CN102659948A - 抗莱克多巴胺抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及抗莱克多巴胺抗体、以莱克多巴胺-牛血清白蛋白为免疫原制备抗莱克多巴胺抗体的方法，用莱克多巴胺人工免疫原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，由间接ELISA和间接竞争ELISA两种方法结合筛选出对莱克多巴胺有特异性的杂交瘤细胞，从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，分离获得所述抗莱克多巴胺的抗体，和将抗莱克多巴胺抗体应用于莱克多巴胺快速检测试剂。对动物性食品检测以及人类健康具有重要意义，可现场操作，3～5分钟即可给出结果等优点，非常适合对大批量样本进行现场筛查的工作。

Description

抗莱克多巴胺抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及抗莱克多巴胺抗体、以莱克多巴胺-牛血清白蛋白为免疫原制备抗莱克多巴胺抗体的方法和将抗莱克多巴胺抗体应用于莱克多巴胺快速检测试剂。

背景技术

莱克多巴胺是一种人工合成的β肾上腺受体激动剂，属于“瘦肉精”的一种。它可以加快畜禽生长速度，降低酮体脂肪含量，提高瘦肉率。人吃了残留莱克多巴胺的组织后会出现中毒症状，对患高血压、青光眼、糖尿病、前列腺肥大等疾病患者危害更大，严重的可能危及生命。因此，莱克多巴胺快速检测试剂的开发对动物性食品检测以及人类健康具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种抗莱克多巴胺抗体。

本发明的第二个目的是提供以莱克多巴胺-牛血清白蛋白为免疫原制备得到抗莱克多巴胺抗体的过程。

本发明的第三个目的是提供一种莱克多巴胺快速检测试剂，是抗莱克多巴胺抗体的有效应用。

本发明所述的抗莱克多巴胺抗体的制备方法为：用莱克多巴胺人工免疫原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，由间接ELISA和间接竞争ELISA两种方法结合筛选出对莱克多巴胺有特异性的杂交瘤细胞，从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，分离获得所述抗莱克多巴胺的抗体。

所述莱克多巴胺人工免疫抗原为莱克多巴胺-牛血清白蛋白偶联物(Rac-BSA)，是按以下方法自制得到：将莱克多巴胺盐酸盐加入已封闭好的氨基化载体蛋白BSA溶液中，利用碳二亚胺法进行偶联。将合成产物置入pH值为7.4、浓度为10mM(mM为“毫摩尔”，表示浓度)磷酸盐缓冲液4℃搅拌透析2天，每天换液2次，以去除未结合的莱克多巴胺或其它小分子物质，透析后-20℃密闭保存。

筛选抗体用莱克多巴胺-卵清蛋白偶联物同上述方法一样合成。

本发明提供的抗莱克多巴胺抗体可应用于检测莱克多巴胺残留。

本发明还提供一种莱克多巴胺快速检测试剂。其制备方法为：利用胶体金免疫层析的原理，在硝酸纤维素膜上的检测区包被Rac-BSA，对照区包被羊抗鼠多克隆抗体。当待测物中有被测的抗原物质(即莱克多巴胺)时，待测物中的抗原物质就会与标记胶体金的抗莱克多巴胺抗体形成Ag-Ab-Au复合物，该复合物中抗体的活性位点将因被样品溶液中的药物占据而无法与T线上药物抗原结合；所以当样品中的莱克多巴胺含量达5μg/L以上时，检测卡上的T线不显色，可以判定为阳性。反之，当样品中莱克多巴胺含量在5μg/L以下或无残留时，检测卡上的T线显色，判定为阴性。

目前对莱克多巴胺残留检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气-质联用法(GC/MS)、放射免疫分析法(RIA)、气相色谱法(GC)、高效薄层色谱法(HPTLC)、液-质联用分析法(LC/MS)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)等。由于各种检测方法的不同(包括方法学原理，使用的生物制剂的质量，操作人员的素质及使用设备的好坏等)，所得结果并不能说明某种检测方法的优劣。这些方法准确，灵敏度较高，出现假阳性、假阴性的机率较低，其中RIA、ELISA、TLC等方法可以大批量检测，样品不需要经过处理，但需要特定的设备，操作人员需要技术培训；GC/MS、HPLC等方法的设备更加昂贵，操作人员技术要求更高，且检测量少。上述检测方法都要求在实验室中通过仪器完成，几个小时之后才能给出鉴定结果，不适合现场初筛。莱克多巴胺快速检测试剂具有携带方便，不需要设备，操作人员无需技术培训，可现场操作，3～5分钟即可给出结果等优点，非常适合对大批量样本进行现场筛查的工作。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

