CN102665769A - 与装载化疗剂的纳米颗粒连接的抗整联蛋白抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及与纳米颗粒共价连接的抗整联蛋白抗体,其中这些纳米颗粒预先装载化疗/细胞毒性剂。根据本发明的抗体-化疗剂-纳米颗粒缀合物,特别是其中所述抗体是MAb DI17E6,并且细胞毒性剂是多柔比星,表现对肿瘤细胞毒性的显著增加。
Description
发明技术领域
本发明涉及与纳米颗粒共价连接的抗整联蛋白抗体。这些纳米颗粒优选地装载有或结合至化疗剂。抗体-化疗剂-纳米颗粒缀合物表现肿瘤细胞毒性的显著增加。本发明特别针对此类抗体缀合物,其中抗体是整联蛋白抑制物,优选地是av整联蛋白阻断抗体,并且纳米颗粒是血清白蛋白纳米颗粒。本发明的抗体纳米颗粒缀合物能够用于肿瘤治疗。因此,抗体偶联的人血清白蛋白纳米颗粒代表了用于向肿瘤受体阳性或表达肿瘤受体的细胞中靶向药物运输的有潜力的递送系统。
发明技术背景
最近几年,癌症研究中出现了基于装载药物的纳米颗粒制剂的新的癌症治疗策略。
纳米颗粒代表了有希望的药物载体,特别是对抗癌药物到肿瘤位点的特异性运输。纳米颗粒表现了高药物装载效率和轻微的药物泄露,良好的储存稳定性,并可避开癌细胞多药物抗性[Cho K,Wang x,Nie S,Chen ZG,Shin DM.;Clin Cancer Res 2008;14(5):1310-1316]。用人血清白蛋白(HSA)制成的纳米颗粒提供多种特别的优势[Weber C,Coester C,Kreuter J,Langer K.;Int J Pharm 2000;194(1):91-102]:HSA耐受良好并且HSA纳米颗粒是生物可降解的。HSA纳米颗粒的制备简单并且是可重复的[Langer K,Balthasar S,Vogel V,Dinauer N,von Briesen H,Schubert D.;Int J Pharm 2003;257(1-2):169-180],并且由于纳米颗粒的表面存在功能基团,纳米颗粒与药物靶向配体的共价衍生是可能的[Nobs L,Buchegger F,Gurny R,Allemann E.;J Pharm Sci 2004;93(8):1980-1992;Wartlick H,Michaelis K,Balthasar S,Strebhardt K,Kreuter J,Langer K.;J DrugTarget 2004;12(7):461-471;Dinauer N,Balthasar S,Weber C,Kreuter J,Langer K,von Briesen H.;Biomaterials 2005;26(29):5898-5906;Steinhauser I,B,Strebhardt K,Langer K.;Biomaterials2006;27(28):4975-4983]。
纳米颗粒在肿瘤组织中的富集可通过被动或主动靶向机制发生。被动靶向由“增强的通透性与保留(EPR)效应”造成,其特征为由于泄露的肿瘤脉管系统和弱淋巴引流的肿瘤中纳米微粒系统的增强积累[Maeda H,Wu J,Sawa T,Matsumura Y,Hori K.;J Control Release2000;65(1-2):271-284]。特别地,已知表面具有聚乙二醇(PEG)修饰的长循环纳米颗粒表现出被动肿瘤靶向[Greenwald RB;.J Control Release2001;74(1-3):159-171]。
在药物载体系统表面偶联肿瘤特异性配体导致主动药物靶向。单克隆抗体(mAb)提供作为药物靶向配体的巨大潜力[Adams GP,Weiner LM.;Nat Biotechnol 2005;23(9);1147-1157]。
来自多种实体的癌细胞被报道表达高水平的整联蛋白αvβ3[AlbeldaSM,Mette SA,Elder DE,Stewart R,Damjanovich L,Herlyn M等人;Cancer Res 1990;50(20):6757-6764;Pijuan-Thompson V,Gladson CL.;JBiol Chem 1997;272(5):2736-2743;Rabb H,Barroso-Vicens E,Adams R,Pow-Sang J,Ramirez G;Am J Nephrol 1996;16(5):402-408;Liapis H,Adler LM,Wick MR,Rader JS.;Hum Pathol 1997;28(4):443-449;Bello L,Zhang J,Nikas DC,Strasser JF,Villani RM,Cheresh DA 等人;Neurosurgery 2000;47(5):1185-1195;Gladson CL.;J Neuropathol ExpNeurol 1996;55(11):1143-1149;Gladson CL,Hancock S,Arnold MM,Faye-Petersen OM,Castleberry RP,Kelly DR.;Am J Pathol1996;148(5):1423-1434;Patey M,Delemer B,Bellon G,Martiny L,Pluot M,Haye B.;J Clin Pathol 1999;52(12):895-900;Ritter MR,Dorrell MI,Edmonds J,Friedlander SF,Friedlander M.;Proc Natl Acad Sci U S A2002;99(11):7455-7460.]。
αvβ3整联蛋白是细胞外基质(ECM)配体(例如玻连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白)的受体并且也被称为“玻连蛋白受体”。大部分组织和细胞类型由低αvβ3整联蛋白水平或没有αvβ3整联蛋白表达表征。然而,它在被细胞因子活化后的内皮细胞和平滑肌细胞上过量表达,特别是在来自肉芽组织和肿瘤的血管中[Eliceiri BP,Cheresh DA.;J ClinInvest 1999;103(9):1227-1230]。因此,它在血管发生中具有重要功能。αvβ3整联蛋白在体内模型中参与黑色素瘤生长。αvβ3抑制物阻断血管发生和肿瘤生长[Mitj ans F,Sander D,Adan J,Sutter A,Martinez JM,Jaggle CS等人;J Cell Sci 1995;108(Pt 8):2825-2838;Mitjans F,Meyer T,Fittschen C,Goodman S,Jonczyk A,Marshall JF等人;Int J Cancer2000;87(5):716-723]。此外,在一些癌症例如乳腺癌或黑色素瘤中,αvβ3表达表现出与疾病的进攻性相关[Brooks PC,Stromblad S,Klemke R,Visscher D,Sarkar FH,Cheresh DA.;J Clin Invest 1995;96(4):1815-1822;Felding-Habermann B,Mueller BM,Romerdahl CA,Cheresh DA.;J ClinInvest 1992;89(6):2018-2022]。
