CN102676681A - 一种检测小麦穗分枝抑制相关基因的专用引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测小麦穗分枝抑制相关基因的专用引物及其应用，专用引物由核苷酸序列如SEQ ID NO.1和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的一对寡核苷酸组成。本发明还公开了专用引物在检测小麦中有无穗分枝抑制相关基因中的应用。本发明所述的检测小麦穗分枝抑制相关基因的专用引物可用于小麦育种的早代选择，大大减少育种筛选的工作量，缩短育种周期，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，为小麦育种提供了技术支持，为选育高产小麦种质提供了一种快捷的选择方法。

Description

一种检测小麦穗分枝抑制相关基因的专用引物及其应用

技术领域

本发明公开了一种检测小麦穗分枝抑制相关基因的专用引物及其应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

植物育种归根到底是对物种（品种）染色体及染色体外遗传结构的改良。现阶段利用常规育种手段进行育种工作依然是主要途径。主要方法包括选择育种、杂交育种。但是在常规育种过程中我们会遇到一些难以克服的困难。比如，在等位基因的外在表现不明显、等位基因为隐性等位基因、等位基因与其他基因或环境之间存在互作的条件下，基因型的鉴定不便；对等表现型鉴定也相当麻烦；不能进行早期选择；不能更广泛和更大强度的选择；回交育种效率低等等。但是利用分子标记手段来辅助育种将会很好解决以上的问题，大大提高育种效率。分子标记辅助育种是指通过在分子水平上分析与目标基因紧密连锁的分子标记的基因型来叛变目标基因是否存在和对其进行间接选择的一种育种方法。其基本原理是利用与目标基因紧密连锁或表现共分离关系的分子标记对选择个体进行目标区域以及全基因组筛选，从而减少连锁累赘，获得期望的个体，达到提高育种效率的目的。

小麦是世界重要的粮食作物，我国政府首先要确保粮食安全生产。加强小麦新品种的培育，过去、现在和将来都是作物科技工作者的首要任务。发掘和利用与重要经济性状有关的功能基因是实现这一任务的有效途径。由于小麦在世界和我国粮食作物中均占有举足轻重的地位，因此，挖掘小麦重要功能分子标记并用于遗传改良显得十分重要。

小麦产量三要素是亩穗数、穗粒数和千粒重。小麦的分枝穗型可以产生更多数目的籽粒数，来自圆锥小麦的分枝穗型在六倍体小麦中是两个隐性基因控制，相比于普通六倍体小麦的40粒/穗，分枝小麦能够达到70-130粒/穗（图1），这将大大提高小麦的产量。

其中，小麦穗是小麦的一个重要器官，直接影响小麦产量，穗分枝可以显著增加单穗的穗粒数。有效利用控制小麦穗分枝的基因，在分子水平上有目的调控麦穗的发育，对小麦高产栽培和育种均具有重要的意义。

通过研究发现不同物种间，植物花序大小有着显著差异，但在物种内个体之间花序发育相对一致，说明植物花序是受遗传控制。植物器官的花序发育不但受外界环境信号的影响，而且受内部发育信号的控制。在植物体中存在着控制花序的基因。

（1）禾本科植物穗（花序）分枝分子生物学研究进展：

禾本科植物(小麦、玉米、水稻等)花序结构直接影响作物产量，阐明其花序形态建成遗传机制是当前花序发育研究的重要内容。正常水稻花序本身有分枝，因此穗分枝突变体和分子水平的研究相对集中于玉米。

禾本科植物的穗状花序，在营养生长转化为生殖生长过程中，远比拟南芥等模式植物复杂。玉米将顺序产生枝分生组织（BM）、小穗成对分生组织（SPM）、小穗分生组织（SM）和小花和花器的分生组织（FM）。当前有许多与穗发育相关的基因被克隆出来，其中许多基因突变都影响花序正常发育，但与穗分枝形成直接相关的基因涉及分生组织决定(bd1、ra1、ra2、ra3)和分生组织决定/性别决定基因(ts4、ids1)等。

早在2002年，Chuck等证明branched silkless1(bd1)改变玉米的小穗分生组织特性，导致在小穗的位置长出分枝，bd1编码一个ERF转录因子，在小穗分生组织中表达，其表达模式表明，在小穗分生组织的侧生部位进行信号途径调节和分生组织调节。

