CN102695802A - 生物质的分室同步糖化和发酵 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了同步糖化和发酵生物质的方法和设备，它们提供降低酶解终产物抑制的分室糖化方法和发酵方法。

Description

生物质的分室同步糖化和发酵
发明领域
本公开涉及生物质糖化和所产生的糖发酵领域。具体地讲，公开了同步糖化和发酵生物质的方法和设备，它们提供降低酶解终产物抑制的分室糖化方法和发酵方法。
发明背景
生物质(纤维质和木质纤维质)原料以及垃圾例如农业残余物、木材、林业垃圾、来自造纸业的淤渣和市政及工业固体垃圾提供了潜力巨大的用于生产化学品、塑料、燃料和饲料的可再生原料。由碳水化合物聚合物(包括纤维素、半纤维素和果胶)组成的纤维质的和木质纤维质的原料以及垃圾一般用多种化学、机械和酶(酶解糖化)方法进行处理以释放主要的己糖和戊糖，它们然后能由微生物转化产生有用的产物。
酶解糖化生物质导致纤维二糖和葡萄糖在糖化容器中积聚，从而产生外纤维素酶的终产物抑制，并减慢纤维素水解速率。也产生木乙糖，所述木乙糖导致木聚糖酶的反馈抑制，从而减慢了半纤维素水解速率。葡聚糖和木聚糖水解的速率减慢可通过加入较高浓度的酶来部分缓解，然而这种解决方案增加了方法成本。
以前用于解决酶解糖化期间的终产物抑制的方法包括：使用同步糖化和发酵(SSF；Takagi，M.等人，In：Process Bioconversion Symposium，551-571，1977)，其中组合了糖化和发酵两个步骤。
在生物燃料生产期间在SSF中组合所述两步方法具有较低的资本成本并且生物燃料产物的存在降低了发酵污染的风险(Wyman，C.E.等人，Biomass Bioenergy，3：301-307，1992)。此外，在该方法中形成的葡萄糖被发酵微生物消耗，从而减轻了β-葡萄糖苷酶和纤维二糖水解酶二者的终产物抑制。从而加快了从纤维素中形成纤维二糖及其水解成葡萄糖的速度，提高了纤维素转化成葡萄糖的速率。另一种减轻葡萄糖终产物抑制的方法描述于(WO 2006/101832)中，其中所述葡萄糖转化成果糖和木糖转化成木酮糖的可逆转化部分地减轻了终产物抑制。
Klei等人(Biotechnol.Bioeng.Symp.(1981)11 Symp.Biotechnol.Energy Prod.Conserve.，3：593-601)讨论了使用来自海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)的固定化β-葡萄糖苷酶在中空纤维超滤膜滤芯中作为酶反应器，从而水解纤维二糖。该系统也用于在纤维素糖化期间循环利用来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶。应用中空纤维膜允许连续加工纤维素并显著地减少对纤维素酶的需求。
在US 4,220,721中，通过吸附到固体支持体上的可重复使用的内葡聚糖酶和纤维二糖水解酶进行同步糖化和发酵。
CN101173306描述了在中空纤维膜反应器中组合使用酶水解和连续发酵以从汽爆秸秆中制造丙酮和丁醇的过程。它表明用于酶水解秸秆的纤维素酶可使用高效的和低成本的膜反应器回收利用。
上述方法各自部分地改善了糖化方法并最低限度地减轻了糖化期间的终产物抑制。
尽管本领域公开了多个方法，但仍需要较有效的方法来解决同步糖化和发酵期间酶解糖化的终产物抑制问题。
发明内容
本公开通过提供分室同步糖化和发酵预处理的生物质的方法和设备，使用其中多价螯合了某些低聚糖水解酶的中空纤维循环回路解决了上述问题。所述方法和设备移除了在预处理的生物质糖化期间可引起糖化酶反馈抑制的生物质组分，从而改善了在糖化期间的可发酵糖释放并通过提高糖化效率增加了目标产物的产量。
本发明的一个方面涉及用于加工预处理的生物质的设备，所述设备包括：糖化容器和分开的发酵容器，其中所述容器由两个外部的循环回路和连接两个外部循环回路的中空纤维循环回路连接，并且包括半透膜，其中所述设备提供预处理的生物质的分室同步糖化和发酵。
在另一方面，提供了如图2所示的设备，其中所述设备包括糖化容器(1)，其与第一外部循环回路(2)连接，并且其中所述第一外部循环回路(2)位于中空纤维循环回路(3)的第一半透膜(10)的外部并与其连接；并且所述中空纤维循环回路(3)与第二外部循环回路(4)连接，所述第二外部循环回路位于中空纤维循环回路(3)的第二半透膜(11)的外部并与其连接；并且所述第二外部循环回路(4)与具有目标产物(6)出口的发酵容器(5)连接。这个设备还可包括一系列循环泵，所述循环泵包括用于第一外部循环回路(2)的第一循环泵(7)；用于第二外部循环回路(4)的第二循环泵(8)；用于内部中空纤维回路(3)的第三循环泵(9)。
在另一方面，提供了加工预处理的生物质的方法，所述方法包括：
(a)提供如图2中所述的本发明设备，
(b)将预处理批量生物质和糖化酶聚生体的混合物提供到所述设备的糖化容器(1)中，其中所述混合物通过糖化来产生高分子量和低分子量组分二者；
(c)提供至少一种在中空纤维循环回路(3)中的多价螯合的酶；
(d)通过第一循环回路经第一中空纤维半透膜(10)递送一定量(b)的混合物，从而(b)的混合物的所述高分子量组分不扩散通过所述膜，而所述混合物的所述低分子量组分扩散通过所述膜进入中空纤维循环回路(3)；
