萃取和分离。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，更具体涉及一种吲哚乙酸分子印迹聚合物的制备方法及其应用，适用于植物样品中生长素的富集和分析。
背景技术
生长素是植物生长发育过程中必需的一类植物激素。常见生长素有吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸、4-氯吲哚乙酸、吲哚丙酸（IPA）等。它们都以吲哚为母环，是一类结构相似的化合物。在实际生产中，生长素具有调节植物顶端优势、促进组织器官成熟和衰老等生理作用，因此准确测定其含量，能更有效地了解生长素的作用机制。
固相微萃取（SPME）是在固相萃取（SPE）的原理上发展起来的一种前处理技术，具有操作简便、样品用量少、无需有机溶剂等许多优点。在复杂样品前处理中，商品化的SPME涂层由于选择性较低、价格昂贵、使用寿命较短等不足而限制了其应用。
分子印迹技术具有很高的选择性和特异性，能弥补SPME选择性不高的缺陷，因而受到许多研究者的广泛关注。通过制备与目标分子在空间结构和结合位点上完全匹配的分子印迹聚合物（MIP），并将其作为SPME的涂层，即形成MISPME技术。该技术结合了SPME萃取的高效性和MIPs强的分子识别能力，是一种很有发展潜力的前处理方法。
MIP或SPME单个方法作为植物激素的前处理方法已有相关文献报道。Li等制备了IAA分子印迹磁性微球提取植物样品中的生长素。Liu等将SPME-HPLC联用技术用于测定巴蕉木质部流中4种植物激素，但该方法涉及商品化SPME萃取头，价格昂贵且专一性有限。而以IAA作为模板分子，制备纤维式MISPME涂层用于生长素的分析至今未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种吲哚乙酸分子印迹聚合物的制备方法及其在SPME涂层上的应用。
本发明采取的技术方案如下：
本发明首先提供了一种吲哚乙酸分子印迹聚合物的制备方法，以IAA作为模板分子，加入功能单体4-乙烯吡啶和致孔剂乙腈，混匀，常温放置12 h，再加入交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和引发剂偶氮二异丁腈，超声混匀、通氮除氧后即得到预聚合溶液；将预聚合溶液于60 ℃反应8 h以上，得到固态聚合物；上述固态聚合物以甲醇-乙酸溶液脱除模板分子，干燥得到吲哚乙酸分子印迹聚合物。
其中模板分子、功能单体、交联剂、引发剂四者的摩尔比分别为2：12：6：1。
交联剂和功能单体的总体积与致孔剂的体积比为1：6。
所述吲哚乙酸分子印迹聚合物用于SPME涂层。
本发明还提供了一种分子印迹固相微萃取涂层的制备方法，所述制备方法的具体步骤包括：
1) 石英纤维处理：石英纤维预处理及硅烷化；
2) 预聚合溶液配制：以IAA作为模板分子，加入功能单体4-乙烯吡啶和致孔剂乙腈，混匀，常温放置12 h，再加入交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和引发剂偶氮二异丁腈，超声混匀、通氮除氧后即得到预聚合溶液；
3) 在上述预聚合溶液中插入硅烷化处理的石英纤维，60 ℃反应8 h以上；然后将聚合后的石英纤维取出，老化；
4) 配置新鲜预聚合溶液，重复步骤3）在同一根石英纤维上多次涂渍制得涂层；
5) 涂层制备完成后，用体积比为90:10的甲醇-乙酸混合溶液洗脱去除模板分子。
所述的硅烷化采用硅烷化试剂进行活化处理；所述硅烷化试剂为γ-MAPs和丙酮按体积比1：9混合配制而成；活化处理时间为2 h。
所述老化的条件为60 ℃放置3 h。
其中模板分子、功能单体、交联剂、引发剂四者的摩尔比分别为2：12：6：1。
将制得的IAA-MIP作为SPME涂层。此涂层性质稳定、厚度可控、易于自动化操作，并可选择性萃取和富集结构类似的2种目标物。结合液相色谱检测平台，可实现对生长素的有效分离和高灵敏检测，并用于植物样品分析。
本发明的显著优点是：
1. 将SPME与IAA-MIP有效结合，首次合成了IAA-MISPME涂层；
2. 该涂层是以石英纤维为介质，纤维处理简单、成本低、可多次使用，而且可直接在自组装的萃取装置中使用；
3. 制备的涂层与纤维连接紧密，表面疏松多孔，良好的结构特性有利于目标物的萃取；
4. 制备的涂层具有优良的热稳定性、耐溶剂能力和较长的使用寿命，在多种溶剂中反复使用，也未发现萃取性能下降；
5. 采用多次涂渍法，能制备一定厚度的MISPME涂层，过程易控，且能更有效地实现目标物的萃取与富集；
