CN102670587A - 7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素在医药上的应用 - Google Patents

Abstract

本专利公开了7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素在医药上的应用，属于新药研发领域。免疫系统通过各种免疫细胞分泌不同的细胞因子如TNF-α、IL-4、INF-γ等，调节着机体的免疫平衡，如果体内免疫细胞因子紊乱，过高或过低都会导致疾病。我们通过建立TNF-α-luc转基因报告小鼠药物筛选模型，筛选发现7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素能很好地抑制TNF-α的分泌。TNF-α是一种致炎细胞因子，当TNF-α异常高表达时会导致诸如类风湿性关节炎、银屑病等自身免疫性疾病的发生。基于免疫系统的调节机制，该小分子药物可以抑制TNF-α的表达，为此有望开发作为抗炎药物用于炎症疾病的治疗。

Description

7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素在医药上的应用

技术领域

本发明涉及7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素在药物上的应用，特别是自身免疫性疾病相关的化学药物和抗炎药物的应用。 

背景技术

免疫体系是机体对抗各种疾病的卫士，它主要通过分泌一些细胞因子来调节和激发各种免疫过程；而细胞因子异常高量表达时会导致诸如类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的发生。因此，我们基于免疫系统的调节机制，人为的干预各种免疫细胞因子的激活与分泌，上调或下调达到适当的比例，从而可以调控一些免疫失衡，达到治愈疾病的目的。为此我们建立了TNF-α-luciferase转基因报告小鼠高通量筛选模型，筛选能抑制肿瘤坏死因子(TNF-a)分泌的高活性小分子药物。 

TNF-α是一种前炎症细胞因子，在炎症、感染和其它环境压力作用下多种细胞都可产生TNF-α，包括巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞和角质化细胞。根据细胞种类不同，通过结合于TNFR1(p55)或TNFR2(p75)，TNF-α可诱导不同的生物学效应，募集下游的信号转导、激活效应因子。通过复合信号级联和网络，这些效应可介导半胱氨酸蛋白酶和两种转录因子JNK和NF-κB(nuclear factor-kappaB)的激活。NF-κB可促进多种前炎因子的释放，同时也反过来作用于TNF-α。过量或非调节性TNF-α的产生可介导并加速多种疾病，因此降低TNF-α含量或抑制NF-κB活性理论上是一些炎症、感染、免疫或恶性疾病的有效治疗手段，例如风湿性关节炎、牛皮癣、炎症性肠病等等。 

我国中草药中蛇床子具有祛痰、平喘和抗变态反应等作用，(7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素，又名蛇床子素)蛇床子素为其果实的有效成分。PEI-CHUN L IAO等人(J.Agric.Food Chem.2010，58，10445-10451)证实7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素可抑制NF-κB的活性和ROS的释放，而NF-κB可促进多种前炎因子的释放。 

发明内容

本发明的目的是提供化合物7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素在药物上的应用。7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素，又名蛇床子素，我们将其命名为SZ1#，其化学结构式和物理常数见表1， 

表1 

针对自身免疫性疾病的病理特征，本发明建立了TNF-α-luciferase转基因报告小鼠的高通量筛选模型。转报告基因小鼠的全脾脏细胞在LPS刺激下，与不同浓度的化合物7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素共培养，48小时后收集培养上清，然后检测其对肿瘤坏死因子(TNF-α)分泌的影响情况。本发明在细胞水平上证明了7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素具有很好抑制TNF-α分泌的活性。该化合物结构稳定，毒性低，有很好的抗炎作用。 

具体实施方式

实施例一：7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素在医药上的应用 

1.活性筛选 

1.1将7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素在含10％胎牛血清的改良型RPMI-1640培养液中依次梯度稀释，各取100μl加入96孔板中，设置0.02％DMSO为对照组。取转TNF-α-luc基因报告小鼠脾脏，在超净台中研磨得到淋巴细胞悬液，用含10％胎牛血清的改良型RPMI-1640培养液制成密度为4×10⁶个细胞/ml的细胞悬液，加入1mg/ml LPS刺激细胞增殖分化，将细胞平行加入已加入不同浓度小分子药物的96孔板中，培养48小时后，1400r/min，离心7分钟，吸出全部上清至另一96孔板中，密封后保存在4℃。 