(e)通过在所述中空纤维循环回路中的所述至少一种多价螯合的酶来水解(d)中扩散到中空纤维循环回路(3)中的低分子量组分，从而形成包含可发酵糖的水解产物；以及
(f)递送包含可发酵糖的水解产物渗过第二半透膜(11)进入第二循环回路(4)并进入发酵容器(5)；
其中预处理的生物质组分通过循环泵而遍及所述设备循环。在另一方面，递送到(f)的发酵容器的(e)的可发酵糖由至少一种微生物转化成至少一种目标产物。
在上述方法的另一方面，第一半透膜和第二半透膜的存在通过阻止一种或多种多价螯合的酶扩散到所述糖化容器和发酵容器中来防止其损失。
在上述方法的另一方面，将由所述多价螯合的酶对生物质的作用形成的水解产物递送到所述发酵容器中以减轻糖化容器中的终产物反馈抑制。
在上述方法的另一方面，所述第一半透膜和第二半透膜的分子量渗透性为约10至约30千道尔顿。
在本发明的另一方面，提供了分室同步糖化和发酵预处理的生物质的方法，所述方法包括(a)将预处理的生物质和糖化酶聚生体提供到糖化容器中，从而形成糖化产物并且所述糖化产物移动通过一个或多个半透膜通过至少一个隔室，所述隔室包含一种或多种附加的多价螯合的酶，从而形成包含可发酵糖的水解产物；以及(b)将所述水解产物递送到分开的发酵容器中以发酵成目标产物。
附图简述
图1A和1B：图1A描述了在不同糖化酶比率下，0-120小时的糖化时间段从酸/碱预处理的蔗渣中获得的单体葡萄糖的理论产量，其以百分比表示。糖化在50mM NaCitrate，pH 4.6，1％Tween 20(w/v)和0.01％NaN3(w/v)的存在下进行，固体载量为11％。
Figure BPA00001559839100041
CP纤维素酶、
Figure BPA00001559839100042
木聚糖酶和Novozyme 188酶的酶比率(mg蛋白/g纤维素)分别为：4∶3∶8、8∶3∶4、6∶3∶6、6∶6∶12、12∶6∶1.2和12∶6∶12。图1B示出了在120小时不同酶比率下图1A的单体葡萄糖产量的比较。
图2是分室同步糖化和发酵设备的示意图，其中分开的糖化容器和发酵容器由两个外部循环回路和中空纤维循环回路连接。
发明详述
申请人特别在该公开中加入了所有引用的参考文献的全部内容。除非另行指出，所有百分数、份数、比率等均按重量计。商标以大写体标示。此外，当数量、浓度或其它数值或参数以范围、优选的范围或优选的上限数值和优选的下限数值的列表形式给出时，其应被理解为具体地公开由任何范围上限或优选的数值和任何范围下限或优选的数值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。除非另行指出，凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围均旨在包括其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数。当定义一个范围时，不旨在将本发明的范围限定于所列举的具体值。
本发明的设备和方法利用中空纤维半透膜与连接分开的糖化和发酵容器的中空纤维循环回路减轻在分室同步糖化和发酵(CSSF)期间酶解糖化的终产物抑制。
定义
为清楚起见，本文使用的术语应理解为如本文所述，或如本发明的领域中的普通技术人员所理解的那样。此外，本文所使用的某些术语的解释提供如下：
“葡萄糖”是包含六个碳原子的单糖，其化学式为C6H12O6，在C1上具有一个醛(半缩醛)官能团。
“葡聚糖”是指通过糖苷键连接的β-1，4-连接的D-葡萄糖单体多糖。
“阿拉伯糖”是包含五个碳原子的单糖，它包含醛官能团。
“木糖”是包含五个碳原子的单糖，其化学式为C5H10O5，在C1上具有一个醛(半缩醛)官能团。
“纤维二糖”是来源于两个葡萄糖分子缩合的二糖，所述两个分子通过β(1，4)糖苷键连接。
“纤维二糖水解酶”是指裂解纤维素在还原和非还原末端的纤维二糖单元的酶。
“木乙糖”是木糖单体的二糖，所述单体间有β-1，4糖苷键。
“β-木聚糖苷酶”是指裂解木糖的一组酶，所述木糖包含通过β-糖苷键(例如木乙糖)连接的单体。
“β-木聚二糖苷酶”是将木乙糖水解成木糖的酶。
“木聚糖”是指一种直链多糖，其主要由β-1，4-连接的D-木糖单位组成，它可包含具有其它糖如L-阿拉伯糖和D-木糖的支链。
“木聚糖酶”是指将直链聚-和低聚β-1，4-木聚糖降解成木糖和木糖低聚物的酶。一些木聚糖酶将作用于木糖的支链低聚物。
“β-葡萄糖苷酶”是作用于b1-＞4键的酶，所述键连接两个葡萄糖或葡萄糖取代分子(即，二糖纤维二糖)。它催化β-D-葡糖苷的末端非还原残基水解，释放葡萄糖。
“阿拉伯呋喃糖苷酶”是指水解包含阿拉伯糖的木聚糖末端非还原α-L-阿糖残基的酶。
“外纤维素酶”是指从纤维素的还原和非还原末端释放纤维二糖的酶。
“支链木糖低聚物”是指在低聚木糖主链上存在阿拉伯糖和木糖支链的物质。
“支链木糖低聚物水解酶”是指水解支链木糖低聚物的木聚糖酶。
“半透膜”和“半透膜过滤器”本文互换使用，并且指用作物理屏障的膜，它仅允许达到一定大小、形状或特性的物质通过。本文方法可用的半透膜实例包括由一种或多种聚砜、羟基化聚砜、聚醚砜、羟基化聚醚砜、磺化聚砜、聚醚酮、聚醚醚酮、聚酰亚胺和聚醚酰亚胺制成的膜，...