整联蛋白αvβ3的拮抗剂不仅阻止了肿瘤相关血管的生长,而且引起了体内已形成的肿瘤的衰退。已经开发了多种抗体、拮抗剂和小抑制性分子作为潜在的抗血管发生策略,暗示整联蛋白αvβ3可能是用于特异性抗血管发生治疗、减少肿瘤生长和新血管形成,以及增加肿瘤凋亡指数的内皮细胞上的潜在靶点[Brooks PC,Montgomery AM,Rosenfeld M,Reisfeld RA,Hu T,Klier G等人;Cell 1994;79(7):1157-1164;Peticlerc E,Stromblad S,von Schalscha TL,Mitjans F,Piulats J,Montgomery AM等人;Cancer Res1999;59(11):2724-2730]。
单克隆小鼠抗体17E6特异性地抑制人整联蛋白受体携带细胞的αv整联蛋白亚基。鼠IgG1抗体由例如Mitjans等人(1995;J.Cell Sci.108,2825)和专利US5,985,278和EP719859描述。鼠17E6是从用纯化的和用琼脂糖固定的人αvβ3免疫的小鼠生成的。将来自免疫的小鼠的脾淋巴细胞与鼠骨髓瘤细胞融合,获得的杂交瘤克隆中的一个生产单克隆抗体17E6。DI-17E6是具有单克隆小鼠抗体17E6的生物学特征,但具有在人中免疫原性方面高于全部的改善的性质的抗体。DI17E6的性质及此修饰的抗体的完整的可变和恒定氨基酸序列如PCT/EP2008/005852所展示。抗体具有以下序列:
(1)可变和恒定轻链序列(SEQ ID NO.1):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLANYQQKPGKAPKLLIYYTSKIHS GVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTFPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC和
(2)可变和恒定重链序列(SEQ ID NO.2):
QVQLQQSGGELAKPGASVKVSCKASGYTFSSFWMHWVRQAPGQGLEWIGYINP RSGYTEYNEIFRDKATMTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASFLGRGAMDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQAQSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
在体外这些抗体阻断细胞黏着和迁移并诱导细胞从玻连蛋白包被的表面脱附。在内皮细胞中,它也诱导凋亡。与化疗组合增强效果。在体内,DI17E6阻断黑色素瘤和其他肿瘤的生长以及生长因子诱导的血管发生。因此,17E6以及DI17E6mAb可以直接干扰肿瘤细胞和肿瘤血管发生[Mitjans F,Sander D,Adan J,Sutter A,Martinez JM,Jaggle CS等人;JCell Sci 1995;108(Pt 8):2825-2838;Mitjans F,Meyer T,Fittschen C,Goodman S,Jonczyk A,Marshall JF等人;Int J Cancer2000;87(5):716-723]。
其他抗αvβ3抗体为例如vitaxin或LM609。
化疗剂普遍地用于癌症疾病的治疗。发现如果与抗体施用一起或至少联合应用,它们会表现特别的肿瘤细胞毒性。大部分已知和市售的抗肿瘤抗体只有在与化疗剂(例如顺铂、多柔比星(doxorubicin)或伊立替康(irinotecan))的组合治疗中有效。
因此,本发明待解决的问题是提供抗整联蛋白,优选地抗av的抗体,所述抗体直接或间接地连接于纳米颗粒的表面以增强抗体在治疗,优选地与化疗联合的肿瘤治疗中的效力。
发明概述
发现如果抗体连接于基于蛋白质的纳米颗粒,优选地血清白蛋白纳米颗粒,当治疗与化疗剂的化疗组合时,抗体在抗肿瘤活性方面的效力通常增强。出乎意料地,当各抗体连接的蛋白质-纳米颗粒装载旨在用于化疗剂/抗体组合治疗的化疗剂时,此效应是卓越的。装载有化疗剂并与抗肿瘤抗体共价连接的蛋白质纳米颗粒的细胞毒性比各只装载化疗剂或只装载抗体的纳米颗粒高。完整缀合物的细胞毒性效应甚至与自由化疗剂和自由抗肿瘤抗体的组合相比是增强的。
本发明特别涉及各缀合物,其中例如Mab 17E6或其去免疫化形式的DI17E6与装载多柔比星的HSA纳米颗粒的表面偶联。在偶联后,通过αvβ3阳性细胞的黏着研究和诱导αvβ3阳性细胞从玻连蛋白包被的表面脱附指示DI17E6的生物学活性。此外,多柔比星修饰的DI17E6纳米颗粒在αvβ3阳性癌细胞中诱导比自由多柔比星和自由抗体更强的抗癌效应。
根据本发明,所述效应也能够对除17E6或DI17E6之外的其他抗肿瘤抗体,例如其他抗整联蛋白抗体,以及除多柔比星之外的其他化疗剂,例如伊立替康或顺铂表现。
本发明优选地涉及HSA纳米颗粒。
纳米技术研究的主要目标是具有药物在肿瘤组织中有效积累的优势的纳米颗粒载体的主动靶向,以在靶细胞内达到较高的药物水平。因此,常常使用单克隆抗体源的药物靶向配体。本发明描述了特定的,基于人血清白蛋白的,装载了化疗剂例如多柔比星的,纳米颗粒的制备。通过将例如针对αv整联蛋白的单克隆抗体DI17E6偶联到纳米颗粒的表面,对表达αvβ3整联蛋白的癌细胞的特异性靶向是可能的。
根据本发明,抗体和纳米颗粒表面之间共价结合,抗体的硫醇化是必要的。必须考虑到硫醇化抗体的二聚化倾向以及在抗体内部引入硫氢基的效率。硫醇化的时间越长,和硫醇化试剂2-亚胺基硫烷(2-iminothiolane)的摩尔过量越高,抗体二聚化的过量越大。此二聚化过程可能是两个抗体分子之间的二硫键形成导致的。
在使用例如50或100倍摩尔过量的2-亚胺基硫烷、2和5h温育时间下,引入的硫羟基的定量表明有效的硫醇化需要至少50倍摩尔过量的2-亚胺基硫烷。温育时间越长和硫醇化试剂摩尔过量越大,能够在蛋白质分子内引入越多的硫羟基/抗体。在我们的结果的基础上,在硫醇化效率和二聚化行为之间的折衷,将我们的标准流程的参数固定为2h和50倍摩尔过量的2-亚胺基硫烷。
