CN102656452A - 用于干填充色谱柱的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于从干燥可溶胀颗粒开始的高效色谱柱的填充方法以及通过该方法填充的色谱柱和该色谱柱在生物分子分离中的用途。在该填充方法中，一定量的干燥可溶胀颗粒被转移到色谱柱，所述量足以提供柱室体积的105-120%的液体中的溶胀体积，色谱柱被关闭，并且液体被提供到色谱柱。

Description

用于干填充色谱柱的方法
技术领域
本发明涉及可用于生物分子的液相色谱分离的填充床体柱、填充这种柱的方法以及利用柱分离生物分子的方法。
背景技术
在液相色谱法中使用的色谱柱通常包括封装有多孔色谱介质的填充床体的管状主体，载液从填充床体中流过，其中通过在载液与多孔介质的固相之间的隔离而发生分离。
在任何分离过程之前，必须从将引入色谱柱中的颗粒介质开始对床体进行制备。床体成形过程被称为“填充过程”，并且正确填充的床体是影响包含填充床体的色谱柱的性能的关键因素。通常，填充床体通过浆料填充，即压实被泵入、倒入或吸入色谱柱中的称为浆料的液体中的离散颗粒的悬浮液而制备。一旦将预定体积的浆料输送到色谱柱中，就需要通过沿着色谱柱的纵向轴线朝色谱柱的底部向下以通常恒定的速度移动活动的适配器来进一步压实和压缩浆料。在此过程中过量液体在色谱柱出口被排出，而依靠所谓的“床体支承”的过滤材料保持介质颗粒，其中过滤材料的孔太小，以致于不允许介质颗粒通过。一旦已经将填充床体压缩到最佳的压缩度，填充过程就完成了。用于色谱柱浆料填充的另一种途径是流动填充方法，其中多孔结构的压缩主要通过在色谱柱上施加高流量来实现，从而形成在出口床体支承处开始的多孔结构。所产生的对多孔结构中颗粒的阻力最终引起压降和床体的压缩。通过使适配器就位而最终限制压缩的床体。
后续色谱分离的效率强烈地依赖于1)在填充床体的流体入口和出口处的液体分布和收集系统，2)填充床体中的介质颗粒的特殊取向(也被称为填充几何)，以及3)填充床体的压缩。如果填充床体的压缩太低，那么在床体上执行的色谱分离将受到“拖尾”的困扰，并且这种压缩不足的床体通常是不稳定的。如果填充床体的压缩太高，那么由床体执行的色谱分离将受到“前延(leading)”的困扰，并且这种过压缩的床体可能影响通过量和粘合能力，并且，通常提供高得多的操作压力。如果压缩是最佳的，那么在使用期间形成的分离峰很少出现前延或拖尾，并且是基本上对称的。就实现多孔结构的良好的长期稳定性从而在多个工艺循环中确保最佳性能而言，色谱柱所需要的最佳压缩程度也是关键的。色谱柱所需的最佳压缩程度是按照每个色谱柱的尺寸（宽度或直径）、床体高和介质类型通过实验确定的。
一种备选的填充方法被称为“干填充”，其中色谱柱利用多孔介质的干燥颗粒充填，并且随后在色谱柱中引入液体。这样做的优点是，可以将预填充的色谱柱以干燥状态交付客户而不必向填充液添加任何防腐剂，并且使运输期间的重量最小化。干填充通常用于旨在分离小分子的二氧化硅(silica)介质，如例如G Guiochon J Chromatogr A 704 (1995) 247-268中所描述的，但获得的色谱柱效率非常低。然而，对于溶胀性的色谱介质，例如生物分子的分离中常用的葡聚糖或琼脂糖基介质，由于意识到颗粒的溶胀将引起较差的填充床体性能，因而避免了干填充。US 4,353,801提到溶剂溶胀性苯乙烯-二乙烯苯颗粒的干填充劣于湿填充。
发明内容
