CN102697774B

CN102697774B - 关白附总生物碱及关附壬素的新用途

Info

Publication number: CN102697774B
Application number: CN201210203325.0A
Authority: CN
Inventors: 王广基; 汤依群; 董秀华; 孙建国; 于鹏; 刘静涵; 刘建平; 杨春华; 刘巍; 朱天全; 徐静; 孙申国; 程志国; 汪旻晖
Original assignee: JILIN AODONG ZHAONAN PHARMACEUTICAL CO Ltd; China Pharmaceutical University
Current assignee: JILIN AODONG ZHAONAN PHARMACEUTICAL CO Ltd; China Pharmaceutical University
Priority date: 2012-06-19
Filing date: 2012-06-19
Publication date: 2014-08-20
Anticipated expiration: 2032-06-19
Also published as: CN102697774A

Abstract

本发明提供了一种关白附总生物碱的制备方法，以及其在制备慢钠离子通道阻断剂和制备抗心率失常药物中的应用。研究表明，关白附总生物碱和盐酸关附甲素均对豚鼠心室肌慢钠电流具有抑制作用。特别是关附壬素在制备药物代谢酶抑制剂中的应用。本发明还提供了关附甲素在制备慢钠离子通道阻断剂中的应用。

Description

关白附总生物碱及关附壬素的新用途

技术领域

本发明涉及关白附总生物碱及关附壬素的新用途。具体涉及关白附总生物碱在制备慢钠离子通道阻断剂及抗心律失常药物中的应用。

背景技术

关白附为中药毛莨科黄花乌头Aconitum coreanum(Levl，)Rapaics的块根，为常见中药之一，主治心痛血痹，具有祛风，燥湿，化痰，止痛作用，民间用药疗效好。其化学成份主要有关附庚素(Guanfu base G,GFG)，关附甲素(Guanfu base A,GFA)，关附壬素(Guanfu base I,GFI)等，三者均为二萜类生物碱。现代药理学研究表明关附甲素、关附庚素、关附壬素等具有抗心律失常、抗炎和镇痛作用。但由于关附甲素提取得率为0.1％左右，提取工艺周期较长，原料药损耗大，未能充分利用关白附资源。

近年来研究长QT综合症（L-QT，易诱发室性心律失常，晕厥和猝死的一系列综合症）及其他心律失常发生机制的新靶点，有实验表明，心脏钠离子通道基因SCN5A的突变，造成慢钠电流反复开发,延缓电流衰减，使动作电位平台期延长，引起L-QT。这种变化在慢频率下尤其明显，是LQT3发生的重要原因，也是诱发其他心律失常的重要原因。

发明内容

本发明目的之一在于提供关白附总生物碱的制备方法。

本发明目的之二在于提供关白附总生物碱在制备慢钠离子通道阻断剂中的应用。

本发明目的之三在于提供关附甲素在制备慢钠离子通道阻断剂中的应用。

本发明目的之四在于提供关附壬素在抑制药物代谢酶活性新用途。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的。

一种关白附总生物碱的制备方法，该方法包括如下步骤：

步骤1：取关白附药材，有机溶剂提取，回收溶剂，得提取物浸膏；

步骤2：取步骤1得到的浸膏，以酸溶液捏溶，将酸溶液低温冷藏，取酸水层；

步骤3：取步骤2得到的酸水液，以有机溶剂萃取，酸水母液加碱液调节pH至碱性；

步骤4：将步骤3中碱化的溶液用有机溶剂萃取，取有机溶剂层，回收溶剂，得关白附总生物碱。

优选的，所述步骤1中有机溶剂为正丁醇、异丙醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、乙醚中的任意一种；

所述提取方法为冷浸提取；

所述步骤2中的酸溶液为盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、甲酸、醋酸、丁酸中的一种或几种；

所述步骤3和4中的有机溶剂为正丁醇、乙酸乙酯、甲酸乙酯、甲酸乙酯、氯仿、丙酮、石油醚、乙醚中的任意一种；

所述步骤3中的碱液为氨水、碳酸钠、碳酸氢钠中的一种或几种。

优选的，关白附总生物碱的制备方法包括如下步骤：

步骤1：取关白附药材，在10-30℃下用50-95%乙醇冷浸提取，回收溶剂，得浸膏；

步骤2：取步骤1得到的浸膏，以盐酸水溶液捏溶，将酸溶液低温冷藏，除去上层的脂溶性杂质，取酸水液；

步骤3：取步骤2得到的酸水液，用乙酸乙酯萃取,酸水母液加氨水调节pH=8-11；

步骤4：将步骤3中经氨水碱化的溶液迅速用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，回收溶剂，真空干燥，得关白附总生物碱。