近来，玉米中还发现一条ramosa通路控制玉米穗分枝。ra1、ra2、ra3三个典型的玉米突变体，雌花序高度分枝。对基因表达模式和双突变的研究表明，ra1是一种锌指结构蛋白，可能是一种转录因子，可以控制花序分支的模式，在初生分生组织的基部表达；ra2、ra3分别在上游调控ra1的表达，ra2基因编码LOD家族转录因子，在花序将要形成叶腋原基的分生组织部位表达，该基因突变将导致玉米正常花序的短分枝(小穗或小穗对)发育为长分枝。RA3是一种代谢蛋白，一种6-磷酸海藻糖磷酸酶，暗示磷酸海藻糖（T6P）本身可能有发育调节作用。在ra3突变体中，ra1表达减少，这意味着ra3直接或间接调节ra1。然而，在穗分枝小麦中克隆到一个ra2同源基因，研究证明是形成小麦穗分枝的基因。

（2）小麦穗分枝研究进展：

与玉米相比，受材料限制，小麦穗分枝的分子研究研究尚处于起步阶段。穗分枝小麦是一个主穗轴，在主穗轴上再次分枝，分枝上在长出小穗，这不同于普通小麦在主穗轴上长出小穗。该穗分枝是一种穗结构的变异类型，不增加主穗轴节数，通过主穗轴节上形成的分枝（支穗轴）上着生多个小穗增加小穗数。

自然界中，这种变异类型多来自于具有穗分枝的四倍体圆锥小麦。陕西省农科院李丕皋、封如敏等，采用多次杂交和回交的方法，前后经历20多年时间，在国内外首次将圆锥小麦的穗分枝性状导入普通小麦，育成了小麦亚远缘杂交超高产新品种----分枝麦。其分枝穗通过主穗轴节上形成的支穗轴上着生多个小穗增加小穗数，从而也增加了穗粒数（穗粒数60-120，千粒重约50克），该品种具有很大的丰产潜力。

在传统圆锥小穗中，分枝性状对正常穗型表现为隐性，圆锥小麦分枝性状受隐性单基因控制。袁文业等通过分析“分枝麦”与普通小麦品种杂交产生的F₁、F₂、BC₁的穗分枝性状遗传，证明穗分枝性状由两对隐性基因控制，无胞质效应，同时还受一些修饰基因的影响。

闫晓华对该性状进行穗分枝基因的初步定位，将小麦穗分枝基因初步定位在小麦2A、2D染色体上。在2A染色体上，控制小麦分枝的基因被定位在SSR标记gwm372、wmc502附近；在2D染色体上，控制小麦分枝的基因被定位在SSR标记gwm484、gwm102附近。同时，该课题组根据同源克隆获得了小麦ra2基因，但ra2不在小麦2A和2D两条染色体上，可见，小麦“分枝麦”的穗分枝性状并非ra2导致。

（3）在其他模式植物中，多种开花基因基因可能参与花序：

在拟南芥中，花序分枝受到多个遗传因素相互协调和拮抗的综合调控，包括促进作用的STM和KNOX,有抑制作用的ZPR3和ZPR4等；其中一条通路是WUSCHEL(WUS)促进SAM的形成，它的功能缺失导致花序分枝干细胞功能丧失；WUS诱导CLAVATA(CLV)表达，CLV反馈抑制WUS,抑制SAM形成；SAM的发生可能是CLV和WUS之间协调平衡的结果。在这一通路中，LEAFY(LFY)和AGAMOUS(AG)表达抑制WUS,从而抑制花序分枝发生。但是在大豆中该基因作用不同，GmTFL1b是LFY/FLO基因，在茎尖早期营养生长期表达，茎的节数不断增加，但是在茎尖转变为花器发育时，该基因不表达。

因此，如果能够找到控制小麦穗分枝的基因并加以利用，可以对小麦穗的改良起到非常关键的作用。

（4）当前，在六倍体普通小麦中，没有获得小麦的分枝基因和有效的分子标记。六倍体普通小麦，导入了圆锥小麦的穗分枝性状，该性状稳定遗传，由两个隐性基因（sb1和sb2)控制，在多年的育种实践中，研究人员利用分枝麦为基因供体，3个黄淮麦区（泰山008、潍麦8号和山农12）田间推广品种为轮回亲本，不断回交（每一轮，同时自交表型鉴定，筛选或淘汰下一轮的亲本），获得了多个回交群体，群体内测交，明确获得特定基因型的株系。包括与主推品种具有相似遗传背景的双隐性基因（分枝穗型，sb1sb2系）和单隐性基因（正常穗型，sb1Sb2系和Sb1sb2系）的近等基因系，以及多个分枝穗型和单隐性基因系构建的RIL群体。