由于DI17E6抗体的IgG源,能够在SEM中显示DI17E6通过金抗人IgG抗体反应与纳米颗粒表面结合。在SEM图片中,纳米颗粒表现为150-220nm范围内的灰色球体。偶联到纳米颗粒表面的DI17E6由金表面电子束的反射间接表现。
本发明证明了用不同的抗整联蛋白抗体(例如αv特异性的DI17E6)修饰的HSA纳米颗粒在αvβ3整联蛋白阳性的黑色素瘤细胞M21上的特异性细胞结合与细胞吸收。相反,在αv缺陷型的黑色素瘤细胞M21L上温育后没有可检测的特异性结合。用细胞生长抑制性药物多柔比星装载纳米颗粒对此特异性没有影响。表面上具有非特异性mAb IgG的对照纳米颗粒也表现出非特异性细胞结合,并且没有胞内吸收,它们只是粘附在外层细胞膜上。
细胞附着和脱附测定显示,抗体例如DI17E6的生物学活性在纳米颗粒制备过程中被保留。在DI17E6的情况中,两个测定均基于在玻连蛋白包被的表面上的主要细胞附着由αvβ3整联蛋白完成的事实。αvβ3整联蛋白又称为玻连蛋白受体。因此,αvβ3整联蛋白的抑制导致已附着的细胞脱附或抑制细胞的附着。DI17E6以及DI17E6修饰的纳米颗粒制剂能封闭αvβ3阳性的黑色素瘤细胞M21上的αvβ3整联蛋白位点并抑制细胞附着在玻连蛋白包被的表面。此外,它们能够使已经附着的细胞脱附,而具有对照抗体的纳米颗粒制剂对细胞附着几乎没有影响。能够用其他抗体在各个方法中得出类似的观测结果。
不同的纳米颗粒制剂或自由细胞毒性剂例如多柔比星的平行的脱附动力学研究确认了细胞脱附测定的结果。在DI17E6和多柔比星的情况中,细胞脱附是由NP-DI17E6和NP-Dox-DI17E6诱导的,但装载了多柔比星的纳米颗粒似乎效率更高。此外,更出乎意料的结果是含有多柔比星的纳米颗粒比自由多柔比星更快地诱导细胞死亡。
MTT测定的IC-50值也支持结合纳米颗粒的多柔比星比自由细胞毒性剂细胞毒性更高的这些发现。降低细胞活力所需要的NP-CA-Mab(其中NP是纳米颗粒,CA是细胞毒性或化疗剂而Mab是单克隆抗体),例如NP-Dox-DI17E6(其中Dox是多柔比星)的浓度比诱导相同效果所需要的自由细胞毒性剂低。装载特异性的DI17E6修饰的多柔比星的纳米颗粒似乎在细胞多柔比星运输中优于自由多柔比星。由于在温育后DI17E6修饰的纳米颗粒对αv缺陷型黑色素瘤细胞M21L无效以及在温育后对αvβ3阳性黑色素瘤细胞M21的效力,能够证实NP-Dox-DI17E6的特异性。IgG修饰的纳米颗粒对两个细胞系统,αvβ3阳性黑色素瘤细胞M21和αv缺陷型黑色素瘤细胞M21L都无效。
已知癌细胞对未修饰纳米颗粒的非特异性吸收,但其不如对用配体修饰的纳米颗粒有效,如NP-Dox所示。总之,本发明提供抗体特异性/装载化疗剂的纳米颗粒药物靶向系统,优选地基于DI17E6的αv特异性装载多柔比星的纳米颗粒药物靶向系统,所述系统比自由化疗/细胞毒性剂和未修饰的纳米颗粒效率更高。
特异性地将细胞毒性药物运输到癌细胞中以增加抗癌作用并降低毒性副作用的策略受到高度关注。在此背景下研究了许多纳米颗粒制剂(综述参见Haley等人,文献被引用)。例如,有FDA批准的脂质体多柔比星包囊(和MyocetTM),其中蒽环类药物动力学被改变并且心脏风险降低[Working PK,Newman MS,Sullivan T,Yarrington J.;JPharmacol Exp Ther 1999;289(2):1128-1133;Waterhouse DN,Tardi PG,Mayer LD,Bally MB.;Drug Saf 2001;24(12):903-920;Gabizon A,Shmeeda H,Barenholz Y.;ClinPharmacokinet 2003;42(5):419-436;O′Brien ME,Wigler N,Inbar M,Rosso R,Grischke E,Santoro A,等人;Ann Oncol 2004;15(3):440-449]。
其他实例是第一个基于HSA的纳米颗粒制剂,2005年被FDA批准。这些纳米颗粒含有细胞生长抑制性药物紫杉醇。由于紫杉醇在水中溶解性差,结合纳米颗粒的紫杉醇有多种优势,例如增加的肿瘤内浓度、递送的紫杉醇剂量更高以及减少的灌注时间,不需要术前用药[Gradishar WJ,Tjulandin S,Davidson N,Shaw H,Desai N,Bhar P等人;JClin Oncol 2005;23(21):7794-7803;Desai N,Trieu V,Yao Z,Louie L,Ci S,Yang A等人;Clin Cancer Res 2006;12(4):1317-1324]。
在此,本发明提供纳米颗粒系统,所述纳米颗粒系统特异性地靶向αv整联蛋白,并具有靶向显示αv整联蛋白高表达的肿瘤细胞和/或通过靶向内皮细胞抑制血管发生的潜力。
本发明具体地提供用细胞生长抑制性药物多柔比星装载的靶特异性人血清白蛋白纳米颗粒的制备。通过使用用于共价偶联到纳米颗粒表面的针对αv整联蛋白的单克隆抗体DI17E6,能够显示DI17E6修饰的HSA纳米颗粒对αvβ3整联蛋白阳性黑色素瘤细胞的特异性细胞结合和细胞吸收。两个生物学测定,细胞附着和脱附测定显示,DI17E6抗体的生物学活性在纳米颗粒制备过程中被保留。此纳米颗粒制剂的药物装载对细胞脱附测定没有影响。甚至,与用未装载的纳米颗粒的细胞温育相比,在用装载药物的纳米颗粒的细胞温育的情况下,细胞脱附更有效率。此外,此装载药物的纳米颗粒制剂比自由多柔比星诱导更快的细胞死亡。装载药物的特异性纳米颗粒与自由多柔比星相比细胞毒性更高的此发现由细胞活力测定支持。
总之,本发明提供基于纳米颗粒的药物靶向系统,所述纳米颗粒优选地是装载细胞毒性/化疗剂的HSA纳米颗粒,其中抗整联蛋白受体抗体,优选地抗αv抗体,例如DI17E6与所述纳米颗粒共价偶联。此系统比自由细胞毒性剂更有效。这些纳米颗粒制剂中特异性靶向与药物装载的组合导致癌症治疗的改善。如上所述,DI17E6具有双特异性性质,一方面阻断黑色素瘤生长,另一方面抑制血管发生,是有希望的用于癌症治疗mAb。因此,不仅自由DI17E6,而且用DI17E6修饰并装载药物的纳米颗粒能够在肿瘤治疗中起到双刃剑的作用。
总之,本发明涉及:
●抗整联蛋白抗体纳米颗粒缀合物,通过将抗整联蛋白抗体或其生物活性片段共价连接到预先用化疗剂处理的蛋白质-纳米颗粒的表面获得;
●各抗体纳米颗粒缀合物,其中化疗剂通过吸附装载到蛋白质-纳米颗粒;
●各抗体纳米颗粒缀合物,其中蛋白质颗粒是人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)的蛋白质纳米颗粒;
●各抗体纳米颗粒缀合物,其中未处理的蛋白质-纳米颗粒的颗粒直径在150和250nm之间,优选地在160和190nm之间;