本发明的一个方面是提供一种用于从干燥可溶胀颗粒开始的高效色谱柱的填充方法。这通过包括下列步骤的方法实现：a)将一定量的所述干燥可溶胀颗粒5转移到色谱柱1中的柱室2，所述量足以提供柱室体积的约105-120%的液体中的溶胀体积Vs，b)关闭色谱柱，并且c)将所述液体提供到色谱柱。换言之，该方法包括：计量(例如，通过称量)干燥可溶胀颗粒5的等分试样；将所述等分试样提供到色谱柱1中的柱室2；关闭柱室；并且将液体供应到柱室，其中所述等分试样的溶胀体积Vs为柱室体积的约105-120%。
本发明的具体方面为存储稳定的预填充柱，该预填充柱易于运输到使用者处并由使用者来平衡。这由包括干燥可溶胀颗粒的色谱柱实现，其中颗粒的量足以提供柱室体积的约105-120%的水性液体中的溶胀体积Vs。
以上方面中的一个或多个可由所附权利要求限定的本发明来实现。本发明的另外的方面、细节和优点将从下面的详细描述和权利要求中显而易见。
附图说明
图1示出色谱柱和利用干燥可溶胀颗粒填充该色谱柱的方法的示意图。
图2示出在柱室中插入柔性容器的实施例。
图3示出管状柱室安装在刚性壳体中的实施例。
图4示出填充方法的流程图。
图5示出其中干燥可溶胀颗粒的液体吸收率为确定的实施例的流程图。
图6示出其中色谱柱在施加液体之前被振动的实施例的流程图。
图7示出如何计算色谱柱性能。
具体实施方式
定义
术语“可溶胀颗粒”在本文中是指浸入液体之后尺寸增加的颗粒。这可被看作是液体中的沉降体积，该体积显著大于相同量的干燥颗粒的总体积。
术语“溶胀体积”(Vs)在本文中是指在液体中悬浮和平衡的颗粒的等分试样的沉降体积。可通过下列步骤测量沉降体积：将颗粒的等分试样悬浮；平衡最多24h；如果需要，再次悬浮颗粒；让颗粒沉降；并且在有刻度的容器（例如量筒）中测量沉降体积。
术语“液体吸收率”(Vs/md)在本文中是指如以上定义的颗粒的等分试样的溶胀体积Vs与颗粒的等分试样在浸入液体中之前的干重md之间的比率。
在图1和图4所示的本发明的一个实施例中，一定量的干燥可溶胀颗粒5被转移到色谱柱1中的柱室2，其中颗粒的量足以提供柱室体积的约105-120%的液体中的溶胀体积Vs，色谱柱被关闭，并且液体被供应到柱室。由于溶胀体积高于柱室体积，所以颗粒床体将被压缩到对应的程度(填充柱的压缩系数CF通常定义为Vs/Vcol，其中Vcol为柱室体积)，这提供了高的柱效率和低的峰不对称度。柱效率可表示为折合塔板高度(reduced plate height)h，该值为塔板高度除以颗粒的平均直径。塔板高度通过本领域中熟知的方法测量。峰不对称度可表示为不对称因子As，该值为从峰的后坡到峰的中心的距离与从前坡到峰中心的距离(全部在峰高度的10%处测量)之间的比率。塔板高度和不对称因子两者均对小分子非保持物质适当地测量。色谱柱可设计用于轴向或径向流，并且它可包括流体分配器3。柱室的入口和出口可以由多孔筛4定界，以保持颗粒并让液体通过。多孔筛可由织造筛目、烧结玻璃料或任何其它类型的多孔材料制备。
在图5所示的又一实施例中，该方法的初始步骤是确定干燥可溶胀颗粒的液体吸收率Vs/md并从所述液体吸收率决定待转移到柱室的干燥可溶胀颗粒的量。液体吸收率可使用用于提取代表性样品的成熟方法从颗粒的单独的样品等分试样确定。样品被称量干重(即与环境大气平衡)，并且然后悬浮在测试液中。测试液可以是与色谱柱的填充和操作中所使用的相同的液体或具有类似成分的液体；通常为具有类似离子强度/电导率和pH值的水性缓冲液或盐溶液。让测试液中的颗粒平衡通常约一小时，且在任何情况下不超过24小时。将颗粒再次悬浮并让其沉降。例如在量筒中测量沉降体积。然后，将液体吸收率计算为沉降体积Vs与干燥颗粒样品的重量md之间的比率Vs/md。首先测量液体吸收率的优点是可以预测色谱柱中的颗粒的溶胀体积，从而导致更好控制压缩和柱效率。在特定实施例中，液体吸收率以小于5%的变异系数、或者甚至小于2%的变异系数确定，以允许色谱柱性能的控制的高精度。