（5）目前小麦分枝育种的问题：由于普通栽培小麦是六倍体，分枝性状由两个隐性基因控制，在育种过程中，由分枝麦和正常穗型普通小麦杂交获得的株系，在后代选择中需要自交选择，才能确定是否具有分枝表型，因此延缓了育种速度，加大了工作量。

因此，如果能够找到上述隐性基因的专用引物，对加快小麦育种速度具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种检测小麦穗分枝抑制相关基因的专用引物及其应用。

一种检测小麦穗分枝抑制相关基因的专用引物，由核苷酸序列如SEQ ID NO.1和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的一对寡核苷酸组成。

上述专用引物在检测小麦中有无穗分枝抑制相关基因中的应用。

上述应用，是以待测小麦的基因组DNA为模板，用由上述专用引物进行PCR扩增，如果经电泳检测得到大小为454bp的PCR扩增产物条带，则所述待测小麦为具有穗分枝抑制相关基因的小麦。

上述电泳检测是通过质量浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测的。

上述PCR扩增的扩增反应程序:先94℃预变性6min；再94℃变性l.5min，57℃退火60sec，72℃延伸1min，循环40次；最后72℃延伸l0min。

有益效果

本发明所述的检测小麦穗分枝抑制相关基因的专用引物可用于小麦育种的早代选择，大大减少育种筛选的工作量，缩短育种周期，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，为小麦育种提供了技术支持，为选育高产小麦种质提供了一种快捷的选择方法。

附图说明

图1是进行差异基因表达的两种穗型小麦材料及其发育模式图；

其中：A图中，左：正常穗型；右：分枝穗型。B图中，正常穗（上）和分枝穗（下）的分枝发生差异模式图。箭头是穗轴，圆圈代表小穗。

图2特异引物在Sb1sb2系×分枝麦杂交的一个正常穗型RIL群体中，部分单株的扩增结果；

图3特异引物在Sb1sb2系×分枝麦杂交的一个分枝穗型RIL群体中，部分单株的扩增结果；

图4特异引物在正常穗型小麦×分枝麦杂交的一个正常穗型RIL群体中，部分单株的扩增结果。

图5特异引物在正常穗型小麦×分枝麦杂交的一个分枝穗型RIL群体中，部分单株的扩增结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实验材料

小麦分枝品种分枝麦购自陕西秦丰农业营销网络有限公司；正常穗型泰山008、潍麦8购自山东德盛种业有限公司，山农12购自鑫丰种业有限公司公司。Sb1sb2系小麦为育种种质，购自山东绿原生物技术有限公司。

Trizol试剂购自Invirogen公司，cDNA芯片购自Affymetrix公司，pGEM-T easy vector购自Promaga公司，Gel ExtractionKit试剂盒、Extraction Buffer、Wash Buffer、TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.2.1试剂盒、HindIII和EcoRI内切酶均购自Takara公司，SMART RACEcDNA扩增试剂盒购自Clontech公司。

MMLV反转录酶、T4DNA聚合酶、RsaI酶购自均购自Takara生物制品公司。

实施例1

1、检测小麦中有无穗分枝抑制相关基因的专用引物TFL237的获得

基因的分离与转化

取小麦分枝品种分枝麦和泰山008的二棱期到小花分化期的幼穗为材料，通过对cDNA差减杂交后的结果进行分析，获得差异片段，其中一个LEY/FLO-like基因片段可能与分枝相关；具体步骤如下：