●各抗体纳米颗粒缀合物,其中用化疗剂处理的蛋白质-纳米颗粒的颗粒直径在300和400nm之间,优选地在350和390nm之间;
●各抗体纳米颗粒缀合物,其中抗体通过引入抗体分子中的硫氢基直接或用接头连接到蛋白质-纳米颗粒;
●各抗体纳米颗粒缀合物,其中用所述蛋白质-纳米颗粒处理的化疗剂选自:顺铂、多柔比星、吉西他滨(gemcitabine)、多西他赛(docetaxel)、紫杉醇、博来霉素(bleomycin)和伊立替康;
●各纳米颗粒缀合物,其中共价连接到所述蛋白质-纳米颗粒的抗体选自LM609、vitaxin和17E6,以及其变体;
●各抗体纳米颗粒缀合物,其中所述蛋白质-纳米颗粒是装载多柔比星的HSA,并且共价连接到此颗粒的抗体是17E6或DI17E6;
●药物组合物,其包含药物学有效量的如上所述的抗体纳米颗粒缀合物,和任选地载体、洗脱剂或容器(recipient);
●如上所述的抗体纳米颗粒缀合物在用于治疗癌症疾病的药物的制备中的用途;
●如上所述的抗体纳米颗粒缀合物,用于治疗肿瘤疾病。
根据本发明获得的装载化疗/细胞毒性剂并与抗整联蛋白,特别是抗αv的抗体共价连接的HSA纳米颗粒在细胞附着/脱附测定中显示在10h后细胞已经死亡,所述细胞附着/脱附测定包含携带抗体特异性结合的整联蛋白受体的细胞。
根据本发明的装载化疗/细胞毒性剂并与抗体连接的各HSA纳米颗粒在所述细胞附着/脱附中显示细胞在20h后死亡,其中抗体不是抗整联蛋白抗体,并且细胞不包含抗体能够结合的整联蛋白受体(IgG)。
自由的细胞毒性剂显示在此类系统中细胞在约17h后死亡。
在此类系统中,没有预先装载细胞毒性化合物但与抗整联蛋白抗体连接的纳米颗粒以及自由抗整联蛋白抗体和完全未处理的细胞没有显示细胞死亡。
因此,根据本发明的抗体纳米颗粒缀合物以协同作用的方式导致细胞死亡。
发明详述:
纳米颗粒的制备:为了将DI17E6附着到装载多柔比星的HSA纳米颗粒,使用异双功能的NHS-PEG-Mal接头,所述接头一方面与HSA纳米颗粒表面上的氨基基团反应,另一方面具有与引入抗体DI17DE6内的硫氢基反应的潜力。
DI17E6的硫醇化:向抗体引入硫羟基具有形成氧化性二硫桥导致二聚体或更高的寡聚体的风险[Steinhauser I,Spankuch B,Strebhardt K,Langer K.;Biomaterials 2006;27(28):4975-4983]。因此,在用2-亚胺基硫烷温育2、5、16和24h的时期后用大小排阻层析(SEC)评估二聚体和寡聚体的形成。结果显示,随着硫醇化时间和2-亚胺基硫烷摩尔过量的增加,抗体在层析谱中的保留时间稍微延长(图1A)。此外,峰高度降低并且峰变宽。使用50倍摩尔过量的2-亚胺基硫烷和2h的温育时间,获得的层析谱显示具有较短的保留时间的额外的峰。SEC的分子量校准显示此峰代表分子量为原抗体两倍的化合物。温育时间越长(5、16、24h),此二聚体峰增大并且原峰变宽,说明二硫桥形成增加。此观测结果在100倍过量2-亚胺基硫烷条件下更明显(图1B)。
通过与5,5’-二硫-二-2(硝基-苯甲酸)(Ellman试剂)的二硫化结合定量每个抗体引入的硫羟基的数量。由于延长的温育时间导致增强的二聚体和寡聚体的形成,用5倍、10倍、50倍和100倍摩尔过量的2-亚胺基硫烷温育DI17E62h或5h。更高的摩尔过量和/或更长的温育时间增加每个抗体的硫羟基数量(图2)。使用2h的温育时间,50倍摩尔过量导致0.64±0.15硫羟基/抗体,而100倍摩尔过量导致1.22±0.09硫羟基/抗体。在5h温育时间后,50倍摩尔过量显示1.2±0.29硫羟基/抗体,而100倍摩尔过量显示2.9±0.12硫羟基/抗体。
HSA纳米颗粒的制备:通过去溶剂化制备并用与100%颗粒基质化学计量交联通过戊二醛稳定HSA纳米颗粒。纳米颗粒分别用异双功能的聚(乙二醇)-α-顺丁烯二酰亚胺-ω-NHS酯(NHS-PEG5000-Mal)或单功能的甲氧基聚(乙二醇)丙酸的琥珀酰亚胺酯(mPEG5000-SPA)活化。在第一种情况下异双功能交联剂导致抗体和纳米颗粒之间的共价连接。在第二种情况下,由于聚乙二醇链端的非反应性甲氧基基团,只期望在抗体和纳米颗粒之间的吸附性结合。
未装载的纳米颗粒和装载多柔比星的纳米颗粒的物理化学表征结果分别展示在表1(未装载的纳米颗粒)和表2(装载多柔比星的纳米颗粒)中。未装载的颗粒的特征是颗粒直径为140至190nm,而装载药物的颗粒显示出在350-400nm的范围内的大得多的尺寸。全部纳米颗粒的多分散度在0.01的范围内。这说明了单分散颗粒尺寸分布不依赖于颗粒是否装载药物或表面被修饰。
装载药物的颗粒的多柔比星装载量是55-60μg/mg。DI17E6与颗粒表面的共价连接能够用14-18μg抗体/mg纳米颗粒针对未装载颗粒(NP-DI17E6)和11-20μg DI17E6/mg纳米颗粒针对装载多柔比星的颗粒(NP-Dox-DI17E6)达到。使用对照抗体IgG能够获得类似的结果:
未装载的纳米颗粒表现16-18μg抗体/mg纳米颗粒(NP-IgG)的表面修饰,而包埋药物的颗粒在其表面导致15-20μg IgG/mg纳米颗粒(NP-Dox-IgG)的结合。只有少量的抗体吸附性结合到未装载的纳米颗粒或装载多柔比星的纳米颗粒的表面。对DI17E6,量在2-3μg/mg(未装载颗粒)至0.1-0.5μg/mg(装载多柔比星的颗粒)范围内,而对IgG,量为从4-8μg/mg(未装载颗粒)至2-3.5μg/mg(装载多柔比星的颗粒)的范围内。
能够注意到,IgG表现出比DI17E6更高的吸附性结合的趋势。此外,抗体对纳米颗粒表面的低吸附说明大部分抗体分子通过异双功能PEG间隔区共价附着到颗粒表面。对于细胞培养实验,只使用具有抗体共价连接的样品。
在纳米颗粒表面的抗体可视化:DI17E6是IgG源的单克隆抗体。因此,与18nm胶体金抗人IgG抗体的反应是可能的。在扫描电子显微镜(SEM)图片中纳米颗粒被识别为200nm范围内的灰色球体(图3)。在具有DI17E6偶联的纳米颗粒表面显示出小的白色球体(图3A和3B),而在没有抗体偶联的纳米颗粒表面没有东西被识别(图3C)。小白色球体是SEM中电子束在金标记的样品表面的反射。
细胞结合:用DI17E6偶联的纳米颗粒(NP-DI17E6)或与非特异性对照mAb IgG(NP-IgG)偶联的纳米颗粒温育αvβ3整联蛋白阳性黑色素瘤细胞M21和αv阴性黑色素瘤细胞M21L。如图4A所示,NPDI17E6表现出比NP-IgG更高的对M21细胞的结合。在M21L细胞中观察到了NP-DI17E6和NI-IgG可比较的结合,与M21细胞相比有所减弱(图4B)。掺入多柔比星不影响纳米颗粒结合。NP-Dox-DI17E6表现对M21细胞的高结合而NPDox-IgG对这些M21细胞表现低结合(图4C)。两种纳米颗粒制备物都表现对M21L细胞的低结合(图4D)。