在备选实施例中，代替使用干燥颗粒重量作为基准，液体吸收率基于干燥颗粒体积而确定。同样地，将充填到具有给定特定柱的至少一个柱中的等分试样的制备可基于干燥颗粒体积而不是干燥颗粒质量来进行。
在某些实施例中，在将液体提供到色谱柱之前，可以操纵柱室中的干燥可溶胀颗粒以允许更均匀的空间分布。在图6所示的一个实施例中，在提供液体之前，使色谱柱经受振动，而在另一个实施例中，在提供液体之前，从色谱柱的底端注射气体(例如空气)。这些动作都可引起干燥颗粒至少部分地流化，从而导致在柱室的水平底部表面上的更均匀的颗粒分布。这样做的优点是，在施加液体之后，可以实现溶胀颗粒更均匀的空间分布。振动或气体注射可以在将干燥可溶胀颗粒转移到柱室或柔性容器之后的任何阶段进行。在一个实施例中，可以将惰性气体注入色谱柱中以在存储期间提供针对氧化降解反应的保护。
在一个实施例中，液体沿上流方向提供到色谱柱。液体接着将沿竖直方向上从底部入口均匀地上升穿过干燥颗粒床体，从而导致比液体从色谱柱的顶部向下倒入时更均匀的颗粒分布。一旦颗粒已被液体溶胀，就可以在任何方向上(上流、下流、倾斜等)操作色谱柱。在特定实施例中，到干燥可溶胀颗粒的液体加入速率不超过颗粒的毛细管抽吸速率。毛细管抽吸速率可通过例如以下方式确定：将具有干燥可溶胀颗粒的色谱柱放入包含高达干燥床体的下端的液体的槽中，并且通过光学、重量分析或其它方法测量液体上升穿过床体的速率。使液体加入速率低于或等于毛细管抽吸速率具有如下优点，即在溶胀之后提供更均匀的颗粒分布以及因此更好的色谱柱性能。液体加入速率可表示为柱室中的液体速度(液体流量除以柱室的内部横截面积)。在特定实施例中，在将液体加入到干燥颗粒期间，柱室中的液体速度小于100cm/h，例如在5与70cm/h之间。在一个实施例中，液体为水性的，并且因此其可包括诸如低级醇(如乙醇)的润湿剂(减小表面张力的添加剂)或表面活性剂。这样做的优点是，在溶胀之后可以获得更均匀的颗粒分布。
在图2所示的一个实施例中，将干燥可溶胀颗粒转移到色谱柱中的柱室的步骤包括首先将干燥可溶胀颗粒5转移到柔性容器7，并且然后将柔性容器放入柱室2中。这样做的优点是，可以将颗粒包装在容易运输的低成本柔性容器中供给给使用者，并且使用者可以将容器放入色谱柱中并施加液体。柔性容器的壁可具有多孔部分，该多孔部分将抵靠柱室的多孔的顶板和底板装配。柔性容器可以为例如塑性袋构造或由模制和/或挤出部件组装而成。在一个实施例中，柔性容器被溶胀颗粒膨胀以配合柱室。
在一个实施例中，该方法包括下列步骤：在将干燥可溶胀颗粒转移到柱室8之后和在色谱柱关闭之前，将柱室8转移到刚性壳体11，该壳体在凝胶溶胀和/或色谱柱操作期间为柱室提供尺寸稳定性。在此背景下，独立式柱室8可以在凝胶的溶胀期间或由于加压而在色谱柱操作期间略微挠曲。刚性壳体11将防止任何这种挠曲和任何相关的色谱柱性能劣化。
在一个实施例中，该方法包括在将液体加入到色谱柱之前对具有干燥可溶胀颗粒的色谱柱或柔性容器辐射消毒的步骤。此步骤可以在该方法的任何阶段进行。辐射消毒可通过伽马射线或电子束照射进行。
本发明的一个实施例为包括干燥可溶胀颗粒的色谱柱，其中颗粒的量足以提供柱室体积的约105-120%的水性液体中的溶胀体积Vs。在一个实施例中，该液体为0.1mol/l的20℃下的氯化钠(NaCl)水溶液。这种溶液具有大约10 mS/cm的电导率，该值在生物分子/生物医药分离中使用的许多缓冲液的范围内。