1.2ELISA实验使用Biolegend Mouse TNF-αELISA试剂盒。首先将溶解于包被缓冲液(coating buffer)中的特异性包被抗体(capture antibody)包被在固相载体上，密封后置于4℃冰箱中过夜，洗涤液(wash buffer)，即PBST，洗涤除去没有结合的抗体和杂质；加入封闭液(assay diluent)，可以阻断非特异性的结合，进而减少背景，置于20℃摇床中1小时，摇床转速200r/min。PBST洗涤除去上一步的多余物质。加入待测上清和梯度稀释的标准品，标准品依次浓度为500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.2pg/ml、15.6pg/ml和7.8pg/ml，置于20℃摇床中2小时，摇床转速200r/min。此步可使抗体与抗原充分结合。PBST洗涤除去未结合的物质。加入检测抗体(detection antibody)，特异 性结合抗原，置于20℃摇床中1小时，摇床转速200r/min。洗涤未结合的物质。加入酶标抗体(Avidin-HRP)，酶标抗体可与检测抗体结合，置于20℃摇床中30分钟，摇床转速200r/min。PBST洗涤未结合的物质。加入新鲜制备的底物(TMB Substrate Solution)，避光下置于20℃摇床15分钟，摇床转速200r/min。此时溶液会显现出蓝色。用终止反应液(Stop Solution)终止反应，溶液由蓝色变为黄色。酶联免疫检测仪450nm处测量各孔的吸光值。 

1.3  7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素的剂量-效应结果如图1。 

2.毒性测试(MTT) 

2.1先将7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素在含10％胎牛血清的改良型RPMI-1640培养液中依次梯度稀释，各取100μl加入96孔板中，设置0.02％DMSO和水为对照组。取野生型BALB/c小鼠脾脏，在超净台下磨碎脾脏得到脾脏细胞，用含10％胎牛血清的改良型RPMI-1640培养液配制成密度为4×10⁶个细胞/毫升的细胞悬液，加入1mg/ml LPS刺激细胞增殖分化，将细胞悬液加入已加入不同浓度小分子药物的96孔板中，每孔100μl。 

2.2培养48小时后，每孔吸弃上清120μl，加入MTT溶液每孔20μl，再培养4小时。取出后4℃、1400r/min，离心7min，吸出所有上清，并每孔加入100μl DMSO，置摇床上振荡(200r/min)30分钟，紫色结晶全部溶解。在酶联免疫检测仪570nm处测量各孔的吸光值。 

2.3  7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素的剂量-毒性结果见图2。 

附图说明

1、剂量-效应结果显示，7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素在100nM以上浓度时都能很好抑制TNF-α分泌，具很好的抗炎活性(见说明书附图图1)。 

2、毒性测试结果显示，SZ1#毒性非常低，是理想的抗炎小分子药物(见说明书附图图2)。 

Claims (5)

1.一种化合物7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素(俗称蛇床子素，我们将其命名为SZ1#，其化学结构与物理常数见表1)作为类风湿关节炎等自身免疫性疾病相关的化学药物和抗炎药物的应用，

表1

其特征在于：针对类风湿关节炎的病理特征，建立TNF-α-luciferase转基因报告小鼠的高通量筛选模型，采用转报告基因小鼠的全脾脏细胞，在LPS刺激下与不同浓度的7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素共培养，48小时后收集培养上清，然后检测其化合物对肿瘤坏死因子(TNF-α)分泌的影响情况，在细胞水平上证明了7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素具有较高抑制TNF-α分泌的活性，该化合物结构稳定，毒性较低，有很好的抗炎作用。

2.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于：它是采用96孔培养板，200μl体系，在条件为37℃、CO₂浓度为5％、湿润的培养箱中进行培养。

3.根据权利要求1所述的共培养方法，其特征在于：它是采用每孔中加入100μl梯度稀释后不同浓度的SZl#和100μl的浓度为4*10⁶个/ml细胞悬液共培养。

4.根据权利要求1所述的刺激因子LPS，其特征在于：它的终浓度为100ng/ml。

5.根据权利要求1所述的TNF-α的检测，其特征在于：它采用检测小鼠TNF-α的ELISA试剂盒。

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