CN102666572A - 来自Solanum chacoense的功能性R-基因的克隆和开发 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从S.chacoense、S.berthaultii、S.sucrense或S.tarijense分离出的抗性基因和其功能同源物或片段。此外，本发明涉及所述抗性基因的用途，例如所述抗性基因在植物中增加或赋予对卵菌感染的至少部分抗性的方法中的用途。本发明提供了一种分离或重组的核酸序列，所述核酸序列包括编码图4所示的氨基酸序列之一或其功能片段或功能同源物的核酸序列，诸如在图13中所示。
Description
技术领域
本发明涉及一种从S.chacoense分离出的抗性基因。此外，本发明涉及所述抗性基因在例如克隆功能同源物中的用途、及所述抗性基因在增加或赋予植物对卵菌感染至少部分抗性的方法中的用途。更具体地，本发明提供了一种抗性基因，所述抗性基因能够通过基因工程技术或通过标记物辅助育种(markerassisted breeding)技术增加或赋予对疫霉属(Phytophthora sp.)菌(例如马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans))的至少部分抗性。
背景技术
由卵菌马铃薯晚疫病菌造成的晚疫病是世界上马铃薯生产中的最严重疾病之一，也是二十世纪中期白马铃薯饥荒的原因，曾导致100万人死亡。业内已经耗费大量工作来控制病原体，其中对马铃薯晚疫病菌的化学控制仍然是主要的作物管理策略。但是由于环境安全性正在变得更加重要，而且所述病原体有时能够对杀菌剂处理产生抗性，因此，将抗性导入现代马铃薯品种中是控制该疾病最持久的策略。
上个世纪，曾广泛地使用矮茄(Solanum demissum)(六倍体墨西哥种)培育马铃薯晚疫病抗性品种。最初，描述了源自矮茄的一系列11个R基因。其中，已将R1、R2、R3a/b、R6和R7定位于马铃薯(Solanum tuberosum)的基因图谱中。但是，这些R基因赋予致病变-特异性(pathovar-specific)抗性，渗入马铃薯品种的基因主要是R1、R2、R3、R4和R10，但所述病原体会迅速战胜这些基因。因此，需要新的抗性来源来解决这些问题。目前，已经报道有几种其它的野生茄属(Solanum)品种可成为抗性的潜在来源，其中许多品种已经进行了基因表征(表6)。
近来，鉴别晚疫病抗性的工作已经聚焦于源自不同的野生茄属品种且赋予广谱抗性的主要的R基因上。除了Solanum demissum以外，已经报道了作为晚疫病抗性新来源的其它野生茄属品种，诸如无茎薯(S.acaule)、S.chacoense、S.berthaultii、S.brevidens、S.bulbocastanum、S.microdontum、S.sparsipilum、S.spegazzinii、S.stoloniferum、S.sucrense、S.toralapanum、S.vernei和S.verrucosum(综述(Jansky，2000))。
S.chacoense是来自南美洲的一个自交不亲和二倍体种，被视为是晚疫病抗性的一个来源。Petota组的最新分类学重排揭示了S.chacoense与如S.berthaultii和S.tarijense等品种的关系。已经使用多种分离菌对几个登录号S.chacoense(CHC543-1)、S.berthaultii(BER481-3、BER94-2031)和S.tarijense(TAR852-5)(表5)的植物进行了离体叶片试验(DLA)，并使用分离菌IPO-C对所述植物进行了重复的田间试验。在所有试验中，CHC543-5、BER94-2031、BER481-3和TAR852-2均不受影响，这突出了表达的R基因与抗性育种之间的关系。
第三种方法是分子克隆抗性相关基因，并随后将该基因导入马铃薯品种中，这样可避免出现前面两种策略所遇到的许多问题。
迄今为止，已经克隆了多个晚疫病R-基因，如位于第8染色体上等位基因RB和Rpi-blb1、位于第6染色体上的Rpi-blb2(表6)。近来，也已经分离了Rpi-blb3抗性基因(WO2008/091153)。尽管用RB和Rpi-blb1、Rpi-blb2和Rpi-blb3得到的初步结果是有希望的，但仍需要更多的R-基因。
发明内容
目前，本发明涉及一种在植物中提供对卵菌感染的至少部分抗性或增加抗性的方法，所述方法包括：为植物或其一部分提供编码图4所示氨基酸序列Rpi-chc1或其功能片段或功能同源物的核酸；优选地，其中所述植物是来自茄科(Solanaceae)的植物、更优选为马铃薯(Solanum tuberosum)。优选地，所述卵菌包括疫霉属(Phytophthora)菌、更优选包括马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)。在一个具体实施例中，上述功能同源物选自由493-7_G12、543-5_C2、849-1_M8_M18_M20、487-1_I4_I6_I8、94-2031_L4_L7_l8、561-2_K4_K14_K22、324-2_J1_J3_J8、852-5_E14_E23、852-5_E28、493-9_H5_H30、493-7_G14_G22、561-2_K6_K30_K31和493-7_G21所组成的所述氨基酸序列组。在另一个具体实施例中，如上定义的所述核酸序列包括：如图7中描述的核酸序列、或如图13中描述的编码所述氨基酸序列493-7_G12、543-5_C2、849-1_M8_M18_M20、487-1_I4_I6_I8、94-2031_L4_L7_l8、561-2_K4_K14_K22、324-2_J1_J3_J8、852-5_E14_E23、852-5_E28、493-9_H5_H30、493-7_G14_G22、561-2_K6_K30_K31和493-7_G21的核酸序列。
本发明进一步包括一种培育具有卵菌抗性的四倍体植物的方法，所述卵菌优选为疫霉属菌，所述方法包括：
a、增加二倍体植物的所述配子的所述倍性水平，其中所述二倍体植物已经含有如上定义的核酸序列；
b、使用所述配子与四倍体植物的配子杂交；以及
c、选择存在所述核酸序列的所述杂交的后代。优选地，在所述方法中，步骤a)中的所述二倍体植物是来自S.chocaense、S.berthaultii、S.sucrense或S.tarijense属的植物。
本发明还涉及一种用于选择植物或植物材料或其后代对卵菌感染的易感性或抗性的方法，所述方法包括以下步骤：测试所述植物或植物材料或其后代的至少一部分中是否存在如上所定义的核酸。具体地，在所述方法中，所述测试包括：使用特异性结合所述核酸的引物或探针，检测表2中所示一种或多种标记物的存在。
因此，本发明还涉及一种用于在植物育种中进行标记物辅助选种以得到对卵菌抗性的标记物，其中所述标记物选自表2和8中所示的所述标记物。
在另一实施例中，本发明还涉及一种分离或重组的核酸序列，所述核酸序列包括：编码图4中所述氨基酸序列Rpi-chc1或其功能片段的核酸序列，或编码所述氨基酸序列493-7_G12、543-5_C2、849-1_M8_M18_M20、487-1_I4_I6_I8、94-2031_L4_L7_l8、561-2_K4_K14_K22、324-2_J1_J3_J8、852-5_E14_E23、852-5_E28、493-9_H5_H30、493-7_G14_G22、561-2_K6_K30_K31和493-7_G21或其功能片段的核酸。优选地，所述片段至少包括所述氨基酸序列的所述富含亮氨酸的重复序列(LRR)结构域。在又一优选实施例中，根据权利要求10所述的分离或重组的核酸序列包括如图7中或图13中描述的核酸序列。
本发明进一步涉及一种转基因细胞或四倍体细胞，所述转基因细胞或四倍体细胞包括根据本发明所述的核酸。
作为本发明的一部分，还提供了一种载体，所述载体包括根据本发明所述的核酸序列。优选地，所述载体进一步包括所述基因天然关联的所述启动子和/或终止子，所述载体更优选包括截短的启动子，所述截短的启动子为所述基因序列上游少于1000个核苷酸的序列。
本发明还涉及一种转基因宿主细胞或四倍体宿主细胞，所述转基因宿主细胞或四倍体宿主细胞包含根据本发明所述的核酸、或根据本发明所述的载体；优选地，所述宿主细胞为农杆菌属(Agrobacterium)细胞或植物细胞。
本发明还涉及一种转基因植物细胞或四倍体植物细胞，所述转基因植物细胞或四倍体植物细胞包含根据本发明所述的核酸、或根据本发明所述的载体；优选地，其中所述植物细胞是来自茄科、更优选来自马铃薯、更优选来自四倍体马铃薯的细胞。在又一实施例中，本发明包括一种包含所述细胞的转基因植物或四倍体植物、或源自所述植物的一部分，优选地其中所述一部分是块茎。
本发明还包括一种由根据本发明所述的分离或重组的核酸编码的蛋白或其功能片段，优选地其中所述蛋白具有如图4中描述的所述Rpi-chc1的氨基酸序列。
本发明还涉及一种抗体，所述抗体(特异性地)结合如权利要求20中的所述蛋白。
附图说明
图1：Rpi-chc1(A)和Rpi-ber(B)基因座(分别是7650和06-882种群)的基因图谱和物理图谱。图中示出了标记物的相对位置、在标记物之间识别的重组体的数目、跨R-基因座的重叠的细菌人工染色体(BAC)克隆、以及抗病基因同源序列(RGA)在CHC543-5和RH89-039-16物理图谱中的相对位置。
图2：Chr10 BAC序列注释。
对2个覆瓦式途径(tiling path)进行测序并注释，所述覆瓦式途径由来自RH89-039-16的3个和4个重叠BAC(RH106G038、RH137D014、RH009D021和RH122B15、RH77O23、RH04G12、RH199E15)、及来自CHC543-5的2个重叠BAC组成。用箭头指示标记物和来自重叠BAC的BAC末端序列的位置。用水平箭头指示序列叠连群(contig)的位置。用彩色框指示通过FGENESH算法预测的基因的位置。用垂直箭头指示通过BlastP对NR数据库检索发现的蛋白序列同源性。用加下划线的数字对RGA进行编号，且对它们的基因结构也进行相应地编号。
A：RH106G03，B：RH137D14，C：RH97D21，D：RH122B15，E：RH77023，F：CHC B1(B07-1-05)，G：CHC B2(2-D06_3-D21)。
图3：本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶中进行的疫霉属菌易感性的瞬时互补。进行农杆菌渗入法(agro-infiltration)2天后，在离体叶片试验中，通过接种马铃薯晚疫病菌分离菌90128(对CHC543-5无毒)的游动孢子悬浮液来攻击叶片。已经被农杆菌渗入pBINplus(没有插入序列)的对照植物在接种后6天，出现典型的病害表型。且观察到被农杆菌渗入pBINplus：Rpi-blb1的对照植物具有完全抗性。农杆菌渗入pBINplus：CHCB2-3(来自Rpi-chc1作图区间的3个RGA中的一个)也赋予了植物对马铃薯晚疫病菌感染的完全抗性，而pBINplus：CHCB2-1和pBINplus：CHCB2-2渗入的叶片仍保持易感性。