细胞吸收与细胞内分布:通过共聚焦激光扫描显微术(CLSM)显示这些纳米颗粒制剂的细胞吸收和胞内分布。用NP-Dox-DI17E6、NP-Dox-IgG或自由多柔比星温育αvβ3整联蛋白阳性M21黑色素瘤细胞(图5)。在M21细胞膜的外部只检测到少量NP-Dox-IgG(图5C),而NP-Dox-DI17E6到达了细胞的内部(图5D,图6)。在用NP-Dox-DI17E6(图5D)温育以及用自由多柔比星(图5B)温育后能够检测到红色多柔比星荧光。图6以较高的放大倍率说明了NPDox-DI17E6的细胞内吸收。不同荧光通道(图6B-D)的覆盖证实了NP-Dox-DI17E6的细胞内吸收(图6A)。此外,用共聚焦激光扫描显微术将用NP-Dox-DI17E6温育的M21细胞光学地切割成每个1μm厚的堆叠以证明细胞内吸收。图片系列以图集的形式展示(图7)。
细胞附着/细胞脱附:细胞附着到玻连蛋白包被的表面主要是αvβ3整联蛋白,即所谓的玻连蛋白受体介导的。αvβ3整联蛋白的抑制可能导致已附着的细胞脱附或抑制细胞的附着。DI17E6抑制M21细胞对玻连蛋白包被的表面的附着(图8)。颗粒表面具有DI17E6的纳米颗粒制剂也抑制M21细胞对玻连蛋白的附着,而具有对照抗体的纳米颗粒对细胞附着只有微小的影响(图8)。
脱附测定中的细胞脱附比附着测定中的附着抑制需要稍高的DI17E6浓度(分别是4ng/μl和10ng/μl相比于2ng/μl)。然而,对NP-DI17E6和自由DI17E6,αvβ3阳性黑色素瘤细胞M21从玻连蛋白包被的表面的细胞脱附也是可能的(图9)。此外,NP-Dox-DI17E6表现相同的脱附效力(图9)。
不同纳米颗粒制剂或自由多柔比星的平行的脱附动力学研究确认了细胞脱附测定。在此研究中,用透射光缩时显微术观测1-2d时间范围的脱附。每7分钟完成照片。测量细胞的脱附时间。由NP-DI17E6纳米颗粒诱导的细胞脱附发生在2-22h(表3)之间,而含有多柔比星的纳米颗粒NP-Dox-DI17E6更有效,在第一个3h内诱导完全脱附(表3)。具有IgG修饰的对照纳米颗粒NP-Dox-IgG没有表现细胞脱附(表3)。此外,观察到了DI17E6修饰的含有多柔比星的纳米颗粒的其他优势:这些纳米颗粒在10h内诱导细胞死亡,这比由自由多柔比星温育快。在这种情况下细胞死亡只在17h后发生(表3)。由于IgG修饰的装载多柔比星的纳米颗粒的轻微非特异性细胞结合,如图4C和图5C所示,NP-Dox-IgG颗粒也在20h后诱导细胞死亡。然而,此NPDox-IgG诱导的细胞死亡发生得比自由多柔比星温育晚,这说明在NP-Dox-IgG温育后细胞的边界非特异性多柔比星吸收。
在附录1中缩时声学显微术电影进一步表现了NP-Dox-DI17E6诱导的脱附和细胞凋亡。
细胞活力测定:在MTT细胞活力测定中测试不同纳米颗粒制剂的生物学活性。用IC-50值表示自由形式或掺入到纳米颗粒中的多柔比星将细胞活力减小50%的效力(表4)。在αvβ3阳性M21黑色素瘤细胞中,NP-Dox-DI17E6或非PEG化的NP-Dox比自由多柔比星更有效。与非特异性IgG mAb偶联的对照纳米颗粒在测试的浓度下对细胞活力没有影响(IC-50值:NP-Dox 30.8±3.5ng/ml,NP-Dox-DI17E68.0±0.2ng/ml,自由多柔比星57.5±3.7ng/ml,NP-Dox-IgG>100ng/ml)。相反,NP-Dox-DI17E6在测试的浓度下不减小αv阴性M21L细胞的活力,而自由多柔比星和非PEG化的NP-Dox减小M21L细胞活力(IC-50值:NP-Dox 75.4±8.3ng/ml,NP-Dox-DI17E6>100ng/ml,自由多柔比星70.7±0.8ng/ml,NP-Dox-IgG>100ng/ml)。
如本文所用术语“可药用的”指代表能对哺乳动物施药而不产生不希望的生理效应例如恶心、晕眩、胃部不适等的材料的组合物、载体、稀释剂和试剂。本领域熟知含有溶解或分散于其中的活性成分的药物组合物的制备,不需要基于制剂限制。一般地,将此类组合物制备成液体溶液或悬液的注射剂,然而,也可以制备成在使用前在液体中适合于溶液或悬液的固体形式。制备物也可以被乳化。活性成分能够与赋形剂混合,所述赋形剂是可药用的并且与活性成分相容,并且所述赋形剂的量适用于本文所述的治疗方法。合适的赋形剂是例如水、盐溶液、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。本发明的治疗组合物能够包括其中组分的可药用的盐。
本领域熟知生理可耐受的载体。液体载体的实例是灭菌水溶液,所述灭菌水溶液不含有除活性成分和水之外的其他材料,或者含有处于生理pH值的缓冲剂例如磷酸钠、生理盐溶液或同时含有二者,例如磷酸缓冲的盐溶液。此外,水性载体能够含有多于一种缓冲盐,以及盐类例如氯化钠和氯化钾、葡萄糖、聚乙二醇和其他溶质。液体组合物也能够含有除水之外的液相和不包含水的液相。此类其他液相的实例是甘油、植物油(例如棉籽油)和水-油乳剂。
一般地,根据本发明的抗整联蛋白抗体的治疗有效量是当以生理上可耐受的组合物施药时足以达到下述血浆浓度的量,所述血浆浓度为从约0.01微克(μg)每毫升(ml)至约100μg/ml,优选地从约1μg/ml至约5μg/ml,通常约5μg/ml。换言之,剂量能够在从约0.01mg/kg至约300mg/kg,优选地从约0.2mg/kg至约200mg/kg,最优选地从约0.5mg/kg至约20mg/kg变化,以每天一剂或多剂施药达一天或数天。优选的血浆摩尔浓度是从约2微摩(μM)至约5毫摩(mM),而优选地约100μM至约1mM抗体拮抗剂。
根据本发明的化学细胞毒性或化疗剂的典型剂量是10mg至1000mg,优选地约20至200mg,而更优选地50至100mg每千克体重每天。
本发明的药物组合物能够包括下述短语,所述短语涵盖用减少或避免与本发明的组合治疗(“辅助治疗”)相关的副作用的活性剂治疗对象,所述活性剂包括但不限于例如减少抗癌药毒性效应的那些活性剂,如骨吸收抑制物、心脏保护剂。所述辅助剂防止或减少与化疗、放疗或手术相关的恶心和呕吐的发生,或减少与骨髓抑制性抗癌药物的施药相关的感染的发生。本领域熟知辅助剂。根据本发明免疫治疗剂能够额外地与佐剂例如BCG和免疫系统刺激物施药。此外,组合物可以包括免疫治疗剂或化疗剂,所述免疫治疗剂或化疗剂含有细胞毒性有效的放射性标记的同位素,或其他细胞毒性剂,例如细胞毒性肽(例如细胞因子)或细胞毒性药物等。
附图简述
图1用A)50倍和B)100倍摩尔过量的2-亚胺基硫烷硫醇化DI17E6。在2、5、16和24h的反应时间后用大小排阻层析分析所述抗体。在约11min的保留时间检测到DI17E6而在较短的保留时间检测到较高级缀合物。
