CN110025659A - 一种具有抗hbv作用的中药活性部位及制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及天然药物化学技术领域，具体公开了一种具有抗HBV作用的中药活性部位及制备方法与应用。该方法是以中药苦豆子为原料，采用超临界二氧化碳萃取法萃取得到；所述的超临界二氧化碳萃取法的具体条件为：萃取压力为10～30兆帕，萃取温度为30～40℃，流速为5～15升/小时，萃取时间为2～3小时。由该方法制备得到的中药活性部位具有显著的抗HBV作用，且其抗HBV作用与现有治疗乙肝药物苦参素胶囊以及苦参素片中的主要成分氧化苦参碱的抗HBV作用相当甚至更强。

Description

一种具有抗HBV作用的中药活性部位及制备方法与应用
技术领域
本发明涉及天然药物化学技术领域，具体涉及一种具有抗HBV作用的中药活性部位及制备方法与应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染可引起急性和慢性乙型肝炎，是导致肝硬化、肝癌等严重肝脏疾患的最主要原因之一，长期以来一直都是一个严重的世界性医疗健康难题。据WHO统计，全世界约有20亿人曾经感染HBV，其中有3.5～4.0亿成为慢性携带者，有15％～40％的慢性HBV感染者可发展为肝硬化或肝细胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)，全球每年约有100万人死于HBV相关疾病。HBV是造成全球公共健康问题的主要病毒之一，严重威胁着人类的健康，尽管HBV疫苗的广泛应用和婴幼儿计划免疫项目的推广对乙肝的预防起到了积极的作用，但乙肝的治疗仍然是公众关注的棘手问题。过去十几年，核苷类似物的出现使乙肝的治疗有了重要的进展，然而长期用药引起耐药性病毒变异株的出现限制了它们的临床效果。因此，发现新机制的抗乙肝药物一直是药物研究的重点之一。
苦豆子为豆科槐属植物苦豆子(Sophoraalopecuroides L.)的干燥种子，又名苦豆根、苦甘草、布亚(维吾尔语)等。广泛分布于西亚及中亚地区，我国主要分布于西北一带。作为一种传统中药，苦豆子具有清热燥湿、止痛、杀虫之功效；传统上用于治疗痢疾，白带过多，湿疹，疮疖，顽癣等症。现代研究表明苦豆子的主要成分为生物碱类和黄酮类成分，苦豆子生物碱中的绝大多数为苦参碱型生物碱，其具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤和镇痛等多种药理活性。目前，苦豆子及其次生代谢产物已被制备成多种药物制剂应用于临床治疗中，如苦参素胶囊、苦参素片、苦参碱注射液、苦参碱栓、苦参碱肠溶片、苦豆子片、苦豆子油搽剂、克泄灵片等等。其中，苦参素胶囊、苦参素片是临床常用的治疗慢性乙型肝炎的药物，其主要成分为氧化苦参碱，在我国已经应用十多年，主要用于治疗慢性乙型肝炎，以及放疗和化疗引起的白细胞减少等，其抗乙型肝炎病毒的效应已被越来越多的基础研究与临床研究所证实。因此，以苦豆子为基础，继续开发具有抗HBV作用的有效成分具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种具有抗HBV作用的中药活性部位及其制备方法与应用，由该方法制备得到的中药活性部位的抗HBV作用效果显著。
本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
一种具有抗HBV作用的中药活性部位的制备方法，以中药苦豆子为原料，采用超临界二氧化碳萃取法萃取得到；
所述的超临界二氧化碳萃取法的具体条件为：萃取压力为10～30兆帕，萃取温度为30～40℃，流速为5～15升/小时，萃取时间为2～3小时。
优选地，所述的超临界二氧化碳萃取法的具体条件为：萃取压力为15兆帕，萃取温度为35℃，流速为10升/小时，萃取时间为2.5小时。
优选地，所述的超临界二氧化碳萃取法，还使用乙酸乙酯作为夹带剂。
进一步优选地，所述夹带剂的质量用量为苦豆子质量的10％～15％。
优选地，所述的苦豆子经超临界二氧化碳萃取法萃取后，将得到的苦豆子萃取物再进行ODS柱层析；
所述的ODS柱层析的具体方法为：将苦豆子萃取物上ODS柱，先用体积分数为40～50％的甲醇洗脱除杂；再用体积分数为70～80％的甲醇洗脱；收集体积分数为70～80％的甲醇洗脱部位，浓缩干燥即得所述的具有抗HBV作用的中药活性部位。