图4：来自S.chacoense(CHC B1-1、CHC B1-2、CHC B2-1、CHC B2-2和CHC B2-3＝Rpi-chc1)和源自马铃薯登录号为RH89-039-16的相关序列(77O23c5794、77O23c5795、77O23c671、77O23c7063、77O23c7064、122B15C88、122B15C247、137D14c131和137D14c132)的RGA的氨基酸序列比对。
具有未知功能的蛋白ABF81421由来自毛果杨(Populus trichocarpa)的基因编码。
图5：Rpi-chc1中蛋白结构域的组织结构。
N-端CC-结构域包含氨基酸1-231。使用“卷曲(COIL)”算法(窗口大小为14)预测，使用阴影描绘的氨基酸能够折叠成卷曲结构。中央结构域核酸结合位点(NB-ARC)结构域包含氨基酸232-557。使用阴影显示的结构域分别表现出与以前描述的激酶1a、激酶2、激酶3a、GLPL、RNBS-D和MHD的结构域具有相似性。C-端富含亮氨酸的重复序列(LRR)-结构域由29个不完全的富含亮氨酸的重复序列组成。本文中用阴影标示保守的疏水氨基酸(A、V、L和F)。共有序列示于底部。
图6：Rpi-chc1相关序列和晚疫病抗性基因在染色体10上的图谱位置。
左边示出了SH和RH染色体的超高清(UHD)图谱(van Os等人，2006)。中间示出了本研究得到的06-882和7677。右边示出了Rpi-ber(Rauscher等人，2006)、Rpi-ber1和Rpi-ber2(Park等人，2008)的位置。红线指示Rpi-chc1相关序列的定位。绿线指示晚疫病抗性基因的定位。
图7：含有Rpi-chc1编码序列和调控序列的克隆CHC B2-3(7907bp)的核苷酸序列。用阴影突出显示4550bp的Rpi-chc1编码区(3358-7266)。上游3357个核苷酸(1-3357)和下游的641个核苷酸(7267-7907)包含调控序列。
图8：转基因Desiree植物中进行的马铃薯晚疫病菌(Pi)易感性的功能互补。在离体叶片试验中，用Pi分离菌90128攻击Rpi-chc1候选基因(RGC-1、RGC-2和RGC-3)转化的Cv Desiree。接种后6天拍照。观察到仅含有RGC-3的转基因物具有抗性。
图9：使用共渗入法筛选PEX集合。将PEX克隆单独渗入本氏烟草叶、或PEX克隆与Rpi-chc1共渗入本氏烟草叶。渗入后1周，拍照。叶片A，PEX1＝RD31，PEX2＝RD36。叶片B，PEX1＝RD12-1，PEX2＝RD12-2。叶片C，PEX1＝INF1，PEX2＝pGR106。在每一叶片中，用R3a+avr3a渗入左下斑点。用Rpi-chc1渗入右下斑点。叶片A没有显示出可辨认的应答效应。B显示出因Rpi-chc1与RD12相互作用而出现的枯斑。C显示出因INF1而出现的自发枯斑。
图10：驱动Rpi-chc1表达的调控元件。
将Rpi-chc1的开放阅读框(ORF)克隆在四种之一的启动子/终止子序列之间；其中四种启动子/终止子序列为：Rpi-chc1自己的3kb启动子和0.5kb终止子(p-chc1-长)、Rpi-chc1自己启动子中的0.9kb和0.5kb终止子(p-chc1-短)、pMDC32中的双35S启动子或Rpi-blb3启动子/终止子组合(Lokossou等人，2009)。如图所示，在5个系列稀释浓度(OD600＝2.0、1.0、0.5、0.2、0.1)下，进行与PEX-RD12的农杆菌共渗入。使用与Avr3a混合的R3a作为阳性对照(+)，使用Rpi-chc1作为阴性对照(-)。渗入后6天拍照。
图11：用于种质筛选的Rpi-chc1特异性引物对的选择。
A：Rpi-chc1特异性引物对的选择。引物组合a：581+582，b：585+587，c：585+589，d：586+587，e：586+589，f：588+589，参见表8。使用的模板是1：chc543-5(用于Rpi-chc1的供体植物)，2：chc544-5(作图种群的易感亲本)，3：RH89-39-16(易感植物，Rpi-chc1同源序列的供体)，4：CHC BAC-1(含有3个无活性的RGA的BAC克隆)，5：CHC BAC-2(含有Rpi-chc1的BAC克隆)，6：MQ。
B：使用引物组合D，筛选表7中列出的来自分类群10-12至10-17的225个基因型。白色箭头指示6种基因型中具有预期大小的片段。
图12：Rpi-chc1同源物的系统进化分析(Fylogenetic analysis)。
绿色：通过Rpi-chc1同源物PCR分离出的序列(实例2)
黑色：在基于图谱的克隆过程中鉴别出的Rpi-chc1同源物(实例1)
图13：找到的21个Rpi-chc1同源物的核酸序列。
图14：由图11的Rpi-chc1同源物和实例1描述的Rpi-chc1同源序列编码的蛋白序列的Clustal W比对。
具体实施方式
本文所用术语“植物或其一部分”是指，可以再生出马铃薯植物的任何完整或部分的植物、单细胞和细胞组织(如植物中未受损的植物细胞)、细胞团(cell clump)和组织培养物。植物部分的实例包括但不限于：来自花粉、胚珠、叶、胚芽、根、根尖、花药、花、果实、茎、芽、块茎(包括用于食用的马铃薯块茎、或用于栽培或克隆繁殖的“种块”)和种子的单细胞和组织，以及花粉、胚珠、叶、胚芽、根、根尖、花药、花、果实、茎、芽、幼枝、根茎、种子、原生质体、愈伤组织等。
本文所用术语“种群”是指具有共同遗传起源的植物的遗传多样性的集合。
本文所用术语“品种”如在国际植物新品种保护联盟(UPOV)条约中所定义的，表示在已知最低类别的单个植物分类单元内的任意植物群，所述群可以：(a)由特定基因型或基因型组合的特征性的表达来确定；(b)通过至少一种所述特征性的表达而与其它任意植物群区分开；和(c)视作适于进行无变化繁殖的一个单位。
本文所用术语“栽培品种”(表示栽培的品种)定义为通常不会在自然界发现、但已被人类栽培出的品种，即具有与“野生”状态不同的生物学状态。其中所述“野生”状态表示植物或登录号(accession)最初未经栽培或天然的状态。术语“栽培品种”具体涉及具有四倍体水平的马铃薯植物。术语“栽培品种”进一步包括但不限于：半天然品种、半野生品种、杂草品种(weedy)、传统栽培品种、地方品种、育种材料、研究材料、育种系、复合种群、杂种、原始原种/基本种群、近交系(杂种栽培品种的亲本)、分离种群、突变体/遗传原种、和高级/改良的栽培品种。
本文所用“杂交”是指雄性植物(或配子)对雌性植物(或配子)进行授精。术语“配子”表示单倍体或二倍体的生殖细胞(卵子或精子)，其中生殖细胞是在植物中通过减数分裂、或通过第一次或第二次重组、或从配子体经双减数分裂生成，并参与有性生殖；在该过程中，2个异性配子融合，以形成二倍体或多倍体的合子。该术语通常包括花粉(包括精子细胞)和胚珠(包括卵子)。因此“杂交”通常表示来自一个个体的花粉对另一个个体的胚珠进行授精，而“自交”表示来自一个个体的花粉对遗传上相同的个体的胚珠进行授精。
本文所用术语“回交”是指如下过程：2个亲本系之间杂交所产生的植物与其亲本系之一杂交；其中在回交中使用的亲本系称作回归亲本(recurrentparent)。重复回交会产生与回归亲本越来越相似的基因组，直至实现所述亲本的特定纯合性或杂合性水平。
本文所用“自交”定义为表示自体受精的过程，其中某一个体被它自身的花粉授粉或授精。
本文所用术语“标记物”是指，在推断基因组序列特性差异的方法中使用的任意指示物。所述指示物的实例是：限制性片段长度多态性(RFLP)标记物、扩增片段长度多态性(AFLP)标记物、单核苷酸多态性(SNP)、插入突变、微卫星标记物(SSR)、序列特征性扩增区域(SCAR)、酶切扩增多态性序列(CAPS)标记物、或同工酶标记物、或本文所述标记物的组合，所述标记物确定了特定的遗传定位和染色体定位。
本文所用“基因座”定义为给定基因在植物染色体上占据的遗传或物理位置。
本文所用术语“等位基因”是指基因的一个或多个可选择形式中的任意种，所述等位基因皆与植物中的特定表型特性或特征的存在或缺失有关。在二倍体细胞或生物体中，给定基因的2个等位基因占据一对同源染色体上的对应基因座。在有些情况下，使用“单倍型”(haplotype)(即染色体段的等位基因)比“等位基因”更准确，但在这些情况下，术语“等位基因”应当理解为包括术语“单倍型”。
本文所用术语“杂合的”仅限于二倍体，是指当不同的等位基因位于同源染色体上的对应基因座处时存在的遗传条件。
本文所用“纯合的”仅限于二倍体，定义为当相同的等位基因位于同源染色体上的对应基因座处时存在的遗传条件。
本文所用术语“无显性组合(nulliplex)”、“单纯形(simplex)”、“二显性组合(duplex)”、“三显性组合”和“四显性组合”限于四倍体，定义为当在对应同源染色体的对应基因座处的特定等位基因分别以0、1、2、3或4倍存在时的遗传条件。在四倍体水平，只有当等位基因存在于四显性组合条件下时，才可观察到与隐性等位基因相关的表型效应；而当等位基因存在于单纯形或更高条件下时，已经可以观察到与显性等位基因相关的表型效应。
本文所用术语“单倍体”、“二倍体”和“四倍体”定义为在每个细胞(不包括生殖细胞)中各染色体分别具有1对、2对和4对。
本文所用术语“单倍型”是指可在相同染色体上传递的多个基因座上的等位基因的组合。根据给定基因座集合之间重组事件发生的次数，单倍型包括少至2个基因座的单倍型和整个染色体的单倍型。
当提及判断出存在与Rpi-chc1基因表达相关的真菌抗性时，本文所用术语“推断(infer或inferring)”是指，通过单独或组合地分析所述基因的核苷酸存在于植物或其部分的核酸样品中，从而得出关于所述基因存在于植物或其部分中的结论。如本文所公开的，通过检验核酸分子表达水平的定性差异或定量差异，可以直接鉴别核苷酸的存在，或者，通过检验Rpi-chc1蛋白(表达水平)来间接鉴别核苷酸的存在。
本文所用术语“引物”是指如下的寡核苷酸：当置于能诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下，即，存在核苷酸和聚合试剂(如DNA聚合酶)且在适宜温度和pH的条件下，所述寡核苷酸能够与扩增靶点退火结合，以使DNA聚合酶附着在上面，从而可作为DNA合成的起始位点。(扩增)引物优选为单链，以获得最大扩增效率。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。另外，引物必须足够长，从而在存在聚合剂的条件下启动延伸产物的合成。其中，引物的确切长度取决于温度和引物来源等许多因素。如本文所使用的“双向引物对”表示一个正向引物和一个反向引物，这是在DNA扩增(如PCR扩增)的技术领域中通常使用的。
本文所用术语“探针”是指单链寡核苷酸序列，其中所述单链寡核苷酸序列可识别靶核酸序列分析物或其cDNA衍生物中的互补序列，并与所述互补序列形成氢键合的双链。
术语“严谨”或“严谨杂交条件”表示可影响杂交稳定性的杂交条件，例如，温度、盐浓度、pH、甲酰胺浓度等。通过实验对这些条件进行优化，以最大化引物或探针与它的靶核酸序列的特异性结合，并最小化非特异性结合。所用的该术语包括如下的条件：在该条件下，探针或引物会与它的靶序列杂交，且达到的可检测程度优于其它序列，例如超过背景至少2倍。严谨条件是序列依赖性的，且在不同情况下是不同的。较长序列在较高温度下进行特异性杂交。通常所选择的严谨条件为在确定离子强度和pH下，比特定序列的热解链温度(Tm)低约5℃。Tm是在确定离子强度和pH下50％的互补靶序列与完全匹配的探针或引物杂交时的温度。