（1）RNA提取及mRNA分离和纯化：

分别取小麦分枝品种分枝麦和正常穗型泰山008的二棱期到小花分化期的幼穗，置于液氮预冷的研钵中，加入液氮快速磨成粉末，将粉末装入1.5ml离心管中，迅速加入1ml Trizol试剂颠倒混匀，室温静置5分钟；然后，在4℃、12000rpm离心10分钟，取上清液移至新的1.5ml离心管中，加入200μl氯仿，剧烈震荡15秒钟，室温静置2～3分钟，然后，在4℃、12000rpm离心15分钟，将无色水相移至新的离心管中，加入250μl异丙醇，250μl高盐溶液（3.0M NaCl），颠倒混匀，室温静置10分钟，然后，在4℃、12000rpm离心10分钟，吸除上清液，加入1ml冰冷的体积百分数为75％的乙醇溶液，蜗旋震荡1.0min，然后，在4℃、7500rpm离心5分钟，37℃干燥10分钟，加入20μl的DEPC水溶解沉淀，再置于55℃水浴中溶解10分钟，冰浴5分钟后在12000rpm离心10min，制得小麦分枝品种分枝麦的总RNA溶液和正常穗型泰山008总RNA溶液。

用紫外分光光度计Ultrospee111（购自Pharmacia公司，美国）以λ260/λ280检测总RNA的浓度、鉴定纯度；用1.2wt%的对甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。RNA量应满足构建差减杂交与标记探针筛选之用。mRNA的分离纯化按QIAGEN试剂盒（购自吉百克生物制品公司，德国）中记载的01igotex方法，从总RNA中分离mRNA，检测各mRNA样品的浓度、纯度与完整性（检测方法同总RNA）。用DEPC处理水将mRNA的终浓度调整到0.5pg/pl，-70℃保存。

（2）抑制差减杂交：

具体操作依照CLONTECH的差减杂交试剂盒PCR-Slect^TMcDNA Subtraction kit进行（本步骤中所述的各种溶液的具体成分均记载于CLONTECH PCR-Slect^TMcDNA Subtraction kitUser Manual，PT1117-1（PR22926），Published 2008）。正常穗型小麦样品作为差减杂交的试验方(下简称Tester)，以分枝麦样品作为驱动方(下简称Driver)。

①cDNA第一链的合成：

取两个0.5ml灭菌微量离心管，将所获得的Tester和Driver的mRNA分别按以下反应体系加入各成分:mRNA(0.5μg/μl,4μl)、cDNA合成引物(10μmol/μl,1μl)，将微量离心管置于热循环仪内，70℃孵育2min后；迅速取出置于冰上冷却2min：向两管中分别加入下列成分:5×第一链缓冲液(first-strand buffer)2μl，dNTP混合物(每种浓度20mmol/L)1μl，DTT(0.lmol/L)1μl，MMLV反转录酶(200U/μl)1μ1；轻微震荡混匀后短暂离心，置于37℃空气温箱中孵育90min；将微量离心管置于冰上终止cDNA第一链合成并立即开始第二链合成。

②DNA第二链的合成：向两个cDNA第一链合成反应体系中分别加入如下预冷的成分:灭菌水48.4μl，5×第二链缓冲液(seeond-strandbuffer)16.0μl，dNTP混合物(每种浓度l0mmol/L)1.6μl，20×第二链酶混合物(second-strand enzyme cocktail)4.0μl，混匀后将微量离心管短暂离心，终体积为80μl。将反应混合物置于16℃水浴中孵育2h；向其中加人2μl(6U)T4DNA聚合酶并充分混匀，16℃水浴中继续孵育30min；加人20×EDTA糖原混合物4μl以终止cDNA第二链合成反应；分别向两个微量离心管中加入100μl酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶l)的混合液，充分震荡混匀后，室温下12000g离心10min，将上层水相移至另一干净的离心管中，废弃中间蛋白层及下层有机相；向上层水相中加入100μl氯访∶异戊醇(体积比为24∶l)的混合液，震荡混匀，室温下12000g离心10min，再将上层水相分别移至另一干净的离心管中，废弃中间蛋白层及下层有机相；加入40μl的4mol/L醋酸铵和300μl的95%乙醇，充分震荡混匀后，室温下12000g离心20min，小心弃去上清；加入体积百分数为80%乙醇500μl覆盖沉淀，室温下12000g离心10min，小心弃去上清；干燥沉淀，并将沉淀分别溶于50μl无菌水中；从两管中各取出8μl置于另一干净离心管中，-20℃保存，用于RsaI酶切后凝胶电泳分析所合成的双链cDNA产物的大小，分别制得Tester溶液与Driver溶液。