更有选的参数为：步骤2中盐酸水溶液为0.5-1.5mol/l；和/或步骤3中：酸水母液加氨水调节pH=9。

更优选的，关白附总生物碱的制备方法包括如下步骤：

步骤1：取关白附药材，粉碎，在10-30℃下用2-8倍量50-95%乙醇冷浸提取2-4次，每次12-36小时，合并提取液，回收溶剂，得浸膏；

步骤2：取步骤1得到的浸膏，以1-3倍量0.5-1.5mol/l的盐酸水溶液捏溶，将酸溶液低温冷藏12-24小时，除去上层的脂溶性杂质，取酸水液；

步骤3：取步骤2得到的酸水液，用乙酸乙酯萃取2-4次，酸水母液加氨水调节pH=8-11；

步骤4：将步骤3中经氨水碱化的溶液迅速用乙酸乙酯萃取2-4次，取乙酸乙酯层，回收溶剂，真空干燥，得关白附总生物碱。

进一步优选的，关白附总生物碱的制备方法包括如下步骤：

步骤1：取关白附药材，粉碎成10-20目粗粉，在25℃下用5倍量85%乙醇冷浸提取4次，每次24小时，合并提取液，回收溶剂，得浸膏；

步骤2：取步骤1得到的浸膏，以1倍量1mol/l的盐酸水溶液捏溶，将酸溶液于2℃低温冷藏12-24小时，除去上层的脂溶性杂质，取酸水液；

步骤3：取步骤2得到的酸水液，用乙酸乙酯萃取2次，酸水母液加氨水调节pH=9；

步骤4：将步骤3中经氨水碱化的溶液迅速用乙酸乙酯萃取4次，取乙酸乙酯层，回收溶剂，真空干燥，得关白附总生物碱。

或，步骤1：取关白附药材，粉碎成10-20目粗粉，在10℃下用3倍量95%乙醇冷浸提取2次，每次36小时，合并提取液，回收溶剂，得浸膏；

步骤2：取步骤1得到的浸膏，以3倍量0.5mol/l的盐酸水溶液捏溶，将酸溶液于2℃低温冷藏12-24小时，除去上层的脂溶性杂质，取酸水液；

步骤3：取步骤2得到的酸水液，用乙酸乙酯萃取4次，酸水母液加氨水调节pH=8；

步骤4：将步骤3中经氨水碱化的溶液迅速用乙酸乙酯萃取2次，取乙酸乙酯层，回收溶剂，真空干燥，得关白附总生物碱。

或，步骤1：取关白附药材，粉碎成10-20目粗粉，在30℃下用8倍量75%乙醇冷浸提取3次，每次12小时，合并提取液，回收溶剂，得浸膏；

步骤2：取步骤1得到的浸膏，以2倍量1.5mol/l的盐酸水溶液捏溶，将酸溶液于2℃低温冷藏12-24小时，除去上层的脂溶性杂质，取酸水液；

步骤3：取步骤2得到的酸水液，用乙酸乙酯萃取2次，酸水母液加氨水调节pH=11；

上述关白附总生物碱还可以按常规工艺制成关白附总碱盐。

本发明关白附总生物碱和总碱盐可以按常规的制剂工艺制成药剂学可接受的任意常规剂型，例如肌肉注射剂，静脉注射剂、粉针剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。

本发明关白附总生物碱在制备慢钠离子通道阻断剂中的应用；所述关白附总生物碱可以是游离碱或无机酸盐的形式。

一种关附甲素在制备慢钠离子通道阻断剂中的应用；所述关附甲素可以是游离碱或无机酸盐的形式。

一种关附壬素在制备抑制药物代谢酶药物中的应用。

所述药物代谢酶优选为细胞色素P450酶系中的一种或几种；进一步优选为CYP2D6。

本发明所述药物代谢酶CYP2D6所代谢的药物化合物及其盐的分子结构特征为：在化合物分子结构中距离氧化位点5～7A处有一个氮原子。包括抗抑郁药如阿米替林、丙咪嗪、氯米帕明、地昔帕明、去甲替林、氟西汀、帕罗西汀、顽发克星等；β受体阻滞剂如卡维地洛、普萘洛尔、美托洛尔、阿普洛尔、丁呋洛尔、噻吗洛尔、布尼洛尔等；抗精神病药如氯丙嗪、奋乃静、瑞斯哌东、托哌酮等；抗高血压药如胍喹啶、吲哚拉明、乌拉地尔等；抗心绞痛药如派克昔林、特罗地林等；镇痛药如曲马多；止咳平喘药如可待因、右美沙芬等；抗心律失常药如恩卡尼、司巴丁、氟卡尼、普罗帕酮、美西律、茚丙胺。所述关附壬素可以是游离碱或无机酸盐的形式；优选为盐酸盐或硫酸盐。