通常，严谨条件如下：在pH7.0-8.3时，盐浓度小于约1.0M Na+离子、通常约0.01-1.0M Na+离子浓度(或其它盐)，并且对于短的探针或引物(例如，10-50个核苷酸)温度至少约为30℃，而对于长的探针或引物(例如，多于50个核苷酸)温度则至少约为60℃。可借助于加入去稳定剂如甲酰胺来实现严谨条件。示例性的低严谨条件或“降低的严谨条件”包括：在37℃，在30％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液中杂交；并在40℃，在2x枸橼酸钠溶液(SSC)中洗涤。示例性的高严谨条件包括：在37℃，在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交；并在60℃，在0.1xSSC中洗涤。杂交过程是本领域众所周知的，且描述在例如Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，Struhl，K.主编(1998)的Current protocols in molecular biology(V.B.Chanda，系列版New York：John Wiley&Sons(纽约：约翰威立国际出版公司))。
本发明描述了Rpi-chc1基因的克隆。使用S.chacoense作图种群，将Rpi-chc1定位在染色体10上的一个新R基因座上。使用与Rpi-chc1高度连锁的标记物，制备R基因座的物理图谱。以存在于2个包括Rpi-chc1基因座的BAC克隆其中一个上的3个R基因类似物(RGA)为靶点，进行互补分析，且证实其中一个R基因类似物是功能性的Rpi-chc1基因。除了本发明描述的R-基因簇以外，Rpi-chc1与来自白杨(毛果杨)的具有未知功能的基因(命名为ABF81421)所编码的蛋白具有最高的氨基酸序列一致性(40％)，而与以前在茄科中鉴别出的R蛋白具有较低的同源性百分比(＜30％)(表3)。
在第一个实施例中，本发明提供了一种分离或重组的核酸序列，所述核酸序列包含：编码如图4所示的氨基酸序列Rpi-chc1(＝CHC_B2-3)或其功能片段或功能同源物的核酸序列(即图4所示的氨基酸序列的功能片段或功能同源物)。
术语“核酸”是指单链或双链DNA或RNA分子。
还包括本文所述的核苷酸序列的互补序列。
术语“其功能片段”通常用于表示Rpi-chc1蛋白的片段，且所述片段能够在茄科植物中提供对卵菌感染的至少部分抗性或增加抗性。所述片段例如是图4所示的Rpi-chc1蛋白的截短形式。Rpi-chc1蛋白的截短形式/片段少于1302个氨基酸，且优选包括LRR结构域的一部分(即在Rpi-chc1的大约氨基酸557-1302位延伸的富含亮氨酸重复序列结构域的部分)和/或Rpi-chc1蛋白的N-端部分。
术语“功能同源物”通常用于表示与本文所述的Rpi-chc1蛋白具有高度同源性或具有高度一致性的蛋白序列，所述蛋白能够在茄科植物中提供对卵菌感染的至少部分抗性或增加抗性。所述功能同源物包括人工改变或氨基酸残基替换，但变化的蛋白至少部分保持Rpi-chc1蛋白的作用。例如，某些氨基酸残基可以常规替换为其他具有相似性质的残基，例如将一个碱性残基替换为另一个碱性残基，将一个酸性残基替换为另一个酸性残基，将一个疏水残基替换为另一个疏水残基等等。疏水氨基酸的实例是缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸是具有芳族侧链的氨基酸的实例，半胱氨酸以及甲硫氨酸是具有含硫侧链的氨基酸的实例。丝氨酸和苏氨酸含有脂族羟基，且被认为是亲水的。天冬氨酸和谷氨酸是具有酸性侧链的氨基酸的实例。简言之，术语“其功能同源物”包括Rpi-chc1蛋白的变体，其中已经插入、替换或删除了氨基酸，但至少部分保持Rpi-chc1蛋白的作用，即在茄科植物中提供对卵菌感染的至少部分抗性或增加抗性。优选的变体是仅含有如上所述的常规氨基酸替换的变体。在上述定义中的高一致性是指具有至少80％、85％或90％的一致性。甚至更优选的是，同源蛋白是具有91％、92％、93％、94％或95％一致性的氨基酸。最优选的是，同源蛋白是具有与Rpi-chc1的氨基酸序列有96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸。例如，同源蛋白是与图5中的CHC_B2-3和与图14中的Rpi-chc1 ORF一致的序列。
功能性同源核酸序列是编码如上所述的功能性同源蛋白的核酸序列。
例如，使用诸如BLAST、ClustalW或ClustalX等计算机程序可以确定同源性和/或一致性百分比。
许多核酸序列编码与图4所示的Rpi-chc1蛋白100％一致的蛋白。这是因为，核苷酸三联体中的核苷酸可以在不会改变对应氨基酸的情况下发生改变(核苷酸三联体中的摆动)。因而，可以在不影响蛋白氨基酸序列的情况下，来改变编码该蛋白的核苷酸序列。在一个优选的实施例中，本发明提供了如图7中描述的分离或重组的核酸序列。在一个优选的实施例中，本发明提供了一种代表Rpi-chc1蛋白编码序列(CDS)的分离、合成或重组的核酸，即图7的核苷酸3358-7266(加阴影的)或其功能片段或功能同源物。图13中示出了具有高一致性的同源物的核苷酸序列，并在图14的比对中给出了对应的氨基酸序列。
例如，通过使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)瞬时转化试验(农杆菌渗入法)和/或使用离体叶片试验，可以测试本文所述Rpi-chc1基因和蛋白片段及其同源物的功能。
例如，实验部分描述了使用农杆菌渗入法对测试候选基因进行功能筛选，其中使用含有候选Rpi-chc1同源物的农杆菌株渗入4周龄野生型本氏烟草植物。渗入后1天，在离体叶片试验中，用对本氏烟草有毒性的马铃薯晚疫病菌菌株(例如IPO-C或90128)攻击渗入的叶片。该系统同样适用于测试Rpi-chc1的候选同源片段。因此，本领域技术人员可以容易地确定Rpi-chc1同源物或片段是否可以视作功能同源物或片段。
通过农杆菌渗入法实现的瞬时基因表达是一种快速灵活且可再现的使有用蛋白高水平表达的方法。在植物中，根癌农杆菌重组菌株可以用于瞬时表达已插入细菌Ti质粒的T-DNA区域中的基因。将细菌培养物渗入叶片中，基于T-DNA转移，以在植物细胞中异位表达感兴趣的基因。但是，由于异位RNA表达在2-3天后停止，因此使该系统的实用性受到限制。经证实，转录后基因沉默(PTGS)是该效率低的主要原因。基于共表达病毒编码的基因沉默抑制蛋白(番茄丛矮病毒(TBSV)的p19蛋白)的系统，会防止渗入组织中的PTGS的起始，从而得到高水平的瞬时表达。在p19的存在下，许多蛋白的表达增加了50倍或更多，因此可以从少至100mg的渗入的叶片材料中纯化蛋白。尽管p19的使用具有显而易见的优点，但没有p19的农杆菌渗入也可以用于测试候选片段和功能同源物的功能。
可选择地，各候选基因(例如是片段或同源物)构建体用于转化易感的马铃薯栽培品种例如Desiree。例如，使用分离菌IPO-0、IPO-C或90128，在离体叶片试验中攻击初级转化体。则对这些分离菌具有抗性的转化体即携带例如Rpi-chc1的功能片段或同源物。
在另一个实施例中，本发明提供了一种包含本文提供的核酸的载体，其中所述核酸能够在茄科植物中提供对卵菌感染的至少部分抗性或增加抗性。更具体地，本发明提供了一种包含分离、合成或重组的核酸序列的载体，其中所述核酸序列包含编码图4的氨基酸序列Rpi-chc1或其功能片段或功能同源物的核酸序列。本发明还提供了一种包含如图7中描述的核酸序列的载体。
合适的载体的实例是pBeloBACII、pBINplus、pKGW-MG或任何可买到的克隆载体。
如下所述，存在许多将本发明的核酸转移至植物中的方法。一种合适的转移方法是由农杆菌介导，其中要转移的核酸是二元载体的一部分，因此优选上述载体是二元载体。另一种合适的方法是含编码Rpi-chc1的基因的植物与不含该基因的植物杂交，且鉴别已经遗传得到Rpi-chc1基因的那些杂交后代。
本发明另外提供了一种包含本文所述核酸或本文所述载体的宿主细胞。优选的宿主细胞的实例是适于BAC克隆的大肠杆菌(E.coli)细胞(例如DH10B)或农杆菌属(宿主)细胞。在另一个实施例中，所述宿主细胞包括植物细胞。优选的植物细胞是源自茄科成员的细胞；甚至更优选地，所述植物细胞包括来自马铃薯、番茄(Solanum lycopersicum)(以前称作Lycopersicon esculentum)、胡椒属植物和茄子的植物细胞。通过技术人员已知的方法(例如再生方法)，从所述细胞可以得到转基因或遗传改造的植物(例如马铃薯或番茄植物)。
本发明进一步提供了一种本文所述的遗传改造的植物叶片、块茎、果实或种子、或一部分或后代。
在又一实施例中，本发明提供了一种由本文所述的分离或重组的核酸或其功能片段或功能同源物编码的蛋白。在一个优选的实施例中，本发明提供了一种由如图7中描述的核酸序列编码的蛋白。在又一优选的实施例中，本发明提供了一种包含图4的氨基酸序列或其功能片段或功能同源物的蛋白。进一步优选的是如图14中描述的功能性(活性)蛋白，更具体地，将所述蛋白命名为493-7_G12、543-5_C2、849-1_M8_M18_M20、487-1_I4_I6_I8、94-2031_L4_L7_l8、561-2_K4_K14_K22、324-2_J1_J3_J8、852-5_E14_E23、852-5_E28、493-9_H5_H30、493-7_G14_G22、561-2_K6_K30_K31和493-7_G21。
本文所述的Rpi-chc1蛋白包含1302个氨基酸，且Rpi-chc1的LRR结构域由29个不完全重复序列组成(图5)。有趣的是，Rpi-chc1与来自S.chacoense的Rpi-chc1基因簇的其它RGA、以及与来自马铃薯染色体10上的合成簇的基因具有最高同源性(75％-98％)(表3)。而且，发现Rpi-chc1与来自白杨的具有未知功能的基因(登录号ABF81421，表3)编码的蛋白具有较低、但是显著的同源性(40％)。Rpi-chc1的不同结构域与ABF81421编码的白杨蛋白的对应结构域具有不同的同源性程度：NBS结构域是最保守的(48％氨基酸的一致性)，其次是CC结构域(34％氨基酸的一致性)，LRR结构域是最不保守的(21％氨基酸的一致性)。另外，发现Rpi-chc1与来自黄瓜的FOM2蛋白(赋予对真菌病原体锤形真菌(Fusarium oxysporum)的抗性)、来自S.bulbocastanum的Rpi-blb1、来自S.demissum的R3a、和来自大豆(Glycine max)的RPS1(它们赋予对疫霉属菌的抗性)的总同源性低于33％。这些序列同源性表明Rpi-chc1是还没有在茄科中表征的古老的R-基因家族的成员。
如上所述，Rpi-chc1的功能片段或其功能同源物是能够在茄科植物中提供对卵菌感染至少部分抗性或增加抗性的片段或同源物。
上文已经提供了用于测试Rpi-chc1功能片段或功能同源物的功能的方法。
基于本文所述的核酸序列，本发明还提供了探针和引物，即与本文所述的(互补)DNA链之一互补的寡核苷酸序列。探针可用于例如Southern分析或Northern分析，引物可用于例如PCR分析。基于本文所述的核酸序列的引物用于帮助活跃在经典育种领域和/或通过遗传改造植物(优选地，所述植物是马铃薯、Solanum lycopersicum(以前称作Lycopersicon esculentum)、胡椒属植物或茄子)核酸含量的育种领域的植物育种者，以选择能够表达例如Rpi-chc1或其功能片段或功能同源物的植物。