③双链cDNA RsaI酶切与连接接头：

取上述Tester溶液与Driver溶液各43.μl，分别加入10×的酶解缓冲液5.0μl、RsaI酶(10U/μl)，混合离心后37度放置1.5小时。各取5μl分析酶解效率，加入2.5μl的20×EDTA/Glycogen Mix终止反应。反应混合物经酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶l)混合液、氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)混合液分别抽提一次，水溶相经醋酸铵和乙醇沉淀离心，沉淀经体积百分数为80%乙醇清洗、空气干燥，溶于5.5μl无菌水中，得处理后的溶解液体。取0.5μl检测酶解效率。

取Tester 1μl用5μl无菌水稀释，将其各取2μl分别加入到两个0.5ml的离心管中，加入接头1与2R以及连接混合物（5×连接缓冲液、T4DNA连接酶（400U/μl）），使总反应体积为10μl。混合物离心后，PCR仪16℃过夜，加入1μl 20×EDTA/Glycogen Mix终止反应，72℃加热使酶失活，得连有接头l的Tester-1溶液和接头2R的Tester-2R溶液。

④二次差减杂交反应：

取Tester-1溶液、Tester-2R溶液各1.5μl，分别加入Driver溶液1.5μl、4×杂交缓冲液1.0μl，PCR仪上98℃变性1.5min后，68℃杂交8hr，完成第一次杂交。随后立即进行第二次杂交。取新的变性的Driver溶液1μl与第一次杂交后的溶液一起混合，PCR仪上65℃杂交过夜，完成第二次杂交。杂交混合物中加入200μl的稀释缓冲液，吹吸混匀后置于热循环仪中，68℃加热7min，-20度贮存备用。

⑤二次PCR扩增反应和差减效率分析：

取稀释后的二次杂交产物1μl加入0.5μl 50×Advantage polymerase mix，以与接头1和接头2R相同的外侧序列为引物(5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’（SEQ ID NO.16）)进行第一次PCR扩增，将第一次PCR产物稀释10倍后，取1μl作为模板，利用接头1和接头2R的不同内侧序列为巢式引物(5’-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’（SEQ ID NO.17），5’-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3’（SEQ ID NO.3）)进行第二次PCR扩增。对PCR产物的电泳分析和利用PCR扩增的方法通过比较已知cDNA在消减前后丰度的差别，来进行差减效率的分析。

（3）差减cDNA文库的构建：

将步骤（2）第⑤步二次PCR扩增产物按QIAGEN PCR纯化试剂盒（购自天根生物技术有限公司）中说明书中描述的方法，经纯化浓缩后溶于25μl 10mol Tris-HCI中。取纯化后的PCR产物3μl，按Promega pGEM-T载体的方法连接，加入连接体系：lμl 10X连接缓冲液、1μl pGEM-T Easy载体、1μl T4连接酶，4℃过夜。从连接体系中取1μl与40μl感受态细胞DH10B混合，用电转化仪(E.Coli pulser Transformation apparatus BIO-RAD)转化，加入lml SOC培养基（pH值7.0,胰蛋白胨20.0g/L,酵母浸粉5.0g/L,氯化钠0.5g/L,氯化钾0.186g/L,氯化镁0.95g/L,硫酸镁1.2g/L葡萄糖3.6g/L）,置37℃培养箱中，慢速摇1小时。之后取100μl菌液种涂于含50μg/ml Amp的LB/X-gal/IpTG培养板上，37℃培养14小时。计数培养板上的蓝白菌落数。挑取白色克隆，转接于盛有LB液体培养基的96孔板中，培养过夜，加LB液体培养基重量25%的甘油后液氮中速冻，-70℃保存，得保存菌种。提取质粒后，用载体克隆位点两端的差减片段接头即NEST 1和NEST 2R（详见QIAGENPCR纯化试剂盒说明书中的描述）直接进行PCR扩增，检测插入片段大小。

（4）质粒提取

将步骤（3）制得的保存菌种对应接种到96孔细胞培养板中，按照Millipore方法用MADV板分离纯化质粒。程序经优化为:

①将接菌的96孔培养板(每孔1.2ml LB/Amp液体培养基)置于摇床，37度，300rpm震荡培养20hr。

②1500Xg离心10min后，沉淀中加入含0.lmg/mlRNaseA的Solution 1，震荡混匀，室温放置10min.