6. 与常规SPE相比，该SPME方法的灵敏度显著提高；与常规SPME方法比较，该涂层的选择性大为增强；
7. 建立的方法能适用于复杂基质预处理，应用范围广泛。
附图说明
图1是自组装的SPME装置示意图；其中，1. 活塞；2. 5 μL GC微量注射器；3. 血清瓶；4. 正己烷；5. IAA-MISPME涂层；6. 磁子；7. 磁力搅拌器。
图2是IAA-MISPME涂层的表面形貌；放大倍数：(a): ×1000； (b): ×5000；(c): ×10000。
图3是IAA和IPA萃取前后的色谱对比图；其中，（A）直接进样，10 mg/L；（B）MISPME涂层萃取，0.1 mg/L，均固定进样10 μL。
图4是IAA-MISPME涂层的选择性评价；其中，IAA（吲哚乙酸，模板分子），IPA（吲哚丙酸，结构类似物），iP（异戊烯基腺嘌呤，参照物）。
图5是空白（虚线）和加标（实线）烟草叶片基质提取液萃取实验的色谱叠加图，加标浓度为0.05 mg/L。
具体实施方式
按本发明的内容制备IAA-MISPME涂层：
a) 石英纤维预处理：取长约20 cm石英纤维，一端浸于丙酮中5 min，剥去外层的聚酰亚氨涂层，依次用二次水、1.0 mol/L NaOH、二次水、1 mol/L HCl 浸泡、洗净，晾干后将石英纤维放入10%（v/v）γ-MAPS丙酮溶液中硅烷化处理2 h，取出后用甲醇冲洗，氮气吹干，待用。
b) 预聚合溶液制备：将IAA作为模板分子，加入适量4-乙烯吡啶（功能单体）和乙腈（致孔剂）混匀，常温放置12 h，再加入三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（交联剂）和偶氮二异丁腈（引发剂），超声混匀、通氮除氧后即得到预聚合溶液。
c) 聚合反应：将b)液转移至2.0 mL衍生化小瓶中，插入硅烷化的纤维，60 ℃热引发共聚反应。8 h后，小心拔出石英纤维，60 ℃老化3 h。
d) 反复涂渍：按b)配制新鲜预聚溶液，在同根纤维上重复c) 操作，至涂层厚度达到要求。
e) 去除模板分子：用甲醇-乙酸（90:10，v/v）混合溶液洗脱去除模板分子。除不加模板分子外，同时制备非印迹固相微萃取（NISPME）涂层。
自组装萃取装置如图1所示：以5 μL GC微量进样器（2）作为萃取手柄，以涂有IAA-MISPME涂层的纤维（5）取代原微量进样器的铁丝，以进样器活塞（1）来控制萃取过程中涂层的伸缩，样品溶液（正己烷）装于血清瓶（3）中，并置于磁力搅拌器（7）上进行搅拌萃取。具体MISPME法萃取过程为：萃取溶剂为20 mL正己烷，搅拌速度为400 rpm，萃取温度为60 ℃，萃取时间为40 min, 解析溶剂为乙腈，解析体积为10 μL，解析时间为10 min。
将上述萃取头与液相色谱联用，色谱条件如下：色谱柱为ZORBAX SB-C8（250 mm×4.6 mm I.D.，5 μm，Agilent），流动相：甲醇-水（60：40，v/v，%），流速：1.0 mL/min，最大紫外波长：223 nm。
涂层的性能评价：通过场发射透射电镜研究了IAA-MISPME涂层的表面形貌。结果表明，涂层与纤维粘附情况总体较好，未发现有涂层脱落现象（图2a）；图2（b）和（c）中可观察到MISPME涂层表面呈现疏松多孔状和高度交联结构。这种形貌结构为MISPME涂层萃取分析物奠定了基础。为考察MISPME法对目标物的富集能力，将自制涂层萃取浓度为0.1 mg/L的2种生长素，并与直接进样法（待测物10 mg/L）相比较（图3）。可以看出，尽管浓度相差2个数量级，但MISPME涂层对两种生长素的萃取响应值仍然较高。产生这种富集效果，主要归因于在IAA-MIP制备时，聚合溶液中模板分子IAA与功能单体之间的氢键作用使4-乙烯吡啶围绕在IAA分子周围，并呈现特异性的排列。配制浓度为0.1 mg/L的IAA、IPA及iP（异戊烯基腺嘌呤）混合溶液，来考察MISPME涂层的性能。吸附量Q =(C0 – C1) * V/m。其中，Q-吸附量（mg/g）；C0-萃取前样品溶液浓度（mg/mL）；C1-萃取后样品溶液浓度（mg/mL）；V-样品溶液体积（mL）；m-纤维上的IAA-MIP质量（g）。用印迹因子α的值来评价KT-MIP对模板分子KT的选择性识别能力，α=QMIP /QNIP，其中，QMIP、QNIP分别为分子印迹材料、非分子印迹材料对目标物的吸附量。由图4可知，IAA-MISPME涂层对模板分子及其结构类似物IPA的萃取量明显高于NISPME涂层，其萃取量可达930 pmol和764 pmol；而对结构相似度较小的iP，其萃取量仅为156 pmol，与NISPME涂层相当。用MISPME涂层对分析物的萃取量除以NISPME涂层对应的萃取量，计算得到三种物质的印迹因子（α）分别为2.78、2.59、0.95，进一步表明MISPME涂层对IAA和IPA选择性能较佳。