因此，在另一个实施例中，本发明提供了一种结合分子，所述结合分子能够结合编码本文所述Rpi-chc1或其功能片段或功能同源物的核酸或其互补核酸。在一个优选实施例中，所述结合分子是引物或探针。如前所述，所述结合分子对于植物育种者是非常有用的，因此本发明进一步提供了一种用于选择对卵菌感染具有易感性或抗性的植物、或植物材料、或其后代的方法。优选地，从所述植物中分离出要测试植物的核酸，并使所述获得的分离的核酸与一个或多个(优选不同的)结合分子接触。可以使用例如PCR分析来测试植物基因组中是否存在Rpi-chc1，在没有标记物的转化方法(诸如WO03/010319中描述的方法)中，所述方法是特别优选的。
通过技术人员已知的方法，还可使用本文所述的Rpi-chc1蛋白诱导抗体。本发明因而还提供了一种与本文所述分离或重组的核酸(例如图7的核酸序列)编码的蛋白(特异性)结合的抗体、或一种与如图4中描述的蛋白或其功能片段或功能同源物(特异性)结合的抗体。例如，所述抗体可用于诸如Western印迹法或酶联免疫吸附试验(ELISA)等蛋白分析方法中，从而可用于选择成功表达Rpi-chc1基因的植物。
基于本文提供的核酸序列，本发明还提供了在植物中导入或增加对卵菌感染抗性的方法。因此，本发明还提供了一种用于在植物中提供对卵菌感染至少部分抗性或增加抗性的方法，所述方法包括为植物或其一部分提供：
-包含编码图4的Rpi-chc1氨基酸序列或其功能片段或功能同源物的核酸序列的分离或重组的核酸序列；或
-如图7中描述的分离或重组的核酸序列；或
-包含本文所述核酸序列的载体；或
-本文所述的宿主细胞。
所述用于在植物中提供对卵菌感染至少部分抗性或增加抗性的方法可以是基于经典育种的，起始于已经含有Rp1-chc1基因或其功能同源物的亲本植物；或所述方法涉及DNA向植物中的转移，即，涉及一种用于转化植物细胞的方法，所述方法包括为所述植物细胞提供本文所述的核酸、或本文所述的载体、或本文所述的宿主细胞。
存在多种将重组核酸转移给植物细胞的方法，例如农杆菌介导的转化。但是，当某人希望实施本发明时，除了农杆菌感染以外，还存在其它有效地将DNA传递给受体植物细胞的方法。值得相信的是，用于将DNA传递给植物细胞的合适方法实际上包括可以将DNA导入细胞中的任意方法，例如：如通过PEG-介导的原生质体转化等来直接传递DNA、通过干燥/抑制-介导的DNA摄取(Potrykus等人，Mol.Gen.Genet.，199：183-188，1985)、通过电穿孔(美国专利号5,384,253)、通过与碳化硅纤维一起搅拌(Kaeppler等人，1990；美国专利号5,302,523；和美国专利号5,464,765)、通过DNA包被颗粒的加速(美国专利号5,550,318；美国专利号5,538,877；和美国专利号5,538,880)。通过应用所述这些技术，可以稳定转化来自基本上任意植物物种的细胞，且这些细胞可以发育成转基因植物。
在使用农杆菌介导的转移的情况下，优选使用实质有毒性的农杆菌诸如根癌农杆菌(A.tumefaciens)(实例是A281菌株或由其衍生菌株)、或在本领域中可得到的其它有毒性的菌株。这些农杆菌菌株携带源自Ti质粒pTiBo542毒性区域的DNA区域，所述Ti质粒调节T-DNA加工及其向植物细胞中的转移。基于农杆菌的植物转化是本领域众所周知的，例如，Komari，T.等人的PlantTransformation Technology：Agrobacterium-Mediated Transformation(见Handbook of Plant Biotechnology，Christou，P.和Klee，H.编，约翰威立国际出版公司，奇切斯特(Chichester)，UK 2004，第233-262页)。优选地，使用没有标记物的转化方法，诸如在WO03/010319中描述的方法。
可选择地，可以通过杂交将Rpi-chc1基因的核酸或其功能同源物导入植物。所述杂交方案从选择合适的亲本植物开始。所述亲本植物可以是例如：原始的Solanum chacoense品种(如登录号CHC543-5)、原始的S.tarijense品种(如登录号TAR852-5)、原始的S.sucrense品种(诸如登录号SUC849-2)、或原始的S.berthaultii品种(诸如登录号BER481-3或BER94-2031)、或通过上述基因工程已得到期望核酸的植物。
在根据本发明的方法中，可以使用本领域已知用于杂交选择植物的任意合适的方法，包括体内和体外方法。本领域技术人员应理解，在合适的时候，可以使用如原生质体融合或胚拯救(embryo rescue)等体外技术。
所选择的用于本发明方法杂交目的的植物可以具有任意类型的倍性。例如，所选择的植物可以是单倍体、二倍体或四倍体。但是，二倍体植物(如S.chacoense、S.tarijense和S.berthaultii)杂交，仅会得到二倍体后代。二倍体植物与四倍体植物杂交，会产生不育的三倍体后代。
因而，当选择二倍体植物时，必须使它们的倍性增加至四倍体水平，然后才能在根据本发明的方法中使它们与另一种四倍体植物杂交。用于增加植物倍性的方法是本领域众所周知的，且本领域技术人员容易实施。例如，通过使用所述二倍体植物的2N配子来增加用于杂交目的的二倍体植物的倍性。此外，通过抑制减数分裂过程中染色体的分离(例如通过用秋水仙素处理二倍体植物)，也可以增加倍性。通过对二倍体植物实施所述方法，可得到包含两倍于通常染色体数目的胚芽或配子。然后，所述胚芽或配子可以用于杂交。对于马铃薯，具有抗性的四倍体植物是优选的，因为已知四倍体植物具有更高的块茎产量。
因为已经证实所述抗性特征是显性特性，因此如果仅存在一个具有功能基因的等位基因也是足够的。
优选地，使用经典的体内杂交方法使选择的植物彼此杂交，所述方法包括一次或多次包括自交的杂交步骤。通过实施所述经典杂交步骤，可以在后代中组合两种亲本的特性。例如，可以使提供高产量的植物与含有大量某种营养物的植物杂交。所述杂交会得到包含两种特性的后代，即得到不仅包含大量营养物而且也会提供高产量的植物。
当实施回交时，使F1后代与它的高产亲本P之一杂交，以确保F2后代的特性类似于高产亲本的特性。例如，使用秋水仙素使选择的具有卵菌抗性的二倍体马铃薯成为四倍体，然后与选择的高产四倍体马铃薯栽培品种杂交，以最终得到具有卵菌抗性的高产四倍体后代。另外，还可以实施自交，使选择的植物(亲本或后代)与它们自身杂交，以产生用于育种的自交系品种(inbredvariety)。例如，使从上述F1后代选出的样本与它们自身杂交，以得到F2后代，从该F2后代中可以选择出具有抗性水平增加的样本。
在将核酸转移至植物或植物细胞中以后，必须确定哪些植物或植物细胞已经具有所述核酸。在根据本发明的方法中，当选择和杂交亲本基因型时，在至少一个选择步骤中使用标记物来辅助选择。本领域已知，可在体内和体外的不同生物学水平上发现指示某种特性或状况的标记物。例如，可在肽水平或基因水平上发现标记物。在基因水平，可以在RNA水平或DNA水平上检测标志物。优选地，在本发明中，使用上述引物和/或探针在DNA水平上检测所述标记物的存在。可选择地，通过特异性结合Rpi-chc1蛋白的抗体进行免疫测定，可以评估所述蛋白或其功能同源物在植物部分中的适当表达。与根据本发明的引物和探针最接近地，还可以利用在编码序列附近发现的特异性标记物。在下面的实验部分中示出了所述标记物，包括在表2中示出的标记物。标记物源自附随的BAC序列。
在转基因方法中，可通过使用可选择的标记物或报告基因，来选择转化的植物。在选择标记物或选择基因中，植物转化中最广泛使用的是：EP131623中提出的赋予对选择性试剂卡那霉素抗性的细菌新霉素磷酸转移酶基因(nptI、nptII和nptIII基因)，及在EP186425中提出的赋予潮霉素抗性的细菌aphIV基因。EP275957公开了来自产绿色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的乙酰基转移酶基因的应用，该乙酰基转移酶基因赋予对除草剂草胺膦(phosphinotricin)的抗性。EP218571中提出了赋予对除草剂草甘膦相对抗性的植物基因。报告基因的适宜实例是β-葡糖醛酸酶(GUS)、β-半乳糖苷酶、萤光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。
在一个优选实施例中，本发明提供了一种用于在植物中提供对卵菌感染至少部分抗性或增加抗性的方法，所述方法包括为植物或其一部分提供：
-分离或重组的核酸序列，其中所述核酸序列包含编码图4的Rpi-chc1氨基酸序列或其功能片段或功能同源物的核酸序列，或
-如图7中描述的分离或重组的核酸序列，或如图13中描述的编码选自由493-7_G12、543-5_C2、849-1_M8_M18_M20、487-1_I4_I6_I8、94-2031_L4_L7_l8、561-2_K4_K14_K22、324-2_J1_J3_J8、852-5_E14_E23、852-5_E28、493-9_H5_H30、493-7_G14_G22、561-2_K6_K30_K31和493-7_G21所组成的组中的蛋白的分离或重组的核酸序列，
-包含本文所述核酸序列的载体，或
-本文所述的宿主细胞，
其中所述卵菌包括疫霉属菌，优选马铃薯晚疫病菌；和/或其中所述植物包括来自茄科的植物、优选马铃薯或番茄植物、更优选四倍体马铃薯植物。
本发明还提供了一种植物，所述植物可使用如上所述的用于在植物中提供对卵菌感染至少部分抗性或增加抗性的方法得到。优选的植物是来自茄科的植物，更优选地，所述植物是马铃薯或Solanum lycopersicum(以前称作Lycopersicon esculentum)、Solanum melononga、Capsicum spp(诸如C.annuum、C.baccatum、C.chinense、C.frutescens和C.pubescens)。因而本发明还提供了一种植物，所述植物已经具有编码Rpi-chc1蛋白或其功能片段或功能同源物的核酸。
本发明进一步提供了一种根据本发明植物的植物部分或后代，所述植物部分或后代包含编码图4的Rpi-chc1氨基酸序列或其功能片段或功能同源物的核酸。
在一个优选实施例中，将本文所述的核酸转移给除Solanum chacoense以外的茄属品种，即将本文所述的核酸优选提供给具有非chacoense背景的植物，优选S.lycopersicon或马铃薯。其中后者最优选是四倍体品种，更优选是商业上感兴趣的品种，诸如Bintje、Desiree或Premiere、Spunta、Nicola、Favorit、Russet Burbank、Aveka或Lady Rosetta。
另外，还可将根据本发明的抗性提供给对卵菌感染已经具有部分抗性的植物，其中为所述植物提供编码其它抗性基因(诸如Rpi-blb1、Rpi-blb-2、Rpi-blb-3、Rpi-vnt1或Rpi-mcq1)的核酸。
为了向植物提供对卵菌感染的至少部分抗性，本发明进一步提供了：分离或重组的核酸序列的应用，所述核酸序列包含编码图4的Rpi-chc1氨基酸序列或其功能片段或功能同源物的核酸序列；或如图7中描述的分离或重组的核酸序列的应用；或包含任意所述核酸序列的载体的应用；或包含任意所述核酸序列或所述载体的宿主细胞的应用。在一个优选实施例中，所述卵菌包括疫霉属菌、甚至更优选包括马铃薯晚疫病菌。在另一个优选实施例中，所述植物包括马铃薯或Solanum lycopersicum(以前称作Lycopersicon esculentum)。