本发明所述关附甲素和关附壬素可以从市场购买，也可以从关白附中提取分离或通过化学合成的方法得到，其结构式如下：

关附甲素（GFA）：R1=R3=-Ac;R2=H

关附壬素（GFI）：R1=-Ac；R2=R3=H

附图说明

图1关白总碱对晚钠电流的抑制曲线

图2关白总碱对豚鼠心室肌晚钠电流抑制IC₅₀=0.439mmol/L

图3盐酸关附甲素对晚钠电流的抑制曲线

图4盐酸关附甲素对豚鼠心室肌晚钠电流抑制IC₅₀=0.580mmol/L

图5盐酸关附壬素对CYP2D6代谢能力的影响

图6关白附总碱盐对大鼠房颤时间（s）的影响

图7关白附总碱盐对大鼠ERP的影响

图8关白附总碱盐对犬起搏阈的影响

图9关白附总碱盐对犬房颤持续时间的影响

具体实施方式

实验例1：关白附总生物碱盐抗心律失常的药理研究

1.实验材料：关白附总生物碱盐，按本发明实施例3制备；盐酸利多卡因注射液，山东省泅水希尔康制药有限公司；实验用大鼠由上海斯莱克动物中心提供和家兔由中国药科大学动物室提供。

2．关白附总碱盐对电刺激家兔心脏诱发的心律失常的保护作用

2.1实验方法

家兔12只，体重2.4±0.6kg，分为两组，每组6只，雌雄各半，一组为关白附总碱组，另一组为利多卡因组。乌拉坦1.2g／kg耳缘iv麻醉，在人工呼吸下开胸暴露心脏，并用顾氏心动杠杆连于压力换能器，从JL-3型三道生理仪描记心脏舒缩曲线。将刺激电极置于心尖部（正极）与房室交界处左侧（负极）并连于DGQ-2型刺激器，以波宽1ms、频率20Hz的方法刺激10s，每隔2min刺激一次，逐次增加刺激强度（mV）。测得兔心致室颤值作为对照值。然后由兔耳静脉分别注入关白附总碱或利多卡因，不同剂量给药相隔10min，于每次给药后5min测定致颤阈，与给药前进行比较。

2.2实验结果

实验结果见表1。

表1 关白附总碱盐对兔心电致颤阈值的影响（N=6）（X±S）

^*P<0.05，^**P<0.01（与给药前比较）

结果表明iv关白附总碱盐2、4、8mg／kg均能提高兔心致室颤阂值，且随剂量增大而作用加强；iv关白附总碱盐4、8mg／kg能显著提高兔心致室颤值（P<0.05，P<0.01）。说明关白附总生物碱盐对电刺激兔心引起的室颤有明显提高致颤阈作用。

3.关白附总碱盐对乌头碱诱发大鼠室性心律失常的保护作用

3.1实验方法

大鼠40只，体重202±16g，雌雄各半，随机分为5组，用1.2g／kg乌拉坦ip麻醉后，分别由尾静脉给以关白附总碱盐4、8、16mg/kg及利多卡因15mg／kg。对照组iv等量生理盐水。2分钟后用WSQ-A型微量输液器由颈外静脉恒速注入乌头碱溶液（1μg／ml，0.2ml／min），并由心电示波器监视出现室早，室速，室颤时记录乌头碱的用量。

3.2实验结果

结果见表2。

表2 iv关白附总碱对乌头碱诱发大鼠室性心律失常的保护作用

^*p<0.05，^**p<0.01（与对照组比较）

结果表明中，关白附总生物碱盐能增加乌头碱诱发室早，室速，室颤的剂量，其作用随关白附总碱盐剂量的加大而增加；其中高剂量（8、16mg/g）的关白附总碱盐能明显增加乌头碱诱发室早，室速，室颤的剂量（P<0.05，P<0.01），说明iv关白附总碱盐对乌头碱诱发的室性心律失常有明显的保护作用。

实验例2关白附总生物碱和盐酸关附甲素对心肌慢钠离子通道阻断作用的研究

1 实验方法

1.1心肌细胞分离

正常豚鼠（雌雄不限，250±20g）击晕，迅速开胸取出心脏，放入4℃的无钙台氏液中，修剪后通过主动脉把心脏挂在Langendorff装置上，以37°C的无钙台氏液恒温灌流，流速6～8mL/min。灌流约5min，洗净淤血后换含酶无钙台氏液灌流约10～15min，待心肌呈现膨胀疏松且半透明状时，剪下左心室，在KB液中用玻璃滴管轻轻吹打，过滤，即可得到横纹清晰，表面光洁的棒状单个心室肌细胞，保存在KB液中。所有实验用溶液均用95%O₂+5%CO₂饱和。