③每孔加入200μl Solution 2，加盖后翻转10次，总时间不超过5min。

④每孔加入200μl Solution 3，加盖后翻转10次，80度水浴10min，冰浴中放置10-15min。

⑤将一块MultiScreen96过滤板转至新的96孔培养板上，在对应孔中加上述裂解液300μl，2500g离心5min。

⑥取下96孔培养板，每孔加入200μl异丙醇，加盖后翻转混合3次。室温放置10min，4000xg离心45min。

⑦每孔加入500μl70%的冷乙醉清洗沉淀质粒，4000xg离心5min，弃上清，沉淀空气干燥10min。30μl无菌水溶解沉淀后，用0.8%的琼脂糖溴化乙锭凝胶电泳检测质粒质量，质粒-20℃保存用于PCR检测SSH文库插入片段长度。

（5）测序和序列分析：

①以插入质粒区域上游正向通用引物T7为测序引物（序列：5’-ACATCCACTTTGCCTTTCTC-3’（SEQ ID NO.4）），测序PCR反应用pE Applied Biosystems公司的测序反应试剂盒(PRISM big dye terminatorkit)。反应条件经优化为:预变性96度，2min，96度，30sec、48度，15sec、68度，3min，40个循环。测序PCR产物经70wt%乙醇纯化两次，用ABI377测序仪（购自PE公司）测序。

②序列分析：

产生的序列去除载体序列后，将所得到的EST通过BLASTW2软件批量提交到Genbank，用BLASTn与BLASTx软件与Genbank unigene库中的序列进行同源比对分析。根据提交序列长度、得分高低、配准百分比，判定EST是否是己知功能基因。判定标准参照水稻、拟南芥的EST研究（NCBI数据库）。BLASTn比较序列大于50%，分值大于80分；或至少重叠50碱基，一致性大于90%。BLASTx的标准是一致性大于40%，或分值大于80。比较后确定的未知功能EST再与GenBank的EST库进行BLASTn比较。

（6）专用引物TFL237的获得：

①在这些差异片段中，有一个类似LEY/FLO基因的片段。根据测序结果设计引物：

其中上游引物有：

5’GCAAGAAGCAGAAGAATGGGT-3’（SEQ ID NO.5）；

5’AGAAGCAGAAGAATGGGTCCG-3’（SEQ ID NO.6）；

5’CAAGAAGGCGAGGAGGAACAA-3’（SEQ ID NO.7）；

5’GCGAGGAGGAACAAGGTGAA-3’ （SEQ ID NO.8）；

5’GAGGAGGAACAAGGTGAAGGA-3’（SEQ ID NO.9）；

5’AGGAGGAACAAGGTGAAGGAG-3’（SEQ ID NO.10）；

5’AAGAAGAACGGGCTGGACT-3’  （SEQ ID NO.11）；

5’TGTTCCATCTCTACGAGCAGC-3’（SEQ ID NO.12）；

下游引物为：

5’CCGCATCTTGGGCTTGTTGA-3’（SEQ ID NO.13）；

5’TAGAACATTGGCGGCGGCAT-3’（SEQ ID NO.14）；

5’CCCAAGCAACAAACTCACAAC-3’（SEQ ID NO.15）；

②DNA的提取：DNA的提取按照天根生物技术有限公司，产品说明书中的提取方法。

采集100mg幼嫩叶片，用液氮研成粉末，装入1.5ml离心管中（-20℃预冷）；预热1.5×CTAB到95℃，加1ml到装有叶片粉末的离心管中，混匀；立即置于65℃水浴30min，每5min，上下颠倒1次；12000g离心5min；吸取上清液约600μl，加入等体积（600μl）氯仿/异戊醇(24∶1)，上下颠倒数次，至下层液相呈深绿色；12000g离心5分钟；取450μl上清于一新1.5ml离心管，加入1ml 95%乙醇和45μl 10M NH₄AC，混匀，室温放置10min；12000g离心10min，去上清，用75%EtOH浸洗沉淀，自然干燥约30min；加入50μl 1/10TE或无菌水（含20μg/RNase），置于4℃过夜，待DNA溶解后，检测DNA浓度及质量。