抗莱克多巴胺抗体的制备方法为以下顺序步骤：

1.免疫动物：

选择6周龄，雌性，BALB/C小鼠，将Rac-BSA重氮偶联抗原与福氏完全佐剂等量混合、乳化，经腹部皮下多点注射，进行基础免疫。免疫前断尾取血，分离血清，保存在-20℃，作为正常对照小鼠的血清。隔4周，进行第二次免疫，抗原剂量同基础免疫，抗原与福氏不完全佐剂混合、乳化，对小鼠进行加强免疫。隔4周，进行第三次免疫，免疫条件同第二次。第三次免疫后第7～10天，断尾取血，分离血清，用ELISA方法检测血清效价。用生理盐水稀释免疫原对高效价小鼠进行连续加强免疫。

经过多次免疫剂量的调试试验得出，免疫剂量在50μg/0.2ml/只时为最佳免疫剂量。

2.饲养细胞的制备：

融合前一天，引颈处死小鼠，浸泡于75％酒精1min。将小鼠仰卧在解剖板上，剪开胸部皮肤，纵向拉开皮肤，暴露腹部用注射器抽取5ml无血清培养液注入腹腔，轻揉腹部1～2min，吸出细胞悬液，移入离心管。用无血清培养液离心洗涤1次(1000rpm，5min)。弃去上清液，加入HAT培养液，均匀悬液，接种于96孔培养板，0.1ml/孔。置37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养备用。

3.细胞融合和杂交瘤的筛选：

将50％PEG4000、无血清培养液、HAT筛选培养液置37℃ CO₂培养箱中预热。收获对数生长期的Sp2/0细胞，用无血清培养液洗涤3次(1000r/min离心10min)，作活细胞计数。无菌条件下分离脾细胞，作活细胞计数。将1×108脾细胞与1×107Sp2/0细胞在50ml尖底离心管中混匀，以1000r/min离心10min，弃去上清液，用食指轻弹管底，使细胞沉淀松散。将含有脾细胞和Sp2/0瘤细胞的50ml尖底离心管放于38℃融合水杯中，用1ml吸管吸取0.7mlPEG4000缓慢加入到细胞混悬液中(在1min内完成)，边加边轻轻地转动试管，使PEG与细胞充分混匀。静置90秒，在2min内加完15ml 37℃预热的无血清培养液，以1000r/min离心10min，弃去上清液，加入37℃预温HAT培养液充分混匀。接种于前一天含有BALB/C饲养细胞的96孔培养板中，0.1ml/孔。置37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养。

融合5天观察有小集落后，用HAT筛选培养液换液，10天后换HT培养液，镜检96孔细胞培养板，融合率达到60％。待培养孔中的杂交瘤细胞生长到约占1/3孔时，在无菌条件下吸取0.1ml培养液，用间接ELISA法检测阳性孔，OD450值大于1时，判定为阳性孔。将阳性孔细胞转至24孔含有巨噬细胞的培养板，待集落长至1/3～1/2孔时，取培养上清液，用间接ELISA法检测特异性。检出无交叉阳性株，进行克隆化培养，同时转入培养瓶。

4.腹水制备：

将6-C8细胞株的生产细胞经复苏后，培养于含15％胎牛血清的DMEM培养液中进行扩增。于两周前给小鼠腹腔注射降植烷(0.5ml/只)。然后将扩增的杂交瘤细胞接种于用降植烷处理过的BALB/C小鼠腹腔内，每只小鼠腹腔内注射0.5×107细胞/ml。7天后小鼠开始产生腹水。我们采用单次处死采集的方法收集腹水，保证腹水的均一性。最多从一只小鼠中可以获得6ml左右的腹水。

5.抗体的分离纯化：

取小鼠腹水置于离心管中，于高速低温离心机中，12000rpm离心10min，吸弃上层浑浊液，取中间层上清，保存在EP管中，利用饱和硫酸胺分段盐析法对腹水进行粗纯。粗纯的抗体经透析除盐后过Protein G柱子纯化。先用结合缓冲液平衡Protein G层析柱然后加入混合有结合缓冲液的粗纯抗体溶液，经结合、洗涤和洗脱收集洗脱样品中和后，将样品放在0.02PB，pH7.4的缓冲液透析过夜，透析液再离心12000rpm，20min。取上清即为纯化抗体。

结果表明：制备鼠源抗体，经Protein G柱纯化，抗体纯度达到95％以上；抗体亲和力为(3.29±0.29)×108M，特异性方面用ELISA检测抗体不识别克伦特罗、马布特罗、溴布特罗、沙丁胺醇、特普它林等小分子药物，完全可以满足用于制备检测试纸。