1.2全细胞膜片钳记录方法

在室温下吸取细胞保存液数滴加于2mL细胞培养皿中，置于倒置显微镜（Nikon）载物台上，待细胞静置贴壁,用细胞外液灌流清洗细胞。电极选用硬质玻璃经微电极拉制仪（HEKA）二次拉制而成，经过热抛光后，电极充以内液入水后电阻值为4-6MΩ，选取横纹清晰、边缘整齐、表面无颗粒、无收缩的细胞，调节三维操纵器使电极尖端移向细胞表面，轻施负压，形成高阻封接后，补偿快电容并给更大负压吸破细胞膜形成全细胞记录模式。补偿慢电容和串联电阻，使电容瞬迹减至最小。维持电位-90mV，去极化到+20mV保持50ms，引出快钠电流，快钠电流完全失活后的电流为慢钠电流。使用局部灌流给药系统给药，记录空白细胞外液，含关白附总碱（按本发明实施例1制备）或盐酸关附甲素0.1mmol/L，0.3mmol/L和1mmol/L时的电流，以空白电流与给药电流的差值与空白电流的比值作为抑制率，用Hill方程y=Vmax*x^n/(k^n+x^n)拟合浓度与抑制率的关系，得出半数抑制浓度IC₅₀。

1.3实验溶液配制

无钙台氏液：称量适量的各种溶质，用超纯水配制成含NaCl、KCl、MgCl₂、葡萄糖、HEPES、牛磺酸分别为137mmol/L、5.4mmol/L、1.2mmol/L、10mmol/L、10mmol/L、10mmol/L的溶液，用NaOH调节pH为7.40。

含酶无钙台氏液：在无钙台氏液中加入牛血清白蛋白和胶原酶Ⅱ型，使其浓度分别为1mg/mL，0.3mg/mL，用NaOH调节pH为7.40。

KB液：称量适量的各种溶质，用超纯水配制成含KOH、KCl、KH₂PO₄、谷氨酸、MgCl₂、牛磺酸、EGTA、HEPES、葡萄糖分别为70mmol/L、KCl 40mmol/L、20mmol/L、50mmol/L、3mmol/L、20mmol/L、0.5mmol/L、10mmol/L、10mmol/L的溶液，用KOH调节pH为7.40。

电极内液：称量适量的各种溶质，用超纯水配制成含CsF、CsCl、MgCl₂、NaCl、Na₂-ATP、EGTA、HEPSE分别为110mmol/L、20mmol/L、3mmol/L、10mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、5mmol/L的溶液，以CsOH 调节pH到7.2。

细胞外液：无钙台氏液加入CsCl、CoCl₂、CaCl₂使其浓度分别为5mmol/L、3mmol/L、1mmol/L。

2实验结果

结果见图1-4。

结果显示，关白附总生物碱和盐酸关附甲素对豚鼠心室肌慢钠电流抑制强度分别为IC₅₀=0.439mmol/L（相对分子质量以465计算），IC50=0.580mmol/L。

实验例3关白附总生物碱制备工艺研究

1关白附乙醇冷浸提取与乙醇加热回流提取方法比较

1.1实验方法

冷浸法：将粉碎成10～20目的关白附颗粒500克，用1000ml95％乙醇25℃浸泡24小时，浸出，第二次再加1000ml95％乙醇25℃浸泡12小时，浸出，第三次加1000ml95％乙醇25℃浸泡4小时，浸出，合并浸出液，过滤，滤液减压回收乙醇得稠醇浸膏，加少量蒸馏水，放置冰箱，冷却过滤，除去色素等杂质，用石油醚萃取数次，以除去其中脂溶性成分，再用氯仿萃取，氯仿萃取液用无水碳酸钠脱水过滤后回收氯仿至干，95％乙醇转溶，加盐酸至pH＝3，然后加入晶种，放置析晶，用95％乙醇重结晶得关白附总生物碱盐0.098g，氯仿萃取后的溶液，正丁醇萃取，减压回收正丁醇后95％乙醇转溶，放置冰箱析晶，经Molisch反应，TLC对照，鉴定为糖类物质得0.83g。

回流法：将粉碎成10～20目关白附颗粒500克，分别用95％乙醇1000ml，800ml，600ml于60℃±2℃水浴上热浸提取2小时，1小时，0.5小时，合并提取液，回收乙醇得稠醇浸膏，加少量蒸馏水，放置冰箱，冷却过滤，除去树脂状色素等杂质，用石油醚萃取数次，以除去其中脂溶性成分，再用氯仿萃取，氯仿萃取液用无水碳酸钠脱水,过滤后回收氯仿至干，95％乙醇转溶后，加盐酸至pH＝3，加晶种，放置析晶，用95％乙醇重结晶,得0.10g关白附总生物碱盐。氯仿萃取后的溶液，正丁醇萃取，减压回收正丁醇后用95％乙醇转溶，放置冰箱析晶，经Molisch反应，TLC对照，鉴定为糖类物质，得1.50g。

1.2实验结果

结果见表3。

表3 两种提取工艺方法的比较

提取方法	关白附总生物碱盐得率％	糖类得率％
			冷浸法	0.0196	0.166
回流法	0.0200	0.500

结果表明：冷浸与回流提取提，盐酸关附甲素得率较接近；但是回流提取，糖类物质得率高达0.5％，还有其它水溶性杂质，不仅影响了生物碱分离，还给后处理带来麻烦，因此提取关白附总生物碱盐应采用冷浸法为宜。