③基因组DNA的PCR反应。

其中，引物TFL237获得了明显差异的目标条带。结果显示，在正常穗型小麦中有一条454bp的条带，分枝麦中没有，引物TFL237的序列如下所示：

上游:5’-CAAGAAGGCGAGGAGGAACAA-3’（SEQ ID NO.1）和

下游：5’-CCGCATCTTGGGCTTGTTGA-3’（SEQ ID NO.2）。

应用ABI PRISM 7500PCR仪，以2个样点的DNA为模板，进行PCR扩增。反应体系为25μl：其中10×Taq buffer 2.5μL；MgCl2（25mM）2.5μL；dNTP（10mM）0.5μL；Primer1（10μM）0.5μL；Primer2（10μM）0.5μL；Taq DNA polymerase（5U/μL）0.4μL；SYBR Green（50×）；Rox reference Dye；0.5μL；0.1μL；DNA 1.0μL。

反应程序为：95℃1min，95℃10s，57℃20s，72℃40s，38个循环。反应结束后分析荧光值变化曲线和融解曲线。每个反应重复3次，生物学重复3次。用ABI PRISM7500软件工具分析实时定量PCR数据。比较分枝麦和正常穗型小麦的表达量，确定目标条带的相对表达量。

2.用专用引物TFL237检测小麦中穗分枝抑制基因的可行性验证

(1)Sb1sb2系×分枝麦杂交的RIL群体遗传分析和标记验证

用正常分枝小麦材料Sb1sb2系作母本，分枝麦作父本进行杂交，两个杂交组合F1单株都为正常穗型，没有出现穗分枝单株，这与前期结果一致，在这个组合中，穗分枝受1个隐性基因控制。

对F2进行统计分析发现，F2单株成穗呈规律性的分离，F2群体一共392个单株，其中287个不分枝株系，105株分枝株系，X²检验，P>0.05,分枝其正常穗型株数(穗型性状与泰山008相同)与穗分枝株数(与分枝穗类似)的比例为3∶1,X²检验的吻合性好(如表1所示)，而且标记与表型的吻合度较好，说明分枝性状受一对隐性主基因控制。

表1F₂群体表型及标记的分离与X²检测

从RIL群体中各选择分枝株系和不分枝株系各13株，进行PCR扩增，在不分枝系中都有该条带(图2)，但是在分枝系中没有（图3），说明TFL237引物所扩增的穗分枝抑制亲本的标记带可以作为定位穗分枝抑制的分子标记。

(2)正常穗型×分枝麦杂交的RIL群体的部分单株PCR扩增及电泳分析

用正常分枝小麦材料泰山008作母本，分枝麦作父本进行杂交，两个杂交组合F1单株都为正常穗型，没有出现穗分枝单株，这与前期结果一致，在这个组合中，穗分枝受2个隐性基因控制。

按照步骤（1）的方法用TFL237对RIL群体部分单株(8株RIL正常穗型单株和8株RIL穗分枝单株)的基因组DNA进行PCR扩增及电泳分析，结果在（1）在所有分枝穗型株系中没有检测到454bp的条带，（2）在不分枝株系中，大部分检测到454bp条带，在所有375个株系中，约有1/5的株系没有检测到。父本分枝麦和所有RIL分枝单株中均没有扩增到该条带（图5），但是在母本（正常穗型小麦材料泰山008）和部分RIL正常穗型单株和中均扩增到454bp的条带（图4）。说明该条带的存在将抑制分枝性状的发生，但是没有该条带，也有可能不是分枝麦，是正常穗型的小麦材料。这就要求在实际应用中应该淘汰具有该条带的小麦材料，继续在没有该条带的材料中进行选择。

Claims (5)

1.一种检测小麦穗分枝抑制相关基因的专用引物，由核苷酸序列如SEQ ID NO.1和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的一对寡核苷酸组成。

2.如权利要求1所述的专用引物在检测小麦中有无穗分枝抑制相关基因中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，是以待测小麦的基因组DNA为模板，用由上述专用引物进行PCR扩增，如果经电泳检测得到大小为454bp的PCR扩增产物条带，则所述待测小麦为具有穗分枝抑制相关基因的小麦。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述电泳检测是通过质量浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测的。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，上述PCR扩增的扩增反应程序:先94℃预变性6min；再94℃变性1.5min，57℃退火60sec，72℃延伸1min，循环40次；最后72℃延伸10min。

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