在又一实施例中，本发明提供了一种用于产生Rpi-chc1蛋白或其功能片段或功能同源物的方法，所述方法包括：将本文所述的核酸与调控序列功能性连接，并在宿主细胞中表达所述核酸。调控序列的实例是启动子和/或终止子序列。进一步地，从实例2可见，Rpi-chc1序列优选在它自己的启动子和终止子的控制下进行表达。因此，本发明进一步提供了Rpi-chc1的启动子和/或终止子序列(图7)。图7示出了含有Rpi-chc1基因和调控序列的克隆CHC B2-3(7907bp)的核苷酸序列。用阴影突出了4550bp的Rpi-chc1编码区(核苷酸(nt)3358-7266)。上游3357个核苷酸(nt 1-3357)和下游641个核苷酸(nt 7267-7907)包含确保所述基因正确表达的调控序列。技术人员能够容易地克隆所述调控序列(或部分调控序列)，并测试它们在转录中的效果。已经进一步发现，使用截短的启动子(即所述基因序列上游含小于1000bp、优选不超过900bp的启动子)甚至会得到更好的表达。
下面将通过非限制性实例，对本发明进行更详细地阐释。
实验部分
实例1：种群发育
最近对茄属Petota组的分类系统进行重组揭示了在该组中缺少物种结构(Jacobs等人，2008)。为了鉴别来自分类组10-14(Jacobs等人，2008)的晚疫病抗性特性，我们选择了几个登录号，并在田间试验中测试了它们对马铃薯晚疫病菌菌的抗性水平。其中，选择了5个具有高抗性水平的登录号(TAR852-5、BER94-2031-01、BER481-3、BER493-7、CHC543-5)，它们事先被确定为S.tarijense(TAR)、S.berthaultii(BER)和S.chacoense(CHC)。为了研究这些抗性的遗传基础，我们使用BER493-7、CHC543-5、BER94-2031-01作为抗性亲本，进行杂交，以得到杂交后代。在离体叶片试验中，使用所得的F1种群来测试对马铃薯晚疫病菌抗性的分离(表1)。
表1：种群分析
在标示的杂交后代中，进行离体叶片试验。测定具有R(抗性)、S(易感)或Q(不确定)表型的植物的分离比率。
在种群7650和06-882中，发现了明显的1∶1分离，这是单显性抗性基因分离的标志。在种群7767中，也发现了1∶1分离，但同时也发现了具有中间(Q)抗性水平的10株植物组。
Rpi-chc1和Rpi-ber的图谱位置
从文献得知，来自S.berthaultii的晚疫病抗性基因(Rpi-ber)与在染色体10长臂上的TG63紧密连锁(Rauscher等人，2006)，该区域也是来自S.pimpenellifolium的番茄Ph-2 QTL定位的区域(Moreau等人，1998)。因此，我们在3个种群中开发了TG63中的CAPS标记物。由于使用表2中描述的多态性，分别发现1个和2个重组体，因此认为06-882和7650中的抗性与TG63紧密连锁。尽管观察到更高的重组频率(15个重组体)，但7677种群的抗性也与TG63连锁。因此结论是，染色体10上的该区域对于晚疫病抗性而言是非常重要的。因此，我们开始利用被充分描述的RH89-039-16物理图谱，来制备TG63基因座的参照图谱。使用表2所述的多态性，来确定TG63在RH10B41上的位置。在该图谱位置，锚定了叠连群6701。使用在该叠连群中的BAC末端序列来制备适于在种群7650中作图的标记物。发现RH199E15S(表2)与7650和06-882中的抗性共分离，这标志着来自RH89-039-16的6710位于合成有Rpi-chc1和Rpi ber基因座的基因座中。
除了遗传上锚定TG63以外，还通过PCR筛选RH BAC文库，将TG63定位在RH89-039-16的物理图谱中。发现了阳性叠连群2203。值得注意的是，使用两种独立的标记物(Jan de Boer，PGSC)，将叠连群2203锚定在RH10B38上。基于重叠群2203中的BAC末端序列，开发出CAPS标记物，并确定CAPS标记物在06-882和7650种群基因组中的位置。这些标记物也与抗性紧密连锁，表明该重叠群也位于合成有Rpi-chc1和Rpi-ber基因座的基因座中。
使用BAC-末端序列，鉴别出侧接叠连群2203和6701的3个额外RH BAC叠连群(图1A)。为了得到足以进行精细作图的序列信息，组成分别由3个和4个重叠BAC(106G038、137D014、009D021和122B15、77O23、04G12、199E15)组成的2个覆瓦式途径，并对其进行测序。RH BAC序列的注释(图2)揭示在第一个覆瓦式途径存在2个RGA(位于RH10B38上)，且在第二个覆瓦式途径存在7个RGA(位于RH10B41、42上)，如图1A中的箭头所示。确定了源自这些和其它的染色体10序列的几种标记物在S.chacoense种群7650(图1B)和S.berthaultii种群06-882(图1A)基因组中的位置。这些种群的大小分别增加至2357和2532。筛选相关基因组区域中的重组体，以使用种群7650中的标记物RH099F09T和RH092A09S作为种群06-882中的标记物RH91C10T和RH199E15S。作为源自相同RH BAC(RH137D14)的标记物，137D14-C37-7和137D14-C37-2在RH89-039-16中仅间隔15kb，并分别在7650种群(2个重组体)和06-882种群(没有重组体)中共分离。这强烈地暗示，Rpi-chc1和Rpi-ber位于合成基因簇中，且在所述基因之间可能存在等位基因关系。
Rpi-chc1的克隆
为了克隆Rpi-chc1，使用源自抗性克隆CHC543-5的DNA构建了2个BAC文库。第一个文库构建在pCC1BAC BAC载体中，且含有约22.000个克隆(平均插入序列大小为～70Kbp)，对应于1个基因组等量物。第二个文库构建在pIndigoBAC-5BAC载体中，且含有约110.000个克隆(平均插入序列大小为～45Kbp)，对应于3个基因组等量物。用标记物RH106G03T筛选第一个文库(表2，图1B)，其中标记物RH106G03T与7650种群中的抗性共分离，仅发生3次重组事件。以此方式，鉴别出BAC克隆CHC B1。绘制CHC B1的2个BAC末端(B07_1_C15)的图谱，并使用RP末端(标记物B07_1_C15_RP′)(其仅示出与Rpi-chc1抗性基因有一次重组事件)来筛选第二个BAC文库，从而鉴别出CHC B2(2-D06_3-D21)(图1B)。证实CHC B2含有RH137D14 C37-7标记物。发现了与在Rpi-chc1抗性基因其它部位上的RH137D14 C37-7的2次重组事件。因此得出结论，Rpi-chc1基因座限定于0.2cM(5/2357重组体)区间，该区间被2个部分重叠的BAC克隆CHC B1和CHC B2物理跨越(图1B)。
通过对这2个BAC进行测序，发现CHC B1含有2个RGA，CHC B2含有3个RGA，分别被命名为CHC B1-1、CHC B1-2、CHC B2-1、CHC B2-2和CHC B2-3(图2)。后3个RGA在由B07_1_C15_RP′和RH137D14 C37-7限定的图谱区间内。因此，通过使用高保真聚合酶
进行长距离PCR，将所述3个基因亚克隆进pBINplus载体中，且使所述3个基因处于它们天然调控元件的控制下。对得到的亚克隆进行完全测序，发现与它们的BAC模板序列相同。
使用根癌农杆菌瞬时试验(农杆菌渗入)，在本氏烟草中进行互补分析，其中用分别含有pBINplus：CHC B2-1、pBINplus：CHC B2-2和pBINplus：CHC B2-3的农杆菌株AGL1+virG渗入4周龄的野生型本氏烟草植物中。我们使用没有插入序列的pBINplus和pBINplus：Rpi-blb1作为对照。在2天后，在离体叶片试验(DLA)中，用马铃薯晚疫病菌90128攻击渗入的叶片。被pBINplus：CHC B2-3和pBINplus：Rpi-blb1渗入的叶片表现出对感染的抗性，而pBINplus：CHC B2-1、pBINplus：CHC B2-2和没有插入序列的pBINplus则移生有马铃薯晚疫病菌，这从叶片上生成的孢子病变可以明显看出来(图3)。本实验清楚地表明，CHC B2-3是对马铃薯晚疫病菌有活性的抗性基因。由于在Rpi-chc1的基因图谱区间中的其它基因都没有显示出活性，因此可以得到结论，即CHC B2-3是Rpi-chc1基因。
Rpi-chc1同源性和结构
令人感兴趣地是，Rpi-chc1与来自S.chacoense的Rpi-chc1基因簇的其它RGA、以及与来自马铃薯克隆RH89-039-16染色体10上的合成簇的基因具有最高的同源性(75％-98％)(表3、图4)。并且，发现了Rpi-chc1与来自白杨(登录号ABF81421)的具有未知功能的基因所编码的蛋白具有较低、但是显著的同源性程度(40％)(表3、图4)。Rpi-chc1蛋白的不同结构域与由ABF81421编码的白杨蛋白的对应结构域具有不同的同源性程度。其中，NBS结构域是最保守的(48％氨基酸的一致性)，其次是CC结构域(34％氨基酸的一致性)，LRR结构域是最不保守的(21％氨基酸的一致性)。还发现Rpi-chc1蛋白与如下蛋白的总同源性低于33％：来自黄瓜的FOM2蛋白(Joobeur等人，2004，该蛋白赋予对真菌病原体锤形真菌(Fusarium oxysporum)的抗性；来自S.bulbocastanum的Rpi-blb1(Song等人，2003；van der Vossen等人，2003)；来自S.demissum的R3a(Huang等人，2005)；以及，来自大豆(Glycine max)的RPS1-k(Gao等人，2005)；其中Rpi-blb1、R3a、RPS1-k赋予对疫霉属(Phytophthora sp)菌的抗性。
Rpi-chc1包含具有3909个核苷酸(nt)的ORF，该ORF编码具有1302个氨基酸的蛋白，所述蛋白包含CC-NB-LRR R-蛋白特有的所有序列(图5)。可在N末端辨别出具有折叠成卷曲的卷曲结构潜力的5个氨基酸段。中央的NB-ARC结构域含有与激酶1a、激酶2、激酶3a、GLPL、RNBS-D和MHD亚结构域相似的氨基酸段(Bendahmane等人，2002；van der Biezen和Jones，1998)。与许多其它NB-LRR蛋白相比，Rpi-chc1蛋白的特征在于缺少明显的RNBS-A亚结构域，但存在双MHD亚结构域。C-端结构域含有29个不完全的富含亮氨酸的重复序列(LRR)。LRR 3和LRR 4皆含有特征性的LDL特征，该特征经常存在于LRR3中。已报道MHD和LRR3皆影响活性调节和假定的分子内相互作用(Bendahmane等人，2002；Tameling等人，2006)。这2个亚结构域的重复可能暗示共同的调控机制。
在基因组中的Rpi-chc1同源基因座；基因座定向作图(locus directedprofiling)。