在一个实施例中，干燥可溶胀颗粒的液体吸收率Vs/md(在0.1M的20℃下的NaCl水溶液中)在5与25 ml/g之间，例如在5和15 ml/g之间。该实施例的优点是在色谱柱的操作期间对压缩系数的良好控制和最小化所施加液相成分的溶胀(和色谱柱性能)的波动。在一个实施例中，干燥可溶胀颗粒在蒸馏水中的液体吸收率比在0.1M水性NaCl中的液体吸收率的1.5倍小。这样做的优点是将液相成分的溶胀波动保持在较低水平。
在一个实施例中，柱体积为固定的。固定体积的色谱柱可以构造成不具有任何移动部件(适配器等)，这样简化了构造，并且从成本角度来看是有利的。在一个实施例中，色谱柱包括模制或挤出部件。诸如注模、吹模、旋模、压缩模制等的模制和挤出方法对于由例如热塑性材料制造柱部件来说是方便而节约成本的方法。
在一个实施例中，柱室体积为至少一升。具有超过1升的床体体积的色谱柱常常用于工业生物药品纯化中。这种色谱柱常常是具有移动部件的复杂而昂贵的钢结构，因此需要允许使用简单的塑性结构的解决方案。
在图2所示的一个实施例中，色谱柱1包括包含干燥可溶胀颗粒5的柔性容器7。这样做的优点是，可以将颗粒包装在容易运输的低成本柔性容器中提供给使用者，并且使用者可以将容器放入色谱柱中并施加液体。柔性容器可包括至少一个柔性壁，即，当把1巴的过压施加到无支承的容器时，可以足够挠曲以引起至少1%的容器体积变化的壁。柔性容器的壁可具有多孔部分，该多孔部分将抵靠柱室2的多孔顶板和底板13装配。柔性容器可以为例如塑性袋构造或由模制和/或挤出部件组装而成。在一个实施例中，柔性容器为可膨胀的，以在颗粒溶胀时配合柱室。在另一个实施例中，保持颗粒且提供液体分布的多孔顶板和底板区段可以合并到柔性容器中。在这种情况下，柔性容器为封闭系统，并且不与壳体或从外部机械地支承柔性容器的其它部件流体接触。
在图3所示的一个实施例中，色谱柱包括具有例如圆形、椭圆形或矩形截面的至少一个管状柱室8，并具有至少一个刚性管壁9和至少一个柔性端件10。柔性端件可以是多孔的且被放置成与刚性壳体11中的多孔顶板或底部13紧密接触。刚性壳体的顶端和底端可由本领域中熟知的一般夹紧结构(图3中未示出)保持在一起。
在一个实施例中，干燥可溶胀颗粒包括多聚糖，例如交联琼脂糖。由于其高通过量和低非特异性吸收，交联琼脂糖颗粒对于生物分子纯化和生物医药纯化非常有用。交联琼脂糖颗粒通常在水性乙醇溶液中供应，并且使用干燥琼脂糖颗粒的优点在于不必处理易燃乙醇。琼脂糖颗粒的干燥可使用例如冷冻干燥、喷雾干燥或真空干燥进行。
在实施例中，干燥可溶胀颗粒包括带电配体。这种配体主要在离子交换和多模式分离中使用，这两种分离都是生物分子分离和生物医药分离中非常有用的。可以设想阳离子交换剂、阴离子交换剂和多模式离子交换剂。
在一个实施例中，干燥可溶胀颗粒包括具有疏水性官能团的配体。这种配体在疏水作用色谱和许多多模式分离中使用，这两种应用都是生物分子分离和生物医药分离中非常有用的。具有疏水性官能团的配体和配体部分的实例为烷基和芳基。
在一个实施例中，干燥可溶胀颗粒包括亲和配体。这种配体在生物分子和生物医药的高选择性分离中非常有用。亲和配体的实例为蛋白A、蛋白G、蛋白L、凝集素、酶底物、凝集素、生物素、抗生物素蛋白、抗体、抗体片段、抗原等。
在一个实施例中，提供到具有干燥可溶胀颗粒的色谱柱的液体包括至少一种生物分子，例如生物药品。这种液体的实例包括蛋白溶液和病毒悬浮液，例如，生物处理操作中将纯化的进料。直接利用进料溶胀干燥颗粒的优点是，可以取消单独的溶胀步骤，并且溶胀本身可以为未渗入溶胀结构中的物质提供分离和浓缩效果。