“中空纤维半透膜”和“中空纤维半透膜过滤器”是由中空和半透性的纤维制成的半透膜类型。在中空纤维半透膜中存在较大的表面积/体积比。
“第一半透膜”是指允许得自生物质糖化的某些组分从糖化容器中渗过其进入中空纤维循环回路的中空纤维半透膜。
“第二半透膜”是指允许由中空纤维循环回路中的多价螯合的酶产生的糖渗过其进入第二外部循环回路的中空纤维半透膜。第一和第二中空纤维半透膜二者均由类似的材料制成，例如上文所述的那些材料。
“目标产物的选择性移除”或“选择性移除的目标产物”是指移除发酵容器中的目标产物并且不移除任何其它组分。
“分室同步糖化和发酵(CSSF)”在本文上下文中是指其中一种或多种糖的发酵和预处理的生物质的糖化在由至少一个循环回路连接的分开的容器中同步进行的方法。
“发酵”是指利用微生物将化学底物(经由有氧或者厌氧的过程)转化成目标产物。
“发酵容器”是指可用于本文的任何适用容器，所述容器适用于通过微生物将底物发酵成目标产物。
“水解产物”是指来源于生物质糖化的产物。在水解产物中的糖化产物将取决于不同的水解糖化酶和不同的水解时间。有效的糖化产生包含可发酵糖的水解产物。
“可发酵糖”是指主要包括单糖(仍可存在一些多糖)的糖内容物，在生产目标产物的发酵过程中微生物可利用它们作为碳源。
“循环泵”是指使得液体悬浮在不同循环回路中以循环并通过设备的泵。
“目标产物”是指发酵产生的化学制品、燃料、或化学结构物。产物按广义使用，并且包括分子如蛋白质，包括例如肽、酶和抗体。预期乙醇和丁醇也包括在目标产物的定义之内。
“生物质”是指任何木质纤维质的材料，包括纤维质的和半纤维质的材料，例如生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、庭院垃圾、木材、林业垃圾以及它们的组合，下文将进一步进行描述。这种生物质具有包括多糖和低聚糖的碳水化合物成分，并且还可包含附加组分，例如木质素、蛋白质和脂质。
“预处理的生物质”是已经通过促使酶解糖化的任何装置处理过的生物质。
“糖化”或“酶解糖化”是指通过水解酶的作用，从多糖产生可发酵的糖类。可发酵的糖类经过预处理的生物质的生产，通过由纤维素分解酶和半纤维素分解酶的酶解糖化而实现。
“糖化容器”是指适用于本文生物质糖化的任何容器。糖化容器可包含预处理的生物质，其中发生酶解糖化。
“酶聚生体”或“糖化酶聚生体”是水解酶的集合。这些酶通常由微生物分泌。糖化酶聚生体将通常包含一种或多种纤维素酶、木聚糖酶、糖苷酶和酯酶。在本发明中，加到糖化容器中的糖化酶聚生体不需要包含β-木聚糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶，因为在中空纤维循环回路中包括这些酶。
如本文所用，“多价螯合的酶”是指诸如β-葡萄糖苷酶、β-木聚糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶以及木聚糖酶的酶，它们被多价螯合在中空纤维循环回路内并能够水解葡萄糖低聚物和生物质的直链和支链木糖低聚物。
“终产物反馈抑制”是指当酶促反应的产物积聚时抑制导致其形成的反应的情况。在该公开中，例如外纤维素酶受纤维二糖以及在某种程度上受葡萄糖的反馈抑制，并且木聚糖酶受木乙糖以及在某种程度上受木糖的反馈抑制。β-葡萄糖苷酶受其产物葡萄糖的反馈抑制。β-木聚二糖苷酶受其产物木糖的抑制。
“循环回路”是指分别循环糖化或发酵容器的内容物经过邻近中空纤维循环回路的第一半透膜或第二半透膜的外表面的液体循环回路。
“第一外部循环回路”是使糖化容器的生物质和糖化酶聚生体通过中空纤维循环回路的第一半透膜外表面的液体循环回路。
“第二外部循环回路”是使发酵容器的内容物通过中空纤维循环回路的第二半透膜外表面以收集扩散穿过所述膜的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖并将它们递送到发酵容器的液体循环回路。
“中空纤维循环回路”是指包含第一和第二半透膜过滤器以及一种或多种多价螯合的酶的液体循环回路，其中发生酶促水解并且经由第一和第二外部循环回路，产物渗过第一和第二半透膜在糖化和发酵容器之间运输。
“选择性递送某些组分”是指将来自糖化容器的糖化生物质的一定大小的组分(例如低聚糖如纤维二糖、木乙糖和支链木糖低聚物)通过第一半透膜过滤器递送到中空纤维循环回路并通过第二半透膜过滤器递送到发酵容器。
“高分子量组分”是指分子量大于30KD的生物质组分，它们不能扩散通过中空纤维回路的半透膜过滤器。
“低分子量组分”是指分子量小于30KD的生物质组分，它们能够扩散通过中空纤维回路的半透膜过滤器。
生物质
适用于本文所述方法的生物质包括但不限于，生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭园垃圾、木材和林业垃圾。生物质的实例包括但不限于玉米芯、作物残余如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、蔗渣、高粱、大豆，获取自谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木及矮树丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥的研磨物的组分。
生物质可来源于单一来源，或者它可包括来源于多于一种来源的混合物；例如生物质可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物，或茎或杆和叶的混合物。
在一个实施方案中，用于本发明的生物质包括具有相对高碳水化合物含量的生物质，它们相对密集，和/或相对易于收集、运输、贮存和/或处理。在另一个实施方案中，生物质可包括农业残余物如玉米秸秆、小麦秸秆、大麦秸秆、燕麦秸秆、稻秆、卡诺拉秸秆和大豆秸秆；草如柳枝稷、芒草、米草和草芦；纤维加工残余如玉米纤维、甜菜浆、纸浆厂残渣和废弃物以及蔗渣；高粱；林业垃圾如白杨木、其它硬木、软木和锯屑；和消费者用过的纸制品垃圾；以及其它作物或足够丰富的木质纤维质材料。在另一个实施方案中，有用的生物质包括玉米壳、玉米秸秆、蔗渣和柳枝稷。
在糖化前预处理生物质