图2分别用5、10、50或100倍摩尔过量的2-亚胺基硫烷硫醇化DI17E62h(黑色柱)和5h(阴影柱)。在与Ellman试剂反应后用测光法检测每个抗体分子引入的硫羟基的量(平均±SD;n=3)。
图3用扫描电子显微镜(SEM)证明DI17E6偶联在纳米颗粒表面。在4℃下用18nm胶体金抗人IgG抗体温育表面偶联了DI17E6的纳米颗粒(A,B=A红框中部分的放大图)和没有抗体偶联的纳米颗粒(C)1h。将标记的纳米颗粒固定并脱水。检测是用SEM完成的。
图4未装载和装载多柔比星的纳米颗粒制剂的细胞结合。在37℃下用2ng/μl的不同的未装载(A和B)或装载多柔比星(C和D)的纳米颗粒制剂处理αvβ3整联蛋白阳性黑色素瘤细胞M21(A和C)和αv缺陷型黑色素瘤细胞M21L(B和D)4h(浓度的计算参照DI17E6或等价的NP的量)。进行流式细胞术(FACS)分析以定量其细胞结合。数据显示为FL1-H通道(纳米颗粒的自身荧光)的直方图。绿色:分别是NP-DI17E6和NP-Dox-DI17E6,红色:分别是NP-IgG和NP-Dox-IgG,蓝色:未处理的对照。(ad A:展示3个独立实验中的一个代表性实验,ad B:n=1,ad C:展示14个独立实验中的一个代表性实验,ad D:n=1)
图5用共聚焦激光扫描显微术(CLSM)研究的纳米颗粒的细胞吸收和细胞内分布。在玻片上培养M21细胞,并用10ng/μl的不同纳米颗粒制剂(参照DI17E6浓度或对照纳米颗粒的等价量)在37℃处理4h。使用纳米颗粒的绿色自身荧光和多柔比星的红色自身荧光检测。用ConcanavalinA AlexaFluor 350(蓝色)对细胞膜染色。在细胞的内部切片中拍照。A):对照,没有纳米颗粒的细胞,B)用自由多柔比星温育细胞,C)用具有NP-Dox-IgG的非特异性纳米颗粒温育细胞,D)用具有NP-Dox-DI17E6的特异性纳米颗粒温育细胞。
图6用共聚焦激光扫描显微术研究的NP-Dox-DI17E6的细胞吸收和细胞内分布:荧光通道的分离。在玻片上培养M21细胞,并用10ng/μl的NP-Dox-DI17E6在37℃处理4h。使用纳米颗粒的绿色自身荧光和多柔比星的红色自身荧光检测。用Concanavalin A AlexaFluor 350(蓝色)对细胞膜染色。在细胞的内部切片中拍照。A):全部荧光通道的覆盖,B)蓝色细胞膜通道的显示,C)绿色纳米颗粒通道的显示,D)红色多柔比星通道的显示。
图7用共聚焦激光扫描显微术研究的NP-Dox-DI17E6的细胞吸收和细胞内分布:光学堆叠。在玻片上培养M21细胞,并用2ng/μl的NP-Dox-DI17E6在37℃处理4h。使用所述纳米颗粒的绿色自身荧光和多柔比星的红色自身荧光检测。用Concanavalin A AlexaFluor 350(蓝色)对细胞膜染色。将细胞光学地切割成每个1μm厚的堆叠并以图集的形式展示图片系列。
图8细胞在玻连蛋白包被的表面上的附着。将2ng/μl的自由DI17E6或不同的纳米颗粒制剂与αvβ3整联蛋白阳性的黑色素瘤细胞M21在被玻连蛋白包被的ELISA板上共同温育(浓度参照DI17E6或等价的NP的量计算)。在温育1h后除去未黏着的细胞。按制造商的说明书所述将剩下的附着的细胞用CyQUANT GR染色并对比未处理的对照计数。(每个实验的内部对照(internal control)n=10,展示3个独立实验中的一个代表性实验。)
图9:细胞从玻连蛋白包被的表面的脱附。对于细胞脱附测定,用玻连蛋白包被96孔ELISA板并允许细胞附着和扩散1h。然后添加4ng/μl的自由DI17E6或不同的未装载的或多柔比星纳米颗粒制剂并将板在37℃下再温育4h以诱导脱附(浓度参照DI17E6或等价的NP的量计算)。移除脱附的细胞,按制造商的说明书所述将剩下的附着的细胞用CyQUANTGR染色并对比未处理的对照计数。(每个实验的内部对照n=10,展示9个独立实验中的一个代表性实验。)
附录1:细胞从玻连蛋白包被的表面的脱附:缩时声学显微术,用声学显微术作为研究细胞脱附动力学的另一个方法[41-43]。因此,将αvβ3整联蛋白阳性的黑色素瘤细胞M21接种到用玻连蛋白包被的室中,允许其附着和扩散,然后用装载多柔比星的颗粒表面偶联DI17E6抗体的人血清白蛋白纳米颗粒温育。用缩时声学显微术观察1-2d时间范围的脱附。每分钟拍摄照片。通过人工评估数据分析细胞的脱附。
实施例:
实施例1:纳米颗粒制备
(1)试剂和化学品:人血清白蛋白(HSA,V部分,纯度96-99%)、戊二醛8%水溶液和人IgG抗体获自Sigma(Steinheim,德国)。多柔比星获自Sicor(Milan,意大利)。2-亚胺基硫烷(Traut’s试剂)、5,5’-二硫-二-2(硝基-苯甲酸)(Ellman’s试剂)和D-SaltTM葡聚糖脱盐柱购自Pierce(Rockford,美国),盐酸羟胺和盐酸半胱氨酸x H2O来自Fluka(Buchs,瑞士)。DI17E6获自Merck KGaA,Darmstadt,德国。平均分子量为5.0kDa的甲氧基聚(乙二醇)丙酸的琥珀酰亚胺酯(mPEG5000-SPA)及平均分子量为5.0kDa的交联剂聚(乙二醇)-α-)顺丁烯二酰亚胺-ω-NHS酯(NHSPEG5000-Mal)购自Nektar(Huntsville,美国)。所有试剂都是分析级的,收到后使用。
(2)DI17E6的硫醇化:二聚化反应的动力学:抗体的一级氨基基团可以与2-亚胺基硫烷反应,导致通过开环反应引入硫氢基基团。自由硫氢基基团对随后的抗体通过接头与颗粒表面的共价缀合是必需的。然而,引入硫羟基具有形成氧化性二硫桥,导致DI17E6的二聚体或更高的寡聚体的风险。将DI17E6以1mg/ml的浓度溶解在磷酸盐缓冲液(pH8.0)中。为引入硫羟基,将250.0μl(50倍摩尔过量)和500.0μl(100倍摩尔过量)的2-亚胺基硫烷(6.9mg于50ml pH 8.0的磷酸盐缓冲液中)6添加至500.0μlDI17E6溶液中,并用磷酸盐缓冲液(pH8.0)调整样品的体积。将这些样品在20℃,恒定摇动(600rpm)下分别温育2、5、16或24h。通过添加500.0μl羟胺溶液(0.28mg/ml,于pH8.0的磷酸盐缓冲液中)终止反应。将所述混合物再温育20min。然后,在SWXL柱(7.8mm x 30cm)组合TSKgel SWXL保护柱(guard column)(6mm x 4cm)(Tosoh Bioscience,Stuttgart,德国)上用大小排阻层析(SEC)分析所述样品,使用磷酸盐缓冲液(pH6.6)作为洗脱液,流速为1.0ml/min,以检测二聚体或寡聚体的形成。注入20.0μl的等分试样并通过检测280nm处监测洗脱级分。使用球蛋白标准以就分子量校准SEC系统。