2乙醇冷浸提取工艺研究

2.1仪器与药品：

安捷仑Agilent 1100高效液相色谱仪（四元梯度泵，DAD检测器）；梅特勒－托利多（METTLER）AE-240双量程电子分析天平；BüchiRotavaporR－114型旋转蒸发仪。

关附甲素对照品从中国药品生物制品检定所购买，关白附药材由辽宁、吉林购买。

甲醇，乙腈，庚烷磺酸钠为色谱纯。

水为纯净水。

其他试剂均为分析纯。

2.2关附甲素含量测定方法的建立

（1）色谱条件：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以1.5mg/mL庚烷磺酸钠水溶液（含0.2％三乙胺，用磷酸调pH=5.0）为流动相A，以乙腈为流动相B；洗脱程序见表4；流速1ml／min；检测波长：205nm；柱温：25℃；分析时间40min；理论塔板数按关附甲素峰计算应不低于20000。

表4 洗脱程序

时间（分钟）	流动相A(%)	流动相B(%)
			0～16min	80→76	20→24
16～22min	76→70	24→30
			22～38min	70→66	30→34
38～40min	66	34
			梯度洗脱完成后平衡10min	80	20

（2）线性范围：

精密称取盐酸关附甲素对照品适量，以流动相（A:B=3:1）溶解配制成浓度为1mg／ml的溶液；按上述色谱条件分析，以对照品峰面积为纵坐标（y），对照品浓度为横坐标（x），得回归方程y=6.38×103x+1.29×102,r=0.9998,线形范围为0.5-2.5mg／ml。

（3）对照品溶液的制备：

精密称取盐酸关附甲素对照品适量，以流动相（A:B=3:1）溶解配制成浓度为1mg／ml的溶液，即得。

2.2实验方法

选取乙醇浓度（％，A）、冷浸次数（B）、冷浸时间（天，C）、乙醇用量（V/W，D）四个因素进行考察，每个因素选取三个水平，采用L9（3⁴）正交表进行试验，正交表头设计见表5。得到的浸膏以400ml 0.1mol/lHCl溶液溶解，用乙酸乙酯萃取3次，取水层，用氨水调pH=9，用乙酸乙酯萃取3次，取乙酸乙酯层，减压回收，抽干至发泡无乙酯。真空干燥箱干燥，得到关白附总生物碱提取物，测定关附甲素的含量。

表5 正交实验表头设计

2.3实验结果

结果见表6

表6 正交实验结果

比较各因素R值大小，可以看出哪个因素在提取工艺中占主要地位。按R值大小，各因素主次顺序为：A>C>D>B。结合方差分析结果，因素A最为显著，因素C稍次之，因素B、D均为不显著因素。从正交试验的观点来看，只选取有显著意义因素的最好水平搭配，确定最佳工艺，不显著因素原则上可以根据实验条件（如节约药材、溶剂、时间、能源等）酌情确定一个。因此，在本实验中最佳结合方案为：A2B 1C3D1,即关白附药材的最佳提取工艺为用较大粒度的药材粉末在25℃的温度下用5倍量85%的乙醇提取4次，每次冷浸24h。

3除杂方法研究

3.1实验方法：关白附经乙醇冷浸提取后，除了含有生物碱外，还有大量的脂溶性色素，树脂、油脂等，2％盐酸水溶液捏溶后酸水液，呈粘稠性酱色。为了除去脂溶性杂质，进行了以下试验:

方法一：将酸水液直接过滤，除去色素、树脂、油脂等。

方法二：采用酸水液2℃低温冷藏使脂溶性成分漂浮分层，时间约为12～24小时。

3.2实验结果

结果见表7。结果表明采用酸水液2℃低温冷藏的方法更好。

表7 酸水部位生物碱除去色素，树脂和油脂方法的比较

4碱化工艺研究

4.1实验方法

药材粉末在25℃的温度下用5倍量85%的乙醇冷浸提取4次，每次冷浸24h，减压回收乙醇至无醇味，得醇浸膏，用盐酸溶液捏溶，乙酸乙酯萃取3次，酸水层分别用氨水调至pH=9，NaOH溶液调至pH=10、pH=11，分别迅速用乙酸乙酯萃取3次，减压回收乙酸乙酯至发泡，分别测定关附甲素含量。

4.2实验结果

结果见表8。

表8 碱化工艺研究结果

	pH=9(氨水)	pH=10（NaOH）	pH=11(NaOH)
				含量（mg/g）	17.38	16.78	16.53

结果表明，用氨水调节pH=9，关附甲素含量最高，并且具有很好的稳定性，最终碱化条件确定为用氨水调节pH=9。

5关白附总生物碱精制工艺研究

5.1实验方法

选取酸水用量（V/W，A）、酸值（mol/L，B）、酸水层萃取次数（次，C）、碱水层萃取次数（次，D）四个因素进行考察，每个因素选取三个水平，采用L9（34）正交表进行试验，转移率作为定量指标进行实验。正交设计表头见表9。