在生物质中，结晶纤维素原纤维插入半纤维素基质中，继而半纤维素基质被外部的木质素层包围。预处理生物质通常需要改变木质素屏障以进行随后较有效的酶促糖化过程。预处理生物质使其为糖化做好准备的方法是本领域熟知的(例如Hsu，T.-A.，1996，“Pretreatment of Biomass”，inHandbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.，ed.，Taylor&Francis，Washington，D.C.，179-212；Ghosh，P.，Singh，A.，1993和US 7503981、US7,504,245、US 7,4138,82、WO2008/112291)。一些预处理方法为例如稀酸水解(T.A.Lloyd和C.E Wyman，BioresourceTechnol.，96：1967，2005)、氨纤维爆破(AFEX)技术(F.Teymouri等人，Bioresource Technol.，96：2014，2005)、pH控制液体热水处理(N.Mosier等人，Bioresource Technol.，96：1986，2005)、氨水循环方法(ARP)(T.H.Kim和Y.Y.Lee，Bioresource Technol.，96：2007，2005)、石灰预处理(S.Kim和M.T.Holzapple，Bioresource Technol.，96：1994，2005)和离子液体预处理(US 2008/0227162)。
就生物质预处理而言，温度、pH、预处理时间和反应物浓度、一种或多种附加的试剂的浓度、生物质浓度、生物质类型和粒度是相关的；因此必要时可调节每种生物质的这些变量以优化预处理方法。
本方法的生物质可通过上述任何方法预处理。作为另外一种选择，在一个实施方案中，为了制备本糖化方法的生物质，可在开始时用100mMH2SO4在121℃预处理1小时并用水洗涤。
在一个实施方案中，可进一步将生物质残余悬浮在包含2.9％NaOH(w/v)的69％EtOH(v/v)中并在不锈钢压力容器(19mL容量)内以175℃的温度加热140分钟，冷却至室温，过滤并用69％EtOH洗涤以除去非期望的降解产物和木质素片段。在另一个实施方案中，可风干预处理的生物质。干燥可通过常规手段进行，例如暴露在环境温度至真空或在大气压下通风和/或烘箱中或真空炉中加热。
然后可使用本领域熟知的分析装置分析干燥的预处理的生物质以测定葡聚糖、木聚糖和酸不溶性木质素的浓度。干燥的预处理的生物质的葡聚糖和木聚糖含量用于测定糖化方法中需要的酶载量。
糖化
预处理的生物质可在存在糖化酶聚生体的条件下水解以在水解产物中释放低聚糖和/或单糖。可加入表面活性剂如Tween 20或Tween 80或聚氧乙烯如PEG 2000、4000或8000以改善糖化方法。也可使用其它表面活性剂如在美国专利7,354,743B2中描述的那些，该专利以引用方式并入本文。用于生物质处理的糖化酶和方法参见Lynd，L.R.，等人(Microbiol.Mol.Biol.Rev.，66：506-577，2002)。糖化酶聚生体可包含一种或多种糖苷酶；所述糖苷酶可选自纤维素水解糖苷酶、半纤维素水解糖苷酶和淀粉水解糖苷酶。糖化酶聚生体中的其它酶可包括肽酶、脂肪酶、木素酶和乙酰酯酶及阿魏酸酯酶。
糖化酶聚生体包括一种或多种酶，所述酶主要选自但不限于：“糖苷酶”类，所述酶水解二糖、低聚糖和多糖的糖苷键，存在于广义“水解酶”(EC 3.)的分类酶EC 3.2.1.x中(Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，San Diego，CA with Supplement 1(1993)，Supplement 2(1994)，Supplement 3(1995，Supplement 4(1997)和Supplement 5[分别在Eur.J.Biochem.，223：1-5，1994；Eur.J.Biochem.，232：1-6，1995；Eur.J.Biochem.，237：1-5，1996；Eur.J.Biochem.，250：1-6，1997；和Eur.J.Biochem.，264：610-650，1999])。本发明的方法中可用的糖苷酶能根据它们水解的生物质组分进行分类。本发明的方法可用的糖苷酶包括纤维素水解糖苷酶(例如，纤维素酶、内葡聚糖酶、外葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶)、半纤维素水解糖苷酶(例如，木聚糖酶、内木聚糖酶、外木聚糖酶、β-木聚糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡糖醛酸酶)和淀粉水解糖苷酶(例如，淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、异淀粉酶)。支链木糖低聚物水解酶水解包含木糖和阿拉伯糖，例如L-α-阿拉伯呋喃糖苷酶的支链低聚物。
此外，它可用于将其它活性加入糖化酶聚生体中，如肽酶(EC3.4.x.y)、脂肪酶(EC 3.1.1.x和3.1.4.x)、木素酶(EC 1.11.1.x)和乙酰酯酶(EC 3.1.1.6)以及阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)，以帮助从生物质的其它组分中释放多糖。本领域熟知产生多糖水解酶的微生物常常表现出某种活性，如纤维素降解，该活性由若干种酶或一组具有不同底物特异性的酶催化。因此，来自微生物的“纤维素酶”可包括一组酶，该组酶可全部有助于纤维素水解活性。取决于获取酶时利用的纯化方案，商业或非商业酶制剂，如纤维素酶，可包括多种酶。因此，本发明方法的糖化酶聚生体可包括酶活性，如“纤维素酶”，然而人们认识到该活性可被多于一种的酶催化。
如上文所述，在本发明中，加到糖化容器中的糖化酶聚生体不需要包含β-木聚糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶。一种或多种这些酶将被多价螯合在中空纤维循环回路内。作用于聚木糖和低聚木糖二者的木聚糖酶可被包括在糖化容器中的糖化酶聚生体中，也可被多价螯合在中空纤维循环回路内。
糖化酶可以分离形式商购获得，例如
Figure BPA00001559839100111
CP纤维素酶(Genencor International，Rochester，NY)和
Figure BPA00001559839100112
木聚糖酶(Genencor)。此外糖化酶可为未纯化的并以细胞提取物或完整细胞制剂的形式提供。可使用重组微生物制备所述酶，该微生物已被工程化以表达多种糖化酶。本领域的技术人员将了解如何测定用于聚生体的酶的有效量并调节条件以达到最佳酶活性。本领域的技术人员也将懂得如何优化在复合酶中的此类酶的所需活性，以在选择条件下获得给定预处理产物的最佳糖化效果。
优选地，糖化反应在糖化酶的最佳温度和pH下或接近此最佳pH和温度的条件下进行。本发明方法中使用的糖化酶聚生体的最佳温度范围为约15℃至约100℃。在另一个实施方案中，最佳温度范围为约20℃至约80℃，最典型地为45-50℃。最佳pH范围可为约2至约11。另一个实施方案中，在本发明的方法中，糖化酶聚生体使用的最佳pH范围为约4至约5.5。