实施例2

莱克多巴胺快速检测试剂的制备方法为以下顺序步骤：

6.抗体的金标记：

量取金液50ml，加0.5mol/L K₂CO₃ 75μl，调pH值至8.5，充分搅拌。取莱克多巴胺抗体(将抗体用0.01M PBS稀释为1mg/ml)200μl加入到金液中搅拌30min。加入25ml 10％BSA，搅拌30min。将平衡好的金溶液，装离心管，10000r/min离心30min。弃上清液，加入pH值为8.2的Tris-HCl缓冲液稀释至25ml，搅拌充分溶解。转移至棕色瓶中4℃保存。

7.点金：

取金标抗体稀释液25ml，上样到喷金机上，设定参数选取喷量为2ul/cm。打开气泵，待气压稳定后，将金标抗体均匀喷到30cm*6.5cm的结合垫上，每张喷好后，及时放入37℃恒温箱至少干燥8小时。切成5mm宽的条状，后封入铝箔带，内装干燥剂，室温存放备用。

8.膜的处理：

用pH值为8.2、浓度为10mM的PBS缓冲液对Rac-BSA进行2mg/ml、1.5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml系列梯度稀释，分别包被于NC膜。与固定于结合垫的金标抗体(5mm×3mm)进行免疫层析，通过检测不同浓度的标准品，比较不同的显色水平，选择了显色差异性比较大且灵敏度比较高的1mg/mlRAC-BSA为NC膜检测线的最佳包被浓度。

用pH值为8.2、浓度为10mM的PBS缓冲液配制1mg/ml羊抗鼠多克隆抗体溶液10ml，制膜备用。

确认要喷膜的检测线、对照线，两者线间距为5mm，且使膜在两控制轴间松紧适度，调整Clongene喷膜仪的脉冲、流量，分别装入足够量已配制好的RAC-BSA，羊抗鼠IgG多克隆抗体，开始喷膜。

将喷后的硝酸纤维素膜移入37℃恒温干燥箱、10h后完全干燥取出，装入铝铂袋，内置干燥剂，密封室温存放备用。

9.莱克多巴胺快速检测试剂的组装：

首先将包被好的膜贴在PVC背板中间部位，在质控线一段贴上吸水垫，在检测线一端贴上胶体金结合垫，在胶体金结合垫下端贴上样品垫即可。

裁切：试纸条大板粘贴好后进行裁切，宽度为4.0mm，即为莱克多巴胺快速检测试剂。

结果表明：制备的莱克多巴胺快速检测试剂适用于莱克多巴胺的快速检测。

实施例3

用不同的检测方法对莱克多巴胺进行检测，对比各方法的检测速度、灵敏度和特异性，如表1所示：

表1

说明：实施例2制成的莱克多巴胺快速检测试剂产品检测速度3-5min，比放射免疫分析法(RIA)和气相色谱法(GC)的3-4h和4-5h明显有所缩短，灵敏度达到5μg/ml也比前两者有略微提高，该莱克多巴胺快速检测试剂和前两者一样，除了和莱克多巴胺阳性样品反应呈阳性外，和肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、沙丁醇胺、盐酸克伦特罗及常用抗菌药物(泰妙菌素、泰乐菌素、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、青霉素钠、氨苄青霉素、硫酸链霉素、硫酸庆大霉素、氯霉素、四环素、土霉素、呋喃唑酮、恩诺沙星、环丙沙星)等均无交叉反应。

总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

Claims (4)

1.抗莱克多巴胺抗体，其特征在于：以莱克多巴胺-牛血清白蛋白为免疫原制备得到。

2.权利要求1所述的抗莱克多巴胺抗体的制备方法, 其特征在于：用莱克多巴胺人工免疫原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，由间接ELISA和间接竞争ELISA两种方法结合筛选出对 莱克多巴胺有特异性的杂交瘤细胞，从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，分离获得所述抗莱克多巴胺的抗体。

3.根据权利要求2所述的抗莱克多巴胺抗体的制备方法, 其特征在于：所述莱克多巴胺人工免疫抗原为莱克多巴胺-牛血清白蛋白偶联物（Rac-BSA），是按以下方法自制得到：

将莱克多巴胺盐酸盐加入已封闭好的氨基化载体蛋白BSA溶液中，利用碳二亚胺法进行偶联；将合成产物置入pH值为7.4、浓度为10mM磷酸盐缓冲液4℃搅拌透析2天，每天换液2次，以去除未结合的莱克多巴胺或其它小分子物质，透析后-20℃密闭保存。

4.权利要求1所述的抗莱克多巴胺抗体在莱克多巴胺快速检测试剂中的应用。