本发明的一个实施例是包括根据前述实施例填充的溶胀颗粒的色谱柱。在特定实施例中，色谱柱具有小于15的折合塔板高度h，例如对于测试物质小于10。测试物质可以是非保留小分子，例如无机盐或丙酮。在又一个实施例中，色谱柱的不对称因子As小于3，例如，对于如上所选的测试物质小于2.5。
一个实施例是由同一批干燥可溶胀颗粒制备的至少两个色谱柱。在特定实施例中，色谱柱并联连接。将具有相同床体体积、颗粒类型和床体高度的色谱柱并联连接是一种增加总横截面积和通过量的方便的方式。然而，当使用并联连接的色谱柱时，很重要的一点是，色谱柱中的流体速度相同，以确保在每个柱中实现相同的分离。这对色谱柱在流体阻力和压力-流量行为方面的可重复性提出较高要求。当色谱柱中具有来自同一批次的干燥可溶胀颗粒时，可以足够好地控制流体阻力和压力-流量行为以允许并联使用。
在一个实施例中，包括溶胀颗粒的色谱柱被用于分离至少一种生物分子，例如生物药品。合适的生物分子可以是蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、病毒颗粒等。合适的生物药品可以是免疫球蛋白(如单克隆抗体)、免疫球蛋白片段和其它构造、胰岛素和其它治疗性肽、促红细胞生成素、血浆蛋白、低聚核苷酸、质粒、疫苗等。在特定实施例中，生物分子或生物药品为蛋白质。
在一个实施例中，生物分子或生物药品结合到颗粒并且通过用洗涤液洗涤而除去至少一种杂质。然后，可以用洗提液从颗粒洗提生物分子或生物药品。此模式常常被称为结合-洗提分离，并且当杂质量较大和/或需要非常高的分离选择性时尤其有用。
在另一实施例中，至少一种杂质结合到颗粒，并且在流过色谱柱的过程中回收生物分子或生物药品。此模式常常被称为流过分离(flow-through separation)，并且提供非常高的通过量，特别是当杂质的量相对较低时。
本发明的其它特征和优点将从下面的实例并且从所附权利要求显而易见。
该书面描述利用示例来公开本发明，包括最佳模式，并且还使本领域技术人员能实施本发明，包括制造和使用任何设备或系统以及执行任何合并的方法。本发明的专利保护范围由权利要求所限定，并且可包括本领域技术人员所想到的其它示例。如果这种其它示例具有与所附权利要求的字面语言没有不同的结构元件，或者如果它们包括与所附权利要求的字面语言无实质差别的等同结构元件，则这种其它示例意图在所附权利要求的范围内。
附图描述
图1 i)示出色谱柱1的示意图，色谱柱1具有由多孔筛4定界的流体分配器3和柱室2。
图1 ii)示出在柱室中具有干燥可溶胀颗粒5的色谱柱。
图1 iii)示出在施加液体之后具有充填柱室的此时溶胀的颗粒6的色谱柱。
图2 i)示出具有干燥可溶胀颗粒5的柔性容器7的示意图。
图2 ii)示出放入具有多孔板13的柱室2中的柔性容器7。
图2 iii)示出在施加液体之后的色谱柱，其具有在柱室中充填且使柔性容器膨胀的此时溶胀的颗粒6。
图3示出具有在管状柱室8中的干燥可溶胀颗粒5的色谱柱14的示意图，管状柱室8具有刚性管壁9、柔性多孔端件10且装配到刚性壳体11中，刚性壳体11具有与多孔端件10接触的多孔板13和流体分配器12。
图4为实施例的流程图，其中步骤a)包括将干燥颗粒转移到色谱柱，步骤b)包括关闭色谱柱，并且步骤c)包括将液体供应到色谱柱。
图5为实施例的流程图，其中步骤a)之前为步骤a')，该步骤包括确定干燥颗粒的液体吸收率，并且从液体吸收率决定将转移到色谱柱中的颗粒量。