糖化可进行约若干分钟至约120小时，优选约若干分钟至约48小时。反应时间将取决于酶浓度和比活性，以及使用的底物、其浓度(即载入的固体)和环境条件如温度和pH。本领域的技术人员能够容易地决定特定底物和糖化酶聚生体使用的温度、pH和时间的最佳条件。
糖化可分批进行或以连续方法进行。糖化也可一步进行或多步进行。例如，糖化所需的不同酶可表现出不同的最佳pH或温度。可用酶在某个温度和pH下进行首次处理，随后使用不同酶在不同温度和/或pH下进行第二次或第三次(或更多次)处理。此外，用不同酶在连续步骤中进行的处理可以在相同pH和/或温度下进行，或在不同pH和温度下进行，例如使用在较高pH和温度下稳定的和活性更高的半纤维素酶处理，随后用在较低pH和温度下有活性的纤维素酶处理。
糖化后来自生物质的糖的溶解度可通过测量释放的单糖和低聚糖进行监控。测量单糖和低聚糖的方法是本领域熟知的。例如，还原糖的浓度可使用1，3-二硝基水杨酸(DNS)检测分析法(Miller，G.L.，Anal.Chem.，31：426-428，1959)测定。作为另外一种选择，可使用适当的柱，经由HPLC测定糖，如下文所述。
分室SSF
在本发明方法中，开发出分室SSF(CSSF)以消除在预处理的生物质糖化期间通常存在于糖化酶聚生体中的一些糖化酶的反馈抑制。在一些情况下，可通过将一些酶加入到糖化容器中，因此减少糖化期间由于反馈抑制导致的酶活性损失来部分克服产物反馈抑制。然而，添加较多的酶到糖化过程中虽然加速了水解反应，但这种做法是昂贵的并且增加了方法的总成本。为了消除由于糖化酶的终产物带来的它们的反馈抑制问题，需要不断的除去终产物以避免它们的积聚。
在这种情况下，通过应用CSSF并将一些水解酶糖化酶多价螯合在分开的隔室如中空纤维循环回路中减轻了反馈抑制。糖化容器中的酶底物经由第一半透膜过滤器透入分开的含酶隔室内降低了它们在糖化容器中的浓度，从而消除了糖化酶聚生体酶受它们的产物反馈抑制的可能。在含酶隔室中的多价螯合的酶(例如β-木聚糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶)将它们的底物水解成期望的单糖产物。所述产物移动通过第二半透膜，从而扩散到发酵容器中。第一半透膜和第二半透膜二者均具有10至约30kDa的截留分子量，它们将仅允许小分子渗过(即，可溶解的低聚糖，包括小支链木糖低聚物)。因此保留在分开的隔室中的多价螯合的酶不能渗过第一半透膜或第二半透膜。将二糖水解成它们的单糖并将它们转化成目标产物减少了糖化容器中的酶的终产物抑制。在中空纤维循环回路中的多价螯合的酶使得它们可在糖化期间重复使用，不需要酶复原过程。分开的糖化和发酵容器允许所述容器在不同温度下运行并且还防止发酵细胞粘附到未消化的生物质上。
中空纤维半透膜
在一个实施方案中，半透膜是中空纤维半透膜。中空纤维半透膜提供以下独特的有益效果：高膜堆积密度、高表面积/体积比、清洁设计并且由于它们的结构完整性和构造，它们能够经受渗透反压，因此带来系统设计和运行上的灵活性。
中空纤维半透膜用作物理屏障，它仅允许达到一定大小、形状或特性的物质通过并且是本领域熟知的(例如Hollow fiber manufacture and application，Chem.Technol，Rev.，volume 194，由J.Scott编辑，1981，Noyes Data Corp.，Park Ridge，NJ.和Synthetic membranes，由M.B.Chenweth编辑，第63页，1986，Harwood Academic Press，NY，NY以及Leeper，S.A.，Membrane separation in the recovery of biofuels and biochemiclas：an update review，Sep.Purif.Technol.，第99-194页，1992)。中空纤维半透膜的两个基本形态学是“各向同性”和“各向异性”。膜分离通过使用这些形态学来完成。
“各向异性”构型包含致密的、半透的超薄外皮，其覆盖在支持多孔结构上方。“各向同性”微孔聚砜半透膜可使用浇铸溶液和沉淀溶液制剂以及浇铸条件的特定组合进行制备。可用这种方法来产生中空纤维和平膜二者。各向同性的膜是无皮的并且特征在于整个膜均匀的孔隙率。为本文公开方法目的，两种类型的中空纤维半透膜均可使用。
因为在中空纤维过滤方法中不涉及相变化并且不需要潜在的加热，中空纤维半透膜系统具有适度的能量需求。此外，中空纤维半透膜具有大的每单位体积膜表面积。因此，虽然中空纤维半透膜的尺寸可能小于其它类型的膜，但它能够提供更高的性能。
中空纤维半透膜是柔性的并且它们能够通过或者“进-出”或者“出-进”过程进行过滤。此外，中空纤维半透膜具有比其它类型的单元操作更低的操作成本。中空纤维半透膜生物反应器是本领域已知的(WO2007/004170和WO2008/006494和WO2007/120449和US2002/0164731)以及(Engasser，J.M.等人，Chem.Eng.Sci.，35：99-105，1980和Kitano，H.与Ise，N.，Treands in Biotechnol.，2：5-7，1984)。中空纤维半透膜生物反应器可连续运行并具有高表面积/体积比的优点。在这些系统中，可使用“游离的”或“固定化的”生物催化剂(酶和/或微生物)。
可利用不同孔径的中空纤维半透膜用于任何类型的预期应用。就本发明方法而言，半透膜具有10至约30kDa的截留分子量，它将仅允许小分子渗过(即，可溶解的低聚糖，包括小支链木糖低聚物)，因此防止多价螯合在中空纤维循环回路区域内的大量酶扩散到糖化和发酵容器中并且将糖化容器中的预处理的生物质与中空纤维循环回路酶和发酵容器分离开来。
用于本发明方法的中空纤维半透膜可由诸如聚砜(PSf)、羟基化聚砜(OHPSf)、聚醚砜(PES)、羟基化聚醚砜(OHPES)、磺化聚砜、聚醚酮(PEK)、聚醚醚酮(PEEK)、聚酰亚胺(PI)、聚醚酰亚胺(PEI)、或它们的任何组合的材料制成。
应用中空纤维循环回路促进糖化并阻止酶抑制。
在一个实施方案中，本发明方法允许应用CSSF以糖化预处理的生物质并将所得糖发酵成所期望的目标产物，上述过程在经由中空纤维循环回路连接到一起的分开的糖化和发酵容器中进行，所述容器包含两个中空纤维半透膜。其中多价螯合至少一种低聚糖水解酶。
将预处理的生物质与糖化酶聚生体一起加入糖化容器，其中利用所述预处理的生物质产生高分子量和低分子量组分。糖化生物质组分通过第一循环回路被递送到第一中空纤维半透膜过滤器。半透膜防止预处理的生物质的高分子量组分扩散，同时允许可溶解的低分子量组分(小于30kDa)扩散。分子量组分渗过半透膜进入包含至少一种多价螯合的糖化酶的中空纤维循环回路。