表9 正交设计表头设计

5.2实验结果

结果见表10。

表10 正交试验结果

结果表明，因素D最为显著，因素B稍次之，因素A、C均为不显著因素。因此，在本实验中最佳结合方案为：A₁B₁C₁D₃,即关白附总生物碱提取物的最佳精制工艺为用药材醇浸膏以1倍量1mol/L的盐酸溶液捏溶，用乙酸乙酯萃取2次，酸水层用氨水调至pH=9，迅速用乙酸乙酯萃取4次，乙酸乙酯层减压回收乙酸乙酯，至发泡，减压干燥既得关白附总生物碱提取物。

6药材粉碎粒度研究

6.1实验方法

将关白附粉碎成10～20目，60～80目两种粒度，采用冷浸和定时搅拌冷浸，提取时间为48小时，重复3次，提取液含量经HPLC测定。

6.2实验结果

结果见表11。

表1195％乙醇提取不同粒度关白附中的关附甲素的含量

实验结果表明，关白附提取最佳粒度为10～20目，最佳提取方式为冷浸并定时搅拌。

实施例4人肝微粒体实验考察盐酸关附壬素对CYP2D6单底物代谢能力的影响

1实验材料和仪器：

1.1实验材料

混合人肝微粒体(HLM)购自瑞德肝脏疾病研究(上海)有限公司，由10名捐献者的肝脏制得，其CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、 CYP3A4、CYP2E1活性由瑞德鉴定，含蛋白浓度10mg/500μl。

氢溴酸右美沙芬(dextromethorphan hydrobromide)左氧氟沙星(levofloxacin)购自中国药品生物制品检定所。关附壬素标准品购于中国药品生物制品检定所。

Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、KCl、MgCl₂·6H₂O购自南京化学试剂厂；甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)购自Sigma公司。其余试剂均为市售分析纯。

微粒体缓冲液(PBS)：0.1M KCl-磷酸盐缓冲液，含：0.1M KCl、0.1M Na₂HPO₄、0.1M NaH₂PO₄；pH=7.4。

NADPH能量再生系统：临用新配，含：10mM G-6-P、0.5mM NADP+、10mM MgCl₂、1U/mL G6PDH。

1.2仪器

美国热电公司Finnigan高效液相色谱－四极杆串联质谱联用仪(含Finnigan Surveyor高效液相色谱系统、Finnigan TSQ Quantum Discovery max质谱系统、电喷雾离子源、Xcalibur1.2工作站及LCQuan数据处理软件)。

GENIE VORTEX-2涡旋混合装置；EPPENDORF高速冷冻离心机；Milli-Q Gradient A1超纯水机(Millipore Inc,USA)。

2实验方法：

选取0，0.2，0.8，2，10，50，100μmol/L个浓度的盐酸关附壬素与人肝微粒体，及右美沙芬/5μmol/L于37℃与人肝微粒体(终浓度为0.2mg/mL)在37℃恒温水浴中预热5min，然后加入NADPH能量再生系统启动反应。优化孵育时间为20min。整个反应体系中有机溶剂的含量控制在≤1%。0℃冰浴终止反应后，用含内标(左氧氟沙星，200ng/mL)的甲醇溶液(1:1，v/v)直接沉淀蛋白，充分振荡3min，20000rpm离心10min后定量转移50μL上清液，以5μL进样。同时设立不加盐酸关附壬素（以溶剂二甲基亚砜代替）的空白对照。

3实验结果

实验结果见图5。结果显示，盐酸关附壬素的IC50为22μM，表明盐酸关附壬素可以有效地抑制CYP2D6酶的活力。

实验例5关白附总碱盐抗大鼠房颤作用观察

1实验目的

采用ACh-CaCl₂致大鼠房颤模型，研究关白附总碱盐的抗房颤作用，实验结果显示，关白附总碱盐预防性给予，可以明显降低房颤持续时间，有效抑制QRS波群的展宽。实验以决奈达隆作为阳性对照。关白附总碱盐在ACh-CaCl₂致大鼠房颤模型上抗房颤作用确切。

2实验材料

2.1实验动物

成年SD大鼠，雄性，清洁级，由上海西普尔—必凯实验动物有限公司提供。合格证号：SCXK(沪)2008-0016。温度20-24℃，湿度50%的环境下饲养，照明12小时。自由饮水，进食。

2.2试剂及仪器

决奈达隆，纯品；

关白附总碱盐，按实施例3制备；

乙酰胆碱，纯品，Sigma；

其余试剂：国产，分析纯，市售；

BL-420F生物机能实验系统：成都泰盟科技有限公司。

3实验分组及操作

实验设正常对照组和造模，治疗组。正常组大鼠10只，ip生理盐水7天。其余大鼠10%水合氯醛麻醉大鼠（0.3ml/100g)，尾静脉注射ACh-CaCl₂混合液（0.1gCaCl2+6.6ugACh/10mlH2O，0.1ml/100g)，每天一次，第四天，将大鼠随机分成①模型组、②关白附总碱盐低剂量组（2mg/kg)、③关白附总碱盐中剂量组（6mg/kg)、④关白附总碱盐高剂量组（18mg/kg)和决奈达隆组（30mg/kg）。药效对照组设6mg/kg剂量。所有药物均po给药3天，观察药效。