图6为实施例的流程图，其中步骤c)之前为步骤c')，该步骤包括振动色谱柱。
图7示出了用于色谱柱的折合塔板高度h和不对称因子As的计算。
实例
柱效率测试
将示踪剂(丙酮2% v/v去离子水溶液)作为具有色谱柱体积的1-1.5%的体积的示踪剂施加，以分析柱出口处的停留时间分布(在280 nm下的UV信号)。停留时间分布应表示为单峰，参见图7。下面描述评估。
柱效率通常由两个参数限定：
● 在色谱柱上的峰展宽由等价的理论塔板数(平衡级)描述
● 峰对称性由峰不对称因子As描述
相对峰宽定义为(理论)塔板数N、理论塔板当量高度HETP或优选地折合塔板高度h：
Figure 2010800587769100002DEST_PATH_IMAGE002
不对称因子As描述与理想的高斯峰形的偏差并且由10%峰高度处的峰宽计算：
Figure 2010800587769100002DEST_PATH_IMAGE004
命名
塔板数              N
平均停留时间 1        μ1
方差 1                δ2
保留时间 2            tR
保留体积 2            VR
半峰高度处的峰宽    wh
床体高度             L
颗粒直径             dp
理论塔板的当量高度   HETP
折合塔板高度         h = HETP/dp
不对称因子           As
1   在停留时间分布中的第一和第二时刻
从示踪信号积分导出的(RTD)曲线
2   对应于最大峰高度处的时间(或洗提体积)的保留时间(保留体积)
实例1
所用干燥可溶胀颗粒为Q SepharoseTM HP (GE Healthcare, Sweden)，一种阴离子交换剂，其具有当在水中溶胀时与平均直径34微米的交联琼脂糖珠连接的四甲基铵基团配体。Q Sepharose HP颗粒已转移到丙酮，并且然后在室温下真空干燥。
将每ml柱室体积129mg干燥颗粒转移到两个不同类型的直立式色谱柱：XK26柱(GE Healthcare, Sweden)，其具有26mm的柱室直径、30mm的柱室高度和15.93ml的柱室体积；和XK50柱(GE Healthcare, Sweden)，其具有50mm的柱室直径、31mm的柱室高度和60.87ml的柱室体积。
将20%乙醇的水溶液以60cm/h的流体速度泵入每个色谱柱的底部入口。连续泵送，直到三个柱室体积通过色谱柱，然后以200cm/h的流体速度泵送通过三个柱体积的蒸馏水。在300cm/h的速度下以交替的上流和下流模式泵送4x3柱室体积的蒸馏水，以对色谱柱进行调整。
通过上文所述的柱效率测试来评估色谱柱的性能。性能结果在表1中给出。
运行 N/m h (-) As (-)
XK26down002 15746 1.87 2.03
XK26down003 15739 1.87 2.05
XK26up002 15969 1.84 1.96
XK26up003 15882 1.85 2.01
XK50down003 10672 2.76 1.27
XK50down004 10818 2.72 1.31
XK50up003 11020 2.67 1.25
XK50up004 10645 2.76 1.28
实例2
所用干燥可溶胀颗粒为CaptoTM S (GE Healthcare, Sweden)，阳离子交换剂，其具有当在水中溶胀时与平均直径90微米的葡聚糖伸展交联琼脂糖珠连接的磺酸根基团配体。Capto S颗粒已转移到丙酮，并且然后在室温下真空干燥。