在中空纤维循环回路内的多价螯合的酶作用于中空纤维循环回路中的一种或多种扩散的低分子量低聚糖，从而形成至少一种糖产物。从而形成的产物然后渗过第二半透膜过滤器进入第二循环回路并进入发酵容器，其中通过合适的微生物将它发酵成目标产物。
在一个实施方案中，多价螯合的酶可包括β-木聚糖苷酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶。糖化生物质的纤维二糖、木乙糖和支链木糖低聚物扩散通过所述第一中空纤维半透膜并进入中空纤维循环回路，其中分别通过β-葡萄糖苷酶、β-木聚二糖苷酶和支链木糖低聚物水解酶将它们水解成葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。通过使所述产物渗过第二半透膜到第二循环回路中并进入发酵容器中来减轻葡萄糖、木糖和阿拉伯糖对多价螯合的酶(例如β-葡萄糖苷酶、β-木聚糖苷酶、木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶)的任何反馈抑制，其中它们通过发酵生物催化剂而被消耗。然后经由第一外部循环回路回收利用多价螯合的酶，使其作用于来自糖化容器的较多底物。这个系统允许回收利用高性价比的多价螯合的酶，同时减轻在糖化容器和中空纤维循环回路二者中的酶的终产物反馈抑制。也可将多价螯合的酶固定化以使中空纤维循环回路的内容物通过包含固定化酶的基质。此类固定作用可提供附加的酶稳定性(例如对热变性的稳定性)。通过使用分开的容器，消除了与糖化和发酵的不同温度需求相关联的问题。可使用加热泵将在发酵容器中产生的热量或在多个容器间传递的热量递送到糖化容器。发酵容器中的微生物也不直接接触未消化的生物质，从而消除了由于细胞吸附到生物质上而带来的发酵能力的可能损失。也在不存在未消化的或未完全消化的生物质的情况下除去目标产物。
用于CSSF的设备和方法
在一个实施方案中，CSSF发生在加工预处理的生物质的设备中，所述设备包括：糖化容器和分开的发酵容器，其中所述容器由两个外部的循环回路和连接两个外部循环回路的中空纤维循环回路连接，并且包括半透膜，其中所述设备提供预处理的生物质的分室同步糖化和发酵。
图2示出了本发明设备的实施方案。该图示出了预处理的生物质的CSSF设备的示意流程图，其中分开的糖化和发酵容器如下由两个外部循环回路和一个中空纤维循环回路连接。糖化容器(1)；第一外部循环回路(2)；中空纤维循环回路(3)；第二外部循环回路(4)；发酵容器(5)；目标产物出口(6)；第一外部循环回路的第一循环泵(7)；第二外部循环回路的第二循环泵(8)；中空纤维回路的第三循环泵(9)；中空纤维循环回路的第一半透膜(10)和中空纤维循环回路(3)的第二半透膜(11)。
在一个实施方案中，利用图2设备的方法如下。糖化容器(1)的温度通常保持在35℃至55℃，其pH为4至约6，它包含部分地糖化的生物质，其具有纤维二糖、木乙糖、木糖低聚物和糖化酶聚生体。第一外部循环回路(2)递送糖化容器中的生物质和糖化酶聚生体经过第一中空纤维半透膜(10)外部，其内部是中空纤维循环回路(3)的部分。由于它们的大分子量，生物质的多糖和糖化聚生体的酶不能通过中空纤维半透膜进入中空纤维循环回路，而较小的分子如纤维二糖、木乙糖和支链木糖低聚物能够通过所述膜。将β-葡萄糖苷酶、β-木聚糖苷酶、木聚糖酶和支链木糖低聚物水解酶多价螯合在中空纤维循环回路内。β-葡萄糖苷酶作用于小的可溶解底物(纤维二糖)，其能够通过第一半透膜(10)。β-木聚二糖苷酶、β-木聚糖苷酶型酶也将能够渗过第一半透膜的木乙糖转化成木糖。支链木糖低聚物水解酶将能够通过第一半透膜的待水解支链木糖低聚物(例如通过α-1，2键连接到木糖低聚主链上的L-阿拉伯糖)转化成木糖和阿拉伯糖。因此，在中空纤维循环回路中产生的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖经由第二半透膜(11)和第二外部循环回路(4)被递送到发酵容器(5)，其中通过微生物将它们转化成目标产物。在中空纤维回路中的第二泵(9)连续再循环所述多价螯合的酶并允许它们在它们的相应反应中重复使用。重复使用的酶和所述方法总体较低的酶需求量导致显著的总成本降低。此外，公开的方法是独特的CSSF方法，它消除了对木质纤维质底物的需要并且不需要发酵微生物在相同容器中，因此克服了诸如温度不相容性的挑战。移除发酵容器(6)中的目标产物有助于推动完成整个过程。第一和第三外部回路泵(7)和(8)允许在糖化和发酵容器以及中空纤维循环回路中的多种组分再循环。
在这种方法中，因为微生物不直接接触未消化的生物质，因此消除了由于细胞吸附到生物质上带来的发酵能力的可能损失。
也通过诸如蒸馏、使用选择性渗透膜、全蒸发或其它合适的方法除去发酵容器中的目标产物，其不受存在的未消化生物质的阻碍。
糖化和发酵容器是本领域熟知的，并且本领域的普通技术人员熟悉它们的应用。
发酵生成目标产物
利用合适微生物的多种发酵方法可用于将从预处理糖化生物质中释放的可发酵糖转化成目标产物。就本发明方法而言，可使用分批补料或连续发酵系统。这些方法是本领域熟知的，并且本领域的普通技术人员熟悉它们的应用。“分批补料”发酵方法包括典型的分批体系，不同的是底物随着培养进行添加。分批发酵和补料分批发酵在本领域内是常用的且众所周知，并且实例可见于如下文献：Thomas D.Brock，Biotechnology：ATextbook of Industrial Microbiology，第二版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA.，或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227，(1992)，它们以引用方式并入本文。也期望本发明的方法适应于“连续”发酵方法。连续发酵是一种开放式系统，其中将发酵培养基连续加入到生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。
本发明可使用多种类型的培养基。此类培养基可补充有例如酵母提取物、特定氨基酸、磷酸盐、氮源、盐和微量元素。也可包括通过特定生物催化剂生产特定产品所需的组分，如用于保留质粒的抗生素或酶催化反应所需的辅因子。也可包括附加的糖以提高总糖浓度。
取决于发酵微生物使用的条件，也可调节温度和/或顶部空间气体。发酵可以是有氧的或厌氧的。根据本文所述方法，一种或多种糖的发酵和糖化同步发生，但是在分开的隔室中进行，并将其定义为分室同步糖化和发酵(CSSF)。