为了鉴别基因组中含有Rpi-chc1相关核苷酸序列的位置，开发了一种源自NBS作图(NBS profiling)的新技术(Brugmans等人，2008；van der Linden等人，2004)，并将该技术称作“基因座定向作图”。取代以前使用的靶向通常在所有R-基因中都存在的结构域的引物，我们现在使用Rpi-chc1序列家族中保守的引物(表2)。以此方式，预期仅靶向Rpi-chc1的相关基因。用RsaI、HaeIII、AluI或MseI对来自亲本和不同种群(SHxRH、06-882)的后代的基因组DNA进行酶切。然后，在酶切产物上连接接头(adaptor)。且使用与Rpi-chc1家族特异性引物结合的接头引物，在PCR反应中产生不同分子量的多个片段。使用Licor聚丙烯酰胺凝胶系统，在2个种群中检测到多态带。对来自SHxRH种群的40个后代植物中的多态带进行记录，接着将标记物分离模式拟合至UHD图谱中(van Os等人，2006)。确定了73％的标记物位于染色体10的长臂上，而Rpi-chc1基因定位于该染色体10的长臂。对分离的标记物片段进行序列分析，也显示出标记物片段与Rpi-chc1基因家族的强同源性(表4b)。总之，这些数据表明，“基因座定向作图”是在特定基因组区域中制备标记物的成功方法。在染色体10上，高频率地标记了3个不同的基因座(表4A)。令人感兴趣地是，前2个基因座与叠连群2203和6701(它们分别定位于RH10B38-39和RH10B41-42)的图谱位置相同。第三组标记物定位于RH10B54。令人感兴趣地是，Rpi-ber1基因(Park等人，2008)与RH10B54簇位于相同的标记物区间内。为了测试Rpi-ber基因是否是Rpi-chc1潜在的同源物，在种群06-882中，开发了58个Rpi-chc1基因座定向作图标记物。其中有34个标记物源自抗性亲本，28个标记物与抗性连锁(9个为互引相，19个为相斥相)。2个互引相标记物和7个相斥相标记物与种群的前1771个个体中的抗性完全连锁。这强烈地提示，Rpi-ber是Rpi-chc1的同源物。在28个连锁的Rpi-chc1基因座定向作图标记物中，可以辨别出4组重组模式，在图1A中用代表性标记物的名称来标记每组。3个标记物组匹配RH10B38-39簇，一个标记物组匹配RH10B41-42簇。该结果证实了我们对SHxRH种群的研究结果，即在染色体10上的Rpi-chc1相关序列家族位于至少2个紧密连锁的簇中。
表4b：源自SHxRH种群的Rpi-chc1基因座定向作图标记物的序列同源性
在源自S.berthaultii登录号493-7的不同种群(7677)中，发现用以前描述的NBS5a6引物制备的NBS作图标记物与该种群中的疫霉病菌抗性紧密连锁。该NBS作图标记物位于染色体10长臂上的与TG403相关的端粒位点(图6)。该片段的序列分析揭示出NBS作图标记物与Rpi-chc1家族成员具有高同源性。总之，这些结果表明，染色体10上至少存在4个遗传上不同的Rpi-chc1样簇。这与染色体9长臂上的情形类似，染色体9上鉴别出3个不同的Tm2-2相关簇(Foster等人，2009；Pel等人，2009)。
植物材料和马铃薯晚疫病菌分离菌
在本研究中，我们使用了4个晚疫病抗性克隆TAR852-5(源自CGN22729)、BER94-2031-01(源自PI473331)、BER481-3(源自CGN18190)BER493-7(源自CGN17823)、CHC543-5(源自BGRC63055)。CHC543-5与CHC544-5杂交，以生成种群7650。BER94-2031-01与易感克隆G254杂交，以生成种群06-882。BER493-7与RH89-039-16杂交，以生成种群7677。马铃薯栽培品种Desiree用于转化。野生型本氏烟草植物用于瞬时互补试验。
在表5中示出了在本研究中使用的马铃薯晚疫病菌分离菌的特性和起源。
BAC文库的构建
使用克隆CHC543-5作为构建BAC文库的DNA来源。如(Rouppe van derVoort等人，1999)所述的方法，进行高分子量DNA的制备和BAC文库的构建。对于第一个文库，使用pCC1BAC骨架；对于第二个文库，使用pIndigoBAC-5，其中pCC1BAC骨架和pIndigoBAC-5皆来自Epicenter。对于文库1，得到平均插入序列为～70Kbp的约22.000个克隆，对应1基因组当量；对于文库2，得到平均插入序列为～45Kbp的约110.000个克隆，对应3基因组当量。将BAC克隆保藏为含有大约700-1000个白色菌落的细菌库。这些细菌库经如下方法制备：使用无菌的玻璃涂布器从琼脂平板上刮下菌落，随后再悬浮于含有18％甘油和12.5μg/ml氯霉素的LB培养基中。将这些所谓的超级库(super pool)保存于-80℃。经如下方法进行BAC文库的标志物筛选：首先使用标准的碱性裂解法，从每个库分离出质粒DNA，然后进行PCR，以鉴别阳性库。稀释对应于阳性库的细菌，并涂布在含有氯霉素(12.5μg/ml)的LB琼脂平板上。将单个白色菌落挑入384-孔微量滴定板中，随后通过(Rouppe van derVoort等人，1999)所述的标记物筛选方法，鉴别出单一的阳性BAC克隆。从超级库分离出的BAC克隆的名称具有前缀CHC，并扩展具有编号(B1和B2)，所述编号对应于它们鉴别出的次序。
候选基因的亚克隆
长距离PCR
以如下方法，从BAC克隆CHC B2中亚克隆候选RGA。引物分别设计在预测的起始密码子上游约3kb处和预测的终止密码子下游约700bp处。(CHCB2-1F＝MN459：tgaccctgcaggGGACCCCTTAACAAGTGATGTG，
CHC B2-1R＝MN462：tgacggcgcgccAAAAAGTCCCGCTTTGATACC，
CHC B2-2F＝MN483：tgaccctgcaggCCCCTTAACAAGTGATGTGATG，
CHC B2-2R＝MN484：tgacggcgcgccTCAGGTTCCCTTACAAGATTCC，
CHC B2-3F＝MN479：tgaccctgcaggACGCATCAGGAAGAGAGGAG，
CHC B2-3R＝MN480：tgacggcgcgccGCGGTTCCTCTGTGAAACAC)
DNA测序和计算机分析
使用2kb和6kb文库的鸟枪法克隆策略进行BAC克隆测序，由Macrogen(南韩)进行。使用染料终止物原理，进行测序反应。由Macrogen进行序列叠连群的组装。采用在鸟枪法克隆上或直接在BAC上的引物步移法，进行缺口封闭(gap closing)。
使用基于网络的应用程序FGENESH(Softberry)分析叠连群序列，以便预测基因结构。使用DNA star软件包(Lasergene)，比对RGA和来自可公开得到的数据库的RGA的同源性，并进行距离分析(distance analysis)。使用基于网络的应用程序SMART(EMBL)，鉴别出保守的结构域。
抗性试验
使用离体叶片试验测定原代转化体和本氏烟草叶片的抗性表型。使用种群分离菌90128测定CHC种群的表型。使用分离菌IPO-C测定ber种群的表型。使用表5中描述的分离菌，测定抗性亲本的抗性谱。以(Vleeshouwers等人，1999)所述的方法进行接种物制备和接种。在接种后6天，测定植物表型。将没有表现症状或在近接种点处表现出局部枯斑的叶片记为有抗性的，而将具有明显的生成孢子病变的叶片记为是易感的。
本氏烟草中的瞬时互补
在本氏烟草上进行农杆菌瞬时转化试验(农杆菌渗入)。在补充有5mg/l四环素和50mg/l卡那霉素(用于pBINplus构建体)的LB培养基(1升超纯水中含有10克细菌蛋白胨、10克NaCl和5克酵母浸出物)中，培养重组的根癌农杆菌(A.tumefaciens)AGL1+培养物。培养1或2天后，将计算量的培养物(根据在600nm处的OD0.5)转移至补充有卡那霉素(用于所有菌株)的发根农杆菌培养基(YEB)(1升超纯水中含有5克牛肉膏、5克细菌蛋白胨、5克蔗糖、1克酵母浸出物、2ml 1M的MgSO4)。培养1天后，3500rpm离心过夜细胞，并重新悬浮于补充有1ml 200mM乙酰丁香酮的李氏菌选择性培养基基础(MMA)培养基(20克蔗糖、5克MS盐和1.95克2-N-吗啉基乙磺酸(MES))中，至最终OD0.2，并用3ml注射器渗入4周龄植物中。2天后，在离体叶片试验(DLA)中，用马铃薯晚疫病菌菌株90128攻击渗入的叶片。然后在接种后5-7天，记录过敏反应(HR)或马铃薯晚疫病菌孢子的形成。
实例2：Rpi-chc1是对马铃薯晚疫病菌的功能性抗性基因
方法
植物材料和马铃薯晚疫病菌分离菌
在本研究中，我们使用225种茄属植物，其名称和登录号列在表7中。使用9种晚疫病抗性植物分离Rpi-chc1的功能同源物(tar852-5、源自PI473331的ber94-2031-01、ber481-3、ber493-5、ber493-7、ber493-9、chc543-5、ber324-2、ber487-1、ber561-2和scr849-1)。将CHC543-5与CHC544-5杂交，以生成种群7650。将BER94-2031-01与易感克隆G254杂交，以生成种群06-882。将BER493-7与RH89-039-16杂交，以生成种群7677。使用马铃薯栽培品种Desiree进行转化。使用野生型本氏烟草植物进行瞬时互补试验。
在表5中示出了在本研究中使用的马铃薯晚疫病菌分离菌的特性和起源。
候选基因的克隆
根据生产商的说明书(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs))，使用长距离高保真热稳定的DNA聚合酶PCR扩增Rpi-chc1同源物。将引物设计与Rpi-chc1的起始密码子和终止密码子重叠，且含有AttB1和AttB2延伸(MN595和MN597，表8)。根据生产商的说明书(英杰公司(InVitroGen))，使用BP
将PCR产物重组进pDONR221中。使用标准和定制的引物(MN622-MN650，表8)，在Baseclear(荷兰)进行DNA测序。使用DNA star软件包(Lasergene)对序列进行分析比对，从而进行同源性和种系发生分析。
启动子终止子构建体
为了制造含有Rpi-chc1的启动子和终止子的克隆，用于构建三点Gateway应用介导的表达构建体，而设计了与Rpi-chc1启动子和终止子序列匹配的特异性引物(MN598、MN599、MN600、MN601、MN670；表8)，且在所述引物中分别添加了AttB4、AttB1和AttB2、AttB3重组位点。根据生产商的说明书，使用长距离高保真且热稳定的DNA聚合酶
制备PCR产物。使用BP
重组PCR产物。使用表8中列出的引物MN651和652，分析得到克隆的序列，从而排除PCR错误的出现。使用这些构建体和pDONR221中的ORF序列，通过LR clonase酶进行三点Gateway反应(triple point gatewayreaction)。
抗性试验
使用离体叶片试验测定原代转化体和本氏烟草叶的抗性表型。使用分离菌90128测定CHC转基因植物的表型。使用分离菌IPO-C测定本氏烟草中Rpi-chc1同源物的表型。以(Vleeshouwers等人，1999)所述的方法，进行接种物制备和接种。接种后6天，测定植物表型。将没有表现症状或在近接种点处表现出局部枯斑的叶片记为有抗性的，而将具有明显的生成孢子病变的叶片记为是易感的。
本氏烟草中的瞬时互补