将3.34g干燥颗粒转移到两个直立式XK26柱(GE Healthcare, Sweden)，其具有26mm的柱室直径、30mm的柱室高度和15.93ml的柱室体积。
将20%乙醇的水溶液以30cm/h的流体速度泵入色谱柱的底部入口。连续泵送，直到三个柱室体积通过色谱柱，然后以100cm/h的流体速度泵送通过1.5个柱体积的蒸馏水。
通过上文所述柱效率测试来评估色谱柱的性能。在上流模式下以340cm/h的速度通过蒸馏水，以进行20h的稳定性测试。性能和稳定性结果在表2中提供。
运行 N/m h (-) As (-)
Down001 3602 3.27 1.57
Up005 4587 2.56 1.38
Down002 4855 2.42 1.49
Up006 5161 2.28 1.48
Down003 4966 2.37 1.56
Up007 5229 2.25 1.51
Down004 5035 2.34 1.53
Up008 5269 2.23 1.54
稳定性测试      
Down001 5066 2.32 1.57
Up001 5251 2.24 1.58
Down002 5010 2.35 1.58
本文所提到的所有专利、专利公布和其它已公开的参考文献特此由参考资料以其全部内容仿佛每一篇是由参考文献单独和逐一引入似地合并入本文。虽然描述了本发明的优选示例性实施例，但本领域技术人员将会知道，本发明可通过除了所述实施例之外的实施例来实施，这些实施例仅以举例目的而非限制的方式提供。本发明仅受所附权利要求的限制。

Claims (33)

1.一种用于利用干燥可溶胀颗粒填充色谱柱(1)的方法包括如下步骤：a)将一定量的所述干燥可溶胀颗粒(5)转移到所述色谱柱中的柱室(2)，所述量足以提供所述柱室体积的约105-120%的液体中的溶胀体积Vs，b)关闭所述色谱柱，并且c)将所述液体提供到所述色谱柱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：在步骤a)之前，确定所述干燥可溶胀颗粒的液体吸收率Vs/md并从所述液体吸收率决定将转移到所述柱室的干燥可溶胀颗粒的量的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液体吸收率以小于5%的变异系数确定。
4.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于，还包括在步骤c)之前使所述色谱柱经受振动的步骤。
5.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于，在步骤c)中，所述液体沿上流方向被提供到所述色谱柱。
6.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于，在步骤c)中，液体的加入速率不超过所述颗粒的所述毛细管抽吸速率。
7.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于，步骤a)包括：首先将所述干燥可溶胀颗粒转移到柔性容器(7)，然后将所述柔性容器放入所述柱室(2)中。
8.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于，步骤a)包括将所述柱室(8)转移到刚性壳体(11)，所述刚性壳体(11)在所述凝胶溶胀和/或所述色谱柱操作期间为所述柱室提供尺寸稳定性。