将糖发酵成目标产物可通过一种或多种合适的微生物如细菌、丝状真菌和酵母进行。可使用野生型微生物和重组微生物二者。此类微生物包括但不限于埃希氏菌属、发酵单胞菌属、糖酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、链霉菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属和梭菌属。
目标产物无限制地包括醇(例如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3-丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有机酸(例如乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2，5-二酮-D-葡萄糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木质酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；气体(例如甲烷、氢(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。
发酵过程还包括在酒精消费品工业(例如，啤酒和酒)、乳品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业中所使用的工艺。
除上文所述之外，附加的一般产品例如：有机产品、化学制品、燃料、商品和特定化学制品如木糖、丙酮、乙酸、甘氨酸、赖氨酸、有机酸(例如乳酸)、1，3-丙二醇、丁二醇、甘油、乙二醇、糠醛、聚羟基链烷酸、顺式，顺式-粘康酸和动物饲料(Lynd，L.R.，Wyman，C.E.，和Gerngross，T.U.，Biocommodity engineering，Biotechnol.Prog.，15：777-793，1999；和Philippidis，G.P.，Cellulose bioconversion technology，inHandbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.，ed.，Taylor&Francis，Washington，D.C.，179-212，1996；以及Ryu，D.D.Y.，和Mandels，M.，Cellulases：biosynthesis and applications，Enz.Microb.Technol.，2：91-102，1980)，它们可利用即时方法产生。
潜在的协同产品也可被生产，例如来自可发酵的碳水化合物的多种有机产品。在糖化和发酵后保留的富含木质素的残余可转化成木质素来源的化学制品、化学结构物或用于发电。
如本文所述，目标产物可在递送预处理糖化生物质的某些成分渗过包含中空纤维的循环回路进入发酵容器后进行制备。
可通过诸如蒸馏、使用选择性渗透膜、或全蒸发或非选择性分批或连续补料发酵液的方法从发酵容器中除去目标产物。移除目标产物有助于促进总体反应完成。
实施例
本发明将在下面的实施例中得到进一步阐述。应当理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的必要特征，并且在不脱离本发明的实质和范围的前提下，可对本发明进行各种变化和修改以适应多种用途和条件。
材料
糖化酶得自以下来源。CP和
Figure BPA00001559839100192
Xylanase(GenencorInternational，Palo Alto，CA)以及Novozyme 188(Novozymes，2880Bagsvaerd，Denmark)。
本文使用在Wiley刀式粉碎机中通过1mm筛的蔗渣。
用于实施例中的缩写
在实施例中使用以下缩写：“℃”是摄氏度；“％”是百分比；“mL”是毫升；“h”是小时；“rpm”是每分钟转数；“EtOH”是乙醇；“mg/mL”是毫克每毫升；“g/100mL”是克每100毫升；“N”是正；“g”是克；“NaOH”是氢氧化钠；“v/v”是体积对体积；“mm”是毫米；“mL/min”是毫升每分钟；并且“min”是分钟，“mM”是毫摩尔每升，“mg protein/g cellulose”是指毫克蛋白/克纤维素，“kDa”是指千道尔顿。
实施例1
在生物质糖化期间通过减轻终产物抑制来提高β-葡萄糖苷酶浓度，降 低了对纤维素酶的需求
为了制备用于糖化的生物质，首先如本文所述进行预处理。将用刀式粉碎机粉碎的蔗渣(2g)悬浮在15mL 100mM H2SO4中，并在密封玻璃瓶中将悬浮液在121℃高压灭菌1小时。冷却内容物并将其置于其中包含多孔塑料过滤器的两个一次性色谱柱柱体中，置于15mL锥管中并在室温下，使用HS-4吊桶式转头在RC-5B Sorvall离心机(Thermo FisherScientific，Waltham，MA)中以3000rpm离心以洗涤预处理的生物质。每个柱用溶解在H2O中的2.5mL 69％(v/v)EtOH加NaOH(5mg/1.75mL)和蒽醌(1mg/1.75mL)洗涤过两次，之后，每个柱用5mL H2O洗涤3次。润湿的预处理的生物质残余重3.8g(1.4g干物质)，将其悬浮在附加的4.6g洗涤溶液中。将悬浮液置于不锈钢压力容器(19mL内体积)中，加盖并在175℃下加热140分钟。将压力容器冷却至室温并如上所述在2个色谱柱柱体中离心内容物。每个柱中的预处理的生物质用1.5mL 69％(v/v)EtOH水溶液洗涤4次。然后风干预处理的生物质残余(～92％干生物质)。
将风干的预处理生物质样品(78.7％葡聚糖，5.5％木聚糖)悬浮在50mM NaCitrate缓冲液中，其pH为4.6，固体载量为～11％。加入不同比率和浓度的
Figure BPA00001559839100201
CP纤维素酶、
Figure BPA00001559839100202
木聚糖酶和Novozyme 188每克纤维素。这些比率(mg蛋白/g纤维素)为：4∶3∶8、8∶3∶4、6∶3∶6、6∶6∶12、12∶6∶1.2和12∶6∶12。此外，加入1％Tween 20(w/v)和0.01％(w/v)NaN3。将～0.5mL体积的样品加到包含两个玻璃小珠(3mM)的6mL螺帽管中并在46℃旋转振荡器(250rpm)上孵育。在4小时后以及在开始孵育后每隔24小时移出等分试样并用0.01N的H2SO4稀释41.25倍以用于分析。通过Spin-X过滤器(Corning.Inc.，Corning，NY)过滤样品并通过HPLC(Agilent系列1100/1200，Agilent，Palo Alto，CA)分析滤液。使用BioRad HPX-87H Aminex柱(BioRad，Hercules，CA)分离释放的糖，用0.01N H2SO4作为流动相。柱温保持在60℃，流量保持在0.6mL/min。使用折光率检测器检测洗脱的糖，并且保持在55℃。