进一步优选地，所述的ODS柱层析的具体方法为：将苦豆子萃取物上ODS柱，先用体积分数为45％的甲醇洗脱除杂；再用体积分数为75％的甲醇洗脱；收集体积分数为75％的甲醇洗脱部位，浓缩干燥即得所述的具有抗HBV作用的中药活性部位。
优选地，先用2～5倍柱体积的体积分数为40～50％的甲醇洗脱除杂；再用3～6倍柱体积的体积分数为70～80％的甲醇洗脱。
进一步优选地，先用3倍柱体积的体积分数为40～50％的甲醇洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积分数为70～80％的甲醇洗脱。
所述柱体积是指用ODS填料装柱后，从柱底到ODS填料沉积表面的体积。
本发明还提供一种由上述制备方法制备得到的具有抗HBV作用的中药活性部位。
本发明同时提供所述的具有抗HBV作用的中药活性部位在制备乙肝药物中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供了一种全新的具有抗HBV作用的中药活性部位的制备方法，由该方法制备得到的中药活性部位具有显著的抗HBV作用，且其抗HBV作用与现有治疗乙肝药物苦参素胶囊以及苦参素片中的主要成分氧化苦参碱的抗HBV作用相当甚至更强；
(2)由于本发明所述的中药活性部位抗HBV作用显著，可以用于开发治疗乙肝药物。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
实施例1具有抗HBV作用的中药活性部位的制备
具有抗HBV作用的中药活性部位是以中药苦豆子为原料，采用超临界二氧化碳萃取法萃取即得所述的具有抗HBV作用的中药活性部位；
所述的超临界二氧化碳萃取法的具体条件为：以乙酸乙酯作为夹带剂。夹带剂的用量为苦豆子质量的10％～15％；萃取压力为15兆帕，萃取温度为35℃，流速为10升/小时，萃取时间为2.5小时。
实施例2具有抗HBV作用的中药活性部位的制备
具有抗HBV作用的中药活性部位是以中药苦豆子为原料，采用超临界二氧化碳萃取法萃取得到；
所述的超临界二氧化碳萃取法的具体条件为：以乙酸乙酯作为夹带剂。夹带剂的用量为苦豆子质量的10％～15％；萃取压力为15兆帕，萃取温度为35℃，流速为10升/小时，萃取时间为2.5小时；
进一步地，将经超临界二氧化碳萃取法萃取后得到的苦豆子萃取物再进行ODS柱层析；
所述的ODS柱层析的具体方法为：将苦豆子萃取物上ODS柱，先用3倍柱体积的体积分数为45％的甲醇洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积分数为75％的甲醇洗脱；收集体积分数为75％的甲醇洗脱部位，浓缩干燥即得所述的具有抗HBV作用的中药活性部位。
对比例1中药活性部位的制备
所述中药活性部位是以中药苦豆子为原料，采用超临界二氧化碳萃取法萃取得到；
所述的超临界二氧化碳萃取法的具体条件为：以乙酸乙酯作为夹带剂。夹带剂的用量为苦豆子质量的10％～15％；萃取压力为15兆帕，萃取温度为35℃，流速为10升/小时，萃取时间为2.5小时；
进一步地，将经超临界二氧化碳萃取法萃取后得到的苦豆子萃取物再进行ODS柱层析；
所述的ODS柱层析的具体方法为：将苦豆子萃取物上ODS柱，先用3倍柱体积的体积分数为20％的甲醇洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积分数为50％的甲醇洗脱；收集体积分数为50％的甲醇洗脱部位，浓缩干燥即得所述的中药活性部位。
对比例1与实施例2的区别在于ODS柱层析的具体方法不同；因此，其富集的有效成分也不同。对比例1的洗脱条件为先用3倍柱体积的体积分数为20％的甲醇洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积分数为50％的甲醇洗脱；收集体积分数为50％的甲醇洗脱部位；而实施例2的洗脱条件为先用3倍柱体积的体积分数为45％的甲醇洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积分数为75％的甲醇洗脱；收集体积分数为75％的甲醇洗脱部位。
实施例3中药活性部位抗HBV病毒活性测试
实验分组：
分别测试实施例1制备得到的具有抗HBV作用的中药活性部位(实验组1)、实施例2制备得到的具有抗HBV作用的中药活性部位(实验组2)、对比例1制备得到的中药活性部位(实验组3)以及氧化苦参碱(对照组)的抗HBV病毒活性。
实验方法：