9.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于，还包括在步骤c)之前对具有所述干燥可溶胀颗粒的色谱柱或柔性容器进行辐射消毒的步骤。
10.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于，提供到具有所述干燥可溶胀颗粒的色谱柱的液体包括至少一种生物分子，例如生物药品。
11.一种包括干燥可溶胀颗粒的色谱柱，其中，颗粒的量足以提供所述柱室体积的约105-120%的水性液体中的溶胀体积Vs。
12.根据权利要求11所述的色谱柱，其特征在于，所述液体为0.1M的20℃下的水性NaCl。
13.根据权利要求11-12所述的色谱柱，其特征在于，所述干燥可溶胀颗粒的所述液体吸收率Vs/md(在0.1M的20℃下的水性NaCl中)在5与25ml/g之间，例如在5与15ml/g之间。
14.根据权利要求11-13中的任一项所述的色谱柱，其特征在于，所述干燥可溶胀颗粒在蒸馏水中的液体吸收率比在0.1M水性NaCl中的液体吸收率的1.5倍小。
15.根据权利要求11-14所述的色谱柱，其特征在于，所述柱体积为固定的。
16.根据权利要求11-15中的任一项所述的色谱柱，其特征在于，所述色谱柱包括具有所述干燥可溶胀颗粒(5)的柔性容器(7,8)。
17.根据权利要求11-15中的任一项所述的色谱柱，其特征在于，所述色谱柱包括至少一个管状柱室(8)，所述至少一个管状柱室(8)具有至少一个刚性管壁(9)和至少一个柔性端件(10)。
18.根据权利要求17所述的色谱柱，其特征在于，所述管状柱室安装在刚性壳体(11)中。
19.根据权利要求11-18中的任一项所述的色谱柱，其特征在于，所述色谱柱包括模制或挤出部件。
20.根据权利要求11-19中的任一项所述的色谱柱，其特征在于，所述干燥可溶胀颗粒包括交联琼脂糖。
21.根据权利要求11-20中的任一项所述的色谱柱，其特征在于，所述干燥可溶胀颗粒包括带电配体。
22.根据权利要求11-21中的任一项所述的色谱柱，其特征在于，所述干燥可溶胀颗粒包括具有疏水性官能团的配体。
23.根据权利要求11-22中的任一项所述的色谱柱，其特征在于，所述干燥可溶胀颗粒包括亲和配体。
24.根据权利要求11-23中的任一项所述的色谱柱，其特征在于，所述液体包括至少一种生物分子，例如生物药品。
25.一种包括根据权利要求1-10中的任一项制备的溶胀颗粒的色谱柱。
26.根据权利要求25所述的色谱柱，其特征在于，所述折合塔板高度h小于15，例如小于10。
27.根据权利要求25或26所述的色谱柱，其特征在于，所述不对称因子As小于3，例如小于2.5。
28.根据权利要求11-27中的任一项所述的至少两个色谱柱，其特征在于，所述至少两个色谱柱由同一批干燥可溶胀颗粒制备。
29.根据权利要求28所述的至少两个色谱柱，其特征在于，所述至少两个色谱柱并联连接。
30.根据权利要求25-29中的任一项所述的至少一个色谱柱用于分离诸如生物药品的至少一种生物分子的用途。
31.根据权利要求30所述的用途，其特征在于，所述生物分子或生物药品为蛋白质。
32.根据权利要求30-31中的任一项所述的用途，其特征在于，所述生物分子或生物药品结合到所述颗粒，并且通过利用洗涤液洗涤而除去至少一种杂质。
33.根据权利要求30-32中的任一项所述的用途，其特征在于，至少一种杂质结合到所述颗粒，并且所述生物分子或生物药品在流过所述色谱柱的过程中被回收。
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