(3)DI17E6的硫醇化:硫羟基基团的定量:将DI17E6以1mg/ml的浓度溶解在磷酸盐缓冲液(pH8.0)中。将此抗体溶液(1000μg/ml)分别与4.02μl(5倍摩尔过量)、8.04μl(10倍摩尔过量)、40.2μl(50倍摩尔过量)或80.4μl(100倍摩尔过量)的2-亚胺基硫烷溶液(5.7mg于5.0mlpH8.0的磷酸盐缓冲液中)在20℃,恒定摇动下温育2h和5h。然后用D-SaltTM葡聚糖脱盐柱通过SEC纯化硫醇化的抗体,使用磷酸盐缓冲液作为洗脱液。用测光法在280nm检测含有抗体的级分并随后合并。用30000微型浓缩器(Amicon,Beverly,美国)将从纯化步骤得到的抗体溶液浓缩到含量约1.1mg/ml。将浓缩的DI17E6溶液的等分试样(250μl)与6.25μlEllman试剂(8.0mg于2.0ml pH8.0的磷酸盐缓冲液中)在25℃下温育15min。然后通过使用(Eppendorf AG,Hamburg,德国)用测光法在412nm测量样品。为计算引入的硫羟基的数量,使用以与抗体溶液的相同方法处理的L-半胱氨酸标准溶液。通过微重力测量法确定DI17E6的含量。
(4)未装载的纳米颗粒的制备:将HSA(200mg)溶解在2ml纯化水中。在过滤(0.22μm)后将此溶液调整为pH8.5。为形成纳米颗粒,在恒定搅拌和室温下,用管式泵(tubing pump)(Ismatec IPN,Glattbugg,瑞士)以1ml/min的速率添加8.0ml乙醇。通过使用8%戊二醛溶液(117.5μl)稳定获得的颗粒。交联步骤在恒定搅拌和室温下进行24h。用两步离心步骤(16100g,10min)纯化颗粒并在磷酸盐缓冲液(pH8.0)中重分散到原体积。此重分散是用漩涡混合器和超声波仪进行的。
(5)装载多柔比星的纳米颗粒的制备:将160mgHSA溶解在4ml纯化水中并用0.22μm醋酸纤维素滤膜(Schleicher&Schuell,Dassel,德国)过滤。将此溶液的等分试样(500μl)添加到200μl 0.5%(w/v)多柔比星水性储液中。向此混合物添加300μl纯化水。为在溶液中将多柔比星吸附到人血清白蛋白上,将混合物在搅拌(550rpm)下在室温温育2h。为通过去溶剂化制备纳米颗粒,用管式泵(Ismatec IPN,Glattbrugg,瑞士)连续添加3ml乙醇(96%,v/v)(1ml/min)。在蛋白质去溶剂化后,添加11.75μl的8%戊二醛溶液等分试样以诱导颗粒交联(对应于100%化学计量蛋白质交联)。交联在恒定搅拌和环境温度下进行24h。用两轮差速离心(16100g,12min)纯化获得的纳米颗粒的等分试样(2.0ml)并重分散。在第一轮中用2.0ml纯化水进行重分散,而在第二轮中使用漩涡混合器和超声波仪用磷酸盐缓冲液(pH8.0)将纳米颗粒重分散到500μl体积。用重力测量法确定纳米颗粒含量。通过HPLC用收集的上清液确定未被包埋的多柔比星。包埋的多柔比星的含量通过总多柔比星和未结合药物的差值计算。使用装有250-4-100RP-18柱的Merck Hitachi D7000HPLC系统(Merck,Darmstadt,德国)定量多柔比星。用含0.1%三氟乙酸的水和乙腈(70∶30)流动相,流速为0.8ml/min获得分离。用UV(250nm)和荧光检测(激发560nm,发射650nm)定量多柔比星。
(6)纳米颗粒的表面修饰:按前文所述制备未装载和装载药物的HSA纳米颗粒,并如下修饰:将1ml分散于磷酸盐缓冲液(pH8.0)中的HSA纳米颗粒悬液分别与250μl mPEG5000-SPA溶液(60mg/ml,于pH8.0的磷酸盐缓冲液中)或聚(乙二醇)-α-顺丁烯二酰亚胺-ω-NHS酯在20℃恒定摇动(Eppendorf thermomixer,600rpm)下温育1h。用如上所述的离心和重分散纯化纳米颗粒。用微重力测量法确定纳米颗粒的含量。
为进行抗体的硫醇化步骤,将DI17E6或IgG以1.0mg/ml的浓度溶解于pH8.0的磷酸盐缓冲液中。为引入硫羟基,将DI17E6或IgG分别与50倍摩尔过量的2-亚胺基硫烷溶液(c=1.14mg/ml;40.2μl)温育2h,如Steinhauser等人(2006)[7]先前所述。用大小排阻层析(SEC,D-SaltTM葡聚糖脱盐柱)纯化抗体。获得的溶液含有浓度为约500μg/ml的硫醇化抗体(分别是DI17E6或IgG)。为进行偶联反应,将1.0ml硫氢基反应性纳米颗粒悬液分别与1.0ml硫醇化的DI17E6或IgG温育,以在抗体和纳米颗粒系统之间实现共价连接。为制备具有吸附性附着的抗体的样品,将1.0ml mPEG5000-SPA修饰的纳米颗粒分别与1.0ml硫醇化的DI17E6或IgG温育。全部样品的温育在20℃和恒定摇动(600)下进行12h。用如前所述的离心和重分散从未反应的抗体中纯化样品。为确定未结合的抗体,收集获得的上清液并用如上所述的大小排阻层析(SEC)分析。结合于纳米颗粒表面的抗体的量是用硫醇化和纯化后获得的抗体的量与缀合步骤后获得的上清液中确定的抗体的量的差值计算的。
实施例2:纳米颗粒的表征
使用Malvern Zetasizer 3000HSA(Malvern Instruments Ltd.,Malvern,英国)通过光子关联光谱学(PCS)分析纳米颗粒的颗粒直径和多分散性。使用同一装置通过激光多普勒微电泳测量ξ电势。在两个测量前,用过滤(0.22μm)的纯化水稀释样品。用微重力测量法确定颗粒含量。为此目的,将50.0μl纳米颗粒悬液吸取到铝称重盘中并在80℃干燥2h。在干燥器中贮存30min后,在微量天平(Sartorius,德国)上称重样品。
实施例3:纳米颗粒表面的抗体偶联的证明
将表面偶联了DI17E6的纳米颗粒(NP-DI17E6)和未偶联抗体的纳米颗粒(NP)与18nm胶体金抗人IgG抗体(dianova,Hamburg,德国)在PBS中在4℃温育1h。将标记后的纳米颗粒用2%戊二醛溶液在0.1M二甲基砷酸钠缓冲液中固定,用Millipore滤器(0.22μm)或Millipore滤器插入物过滤。然后将样品在30%、50%和100%乙醇中脱水,风干,在SCD-030涂层器(Balzers,列支敦士登)中用碳包被,并在场发射扫描电镜FESEM XL30(Philips,美国)中检测。使用10kV加速电压进行次级电子(SE)成像。为检测纳米颗粒表面的抗体,用背散射电子(BSE)模式研究样品。
实施例4:细胞培养
所有实验使用αvβ3整联蛋白阳性的黑色素瘤细胞系M21。使用αv-阴性的黑色素瘤细胞系M21L作为对照(两个细胞系都由Merck KGaA提供)。