在本氏烟草上进行农杆菌瞬时转化试验(农杆菌渗入)。在补充有5mg/l四环素和50mg/l卡那霉素(用于pBINplus构建体)的LB培养基(1升超纯水中含有10克细菌蛋白胨、10克NaCl和5克酵母浸出物)中，培养重组的根癌农杆菌(A.tumefaciens)COR308培养物。培养1或2天后，将计算量的培养物(根据在600nm处的OD0.5)转移至补充有卡那霉素(用于所有菌株)的YEB培养基(1升超纯水中含有5克牛肉膏、5克细菌蛋白胨、5克蔗糖、1克酵母浸出物、2ml 1M的MgSO4)中。培养1天后，3500rpm离心过夜细胞，并重新悬浮于补充有1ml 200mM乙酰丁香酮的MMA培养基(20克蔗糖、5克MS盐和1.95克MES)中，至最终OD0.2，并用3ml注射器渗入4周龄植物中。2天后，在离体叶片试验(DLA)中，用马铃薯晚疫病菌菌株90128攻击渗入的叶片。然后在接种后5-7天，记录过敏反应(HR)或马铃薯晚疫病菌孢子的形成。
共渗入
根癌农杆菌COR308中存在在马铃薯普通花叶病毒(PVX)质粒中的一组90种效应物(PEX集合)。所述二元质粒含有来自Pi的效应物，且所述Pi被克隆在PVX基因组内。在农杆菌渗入以后，效应物和PVX都会被表达。在实验时程中，PVX不会发生系统性扩散，而且我们仅对效应物的局部表达感兴趣。在识别由R-基因编码的效应物时，可以在3dpi和5dpi之间观察到HR。6天后可观察到PVX症状，通常在未渗入的叶片中首先观察到该PVX症状。
我们使用R3a和Avr3a-KI、R-基因-AvR-基因组合(已知该组合会产生强应答(Armstrong等人，2005))作为阳性对照。使用Rpi-chc1候选基因的筛选表明有具有2种潜在效应物基因RD12-1和RD12-2的坏死斑(图8)。
在前面的实例中，我们描述了来自基于Solanum chacoense登录号543-5的Rpi-chc1基因克隆的图谱。Rpi-chc1是以前未描述的CC-NB-LRR类的R基因家族的始祖，且位于染色体10靠近标记物TG63的位置上。该基因存在于具有5个同源物的基因簇中。遗传分析显示，这些同源物中仅3个(CHC B2-1、CHC B2-2和CHC B2-3)可能编码Rpi-chc1。本氏烟草中的瞬时互补分析暗示，CHC B2-3是活性拷贝。
在本实验中，我们通过易感cv.Desiree的稳定转化证实了CHC B2-3的确会补偿马铃薯晚疫病菌(Pi)的易感性(图8)。同时，该结果也证实了我们以前CHC B2-3是Rpi-chc1的方案。该结果还表明，Rpi-chc1可以在广谱的茄科种植物(诸如S.chacoense和本氏烟草，以及马铃薯)中起作用。
Rpi-chc1特异性地识别RXLR效应蛋白
为了了解Rpi-chc1的活性范围，我们研究了Rpi-chc1识别的Pi的组分。迄今为止，被宿主R-蛋白识别的所有Pi组分皆是RXLR类效应物。Pi分离菌T30-4对于表达Rpi-chc1的植物是无毒性的，因此该分离菌中肯定表达了同源组分。最近，对T30-4的基因组进行了测序，它的基因组似乎编码数百种RXLR效应物(Haas等人，2009)。将包含所有已知Avr(Avr1、Avr2、Avr3a、Arv4、Avr-blb1、Avr-blb2)的65种RXLR效应物和少数非RXLR效应物(Inf1、PiNIP)克隆进植物表达载体pGR106中，并称作PEX集合(Vleeshouwers等人，2008)。在本氏烟草中，通过与Rpi-chc1的共农杆菌渗入对PEX集合进行筛选。以此方式，在相同细胞中同时表达选择的效应物和Rpi-chc1基因。在效应物被Rpi-chcl识别的情况下，会诱导过敏反应(HR)，并在叶片的渗入区域中导致坏死病变，该现象已在R3a和Avr3a的共渗入中进行了详细地描述(Armstrong等人，2005)，因此使用R3a和Avr3a的共渗入作为我们实验的阳性对照(图9)。单独使用Rpi-chc1进行农杆菌渗入的叶片区域保持绿色，这表明Rpi-chc1自身不会诱导细胞死亡。另外，Rpi-chc1与上述Avr(Avr1、Avr2、Avr3a、Arv4、Avr-blb1、Avr-blb2)的共渗入也没有诱导HR，这表明Rpi-chc1识别Pi的新组分，且具有诱导抗性的独特途径。另一方面，PEX集合中的某些效应物产生了非Rpi-chc1依赖性的过敏反应(图9叶片C)。而且在PEX集合中还存在两个仅表现出Rpi-chc1依赖性的细胞死亡的克隆(图9叶片B)，这两个克隆(RD12-1和RD12-2)彼此高度同源，且事实上编码相同的蛋白。Rpi-chc1没有识别到编码与RD12具有60％一致性的蛋白RD31(图9叶片A)，这表明Rpi-chc1的识别具有非常高的特异性。为了测试识别R-基因部位的特异性，将RD12与Rpi-blb1、Rpi-blb3和R3a一起共渗入。另外，通过共渗入测试了Rpi-chc1的横向同源物(paralog)CHC B2-1和CHC B2-2(参见实例1)，CHC B2-1和CHC B2-2分别在氨基酸水平表现出与Rpi-chc1具有78％和83％的一致性。这些R-基因或R-基因横向同源物与RD12的共渗入皆没有产生过敏反应(数据未示出)。这些结果清楚地表明，Rpi-chc1特异性地识别Pi组分RD12。RD12(＝PITG_16245)在Pi基因组中具有几种横向同源物(PITG_16418、PITG_16427、PITG_16233、PITG_16240、PITG_20934、PITG_20936、PITG_20336和PITG_23230)，它们的序列如下所示。
PITG_16245 MATATVLVQSPASGLTTTVADTAQTATSILTPVLAGEPN
KHVTTRSLRTHPIADSDDGEERLLNGMTDFVKYHAGKM
NPEQLYKYLKLQGRGQEAYKHKNYASYIKKSKKWWK
PITG_16418 MATATVLVQSPASGLTTTVADTAQTATSILTPVLAGEPN
KHVTTRSLRTHPIADSDDGEERLLNGMTDFVKYHAGKM
NPEQLYKYLKLQGRGQEAYKHKNYASYIKKSKKWWKNQ
PITG_16427 MRVLCLALMATATVLVPSPASGLTTTVADTAQTATSILTPVLAGEPN
KHVTTRSLRTHPIADSDDGEERLLNGMTDFVKYHAGKM
NPEQLYKYLKLQGRGQEAYKHKNYASYIKKSKKWWKNQ
PITG_16233 MRVLCLALMATATVLVQSPASGLTTTVADTAQTATSILTPVLAGEPN
KHVATRSLRTHPIDDSDDGEERLLNGMTDFFKYHAGKM
SPEQLYKYLNLKGLGQEAYKHKNYASYIKKSKKWWKNQ
PITG_16240 MRVLCLALMATATVLVQSPASGLTTTVADTAQTATSILTPVLAGEPN
KHVATRSLRTHPIDDSDDGEERLLNGMTDFFKYHAGKM
SPEQLYKYLNLKGLGQEAYKHKNYASYIKKSKKWWKNQ
PITG_20934 MRVLCLALMATATVLVPSPASGLTTTVADTAQTATSILTPVLAGEPN
KHVATRSLRTHPIDDSDDGEERLLNGMTDFFKYHAGKM
SPEQLYKYLNLKGLGQEAYKHKNYASYIKKSKKWWKNQ
PITG_20936 MRVLCLALMATATVLVPSPASGLTTTVADTAQTATSILTPVLAGEPN
KHVATRSLRTHPIDDSDDGEERLLNGMTDFFKYHAGKM
SPEQLYKYLNLKGLGQEAYKHKNYASYIKKSKKWWKNQ
PITG_20336 MRVLCLALMATATVLVPSPASGLTTTVADTAQTATSILTPVLAGEPN
KHVATRSLRTHPIDDSDDGEERLLNGMTDFFKYHAGK
PITG_23230 MRVLCLALMATATVLVPSPASGLTTTVADTAQTATSILTPVLAGEPN
KHVATRSLRTHPIDDSDDGEERL
不能排除，在与Pi的相互作用中，这些横向同源物也可被Rpi-chc1识别。也不能排除，其它不相关的Pi组分也可以被识别，因为已经有了对双特异性的R-基因的描述(Jones和Dangl，2006)。
Rpi-chc1表达对启动子要求
我们使用以前描述的策略(Lokossou等人，2009)来确定哪些调控序列最适合驱动Rpi-chc1开放阅读框的表达，其中使用三点gateway策略，将候选ORF克隆在期望的启动子和终止子之间。将Rpi-chc1 ORF克隆在它自己的3kb启动子和0.5kb终止子(p-chc1-长)之间，该3kb启动子和0.5kb终止子也出现于如图8中描述的最初互补分析中。另外，还将Rpi-chc1 ORF克隆在三个可选择的启动子/终止子组合之间：它自己的启动子的较短形式(0.8kb)和它自己的0.6kb终止子(p-chc1-短)；pMDC32中的双35S启动子、和Rpi-blb3启动子/终止子组合(Lokossou等人，2009)。为了测试哪个是最佳的启动子终止子组合，将4种Rpi-chc1构建体转化至AGL-1+virG，培养物与含有PEX-RD12的根癌农杆菌COR308以1∶1的比例混合。将在MMA培养基中的系列稀释物渗入本氏烟草叶片中(图10)。OD6002.0和1.0的p-chc1-长构建体与RD12的混合物诱导了HR。低2倍浓度(OD600＝0.5)的p-chc1-短构建体也表现了HR。值得注意的是，35S和Rpi-blb3启动子/终止子构建体不适合Rpi-chc1基因的功能表达。这些结果表明，Rpi-chc1的启动子在功能上不同于其它测试的启动子。此外，得出的结论是，在Rpi-chc1启动子上游(＜-900bp)的序列含有表达抑制元件。
Rpi-chc1样序列的种质筛选
为了进一步证实Rpi-chc1可以在种类繁多的茄属品种中起作用的方案，以及研究种质中Rpi-chc1等位基因序列和活性的差异，我们使用活性Rpi-chc1和在最初应用中鉴别出的几个相关序列进行序列比对，对从我们种质集合中的225个基因型(表7)进行筛选，以找到Rpi-chc1的相关序列；其中，所述相关序列源自RH89-039-16和源自chc543-5中的无活性横向同源物。以仅PCR扩增预测的活性拷贝的方式，设计引物对(表8)。如图11A所示，引物组合D和E是高度特异性的，因为仅在含有Rpi-chc1模板的反应中观察到PCR产物，而在含有密切相关序列模板的反应中没有观察到扩增。使用引物组合D和E筛选S.chacoense和S.berthaultii(n＝2600；Rpi-ber；登录号PI265858；94-2031*G254)的精细作图种群(n＝2400)中的重组体，其中Pi抗性正在分离。在任一个种群中，皆没有发现标记物和抗性之间的重组体(数据未示出)。这表明，两种标记物皆是高度特异性的。这也表明，Rpi-ber基因与Rpi-chc1相关，且Rpi-chc1衍生出的分子标记物可以用于标记这些抗性基因。
从其中分离出Rpi-chc1的基因型chc543-5位于分类群10-14中(Jacobs等人，2008)。为了筛选其它Rpi-chc1同源序列，对我们的种质集合中位于分类群10-12至10-17中的225个基因型(表7)进行了选择。使用Ef1-αPCR确定了DNA完整性(数据未示出)，接着使用引物组合D来筛选Rpi-chc1相关序列。在该筛选中，发现6个基因型是阳性的(图11B)。首先，该筛选发现了chc543-5，因此证实了筛选的稳定性。另外，鉴别出5个其它的基因型，其中有S.berthaultii植物324-2、481-3和561-2，从而证实了以前提出的Rpi-chc1和Rpi-ber非常相关的方案。同时也标记了2个其它品种：S.tarijense(852-5)和S.sucrense(849-1)。