4实验方法

10%水合氯醛麻醉大鼠（0.3ml/100g)，麻醉后记录II导联心电图。于 II导联下尾静脉注射ACh-CaCl₂混合液（0.1g CaCl₂+6.6ugACh/10mlH₂O，0.1ml/100g)，记录房颤持续时间。第二、三天重复以上操作。第四天，各治疗组在开始造模前3h，灌胃给予相应剂量的治疗药物，尾静脉注射ACh-CaCl₂混合液，给药剂量和体积同前三天，记录房颤时间。重复以上操作至第七天。各组大鼠造模，治疗完成后，处死大鼠，速取心脏于冰冻的K-H液中清洗，分离左心房，取右心室肌，运用生物机能实验系统测量诱发心房动作电位的阈值以及心房的有效不应期。

5实验结果

实验数据采用均值±标准差（x±s）表示（n=6），

5.1关白附总碱盐对抗房颤作用

实验结果见表12，图6。结果表明：大鼠尾静脉注射ACH-Cacl2混合液，随造模时间延长，大鼠房颤时间明显延长，给予关白附总碱盐后，依浓度缩短大鼠房颤时间。

表12.关白附总碱盐对大鼠房颤时间（s）的影响（x±s，n=6）

5.2关白附总碱盐对房颤大鼠ERP的影响

实验分别测定了各组大鼠左心房ERP数值，作为衡量房颤后大鼠心电重构的初步指标，实验结果如表13，图7。结果表明：模型大鼠心房和心室肌ERP明显缩短，提示多次房颤刺激后，大鼠心肌细胞电重构，形成房颤基质，关白附总碱盐能有效抑制心肌细胞的电重构，维持心电稳定。

表13 关白附总碱盐对大鼠ERP的影响（x±s，n=6）

综上，关白附总碱盐三个剂量(2,6,18mg/kg)po（口服）给药，可对抗大鼠房颤，缩短房颤持续时间，改善房颤引起的心房电重构，三个剂量给予，结果显示有明显的量效关系。抗房颤作用确切。

实验例6关白附总碱盐对心房快速起搏导致的犬房颤的治疗作用（乙酰胆碱合并）

1实验方法

成年比格犬，雌雄不限，体重10-20kg。静脉注射戊巴比妥钠溶液麻醉（3%的溶液，10ml/kg）。根据情况适量追加麻醉剂。麻醉后仰卧固定。剪去颈部和胸前被毛。正中切开颈部，做气管插管连接呼吸机机械通气（呼吸频率16次/分，潮气量12ml/kg，呼吸比3:5）。分离右侧迷走神经，切断，在近心端插入一对电极连接电刺激器。正中切开胸骨上方组织，贴胸骨左缘前断第3，4肋，暴露心包。剪开心包缝制心包吊篮，暴露心脏。在右心房表面钩入一对使用4×6缝合针制成的电极，连接电刺激器。每隔半小时使用0.1ms，20Hz的连续刺激，0.05V递增的强度刺激右心房测定起搏阈。起搏阈是指在正常状态下使用20Hz，1ms的50次串刺激可起搏心房的电压。颈静脉滴注乙酰胆碱200μg/mL,0.2ml/min，然后以2倍起搏阈刺激引发房颤，测定房颤持续时间.在起搏阈和致颤阈稳定后分别灌胃给关白附总碱盐（按实施例3制备）（4mg/kg,8mg/kg）和决萘达隆（20mg/kg）。给药后每0.5小时测定起搏阈和致颤阈及房颤持续时间。

2实验结果

结果见图8-9。

实验结果表明，关白附总碱盐4，8mg/kg预防性给予，心电异位起搏阈增高，提示心房电稳定性增高，房颤持续时间明显缩短，表明药物抗房颤作用。

实验例7关白附总碱盐对心房快速起搏导致的犬房颤的治疗作用（刺激迷走神经合并）

1实验方法

成年比格犬，雌雄不限，体重10-20kg。静脉注射戊巴比妥钠溶液麻醉（3%的溶液，10ml/kg）。根据情况适量追加麻醉剂。麻醉后仰卧固定。剪去颈部和胸前被毛。正中切开颈部，做气管插管连接呼吸机机械通气（呼吸频率16次/分，潮气量12ml/kg，呼吸比3:5）。分离右侧迷走神经，切断，在近心端插入一对电极连接电刺激器。正中切开胸骨上方组织，贴胸骨左缘前断第3，4肋，暴露心包。剪开心包缝制心包吊篮，暴露心脏。在右心房表面钩入一对使用4×6缝合针制成的电极，连接电刺激器。每隔半小时使用0.1ms，20Hz的连续刺激，0.05V递增的强度刺激右心房测定起搏阈。使用0.1ms，5V，5-20Hz的脉冲刺激迷走神经，使R-R间期超过1s，同时使用0.1ms，20Hz，50次的串刺激引发房颤，强度以0.05V递增，以50次刺激结束后有持续房颤时的电压为致颤阈。在起搏阈和致颤阈稳定后分别灌胃给关白附总碱盐（按本发明实施例3制备）（4mg/kg）和决萘达隆（20mg/kg）。给药后每小时测定起搏阈和致颤阈。