图1A示出在不同酶载量下生物质糖化的时间，单体葡萄糖的产量用仅用于糖化的理论产量百分比表示。图1B示出来自图1A的不同酶比率在120小时单体葡萄糖产量的比较。酶糖化实验使用载量为[6∶3∶6]、[6∶6∶12]和[12∶6∶1.2]每克纤维素的 Xylanase：Novozyme 188进行，在孵育120小时后它们的产量实际上相同。该结果表明降低
Figure BPA00001559839100213
CP酶载量可通过提高Novozyme 188(多数为β-葡萄糖苷酶)载量进行补偿。根据这些结果，如果β-葡萄糖苷酶是稳定的和可重复使用的，那么它的可重复利用性和取代一些纤维素酶的能力可降低制备单位量单体糖所需的纤维素酶的成本。
实施例2(预测的)
双中空纤维循环回路捕集β-葡萄糖苷酶和β-木聚二糖苷酶以relIEve 终产物抑制并使得它们回收利用
基于实施例1中所公开的结果，其中移除生物质糖化产物并且其中回收利用β-葡萄糖苷酶和β-木聚二糖苷酶的方法可显著降低制备可发酵糖的成本。
利用由半透中空纤维循环回路连接的分开的糖化容器和发酵容器的连续SSF设备示意图如图2所示。将糖化容器(1)保持在46℃和pH为5。将预处理的生物质与纤维素酶和木聚糖酶一起加到糖化容器中。小己糖和戊糖低聚物包括纤维二糖和木乙糖，它们通过酶解糖化反应产生，它们经由第一外部循环回路(2)被转移到第一半透中空纤维膜(10)中，其中它们通过所述膜进入中空纤维循环回路(3)。中空纤维循环回路包含多价螯合的β-葡萄糖苷酶和β-木聚二糖苷酶。这些酶是不能扩散通过中空纤维膜的大分子，所述膜具有30kDa的截留分子量。然而，半透膜可渗过小分子反应物(纤维二糖和木乙糖)和这些反应物的产物(葡萄糖和木糖)。β-葡萄糖苷酶和β-木聚二糖苷酶将纤维二糖和木乙糖水解成葡萄糖和木糖。将因此形成的葡萄糖和木糖转移到第二半透膜(11)中，并且通过所述膜进入到第二外部循环回路(4)和发酵容器(5)中。可保持在30-33℃和pH为5.8的发酵容器包含所需的培养基和适用微生物以制备目标产物如乙醇或丁醇。在发酵期间，可从发酵容器中经由出口(6)移出目标产物。从发酵容器中移出产物(例如通过喷射或经由选择性渗透膜或全蒸发)有助于促进反应完成。循环回路(2)将部分耗尽纤维二糖和木乙糖的生物质带回糖化容器。第一循环泵(7)和第三循环泵(8)分别循环第一外部回路和第二外部回路的内容物。第二循环泵(9)循环内部中空纤维循环回路的内容物(包括β-葡萄糖苷酶和β-木聚二糖苷酶)以进行附加的一轮反应。因此，在内部中空纤维回路内包含的β-葡萄糖苷酶和β-木聚二糖苷酶减轻在糖化容器中的外纤维素酶和木聚糖酶的终产物抑制，促进完成总体反应，提供将生物质转化成目标产物的较经济的方法。

Claims (15)

1.用于加工预处理的生物质的设备，包括：
糖化容器和分开的发酵容器，其中所述容器由两个外部的循环回路和连接所述两个外部循环回路的中空纤维循环回路来连接，并且包括半透膜，其中所述设备提供预处理的生物质的分室同步糖化和发酵。
2.权利要求1的设备，根据图2，其中所述设备包括糖化容器(1)，其与第一外部循环回路(2)连接，并且其中所述第一外部循环回路(2)在中空纤维循环回路(3)的第一半透膜(10)的外部并与其连接；并且所述中空纤维循环回路(3)与第二外部循环回路(4)连接，所述第二外部循环回路在所述中空纤维循环回路(3)的第二半透膜(11)的外部并与其连接；并且所述第二外部循环回路(4)与具有目标产物(6)出口的发酵容器(5)连接。
3.权利要求2的设备，还包括一系列循环泵，所述循环泵包括用于所述第一外部循环回路(2)的第一循环泵(7)；用于所述第二外部循环回路(4)的第二循环泵(8)；用于所述内部中空纤维回路(3)的第三循环泵(9)。
4.权利要求1或2的设备，其中所述半透膜由选自以下的材料制成：聚砜、羟基化聚砜、聚醚砜、羟基化聚醚砜、磺化聚砜、聚醚酮、聚醚醚酮、聚酰亚胺和聚醚酰亚胺。
5.权利要求1或2的设备，其中所述半透膜具有约10至约30千道尔顿的分子量渗透性。
6.权利要求2的方法，其中所述中空纤维循环回路(3)包含多价螯合的糖化酶。
7.加工预处理的生物质的方法，包括：
(a)提供权利要求3的设备；
(b)将预处理的生物质和糖化酶聚生体的混合物提供到所述设备的糖化容器(1)中，其中所述混合物通过糖化来产生高分子量组分和低分子量组分二者；
(c)提供至少一种在所述中空纤维循环回路(3)中的多价螯合的酶；
(d)通过所述第一循环回路经所述第一中空纤维半透膜(10)递送一定量的(b)的混合物，从而(b)的混合物的所述高分子量组分不扩散通过所述膜，并且所述混合物的所述低分子量组分扩散通过所述膜进入到所述中空纤维循环回路(3)中；
(e)通过在所述中空纤维循环回路中的所述至少一种多价螯合的酶来水解(d)中扩散到中空纤维循环回路(3)中的低分子量组分，从而形成包含可发酵糖的水解产物；以及
(f)递送包含可发酵糖的水解产物通过第二半透膜(11)进入到第二循环回路(4)中并进入到发酵容器(5)中；
其中预处理的生物质组分通过循环泵而遍及所述设备循环，并且其中预处理的生物质被加工。
8.权利要求7的方法，其中所述(b)的糖化酶聚生体包含选自以下的酶：纤维素酶、木聚糖酶、糖苷酶、木素酶和酯酶。
9.权利要求7的方法，其中所述(c)的多价螯合的酶包括选自以下的酶：β-葡萄糖苷酶、β-木聚糖苷酶和木聚糖酶，它们能够水解可溶解的支链木糖低聚物。
10.权利要求7的方法，其中递送到(f)中发酵容器的(e)的可发酵糖由至少一种微生物转化成至少一种目标产物。
11.权利要求10的方法，其中从所述发酵容器中选择性移除所述目标产物。
12.权利要求7的方法，其中将通过所述多价螯合的酶对生物质的作用形成的水解产物递送到所述发酵容器中。
13.权利要求7的方法，其中所述(c)的多价螯合的酶多次回收利用。
14.权利要求7的方法，其中所述第一半透膜和所述第二半透膜各自由选自以下的材料制成：聚砜、羟基化聚砜、聚醚砜、羟基化聚醚砜、磺化聚砜、聚醚酮、聚醚醚酮、聚酰亚胺和聚醚酰亚胺。
15.分室同步糖化和发酵预处理的生物质的方法，包括(a)将预处理的生物质和糖化酶聚生体提供到糖化容器中，从而形成糖化产物并且所述糖化产物移动通过一个或多个半透膜通过至少一个隔室，所述隔室包含一种或多种附加的多价螯合的酶，从而形成包含可发酵糖的水解产物；以及(b)将所述水解产物递送到分开的发酵容器中以发酵成目标产物。
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