在37℃和5%CO2下在补充了10%胎牛血清(Invitrogen,Karlsruhe,德国)、1%丙酮酸盐(Invitrogen,Karlsruhe,德国)和抗生素(50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素;Invitrogen,Karlsruhe,德国)的RPMI1640培养基(Invitrogen,Karlsruhe,德国)中培养细胞。PBS含有Ca2+/Mg2+(Invitrogen,Karlsruhe,德国)。
实施例5:细胞结合
在24孔板(Greiner,Frickenhausen,德国)中培养M21和M21L细胞并用不同的纳米颗粒制剂在37℃处理4h。为测试DI17E6修饰的纳米颗粒,使用2ng/μl的浓度,所述浓度参照偶联到颗粒表面的DI17E6浓度。使用等价纳米颗粒量的没有DI17E6修饰的对照纳米颗粒。在温育后,用PBS(Invitrogen,Karlsruhe,德国)洗涤细胞2次,然后用胰蛋白酶处理并收获。在用FACS-fix(10g/l PFA和8.5g/l NaCl,于PBS中,pH7.4)固定后,对每个样品的10000个细胞进行流式细胞术(FACS)分析,使用FACSCalibur和CellQuest Pro软件(Becton Dickinson,Heidelberg,德国)。能够在488/520nm检测纳米颗粒。
实施例6:细胞吸收和细胞内分布
用共聚焦激光扫描显微镜检查研究纳米颗粒的细胞吸收和细胞内分布。在玻片上培养M21细胞并用2ng/μl或10ng/μl的不同纳米颗粒制剂在37℃处理4h(浓度参照DI17E6或等价的NP的量计算,如2.5所述)。在温育期后,用PBS洗涤细胞2次,并用50ng/μl Concanavalin AAlexaFluor 350(346/442°nm)(Invitrogen,Karlsruhe,德国)对细胞膜染色2min。用0.5%PFA将细胞固定5min。在固定后,将细胞冲洗并包埋到Veetashield HardSetMouting Medium(Axxora,Grünberg,德国)中。用带有510NLO Meta装置(Zeiss,Jena,德国)、MaiTai飞秒或氩离子激光的Axiovert 200M显微镜和LSM Image Examiner软件进行共聚焦显微镜检查研究。在488/520nm检测纳米颗粒。在488/590nm用红色荧光检测多柔比星。
实施例7:细胞附着与脱附测定
将αvβ3整联蛋白阳性的黑色素瘤细胞M21种植在玻连蛋白(MobiTec,德国哥廷根)包被的ELISA板(Nunc,Wiesbaden,德国)上。因此,用1μg/ml玻连蛋白将ELISA96孔板在37℃包被1h。用1%热失活的BSA(PAA,德国)封闭板,并在细胞黏着培养基(含2mML-谷氨酰胺、补充有1%BSA的RPMI 1640)中用2ng/μl自由DI17E6或不同纳米颗粒制剂(涉及自由mAb)和细胞共同温育。在37℃温育1h后,通过用预热的PBS温和洗涤移除未黏着的细胞。用CyQUANT GR(Invitrogen,Karlsruhe)染色剩下的附着细胞,并根据制造商的说明书所述在微量滴定ELISA读数仪中对比未处理的对照计数。
为进行细胞脱附测定,如上所述用玻连蛋白包被96孔ELISA板。在封闭后,允许细胞在细胞黏着培养基中附着和扩散1h。然后,添加4ng/μl或10ng/μl自由DI17E6或不同纳米颗粒制剂(涉及自由mAb)并将板在37℃再温育4h以诱导脱附。然后,用如对细胞附着测定的方法洗涤和处理板。
确定对于用BSA封闭的包被玻连蛋白的表面的特异性附着抑制或脱附诱导。
实施例8:细胞脱附的动力学
为确定细胞脱附的动力学,将细胞接种在用玻连蛋白包被的多孔室中并在潮湿、充入CO2的气候室中用不同纳米颗粒制剂或自由多柔比星在37℃温育。通过透射光缩时显微镜检查来观察在1-2d时间范围内的脱附。每7分钟拍摄照片。通过人工评估数据分析细胞的脱附。
实施例9:细胞活力测定
使用修改的如前所述的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5--二苯基四唑溴化物(MTT)染料还原测定[27]评估细胞活力。
表1:DI17E6和IgG修饰的100%交联的HSA纳米颗粒的物理化学特征(平均±SD;n=3)
表2:DI17E6和IgG修饰的装载多柔比星的100%交联的HSA纳米颗粒的物理化学特征(平均±SD;n=3)
表3:缩时脱附测量的计算
*总温育时间:1-2d
表4:不同纳米颗粒制剂的IC-50值
Claims (12)
1.抗整联蛋白抗体纳米颗粒缀合物,其通过将抗整联蛋白抗体或其生物活性片段与预先用化疗剂处理的蛋白质-纳米颗粒的表面共价连接获得。
2.权利要求1所述的抗体纳米颗粒缀合物,其中化疗剂通过吸附到蛋白质-纳米颗粒来被装载。
3.权利要求1或2所述的抗体纳米颗粒缀合物,其中蛋白质纳米颗粒是人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)的。
4.权利要求1-3任一项所述的抗体纳米颗粒缀合物,其中未处理的蛋白质-纳米颗粒的颗粒直径在150和280nm之间。
5.权利要求1-3任一项所述的抗体纳米颗粒缀合物,其中用化疗剂处理的蛋白质-纳米颗粒的颗粒直径在300和390nm之间。
6.权利要求1-5任一项所述的抗体纳米颗粒缀合物,其中抗体经由引入抗体分子的硫氢基基团直接或通过接头连接到蛋白质-纳米颗粒。
7.权利要求1-6任一项所述的抗体纳米颗粒缀合物,其中用所述蛋白质-纳米颗粒处理的化疗剂选自:顺铂、多柔比星、吉西他滨、多西他赛、紫杉醇、博来霉素和伊立替康。
8.权利要求1-7任一项所述的抗体纳米颗粒缀合物,其中共价连接到所述蛋白质-纳米颗粒的抗体选自LM609、vitaxin和17E6,以及其变体。
9.权利要求1所述的抗体纳米颗粒缀合物,其中所述蛋白质-纳米颗粒是装载多柔比星的HSA,并且共价连接到此颗粒的抗体是17E6或DI17E6。
10.药物组合物,其包含药物学有效量的权利要求1-9任一项所述的抗体纳米颗粒缀合物,任选地还有可药用的载体、洗脱剂或容器。
11.权利要求1-9任一项所述的抗体纳米颗粒缀合物在用于治疗癌症疾病的药物的制备中的用途。
12.权利要求1-9任一项所述的抗体纳米颗粒缀合物,其用于治疗肿瘤疾病。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1175703 Country of ref document: HK |
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C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120912 |