将建立的MISPME法用于植物基质的分析：准确称取2 g新鲜烟草嫩叶液氮下迅速研磨成粉末，加入5.0 mL 80%甲醇提取液（含有0.1%抗氧化剂2,6-二叔丁基对甲酚），-20 ℃下浸提12 h，离心（4 ℃，4000 rpm，5 min）后取上清液，残渣用3.0 mL上述提取液再次浸提1 h，合并两次滤液并转移至100 mL圆底烧瓶中，45 ℃减压蒸馏除去有机相，加入20 mL正己烷提取，用于后续分析。由图5可知，经过MISPME处理后，植物样品的基质干扰减少，背景较为干净。尽管空白植物样品中未测得目标物，但该方法对加标样品中测得的IAA和IPA具有较好的选择性。
总之，以IAA为模板分子，制备了形貌均匀、疏松多孔的IAA-MISPME涂层。在化学性能方面，MISPME 涂层能耐甲醇、乙腈等多种有机溶剂，使用寿命较长。在萃取性能方面，IAA-SPME涂层对模板分子IAA及类似物IPA具有较好的富集能力及选择性，选择性因子高达2.78。建立了IAA-MIPSPME与HPLC联用的方法用于测定生长素，线性范围为1-100μg/L，检测限为0.5μg/L。该方法用于烟草叶片分析，加标回收率在82.5-120.6%之间。与其它SPME、SPE等预处理方法相比，该分子印迹法能复杂的植物背景被纯化，同时，也使痕量被测物得到一定程度的富集，从而提高了分析的灵敏度和专一性。
Claims (9)
1.一种吲哚乙酸分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：以IAA作为模板分子，加入功能单体4-乙烯吡啶和致孔剂乙腈，混匀，常温放置12 h，再加入交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和引发剂偶氮二异丁腈，超声混匀、通氮除氧后即得到预聚合溶液；将预聚合溶液于60 ℃反应8 h以上，得到固态聚合物；上述固态聚合物以甲醇-乙酸溶液脱除模板分子，干燥得到吲哚乙酸分子印迹聚合物。
2.根据权利要求1所述的吲哚乙酸分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：模板分子、功能单体、交联剂、引发剂四者的摩尔比分别为2：12：6：1。
3.根据权利要求1所述的吲哚乙酸分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：交联剂和功能单体的总体积与致孔剂的体积比为1：6。
4.根据权利要求1所述的吲哚乙酸分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：所述吲哚乙酸分子印迹聚合物用于SPME涂层。
5.一种分子印迹固相微萃取涂层的制备方法，其特征在于：所述制备方法的具体步骤包括：
1） 石英纤维处理：石英纤维预处理及硅烷化；
2） 预聚合溶液配制：以IAA作为模板分子，加入功能单体4-乙烯吡啶和致孔剂乙腈，混匀，常温放置12 h，再加入交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和引发剂偶氮二异丁腈，超声混匀、通氮除氧后即得到预聚合溶液；
3） 在上述预聚合溶液中插入硅烷化处理的石英纤维，60 ℃反应8 h以上；然后将聚合后的石英纤维取出，老化；
4） 配置新鲜预聚合溶液，重复步骤3）在同一根石英纤维上多次涂渍制得涂层；
5） 涂层制备完成后，用甲醇-乙酸溶液洗脱去除模板分子。
6.根据权利要求5所述的分子印迹固相微萃取涂层的制备方法，其特征在于：所述的硅烷化采用硅烷化试剂进行活化处理；所述硅烷化试剂为γ-MAPs和丙酮按体积比1：9混合配制而成；活化处理时间为2 h。
7.根据权利要求5所述的分子印迹固相微萃取涂层的制备方法，其特征在于：老化的条件为60 ℃放置3 h。
8.根据权利要求5所述的分子印迹固相微萃取涂层的制备方法，其特征在于：模板分子、功能单体、交联剂、引发剂四者的摩尔比分别为2：12：6：1。
9.根据权利要求5所述的分子印迹固相微萃取涂层的制备方法，其特征在于：所述甲醇-乙酸溶液中甲醇、乙酸的体积比为90:10。
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