2实验结果

结果见表14。

表14 关白附总碱对起搏阈和致颤阈的影响

实验结果表明，关白附总碱盐4mg/kg预防性给予，心电异位起搏阈增高69.3%，提示心房电稳定性增高，作用与决奈相近。由于电稳定作用，引起房颤的刺激强度需增加86%以上，表明药物抗房颤作用。从药物起效时间看,关白附总碱盐起效时间需要2小时-3小时,比决奈稍慢,但持续时间较长.

实施例

实施例1

关白附总生物碱的制备方法包括如下步骤：

步骤1：取关白附药材，粉碎成20目粗粉，在25℃下用5倍量85%乙醇冷浸提取4次，每次24小时，合并提取液，回收溶剂，得浸膏；

步骤2：取步骤1得到的浸膏，以1倍量1mol/l的盐酸水溶液捏溶，将酸溶液于2℃低温冷藏24小时，除去上层的脂溶性杂质，取酸水液；

实施例2

关白附总生物碱的制备方法包括如下步骤：

步骤1：取关白附药材，粉碎成20目粗粉，在10℃下用3倍量95%乙醇冷浸提取2次，每次36小时，合并提取液，回收溶剂，得浸膏；

步骤2：取步骤1得到的浸膏，以3倍量0.5mol/l的盐酸水溶液捏溶，将酸溶液于2℃低温冷藏24小时，除去上层的脂溶性杂质，取酸水液；

实施例3

关白附总生物碱的制备方法包括如下步骤：

步骤5：将步骤4得到的总生物碱用乙醇溶解，加盐酸调节pH=3，静置，抽滤，析晶，即得关白附总生物碱盐。

实施例4

关白附总生物碱盐的制备方法包括如下步骤：

步骤1：取关白附药材，粉碎成20目粗粉，在30℃下用8倍量75%乙醇冷浸提取3次，每次12小时，合并提取液，回收溶剂，得浸膏；

步骤2：取步骤1得到的浸膏，以2倍量1.5mol/l的盐酸水溶液捏溶，将酸溶液于2℃低温冷藏12小时，除去上层的脂溶性杂质，取酸水液；

步骤4：将步骤3中经氨水碱化的溶液迅速用乙酸乙酯萃取4次，取乙酸乙酯层，回收溶剂，真空干燥，得关白附总生物碱；

实施例5

关白附总生物碱盐片剂的制备：

将实施例5制备的关白附总碱盐、SMCC 90（含98%的MCC 102和2%的微粉硅胶）、磷酸氢钙二水合物、胶态二氧化硅、硬脂酸镁按重量比为50：72：25：3：0.75的比例，先将原料药与胶态二氧化硅预混，然后加入稀释剂SMCC 90和磷酸氢钙二水合物，最后加入润滑剂硬脂酸镁，混匀，压片，即得关白附总碱盐片剂。

所述片剂日服用剂量为90-150mg/65kg。

实施例6

关白附总生物碱的制备方法包括如下步骤：

步骤1：取关白附药材，粉碎成20目粗粉，在10℃下用3倍量乙酸乙酯冷浸提取2次，每次36小时，合并提取液，回收溶剂，得浸膏；

步骤2：取步骤1得到的浸膏，以3倍量0.5mol/l的醋酸水溶液捏溶，将酸溶液于2℃低温冷藏12小时，除去上层的脂溶性杂质，取酸水液；

步骤3：取步骤2得到的酸水液，用丙酮萃取4次，酸水母液加氨水调节pH=8；

Claims

1.关附壬素在制备药物代谢酶抑制剂中的应用，所述药物代谢酶为CYP2D6；

其中，CYP2D6代谢的药物为阿米替林、丙咪嗪、氯米帕明、地昔帕明、去甲替林、氟西汀、帕罗西汀、顽发克星、卡维地洛、普萘洛尔、美托洛尔、阿普洛尔、丁呋洛尔、噻吗洛尔、布尼洛尔、氯丙嗪、奋乃静、瑞斯哌东、托哌酮、胍喹啶、吲哚拉明、乌拉地尔、派克昔林、特罗地林、曲马多、可待因、右美沙芬、恩卡尼、司巴丁、氟卡尼、普罗帕酮、美西律、茚丙胺。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于CYP2D6代谢的药物为右美沙芬。