取HepG2.2.15细胞用MEM培养液稀释至4×104/孔接种于24孔板，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中，培养24h。待细胞达到90％汇合度时，弃去上清，然后加入系列浓度(浓度范围为0.1～200μg/mL)的各实验组药物稀释液(1.0mL)。同条件下继续培养，每天换新鲜的原浓度药液继续培养，共加药培养9天。以氧化苦参碱为阳性对照，无药物培养基为空白对照，每组实验做3个复孔。按试剂盒说明书操作提取细胞的DNA(TakaRaMiniBEST Viral RNA/DNA extraction kit Ver.5.0)。利用real time PCR量化细胞HBV DNA水平。并计算抑制50％HBV DNA表达的浓度，即IC50值。具体结果参见表1。
表1.抗HBV活性测试结果
由表1抗HBV活性测试数据可以看出，实验组1由本发明实施例1经超临界二氧化碳萃取法制备得到的中药活性部位具有一定的抗HBV活性，但与对照组氧化苦参碱的活性相差较大。实验组2由本发明实施例2经超临界二氧化碳萃取法萃取，再经ODS柱层析得到的中药活性部位的IC50值小于对照组氧化苦参碱的IC50值。这说明经超临界二氧化碳萃取后进一步经ODS柱层析方法制备得到的中药活性部位具有很好的抗HBV活性，其抗HBV作用优于氧化苦参碱的抗HBV作用。
此外，从实验组2和实验组3试验数据可以看出，实施例2制备得到的中药活性部位其抗HBV的IC50值远远小于对比例1制备得到的中药活性部位；这说明经本发明所述超临界二氧化碳萃取后再在实施例2所述ODS柱层析的洗脱条件下才能富集到抗HBV效果更优异的中药活性部位，而在其它ODS柱层析的洗脱条件下得不到如本发明优异效果的中药活性部位。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有抗HBV作用的中药活性部位的制备方法，其特征在于，以中药苦豆子为原料，采用超临界二氧化碳萃取法萃取得到；
所述的超临界二氧化碳萃取法的具体条件为：萃取压力为10～30兆帕，萃取温度为30～40℃，流速为5～15升/小时，萃取时间为2～3小时。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的超临界二氧化碳萃取法的具体条件为：萃取压力为15兆帕，萃取温度为35℃，流速为10升/小时，萃取时间为2.5小时。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还使用乙酸乙酯作为夹带剂。
4.根据要求3所述的制备方法，其特征在于，所述夹带剂的质量用量为苦豆子质量的10％～15％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的苦豆子经超临界二氧化碳萃取法萃取后，将得到的苦豆子萃取物再进行ODS柱层析；
所述的ODS柱层析的具体方法为：将苦豆子萃取物上ODS柱，先用体积分数为40～50％的甲醇洗脱除杂；再用体积分数为70～80％的甲醇洗脱；收集体积分数为70～80％的甲醇洗脱部位，浓缩干燥即得所述的具有抗HBV作用的中药活性部位。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的ODS柱层析的具体方法为：将苦豆子萃取物上ODS柱，先用体积分数为45％的甲醇洗脱除杂；再用体积分数为75％的甲醇洗脱；收集体积分数为75％的甲醇洗脱部位，浓缩干燥即得所述的具有抗HBV作用的中药活性部位。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，先用2～5倍柱体积的体积分数为40～50％的甲醇洗脱除杂；再用3～6倍柱体积的体积分数为70～80％的甲醇洗脱。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，先用3倍柱体积的体积分数为40～50％的甲醇洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积分数为70～80％的甲醇洗脱。
9.权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到的具有抗HBV作用的中药活性部位。
10.权利要求9所述的具有抗HBV作用的中药活性部位在制备乙肝药物中的应用。
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