Rpi-chc1同源物的寻找
为了进一步表征Rpi-chc1功能和序列的保守性或差异，我们开始从种质筛选阳性的植物以及从已知在染色体10上含有抗性基因的植物(如图6所示)中克隆开放阅读框。设计与Rpi-chc1的起始密码子和终止密码子重叠的引物，并在引物上添加attB1和AttB2延伸片段，以进行BP克隆进入pDONR221中。使用校正型聚合酶的PCR反应，产生所有选择基因型的特异性产物，并克隆这些PCR片段。对于每个基因型，选择6个克隆，并进行末端测序。某些基因型仅得到一种序列类型，对于这些基因型，我们的结论是仅扩增了1个靶基因。对于具有两种或两种以上序列类型的基因型，对额外16个克隆进行末端测序，并分组。使用源自Rpi-chc1的内部引物，对每个序列组的3个克隆进行全长测序。从而鉴定出21个新的Rpi-chc1样序列(图13)。使用clustal-W，比对该编码的蛋白序列和以前鉴别的Rpi-chc1同源物(图14)。这样，得到如图12所示的系统进化树。我们从chc543-5中分离出两种序列类型。第一种类型与Rpi-chc1相同。第二种序列类型位于具有多个序列(都源自S.berthaultii植物)的另一个进化枝(图12中的进化枝1)中，表明该方案可以成功地鉴别Rpi-chc1同源物。四种基因型仅产生一种序列类型：849-1、RH89-39-16、487-1和94-2031-1，其中前3个位于相同进化枝(图12中的进化枝2)上。RH89-39-16序列RH_D3、D4和D7彼此相同，且与RH137D14 c13-2(在最初应用中构建RH物理图谱的过程中制备的序列)有2个核苷酸错配，这两个序列皆位于进化枝2中，所述进化枝2还含有S.sucrense序列849-1_M8、M18和M20，S.berthaultii序列487-1、I4、I6和I8皆是M20。另外，S.tarijense 852-5_E3也存在于进化枝2中。因为RH89-39-16对Pi感染是易感的，提示这些序列是无活性的同源物。从S.tarijense 852-5分离出的2个其它序列位于进化枝3中，所述进化枝3还包括Rpi-chc1基因。此外，进化枝3中还存在来自S.berthaultii植物94-2031-1、561-2、324-2的3个序列，这3个序列仅表现出较小的序列偏差，且编码相同的氨基酸序列。进化枝4仅含有来自S.berthaultii植物的序列。进化枝5仅含有前面鉴别出的序列，在其它组(组6)中也是如此。与进化枝5和组6中的蛋白相比，进化枝1-4编码的蛋白具有45个氨基酸(a.a.)的N-端延伸。进化枝2、3和5中的序列位于距TG63有0.1cM内的R-基因簇上。尚未对进化枝1和4中的序列进行遗传定位。与新近可得到的S.phureja基因组序列对比揭示，来自进化枝1至5的序列在TG63簇中具有最接近的同源物。与番茄基因组对比揭示，在TG63附近还存在Rpi-chc1簇。如前所示，Pi抗性基因Ph-2定位于该遗传位置。一些经测序的番茄植物没有携带Ph-2抗性基因，但是可能存在潜在的无活性的等位基因(图13)。组6序列具有与相关R-基因簇最接近的同源性(参见图6)，其中相关R-基因簇靠近染色体10上的TG403(Pi抗性也定位于该区域)，这也表明来自该簇的Rpi-chc1同源序列可能编码Pi抗性。
Rpi-chc1同源物的功能分析
现在，我们已经确定了21个新的Rpi-chc1同源物，并且已经示出序列差异，但问题是所述序列的功能是否是保守的或变化的。使用三点gateway重组，将所有确定的序列(它们是ORF)亚克隆到二元载体pDEST236中，且所述序列处于Rpi-chc1-短启动子和Rpi-chc1终止子的控制下。基于在图10中的结果，认为这是驱动开发的Rpi-chc1同源物进行表达的最佳组合关系。接着，将构建体转化到根癌农杆菌株COR308中，用于在本氏烟草中进行瞬时互补试验。可选择地，为了与同源的Pi效应物RD12共表达，可将Rpi-chc1同源物转化到根癌农杆菌株AGL1+virG中。这两个实验是互补的，因为瞬时互补试验可以显示Rpi-chc1是否会诱导抗性，而共渗入可以指示所述基因的识别特异性。所有实验至少重复2次，且将结果总结在表9中。可以观察到RD12应答和IPO-C抗性的几种组合。其中可以辨别出2个明显的组：第一组对RD12无应答，且是IPO-C易感的(组1；表9)，这些序列是无活性的同源物，主要位于系统进化的进化枝1中(图12)；第二组(组2；表9)是Rpi-chc1的功能同源物，因为它们会积极地诱导对Pi的抗性，且识别相同的Pi组分(RD12)，该组序列也与其它序列明显不同，因为它们都位于进化枝3中(图12)。S.tarijense 852-5克隆E28在没有RD12存在下诱导HR，它的活性模式方面是独特的，由此构成活性组3，但因为它没有诱导抗性，因此最可能是无活性的等位基因。来自相同植物(克隆E14)的另一个等位基因不识别RD12，但是确实诱导强抗性。活性组4不同于组2的原因在于活性组4最可能识别Pi的不同组分。活性组5非常类似于组4；唯一的差别是，疾病抗性不是那么强。这暗示组5也识别Pi的不同组分，且具有不同的抗性谱。最后一组(组6)是特殊的，因为RD12仅被弱识别，且抗性也是弱的。总之，这些数据表明，最密切相关的Rpi-chc1同源物具有保守的抗性机制，而相关度较低的序列则具有更多样化的抗性机制。总之，这些数据表明，Rpi-chc1基因家族的多个成员具有不同程度的相似性，且具有提供对Pi抗性的功能。
表5：在本研究中使用的马铃薯晚疫病菌分离菌的特性，以及它们与chc、ber和tar登录号的相互作用。R是抗性的，S是易感的，nd是不确定的。
表6：报道的野生茄属种的晚疫病抗性的R-基因和数量性状基因座
表7：筛选Rpi-chc1相关序列的基因型。分类群表示(Jacobs等人，2008)对茄属petota组的重新分类
表8：本研究中使用的引物
表9：新确定的Rpi-chc1同源物的功能分析
在RD12应答的列中，R是指有应答，N是指无应答，*是指自活化，r是指弱应答。在IPO-C抗性的列中，R是指强抗性，r是指弱抗性，S是指易感的。
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Claims (21)
1.一种在植物中提供对卵菌感染的至少部分抗性或增加抗性的方法，所述方法包括：为植物或其一部分提供编码图4所示氨基酸序列Rpi-chc1或其功能片段或功能同源物的核酸；优选地，其中所述植物是来自茄科的植物、更优选为马铃薯。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述卵菌包括疫霉属菌、优选包括马铃薯晚疫病菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述功能同源物选自由493-7_G12、543-5_C2、849-1_M8_M18_M20、487-1_I4_I6_I8、94-2031_L4_L7_l8、561-2_K4_K14_K22、324-2_J1_J3_J8、852-5_E14_E23、852-5_E28、493-9_H5_H30、493-7_G14_G22、561-2_K6_K30_K31和493-7_G21所组成的氨基酸序列组。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中如权利要求1中定义的所述核酸序列包括：如图7中描述的核酸序列、或如图13中描述的编码所述氨基酸序列493-7_G12、543-5_C2、849-1_M8_M18_M20、487-1_I4_I6_I8、94-2031_L4_L7_l8、561-2_K4_K14_K22、324-2_J1_J3_J8、852-5_E14_E23、852-5_E28、493-9_H5_H30、493-7_G14_G22、561-2_K6_K30_K31和493-7_G21的核酸序列。
5.一种培育具有卵菌抗性的四倍体植物的方法，所述卵菌优选为疫霉属菌，所述方法包括：
a、增加二倍体植物的配子的倍性水平，其中所述二倍体植物已经含
有如权利要求1至4中任一项定义的核酸序列；
b、使用所述配子与四倍体植物的配子杂交；以及
c、选择存在所述核酸序列的杂交的后代。
6.根据权利要求5所述的方法，其中步骤a)中的所述二倍体植物是来自S.chocaense、S.berthaultii、S.sucrense或S.tarijense属的植物。
7.一种用于选择对卵菌感染具有易感性或抗性的植物、或植物材料、或其后代的方法，所述方法包括以下步骤：测试所述植物或植物材料或其后代的至少一部分中是否存在如权利要求1至4中任一项定义的核酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述测试包括：使用特异性结合所述核酸的引物或探针，检测表2中的一种或多种标记物的存在。
9.一种用于在植物育种中进行标记物辅助选种以得到对卵菌抗性的标记物，其中所述标记物选自表2中所示的标记物。
10.一种分离或重组的核酸序列，所述核酸序列包括：编码图4中氨基酸序列Rpi-chc1或其功能片段的核酸序列，或编码氨基酸序列493-7_G12、543-5_C2、849-1_M8_M18_M20、487-1_I4_I6_I8、94-2031_L4_L7_l8、561-2_K4_K14_K22、324-2_J1_J3_J8、852-5_E14_E23、852-5_E28、493-9_H5_H30、493-7_G14_G22、561-2_K6_K30_K31和493-7_G21或其功能片段的核酸。
11.根据权利要求10所述的分离或重组的核酸序列，其中所述片段至少包括所述氨基酸序列的富含亮氨酸的重复序列结构域。
12.根据权利要求10所述的分离或重组的核酸序列，所述核酸序列包括如图7中或图13中描述的核酸序列。
13.一种转基因细胞或四倍体细胞，所述转基因细胞或四倍体细胞包括根据权利要求10、11或12中任一项所述的核酸。
14.一种载体，所述载体包括根据权利要求10至12中任一项所述的核酸序列。
15.根据权利要求14所述的载体，所述载体进一步包括基因天然关联的启动子和/或终止子，所述载体更优选包括截短的启动子，所述截短的启动子为所述基因序列上游少于1000个核苷酸的序列。
16.一种转基因宿主细胞或四倍体宿主细胞，所述转基因宿主细胞或四倍体宿主细胞包含根据权利要求10至12中任一项所述的核酸、或根据权利要求14或15所述的载体；所述转基因宿主细胞或四倍体宿主细胞优选为农杆菌属细胞或植物细胞。
17.一种转基因植物细胞或四倍体植物细胞，所述转基因植物细胞或四倍体植物细胞包含根据权利要求10至12中任一项所述的核酸、或根据权利要求14或15所述的载体；优选地，其中所述植物细胞是来自茄科、更优选来自马铃薯、更优选来自四倍体马铃薯的细胞。
18.一种转基因植物或四倍体植物，所述转基因植物或四倍体植物包含根据权利要求17所述的细胞。
19.一种源自根据权利要求18所述的植物的一部分，优选地其中所述一部分是块茎。
20.一种由根据权利要求10至12中任一项所述的分离或重组的核酸编码的蛋白或其功能片段，优选地其中所述蛋白具有如图4中描述的所述Rpi-chc1的氨基酸序列。
21.一种抗体，所述抗体(特异性地)结合如权利要求20中的所述蛋白。
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